Thành phố Hồ Chí MinhTháng 9/2007

PHÂN LẬP VÀ ĐINH DANH MỘT SÓ VI SINH VẬT CỔ

KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG THựC

VẬT Ở VƯỜN QUỐC GIA CÁT TIÊN

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Niên khóa: 2003-2007

Sinh viên thực hiện: PHAN TRUNG HẬU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HỒ CHÍ MINHBỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí MinhTháng 9/2007

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SÓ VI SINH VẬT CÓKHẢ NĂNG KỈCH THÍCH SINH TRƯỞNG THựC

VẬT Ở VƯỜN QUỐC GIA CÁT TIÊN

Giáo viên hướng dẫn:

PGS.TS. BÙI VĂN LỆ

ThS. KIỀU PHƯONG

NAM

Sinh viên thực hiện:

PHAN TRUNG

HẬU

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận này được hoàn thành với sự quan tâm giúp đỡ rất nhiều của các

thầy cô, các anh chị và các bạn. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

PGS.TS Bùi Văn Lệ , người đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điền kiện để em

thực hiện khóa luận này.

Thạc sĩ Kiều Phương Nam , là người thầy hết lòng tận tụy tuyền đạt những

kinh nghiệm quí báo trong suốt quá trĩnh làm đề tài. Em xin cảm ơn thầy rất nhiều!

Quý thầy cô bộ môn công nghệ sinh học, cùng các thầy cô trường Đại học

Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã chỉ dạy và truyền đạt cho chúng em những kiến

thức quý báu suốt 4 năm học qua.

Em cảm ơn anh Bình cùng toàn the các bạn sinh viên năm tư trường ĐH

Khoa học Tự nhiên, ĐH Mở luôn sẵn sàng giúp đỡ và động viên tôi những lúc gặp

khó khăn trong đề tài.

Cảm ơn tất cả các thành viên lớp CNSH 29 và các bạn thân đã cùng tôi chia sẻ

những nỗi buồn vui những năm đại học.

Và trên hết, con cảm ơn ba má , và các anh chị đã luôn chăm lo , ủng hộ, tin

tưởng và khích lệ con những lúc khó khăn nhất để con có thể vững bước trên con

đường đã chọn.

Tháng 9/2007

Phan Trung Hậu

I

TÓM TẮT

Đề tài “Phân lập và định danh một số vỉ sinh vật có khả năng kích thích

sinh trưởng thực vật ở vườn quốc gia Cát Tiên” được thực hiện tại trại thực

nghiệm sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí

Minh từ tháng 3/2007 đến tháng 8/2007.

Kết quả:

- Phân lập và làm thuần được 75 chủng vi sinh vật từ vườn Quốc Gia Cát Tiên.

Trong đỏ cỏ 45 chủng trên môi trường chọn lọc MMS (khoáng MS+1% methanol) và

30 chủng trên môi trường chọn lọc MSo (môi trường MS loại bỏ các thành phần chứa

nitrogen).

- Sàng lọc qua 2 hệ thống (khả năng tác động lên chồi thuốc lá trong điều kiện

in vitro và khả năng kích thích hạt nảy mầm của hạt đậu xanh trong điều kiện in vivo),

chúng tôi chọn lọc được 9 chủng vi sinh vật có khả năng kích thích sinh trưởng trên

thực vật bao gồm: 6012a, 6019a, 6019b, 6021a, 6027a, ONlổa, ON20a, ON28a và

ON29b.

Ket quả định danh:

Chủng 6012a và 6027a được định danh tới cấp độ giống là vi khuẩn thuộc chi

Methylobacterium. Riêng chủng 6012a có thế là một loài mới.

Các chủng 6019a, 6019b, 6021a, ON16a, ON20a, ON28a, ON29b là nấm men

và có đặc điểm tưomg đồng với các giống nấm men sau:

- Các chủng 6019b, ONlỗa, ON20a, ON29b có điểm tưomg đồng với giống

Pichia.

- Chủng 6019a có điểm tưomg đồng với giống Cocidiascusc.

- Chủng 602la có điểm tưomg đồng với giống Rhodotorula.

- Chủng ON28a có điểm tưomg đồng với giống Endomycopsis.

MỤC LỤC

CHƯƠNG......................................................................................................TRANG

Trang tựa......................................................................................................................i

II

Lời cảm om................................................................................................................iii

Tóm tắt ......................................................................................................................iv

Mục lục ......................................................................................................................V

Danh sách các chữ viết tắt.......................................................................................viii

Danh sách các hình ...................................................................................................ix

Danh sách các sơ đồ và biểu đồ.................................................................................xi

Danh sách các bảng...................................................................................................xii

Chương 1: MỞ ĐẦU................................................Error! Bookmark not dellned.

1.1. Đặt vấn đề..........................................................Error! Bookmark not dellned.

1.2. Mục tiêu.............................................................Error! Bookmark not dellned.

1.3. Yêu cầu..............................................................Error! Bookmark not dellned.

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.....................Error! Bookmark not dellned.

2.1. Vườn Quốc gia Cát Tiên ..................................Error! Bookmark not dellned.

2.2. Sơ lược sự tương tác giữa vi sinh vật và thực vật...........Error! Bookmark not

dellned.

2.2.1 Phân nhóm vi sinh vật tương tác với thực vật dựa vào bản chất của sự

tương tác........................................................................................................................7

2.2.1.1. Các vi sinh vật ức chế tác hại của mầm bệnh lên thực vật..................Error!

Bookmark not dellned.

2.2.1.2. Vi sinh vật gia tăng dinh dưỡng cho cây.....Error! Bookmark not dellned.

2.2.2. Vi khuẩn sản xuất các chất kích thích lên sự sinh trưởng ở thực vật. .Error!

Bookmark not dellned.

2.3. Các phương pháp định danh vi sinh vật..............Error! Bookmark not deilned.

2.3.1. Phương pháp truyền thống...............................Error! Bookmark not dellned.

3

2.3.1. Phương pháp hiện đại

Errorỉ Bookmark not delined.

Chương 3: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP.............Error! Bookmark not

deíined.

3.1. Thời gian và địa điểm.........................................Error! Bookmark not

defíned.

3.2. Vật liệu...............................................................Error! Bookmark not

deílned.

3.2.1. Mẩu thí nghiệm..............................................Error! Bookmark not

deílned.

3.2.2. Thiết bị dụng cụ.............................................Error! Bookmark not

dellned.

3.2.3. Hóa chất.........................................................Error! Bookmark not

dellned.

3.2.3.1. Môi trường phân lập và làm thuần vi sinh vật biến dưỡng methyl (MMS)

Error! Bookmark not defíned.

3.2.3.2. Môi trường chọn lọc vi sinh vật cố định nitơ (MSo) . Error! Bookmark not

dellned.

3.2.3.3. Môi trường nhân sinh khối vi khuẩn (CMS)Error! Bookmark not deíined.

3.2.3.4. Các môi trường khác...................................................Error! Bookmark not

deíined.

3.3. Phương pháp thí nghiệm.....................................................Error! Bookmark not

...........................................................................................................................deỉĩned.

3.3.1. Phân lập và lảm thuần...................................................Error! Bookmark not

deíined.

3.3.1.1. Lấy mẫu và tăng sinh mẫu:.........................................Error! Bookmark not

deíined.

3.3.1.2. Phân lập chọn lọc........................................................Error! Bookmark not

deíined.

3.3.1.3. Giữ giống

viii

Error! Bookmark

not defined.

3.3.2. Định tính...........................................................Error! Bookmark not deíined.

3.3.2.1. Khảo sát khả năng kích thích sinh trưởng thực vật của các chủng kiện in

vitro và in vivo.............................................................Error! Bookmark not

...................................................................................deíined.

3.3.2.2. Xử lý thống kê..............................................Error! Bookmark not

deíined.

3.3.2.3. Quan sát hình thái........................................Error! Bookmark not

deíined.

3.3.3. Định danh vi khuẩn......................................Error! Bookmark not

deíined.

3.3.3.1. Khảo sát các đặc

điểm hình thái, sinh lý,

sinh hóa.... Error!

Bookmark not dellned.

3.3.3.2. Đặc điểm sinh

lý...

3.3.3.3. Đặc điểm sinh hóa

Error! Bookmark not deíined.

Error! Bookmark not deíined.

viii

3.3.3.4.

3.3.3.5. So sánh tính tưomg đồng di truyền dựa trên hệ số lascard

Bookmark not defined.

3.3.3.6......................................................................... Phân tích trình tự rDNA 16S

....................................................................................Error! Bookmark not defíned.

3.3.4. Định danh nấm men.........................................Error! Bookmark not defíned.

3.3.4.1. Khảo sát các đặc điểm hình thái nấm men...Error! Bookmark not deíined.

3.3.4.2....................................................................................... Xác định một số đặc

tính sinh hóa của nấm men.......................................................Error! Bookmark not

dellned.

Chương 4: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN...................Error! Bookmark not deíined.

4.1. Kết quả phân lập và lảm thuần..........................Error! Bookmark not deíined.

4.2. Ket quả sàng lọc các chủng có khả năng tương tác với thực vật................Error!

Bookmark not dellned.

4.2.1. Khảo sát khả năng kích thích tăng trưởng thực vật của các chủng YSY trong

điều kiện in vitro........................................................Error! Bookmark not deíined.

4.2.2. Khảo sát khả năng kích thích sự nảy mầm của hạt giống.... Error! Bookmark

not defined.

4.3. Định danh vi sinh vật..........................................Error! Bookmark not deíined.

4.3.1. Kết quả quan sát hình thái................................Error! Bookmark not deíined.

4.3.2. Định danh vi vi khuẩn...................................................................................59

4.3.2.1. Ket quả khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa.........................59

4.3.2.2. Phân tích trình tự rDNA 16S.......................................................................70

4.3.3. Định danh nấm men.........................................................................................77

4.3.3.1......................................................................................................................... Qu

an sát các đặc điểm hình thái nấm men......................................................................77

4.3.3.2. Các đặc điểm sinh 11, sinh hóa...................................................................80

Error!

viii

Chương 5: KẾT LUẬN - ĐÈ NGHỊ.......................Error! Bookmark not defined.2

5.1 Kết luận.........................................................Error! Bookmark not defined.2

5.2 Đề nghị..........................................................Error! Bookmark not deíined.

I

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

85

viii

DANH SÁCH CÁC CHỬ VIÉT TẤT

Bp Base pair

EDTA Ethylene-Diamine-T etraacetic- Acid

MS Murashige và Skoog, 1962

CMS Môi trường bổ sung 2% cao thịt và 2% casein

MMS môi trường Methanol Minerol Salts

Gram (-) Gram âm

Gram (+) Gram dươngPPFM Pink-Pigment Facultative Methylotrophic

PCR Polymerase Chain reaction

MSo Môi trường khoáng MS không có nitrogen

DNA Deoxyribonucleotide Acid

Taq Tag polymeraseLDC Lysine decarboxylase

PHB Poly-beta-hydroxybutyrate

DANH MỤC CÁC HÌNH

TRANG

Hình 2.1: (A) Quá trình chuyển hóa hợp chất 1 carbon ở vi

khuẩn biến dưỡng methyl; (B) Khuẩn lạc Methylobacterium

từ cỏ ba lá trên môi trường phân lập .....................................6

Hình 2.2: Phổ tương tác cố định đạm trên thực vật ...................................................10

Hình 2.3: Azospirillum brasilense bề mặt của rễ lúa .................................................11

Hình 3.1: Chu trình nhiệt của các phản ứng PCR.......................................................41

Hình 4.1: Ket quả tương tác của các chủng vi sinh vật lên

chồi thuốc lá sau 2 tuần...............................................................................................49

Hình 4.2: Sự hình thành mô sẹo ở chồi thuốc lá khi bổ sung

chủng 6027a.................................................................................................................49

Hình 4.3: Ket quả tương tác của 2 chủng vi sinh vật ON16a (A),

ON29b (B) lên chồi thuốc lá........................................................................................52

Hình 4.4: Kết quả khảo sát khả năng kích thích nảy mầm của chúng

6012a so với đối chứng sau 2 ngày.............................................................................55

Hình 4.5: Kết quả khảo sát khả năng kích hạt nảy mầm của chủng

ON20a so với đối chứng..............................................................................................57

Hình 4.6: Hình thái tế bào qua kính hiển vi vật kính 100X........................................60

Hình 4.7: Khảo sát ngưỡng nhiệt độ phát triển của vi khuẩn

6012a và vi khuẩn 6027a.............................................................................................63

Hình 4.8: Kết quả thử nghiệm sinh hóa IDS 14GNR của hai chủng

vi khuẩn........................................................................................................................66

Hình 4.9: Ket khảo sát khả năng cố định nitơ của hai chủng 6012a

và 6027a.......................................................................................................................67

Hình 4.10: Kết quả định tính PHB của chủng 6012a dưới kính hiển

vi huỳnh quang bươc sóng 460nnL................................................................................68

Hình 4.11: DNA bộ gen của các chủng vi khuẩn........................................................71

DANH MỤC CÁC sơ ĐÒ VÀ BIỂU ĐÒ•Hình 4.12: Sản phẩm PCR với cặp mồi (2F, 2R).........................................................72

Hình 4.13: Sản phẩm PCR với cặp mồi (27F, 1525R).................................................73

Hình 4.14: Sản phẩm PCR với cặp mồi (520F, 920R).................................................74

Hình 4.15: Mối quan hệ phát sinh loài của chủng 6012a với tất cả

các chủng chuẩn của các loài Methylobacterium đã và sẽ công

bố trong năm 2007 dựa trên trình tự rDNA 16S nguyên vẹn......................................76

TRANG

Sơ đồ 3.1: Quy trình thí nghiệm.............................................................................. 24

Biểu đồ 4.1: So sánh ảnh hưởng của các chủng vi sinh vật lên

chiều cao và chiều dài rễ cây thuốc lá trên môi trường MS....................................47

Biểu đồ 4.2: So sánh ảnh hưởng của các chủng vi sinh vật lên trọng

lượng tươi và trọng lượng khô cây thuốc lá trên môi trường MS...........................48

Biểu đồ 4.3: So sánh ảnh hưởng của vi sinh vật lên chiều cao và

chiều dài rễ cây thuốc lá trên môi trường MSo.......................................................51

Biểu đồ 4.4: So sánh ảnh hưởng của vi sinh vật lên trọng lượng tươi và

trọng lượng khô cây thuốc lá trên môi trường MSo................................................51

Đồ thị 4.1: Đường tương quan tuyến tính giữa giá trị OD610nm và

mật độ tế bào...........................................................................................................61

Đồ thị 4.2: Đường cong tăng trưởng của 2 chủng vi khuẩn phân lập được............61

Biểu đồ 4.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tăng trưởng của hai

chủng vi khuẩn trên môi trường dịch thể CMS sau 3 ngày nuôi cấy......................62

Biểu đồ 4.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tăng trưởng của hai chủng vi khuẩn trên môi trường dịch thể CMS sau 3 ngày nuôi

cấy.............................................................................................................................62

xii

DANH MỤC CÁC BẢNG

TRANG

Bảng 3.1: Hướng dẫn đọc kết quả ừong bộ thử nghiệm

sinh hóa IDS 14GNR..................................................................................................37

Bảng 4.1: Khảo sát khả năng tương tác thực vật của các chủng vi sinh

vật biến dưỡng methyl trên môi trường MS (Murashine & Skoog, 1962).................47

Bảng 4.2: Ket quả khảo sát khả năng kích thích sinh trưởng của các chủng

vi sinh vật trên chồi thuốc lá nuôi cấy in vitro trong môi trường MSo......................50

Bảng 4.3: Kết quả khảo sát khả năng kích thích nảy mầm của các chủng

vi sinh vật biến dưỡng methyl....................................................................................53

Bảng 4.4: Kết quả khảo sát khả năng kích thích nảy mầm của các

chủng vi sinh vật phân lập trên môi trường MSo.......................................................55

Bảng 4.5: Bảng thống kê các đặc điểm hình thái của các chủng

vi sinh vật có khả năng tương tác với thực vật...........................................................58

Bảng 4.6: Các đặc điểm hình thái cơ bản của 2 chủng vi khuẩn ...............................60

Bảng 4.7: Đặc điểm biến dưỡng carbon của hai chủng 6012a và 6027a....................64

Bảng 4.8: Bảng kết quả thử nghiệm sinh hóa IDS 14GNR và

hoạt tính Catalase.........................................................................................................66

Bảng 4.9: Bảng tổng kết các đặc điểm hình thái sinh lý sinh hóa

của 2 chủng vi khuẩn...................................................................................................69

Bảng 4.10: Nồng độ và độ tinh sạch DNA bộ gen của chủng

phân lập được ghi nhận qua máy đo Nanodrop..........................................................71

Bảng 4.11: Hệ số tương đồng di truyến của chủng 6012a với các loài

Methylobacterium sp. đã được công bố......................................................................75

Bảng 4.11: Đặc điểm hình thái của các chủng nấm men.............................................78

Bảng 4.12: Khả năng lên men đường glucose.............................................................80

Bảng 4.13: Khả năng đồng hóa nguồn carbon và đồng hóa nitrat...............................80

1

Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Từ xưa đến nay, năng suất cây trồng luôn là vấn đề quan tâm hàng đầu của mọi

nền nông nghiệp. Do đỏ đã có rất nhiều phương pháp được sử dụng nhằm cải thiện

năng suất cũng như tăng cường sức đề kháng của cây trồng với mầm bệnh trong đó

phổ biến nhất là sử dụng thuốc trừ sâu và phân bón hoá học. Tuy nhiên các biện pháp

này còn rất nhiều hạn chế như: gây ô nhiễm môi trường, thoái hoá đất và ảnh hưởng

xấu đến sức khoẻ con người. Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, các biện

pháp và xu hướng mới đã ra đời với mục tiêu xây dựng một nền nông nghiệp bền

vững, thân thiện với môi trường mà vẫn đạt năng suất cao. Bên cạnh đó, gần đây nhiều

công bố khoa học cho thấy tiềm năng sử dụng tương tác có lợi giữa vi sinh vật với cây

trồng để kích thích sinh trưởng ở thực vật, trong đó các vi sinh vật có khả năng cố định

nitrogen và biến dưỡng methyl đang thu hút được rất nhiều sự quan tâm.

Khả năng kích thích sinh trưởng thực vật của các chủng vi sinh vật này được

biết đến thông qua cơ chế cố định đạm hoặc sự sản sinh các họp chất sinh học như các

phytohormone, vitamin và cả một số loại enzyme có khả năng ức chế sự phát triển của

mầm bệnh qua đó kích thích sinh trưởng của cây chủ. Chính bởi những ưu điểm này

mà việc tìm ra các chủng vi sinh vật có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật đang

là một hướng đi đầy tiềm năng. Đặc biệt trong điều kiện nước ta là một trong những

quốc gia có đa dạng sinh học phong phú với các khu bảo tồn thiên nhiên còn hoang dã,

thì tiềm năng tìm thấy các chủng vi sinh vật có ích trên là rất lớn.

Trên những cơ sở đó, chúng tôi tiến hành đề tài:

“ Phân lập và định danh một số vỉ sinh vật có khả năng kích thích sinh

trưởng thực vật ở vườn Quốc gia Cát Tiên”.

2

1.2 Mục tiêu

> Phân lập và tuyển chọn những vi sinh vật có đặc tính tương tác thực vật để ứng

dụng trong nông nghiệp.

> Định danh để tìm kiếm các loài mới.

1.3 Yêu cầu

> Phân lập và làm thuần được một số chủng vi sinh vật có khả năng biến dưỡng

methyl và cố định nitrogen ở vườn Quốc gia Cát Tiên.

> Khảo sát để chọn lọc những vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật từ những

chủng phân lập được.

> Bước đầu định danh các chủng vi sinh vật có khả năng kích thích sinh trưởng

thực vật dựa vào các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá và sinh học phân tử.

3

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Vườn Quốc gia Cát Tiên [23]

Vườn Quốc gia Cát Tiên (VQGCT) nằm trên vùng chuyển tiếp từ cao nguyên xuống đồng bằng qua địa phận ba tỉnh:

huyện Cát Tiên, Bảo Lâm (tỉnh Lâm Đồng); Bù Đăng (tỉnh Bình Phước); Vĩnh Cửu, Tân Phú (tỉnh Đồng Nai). Chính vì thế

vườn có nhiều dạng địa hình: từ núi cao, sườn dốc, đồi nhấp nhô cho đến thềm sông bằng phẳng, nhiều thác ghềnh, suối lớn và

những vùng đầm lầy ngập nước. VQGCT cách thành phố Hồ Chí Minh 150km với tổng diện tích là 73878 ha, tài nguyên thiên

nhiên phong phú, đa dạng và là một trong những Vườn Quốc gia lớn nhất Việt Nam.

❖ Hệ thực vật

Vườn Quốc gia Các Tiên có nhiều dạng sinh cảnh: rừng nguyên sinh và thứ sinh trên đất thấp ưu thế bởi các loài thuộc

họ Dầu (Dipterocarpaceae); rừng nửa rụng lá nguyên sinh và thứ sinh ừên đất thấp ưu thế bởi các loài Lagertroemia sp. đất

ngập nước ngọt và trảng cỏ ngập nước theo mùa ưu thế bởi các loài Saccharum sp. rừng ngập lụt ưu thế bởi các loài

Hydrocarpus sp. xen lẫn Ficus benjamina và các kiểu sinh cảnh thứ sinh như rừng ừe nứa, ừảng cỏ... Hệ thực vật đã ghi nhận

1362 loài thực vật bậc cao có mạch, trong số đó có 34 loài có tên trong "Sách Đỏ" Việt Nam và nhiều loài cây gỗ có giá trị như

gõ đỏ, xoay, cẩm lai, giáng hưomg quả to

❖ Hệ động vật

Theo thống ghi nhận 77 loài thú, 318 loài chim, 58 loài bò sát, 26 loài ếch nhái, 130 loài cá. Trong số đó có các loài thú

lớn quý hiếm và một số loài có nguy cơ đe doạ tuyệt chủng toàn càu như tê giác Java, bò tót, voi Châu Á, cá sấu nước ngọt

(Crocodylus siamensis); một số loài chim đặc hữu như gà so cổ hung (Arborophila davidi), gà tiền mặt vàng (Polyplectron

germani), một số loài chim nước quý hiếm như quắm cánh xanh (Pseudibis davisoni), ngan cánh trắng (Cairina scutulata), già

đẫy nhỏ (Leptoptilos javanicus). Đối tượng bảo tồn là rừng cây họ Dầu, các hệ sinh thái đặc thù, các loài tê giác, cá sấu, bò tót,

các loài chim đặc hữu. VQGCT thực sự là kho bách khoa toàn thư sống cho công tác nghiên cứu thế giới tự nhiên

2.2 Stf lược sự tương tác giữa vỉ sinh vật và thực vật

Các vi khuẩn tương tác với thực vật rất đa dạng về giống loài và cơ chế tương tác với thực vật. Những vi khuẩn này là

một bộ phận quan trọng trong quá trình phát triển của thực vật. Mặc dù các nghiên cứu về vi khuẩn tương tác thực vật chủ yếu

4

tập trung vào các vi sinh vật gây bệnh trên thực vật và các vi sinh vật cố định nitơ. Tuy nhiên, mối quan tâm về sự đa dạng của

các vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật đã và đang gia tăng. Và thực tế trong tự nhiên có nhiều loại vi sinh vật có khả

năng kích thích sinh trưởng thực vật, nhưng chúng chỉ chiếm một tỷ lệ nhỏ trong quần thể vi sinh vật. Những vi sinh vật này có

vai trò quan trọng trong nông nghiệp hay môi trường. Những tiến bộ kỹ thuật trong sinh thái và di truyền vi sinh vật đã và đang

phát hiện ra nhiều loài vi sinh vật có ích, có tác động tích cực lên sự sinh trưởng và phát triển của thực vật. Đồng thời cũng làm

sáng tỏ các cơ chế tương tác giữa thực vật và vi sinh vật, làm nền tảng cho việc ứng dụng các vi sinh này vào cuộc sống [18].

Các vi sinh vật tương tác với thực vật không chỉ bao gồm các vi sinh vật tiền nhân (Prokaryote) mà nó còn cả các vi sinh

vật nhân thực (Eukaryote):

+ Prokaryote là thành phần chiếm đa số của hầu hết các quần thể vi sinh vật trong thực vật. Các prokaryote này, thường

là vi khuẩn có thể hiện diện với mật độ lên tới 109 tế bào trên 1 gram mô rễ. Nếu nuôi cấy chúng trên môi trường chọn lọc có

thể đạt 1010 tế bào trên 1 gram sinh khối thực vật [18].

+ Eukaryote bao gồm nấm sợi, nấm men, tảo, protozoa và các tuyến trùng thường tập trung với mật độ thấp hon các

prokaryote. Một thí dụ rõ ràng là các vi sinh vật cộng sinh hên rễ có thể đạt lượng tế bào trên 1 gram mô rễ là: 10 6-109 tế bào vi

khuẩn, 107 xạ khuẩn, 105-106 tế bào nấm men, 103 đối với tảo, 102-103 đối với protozoa. Bacteriophage và các loại virus cũng là

thành viên của quần thể này, chúng có thể tìm thấy trong đất với mật độ 108-109 tế bào trên một gram đất [6].

Vi sinh vật tưong tác thực vật có thể phân nhóm dựa vào nơi cư trú, và bản chất tác động của chúng lên thực vật.

Phân nhóm dựa vào nơi cư trú bao gồm

Các vi sinh vật biểu sinh (epiphyte): bao gồm các vsv cộng sinh ở vùng rễ (Rhizosphere) và vsv cộng sinh trên bề mặt

lá (Phyllosphere). Phần lớn các vi sinh vật biểu sinh tương tác thực vật sống bằng các chất dinh dưỡng thoát ra trên bề mặt cây.

Ví dụ vùng rễ thường tiết ra nhựa keo (dịch nhày) chứa: Hydrat polysaccharide, acid hữu cơ, vitamin, và amino acid, đó là điều

kiện tối ưu đối với một giá thể mà vi sinh vật cần cho sự sinh trưởng và phát triển. Nhựa keo được bao bọc bởi nước, và như

thế giúp làm môi trường thủy giải tốt đối với rễ và vi sinh vật vùng rễ phát triển [16].

Ở vùng lá, nguồn thức ăn cho các vi sinh vật là dịch lá tiết ra. Trong nhóm vi sinh vật vùng lá thì vi khuẩn biến dưỡng

methyl tùy ý (Pink-pigmented íacultatively methylotrophic, PPFM) chiếm tỉ lệ lớn và nó được phân bố hên nhiều loại cây.

[14]. Chúng sử dụng nguồn carbon là nguồn methanol do cây tiết ra từ quá trình phân hủy các pectin có methyl. Nhờ khả năng

sử dụng nguồn thức ăn khác thường này, PPFM có thể loại bỏ các chất độc này khỏi mô thực vật, và có chỗ cư ngụ trên lá. Các

PPFM sử dụng nguồn carbon, và các khoáng chất từ cây chủ, đồng thời tham gia vào các quá trình sinh hóa chuyển hóa quan

trọng của cây chủ [19] (Hình 2.1).

Đa số các vi sinh vật này không làm thay đối sự sinh trưởng và sinh lý của cây. Do đỗ, phần lớn vi sinh vật tương tác thực vật

có một tương tác hội sinh (commensalỉstỉ) với cây chủ.

5

methyl

(B) Khuẩn lạc Methylobacterium từ cỏ ba lá trên môi trường phân lập [20]

Các vỉ sinh vật nội sinh (endophytỉc)

Các vi sinh vật nội sinh (endophytỉc) là các vi sinh vật sống bên trong mô thực vật sống và không gây hạỉ tới cây chủ.

Chúng được phân lập từ bề mặt mô hay chiết xuất từ mô thực vật. Mặc dù, các loại nấm endophytỉc đã được nghiên cứu rộng

rẫi trong khi các vi khuẩn endophytic thì chưa, các vi khuẩn này vẫn thu hút được sự quan tâm nhờ vào tiềm năng sử dụng của

chúng trong nông nghiệp.

Các vsv nội sinh được phân lập từ nhiều loại mô và cây khỏe mạnh. Kobayashỉ và Palumbo (2000) đã biên soạn một

danh sách 55 giống và 144 loài endophytic phân lập từ rễ, thân, hoa, hạt, quả của nhiều loài thực vật [14].

2.2.1 Phân nhóm vỉ sinh vật tương tác với thực vật dựa vào bản chất của sự tương tác [16]

Theo bản chất của sự tương tác thì các vi sinh vật tương tác được chia làm 2 nhóm: nhóm vi sinh vật có lợi cho thực vật

và nhóm vi sinh vật gây bất lợi cho thực vật.

Các vi sinh có lợi chiếm ưu thế là các vi sinh vật kích thích sự sinh ở thực vật sinh trưởng. Việc tìm hiểu và xác định các

cơ chế này rất khó khăn do sự đa dạng của các cơ chế. Đối với các vi sinh vật cố định đạm, sự kích thích sinh trưởng chỉ thấy

rõ khi cây sống trên vùng đất nghèo đạm. Đen nay khả năng kích thích sinh trưởng thực vật đến nay được hiểu theo 4 con

đường chính

- Gia tăng lượng các chất dinh dưỡng ở dạng dễ sử dụng cho cây

- Sản xuất các phytohormone kích thích sinh trưởng thực vật

- Tăng cường ảnh hưởng có lợi của các tương tác cộng sinh

- Giảm tác động có hại của các mầm bệnh.

2.2.1.1 Các vi sinh vật ức chế tác hại của mầm bệnh lên thực vật: thường được tìm thấy ở các vi sinh vật nội sinh. Các vi

sinh vật nội sinh bảo vệ cây khỏi sự tấn công của các mầm bệnh bằng các cơ chế sau:

Hình 2.1: (A) Quá trình chuyển hóa hợp chất 1 carbon ờ vi sinh vật biến dưỡng

6

• Cạnh tranh về noi ở và dinh dưỡng

Các endophyte thuộc nhóm này có khả năng sinh sản rất nhanh chóng, chúng vượt qua số lượng các mầm bệnh trong cây

và ức chế sự sinh sản cũng như dinh dưỡng của mầm bệnh. Ví dụ điển hình trong trường họp này là một số loại nấm men. Sự

sinh sản bằng cách nảy chồi khiến nấm men nhân lên số lượng một cách nhanh chóng và khiến sự nảy mầm của các bào tử B.

cinerea hoàn toàn bị ức chế.

• Sự tổng hợp các loại họp chất thứ cấp

Trong nhiều nghiên cứu người ta nhận thấy các vi sinh vật nội có sự sản sinh ra các loại họp chất thứ cấp có hoạt tính của

kháng sinh do đó chúng có khả năng ức chế và tiêu diệt một số loại nấm bệnh.

Như trường họp của 2 loại kháng sinh tự nhiên do Sporothrix ýloccolosa sản xuất ra là: heptadeceonic và methyl-

hepadecenoic acid có khả năng kháng khuẩn và kháng một số loại nấm như: B. cinerea, Fusarium oxysporưm sp. Urquhart và

Punja (2002) cũng đã tinh chế một ester acid béo với hoạt tính kháng nấm từ Tiỉỉetiopsis pallescens.

• Enzyme phân hủy vách tế bào [16]

Nhiều nghiên cứu cho thấy, các vi sinh vật tương tác thực vật có khả năng sản sinh ra các loại enzyme phân hủy thành

lysis của tế bào các loại mầm bệnh như : enzyme chitinase, P-l ,3-glucanase...

Một số loại nấm men như Pichia anomala, p. membranifaciens,R. glutinis, c. laurentii, A. pullulans, Tilletiopsis

albescens, tạo P-l,3-glucanase chống lại các loại nấm gây bệnh trên lá và trên quả như : A. niger, Sphaerotheca ýuliginea, p.

xanthii (Urquhart, 1994; Castoria, 1997; Jijakli và Lepoivre 1998; Castoria và cộng sự , 2001; MasihvàPaul 2002). Trong công

trình của Madhaiyan và cộng sự (2004) cũng đã chứng tỏ mối tương quan giữa khả năng kháng bệnh của cây lúa khi xử lý với

vi khuẩn Methylobactreium sp. và sự gia tăng polyphenol oxidase trong cây [16].

• Kích thích phản ứng phòng vệ ở cây chủ

Sự cảm ứng này liên quan đến việc sản xuất một số họp chất như phenylalanine ammonia lyase phytoalexin, peroxidase

và ethylene trong mô tế vào thực vật.

2.2.1.2 Vi sinh vật gia tăng dinh dưỡng cho cây [16]

Khả năng cố định nitơ (biến đổi nitơ thành amonia) chủ yếu giới hạn trong giới prokaryotes nhưng đa dạng giữa các

giống vi khuẩn. Nằm trong số gần 100 loại cố định nitơ (diazotrophic), chỉ có một vài loại có tính chuyên biệt cao, các tương

tác mật thiết có thế tạo một cơ quan mới hay một cơ quan có cấu trúc giống với cơ quan của cây chủ. Tương tác đạt cực đại khi

chúng chuyển sang cố định nitơ cho cây chủ, theo đó cung cấp một lượng dinh dưỡng cho cây chủ. Ngược lại cây chủ cũng

giúp bảo vệ vi khuẩn khỏi điều kiện môi trường và cung cấp các họp chất giàu năng lượng cho hoạt động cố định nitơ. Các vi

sinh vật cố định đạm bao gồm vi khuẩn cộng sinh trên cây họ đậu, các vi sinh vật tự do cố định đạm, các vi khuẩn lam...

7

Vi khuẩn cộng sinh trên cây họ đậu❖

Nghiên cứu điển hình nhất về tương tác cộng sinh giữa vi khuẩn và thực vật là tương tác giữa vi khuẩn tạo nốt sàn trên rễ

và các cây họ đậu. Các cây thuộc họ này bao gồm: đậu hòa lan, đậu nành, đậu lăng và cỏ linh lăng cũng như các loại cỏ trinh

nữ, cây keo...

Ngày nay, các nghiên cứu cho thấy vi khuẩn cộng sinh được phân loại thành vài giống, và các loài chuyên biệt nhất thuộc

giống Rhizobium, Sinorhizobiu, Mesorhizobiưm, Bradyrhizobium.

Hầu hết các vi khuẩn cộng sinh trên cây họ đậu đều tạo ra nốt sần trên rễ (các nốt sần này là những tín hiệu cho thấy có

sự tương tác giữa vi khuẩn và cây trồng). Yà trong sự đáp ứng này, có sự sản xuất các phân tử tín hiệu lipochitooligosaccharide

thường được gọi là các nhân tố Nod. Các nhân tố Nod khiến các sợi rễ xoắn lại, hạn chế sự thủy phân của thành tế bào bên

trong các nốt xoắn, sự lõm vào của màng plasma, sự lắng đọng của vật liệu tạo vách tế bào mới tạo ra dòng xâm nhiễm. Chúng

giữ vai trò như một đường ngõ đi vào mô cây. Vi khuẩn phân chia bên trong các dòng này khi chúng phát triển xuyên qua

nhiều lớp vỏ tế bào trong rễ. Một số loài vi khuẩn cộng sinh cây họ đậu khác lại xâm nhập vào cây thông qua các lỗ hổng ở

biểu bi và di chuyển xuống vùng gian bào của rễ, có hoặc không có sự hình thành các dòng xâm nhiễm.Ở một vài loài cây chủ như là cỏ linh lăng và đậu hà lan, vi khuẩn gây ra sự phân chia trực phân bên trong vỏ tế bào và gây nên các nốt sần bất định (các nốt sần này tiếp tục kéo dài phụ thuộc vào sự liên tục của mô phân sinh ở đỉnh); ở các cây chủ khác như đậu nành, vi khuẩn gây ra sự phân chia trực phân của vùng bên ngoài lớp vỏ tế bào và dẫn đến sự hình thành nốt sần bất định. Ở hai trong số 3 phân họ cây họ đậu (Mimosoideae và Papilionoideae), vi khuẩn di chuyển từ dòng xâm nhiễm vào trong tế bào chất của tế bào cây chủ bằng cơ chế nhập bào (endocytosis). Nó cho phép vi khuẩn được bao bọc bởi màng tế bào thực vật. Các vi khuẩn ở trong vùng gian bào và nội bào này được gọi là các bacteroid, phân chia cho đến khi chúng chiếm đầy tế bào cây chủ và phân hóa thành dạng giàu nitrogenase, enzym

8

e

quan trọng để cố định nitơ. Trong phân họ Caesaỉpinoideae, các vi khuẩn không rời

khỏi trong dòng xâm nhiễm thay vào đó, các dòng xâm nhiễm phân nhánh cho đến khi nó

chiếm đày tế bào chủ. Sự cố định nitơ chỉ xảy ra khi nồng độ oxi tự do trong nốt sần đủ

thấp để cho phép kích hoạt enzyme nitrogenase. Protein liên kết oxy leghemoglobin ở

thực vật (có chức năng liên quan tới hemoglobin, giữ vai trò lảm giảm luợng oxy khi xử

dụng oxy để hô hấp).

Ngoài ra còn có các các sinh vật nội bào cố định đạm không hình thành nốt sần

(diazotrophic endophyte) đã được phân lập từ một số loại cây thân thảo như: bắp, lúa, mía

đường, lúa mì...ví dụ điển hình về vi khuẩn nội bào cố định đạm là Gluconacetobacter

diazotrophicus (trước đây là Acetobacter diazotrophicus), Herbaspirillum spp ở cây mía,

Alcaligenes, Azospirillum, Bacillus, Enterobacter, , Klebsiella, Pseudomonas và

Rhizobium trên lúa và bắp (James, 2000). Khi chủng các loại vi khuẩn nay lên rễ, chúng

sẽ xâm nhiễm vào rễ và nhiều khi là vào hệ thống mô mạch tạo thành các quần thể vi sinh

vật trong vùng gian bào và có thể đạt nồng độ 101- 107 tế bào trên 1 gram trọng lượng tươi

[16].

Vi sinh vật tự do cố định nittf❖

Đây là các loại vi khuẩn tương tác thực vật cố định đạm nhưng không xâm nhập vào

một loại cây chủ theo hướng cộng sinh chuyên biệt.

1. Vi sinh vật cộng sinh cư trú ở vùng gian bào

(Endosymbionts)

Ví dụ: vi khuẩn cộng sinh gây nốt sần

trên rễ cây họ đậu

2. Vi sinh vật cư trú ở vùng ngoại bào

(Ectosymbionts)

Ví dụ: tương tác giữa vi khuẩn lam và

một số loài thực vật

bậc thấp

3. Vi sinh vật bên trong mô cây chủ (Endophytes)

Ví dụ: Herbaspirillum sp. ở cây mía

đường

Sự giatăng độ

mậtthiết của

cáctương

tác

9

4. Vi sinh vật chỉ sống trên bề mặt cây

Ví dụ: Azospirillum và Klebsiella

10

Hình 2.2: Phổ tương tác cố địnhđạm trên thực vật [16].

] Hầu hết các prokaryote cố định nitrogene sống trạng thái tự do. Sự cố định nitrogen ở

vùng rễ phổ biến hom do việc cố định nitrogen cần năng lượng lớn, và vùng rễ cây là vùng

giàu carbohydrate.

Các loài Azospirillum là những loài cố định nitrogen đầu tiên được phân lập từ rễ cây

và nó có các đặc tính tốt nhất của các loài sinh vật cố định đạm tưcmg tác thực vật. Không

giống các sinh vật nội sinh cố định đạm như Gluconacetobacter diazotrophicus và

Herbaspirillum sp. (nội sinh bắt buộc), Azospirillum sp. là nhóm nội sinh không bắt buộc.

Chúng vừa sống được cả nội sinh và trên vùng rễ.

Hình 2.3. Azospirillum brasilense bề mặtcủa rễ lúa [201

Bên cạnh nitrogen thì phosphate là loại dinh dưỡng khoáng thứ hai ảnh hưởng nhiều

lên sinh trưởng của cây. Lượng phosphate trong đất rất dồi dào nhưng phần lớn đều ở dạng

chưa hòa tan. Nhiều loài vi sinh vật rễ có thể hòa tan các phosphate vô cơ bằng cách tiết ra

các acid hữu cơ, như gluconic acid và 2-ketogluconic acid, hay có thể khoáng hóa

phosphate vô cơ bằng cách tiết enzyme ngoại bào phosphatases. Một số loài vi khuẩn khác

sản xuất các hcrp chất hữu cơ (gọi là siderophore) các chất này kết họp với Fe3+, khiến nó

dễ chuyển đổi thành dạng dễ sử dụng hơn (Fe2+) [16].

11

2.2.2 Vi khuẩn sản xuất các chất kích thích lên sự sinh trưởng ở thực vật.

2.2.2.1 Enzymes:

Một số nghiên cứu cho thấy có sự tổng hợp ACC deaminase (1- aminocyclopropane-

l-carboxylate deaminase) từ các vi khuẩn kích thích sinh truởng thục vật ở vùng rễ (Li và

ctv., 2000) nhu: Methylobacterium sp., Alcaligenes spp. Bacillus pumilus, Enterbacer

cloacae, burkholderia cepacia, Pseudomonas putida, Pseudomonas spp.và

Variovoraxparadoxus [19]. Cơ chế này đuợc lý giải là do ACC có khả năng làm giảm

ethylen trong rễ (mà ethelen này ức chế sụ sinh truởng của rễ) do đó kích thích rễ phát

triển.

2.2.2.2 Phytohormone:

Tác động kích thích lên sinh truởng thục vật thuờng là do sụ sản xuất các

phytohormone. Phytohormone phổ biến nhất là auxin indole-3-acetic acid (IAA). đã có

nhiều nghiên cứu về sụ sản xuất auxin này ở các loài vi khuẩn nhu: Azospirillum

brasilense, Aeromonas veronii, Agrobacterium sp., Alcaligenes piechaudii, Bradyrhizobium

spp., Comamonas acidovorans, Enterobacter sp., và Rhizobium legưminosarưm [19]. Tuy

nhiên có rất ít các vi sinh vật có khả năng tổng hợp IAA để kích thích sụ sinh truởng ở thực

vật. Chúng thuờng là các vi khuẩn gây bệnh nhu Argobacterium tumeýaciens, A.

rhizogenes và p. syringae pv.

Một số quan sát cho thấy rằng vi khuẩn Methylobacterium sống cộng sinh trên thục

vật mà không gây bệnh cho cây chủ, nguợc lại chúng còn có khả năng hỗ trợ cây chủ phát

triển rất tốt. Holland và Polacco (1994) đã nghiên cứu về Methylobacterium, cytokinin và

sụ phát triển của thục vật bằng cách đun hạt đậu nành (50°c trong 4 giờ) để giảm khả năng

nảy mầm xuống khoảng 30%. Khi đó mật độ PPFM nhiễm ở hạt cũng đồng thời giảm

xuống 90%. Việc bổ sung cytokinin (benzyl adenine + zeatin 0,5 mg/1) vào các hạt này có

tác dụng phục hồi tỉ lệ nảy mầm. Bổ sung PPFM vào môi trường hạt nảy mầm cũng có tác

dụng tuơng tụ nhu tác dụng của cytokinin [10]. Ket quả này phù hợp với giả thuyết cho

rằng PPFM ảnh huởng đến luợng cytokinin có trong mô tế bào thục vật.

Koenig và cộng sự (2002), nghiên cứu về mối liên hệ giữa Methylobacterium sp. và

thực vật ở mức phân tử. Họ chứng minh bốn loài Methylobacterium sp. phân lập từ lá và

12

loài M. extorquens đều tạo ra cytokinin là trans-zeatin ở mức rất thấp và tiết vào môi

truờng nuôi cấy [15].

Tuy nhiên, kết quả của Koenig và cộng sụ đã cung cấp bằng chứng về cơ chế tổng

họp cytokinin ở các chủng Methyỉobacterium, là tiền đề cho các nghiên cứu về mối quan hệ

giữa Methyỉobacterium và thục vật. Hơn nữa, bằng chứng về một vi khuẩn hội sinh tạo

phytohormone đã đua đến cái nhìn thấu đáo hơn về vai trò của vi khuẩn Methylobacterium

sp. với thục vật.

Kết quả: Methylobacterium sp. có khả năng tổng họp cytokinin phù họp với những

khám phá khác và một số dinh duỡng methyl khác (nhu Methylomonas methanica,

Methylovorus may) có khả năng tổng họp cytokinin [7]. Hơn thế nữa, Joshi lagmoha và

Holland (2001) đã đua ra giải pháp tăng năng suất bằng cách phun PPFM lên cây trồng

[21].

Bên cạnh đó năm 2004, Omer và cộng sụ đã khảo sát sự hiện diện của IAA trong môi

truờng chứa dịch nuôi cấy vi khuẩn biến duỡng methyl. Qua đó, phát hiện thấy có 3 trong

16 chủng phân lập có phản ứng duơng tính với với thuốc thử Salkowski. Điều này đuợc

chứng minh rõ hơn bằng phuơng pháp sắc lý lỏng cao áp (HPLC) kết họp với phân tích phổ

NMR (nuclear Mangnetic Radiation: cộng huởng từ hạt nhân). Ba chủng tạo ra IAA có

hàm luợng phytohormone từ 6 - 13,3 mg/1 nếu bổ sung L-tryptophan (L-TRP). Khi không

bổ sung L-TRP thì nồng độ IAA tạo ra chỉ từ 1.1-2,4 mg/1 [17], [9].

Các kết quả này đã gây đuợc sụ chú ý lớn. Agricell Report nhấn mạnh: “Việc khảo

sát về khả năng vi khuẩn dinh duỡng methyl kích thích tăng truởng và phát sinh hình thái

thục vật trong điều kiện in vitro là rất lý thú và mang lại rất nhiều triển vọng”.

Hy vọng rằng các nghiên cứu về mặt sinh lý, sinh hoá và cơ chế phân tử của vi khuẩn

dinh duỡng methyl tuơng tác với thục vật sẽ đem lại những hiểu biết hơn về nguyên lý của

mối quan hệ này đồng thời mở ra hướng ứng dụng mới của công nghệ sinh học trong nông

nghiệp ở điều kiện in vitro và in vivo.

2.3 Các phu'0'ng pháp định danh vi sinh vật

Từ lâu thì việc định danh vi sinh vật cần phải khảo sát các đặc điểm hình thái và các

đặc điểm sinh 11, sinh hóa của vi sinh vật. Đồng thời, phưomg pháp sinh học phân tử giải

13

ừình tự đoạn gen đặc trưng của vi sinh vật cũng được tiến hành để cho kết quả nhanh

chóng và chính xác.

2.3.1 Phương pháp truyền thống

Việc phân loại vi khuẩn được thực hiện đầu tiên vào năm 1987, khi Ferdinad Cohn

phân nhóm vi khuẩn dựa vào hình dạng tế bào. Mặc dù phưomg pháp phân loại dựa vào

hình thái sớm cho thấy không có hiệu quả trong phân loại, nhưng hình thái và đặc điểm cấu

trúc hiển vi vẫn có vai ừò quan trọng trong định danh vi sinh vật, đặc biệt là trong việc định

danh các chủng mới [1].

Phưomg pháp truyền thống để định danh vi sinh vật thường dựa vào các chỉ tiêu phân

loại như: đặc điểm hình thái, sinh lý, đặc điểm biến dưỡng năng lượng. Trong đó các thử

nghiệm để xác định các đặc điểm sinh lý, sinh hóa là các chỉ tiêu quan trọng nhất [22].

Sữ dụng khóa phân loại❖

Thông thường để định danh các loài vi khuẩn mục tiêu theo phưomg thức truyền

thống, người ta thường dựa vào các khóa phân loại, trong đó khóa phân loại Prokaryote đày

đủ nhất, được sử dụng rộng rãi là khóa phân loại Bergey (Bergey ’s Manual of Systematic

Bacteriology) [3].

Riêng đối với nấm men việc định danh theo phưomg thức truyền thống rất phức tạp.

Từ trước đến nay có rất nhiều khóa phân loại nấm men của nhiều tác giả khác nhau.

Hansen là người đưa ra khóa phân loại nấm men đầu tiên. Trong khóa phân loại này,

Hansen chia nấm men thành 8 giống. Sau Hansen, Klocker (1907), Guilliermond (1920)

cũng đã tiến hành chỉnh sữa khóa phân loại của Hansen, nhưng chưa được hoàn thiện [2].

Đen năm 1952, J. Lodder và Kreger-van rij đã tổng kết lại một cách khá hoàn thiện

vấn đề phân loại nấm men và xuất bản một tài liệu rất có giá trị (J. Lodder and

N.J.W.Kreger-Van Rij, 1952, the yeast, a taxonomic study, North Holland, Pub Co.

Amsterdam), được xuất bản lần thứ hai năm 1957. Năm 1970, J. Lodder bổ sung sửa chữa

lại và in tái bản làn thứ nhất năm 1970, lần thứ hai 1971. Đây là tài liệu phân loại nấm men

rất có giá trị và và là khóa phân loại thông dụng nhất hiện nay trên thế giới. Hệ thống phân

loại này dựa trên kiểu phân chia tế bào, hình thái bào tử nang và đã xác định 349 loài nấm

men thuộc 39 chi khác nhau [2].

14

❖ Sử dụng phương pháp số học

Ngoài ra, dựa vào những thông tin về đặc điểm của vi sinh vật, người ta còn có thể

tính hệ số tương đồng để đánh giá mức độ tương đồng giữa các chủng vi sinh vật. Trong đó

hệ số laccard được sử dụng để so sánh mức độ tương đồng giữa hai chủng khi muốn bỏ qua

các đặc điểm mà cả hai chủng đều thiếu [1].

2.3.2 Phương pháp hiện đại

❖ Giới thiệu

Ngày nay, sự phát triển của các kỹ thuật sinh học hiện đại đã đưa việc phân loại, định

danh vi sinh vật lên một bước phát triển mới. Phương pháp hiện đại trong định danh vi sinh

vật dựa trên vật liệu di truyền có thể cho kết quả chính xác trong một thời gian ngắn. Tuy

nhiên, phương pháp phân loại hiện đại này đòi hỏi phải có trang thiết bị hiện đại và hóa

chất đắt tiền [3].

Năm 1967, Zucker Kank và Pauling đã cho rằng các phân tử sinh học có thể là “tài

liệu của lịch sử tiến hóa”, là “thước đo tiến hóa”.

Phân tử rRNA 16S ở prokaryote và 18S ở eukaryote (riêng nấm men thì trình tự đoạn

D1/D2 26s rRNA và vùng ITS 5.8S rRNA được sử dụng phổ biến để xây dựng cây phát

sinh chủng loài) là một công cụ hữu ích trong phân loại và định danh vi sinh vật. Ngoài đặc

điểm là hiện diện trong tất cả các sinh vật, có chức năng không đổi, phân tử rRNA 16S còn

có ưu điểm là có nhiều bản sao trong tế bào, có tính bảo tồn cao nhưng vẫn có những vùng

trình tự khác biệt giữa các loài và trình tự đặc trưng từng nhóm vi sinh vật; đặc biệt là thích

họp với mục tiêu phân loại nhờ có kích thước vừa phải (khoảng 1500 ribonucleotide),

thuận tiện cho việc giải trình tự[l].

Phưomg pháp hiện đại dùng đế định danh vi sinh vật bên cạnh việc dựa vào trình tự

rRNA, các trình tự rDNA (trình tự mã hóa cho rRNA) cũng thường được sử dụng, vì DNA

là vật liệu dễ thu nhận và có tính bền cao hom RNA.

Một số phưomg pháp phân loại dựa vào vật liệu di truyền đang được sử dụng hiện

nay:

*l* Sử dụng mẫu dò kết họp vói phưong pháp lai ỉn-stíu phát huỳnh quang

(Fluorescence ỉn-sừu Hybridazation - FISH)

15

Mẩu dò là một trình tự acid nucleic, thường là một đoạn mạch đom của acid nucleic

(DNA) được gắn với một nhân tố nhận biết là phóng xạ hay chất phát huỳnh quang, dùng

đế nhận biết trình tự nucleotide đặc trưng (trình tự nhận diện) của một chủng vi sinh vật đã

biết trước.

Phân tích dữ liệu các trình tự ssu rRNA (Small Subunit rRNA) đã biết sẽ cho phép

xác định các trình tự nhận diện chuyên biệt cho từng giới. Một số trình tự nhận diện cho

một nhóm chuyên biệt chuyên biệt trong giới, thậm chí một giống, một loài cũng đã được

xác định. Trong tương lai, nhiều trình tự tương tự được xác định và sẽ rất hữu dụng trong

việc nhận diện, định danh một vi sinh vật mới.

Các trình tự nhận diện chuyên biệt cho vi khuẩn có thể được tổng họp, đánh dấu bằng

chất phát huỳnh quang và dùng để phát hiện chuyên biệt các giới này. Các mẫu dò này

được gọi là “mẫu dò phát sinh chủng loại” (phylogenic prode).

Bằng việc xử lý mẫu chứa vi sinh vật bằng một tác nhân thích họp làm tăng tính

thấm của màng, cho phép mẫu dò vào bên trong tế bào, thực hiện phương pháp lai phân tử

{lai in-situ, tức là lai trực tiếp trên tế bào mẫu), và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang,

người ta có thể xác định trực tiếp chủng thuần thuộc giới nào hay quần xã vi sinh vật hiện

diện trong một mẫu tự nhiên gồm những giới nào. Kỹ thuật lai và phát hiện này được gọi là

phương pháp lai in-situ huỳnh quang (FISH). Phương pháp này được sử dụng rộng rãi

trong nghiên cứu sinh thái học vi sinh vật.

*l* Phương pháp lai nucleic acid [4]

Thành phần base của DNA chỉ có tác dụng chứng minh các vi khuẩn là không có liên

hệ với nhau. Tỷ lệ các base trong DNA có thể thay đổi trong phạm vi rất rộng. Nếu hai vi

sinh vật có thảnh phần base khác nhau thì chúng không có liên hệ với nhau. Tuy nhiên, hai

vi khuẩn có cùng thảnh phần base chưa hẳn là có quan hệ với nhau do trình tự base có thể

khác nhau. Việc lai giữa các DNA của hai vi khuẩn cho phép định danh một loài mới hoặc

xác định mối quan hệ đến mức giống và loài giữa hai vi khuẩn.

Để xác định mối quan hệ giữa các chủng, thông thường người ta so sánh phần trăm

lai (DNA-DNA) giữa chủng cần khảo sát với một chủng đã biết (chủng chuẩn). DNA từ

chủng chuẩn được ly trích, tinh chế, đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ, phân đoạn thành

16

những đoạn ngắn có chiều dài ngẫu nhiên, đun nóng để tách mạch. DNA từ các chủng được

khảo sát cũng được chuẩn bị tưomg tự nhưng không được đánh dấu. Tiến hành lai mẫu

DNA chủng chuẩn với nhau (đối chứng). Sau đó tuần tự lai DNA chủng chuẩn với DNA

chủng cần khảo sát. Thu lấy DNA mạch kép (có lai), loại bỏ DNA mạch đom. Đo năng

lượng phóng xạ của trường họp đối chứng. Lượng này được xem là tưomg đưomg 100%

lai. Tưcmg tự tính năng lượng phóng xạ thu được từ các trường họp lai giữa chủng chuẩn

với chủng được khảo sát. Tính phàn trăm lai.

Từ số liệu về mức độ lai có thể xác định mối tưcmg quan giữa các chủng như

sau:

Trên 70% lai: 2 chủng cùng loài (khác chủng)

Trên 20% lai: 2 chủng cùng giống (khác loài)

Dưới 10% lai: 2 chủng khác giống

Lai nucleic acid dựa vào nguyên tắc bố sung giữa các base A-T và G-C. Các đoạn

polynuclotide đom có nguồn gốc khác nhau nhưng có cấu trúc bổ sung với nhau thì chúng

có thể bắt cặp với nhau tạo ra phân tử lai.

Một số phương pháp lai nucleic acid thường được sử dụng:

Phương pháp lai Southern Blot

Kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (Rectriction Fragment Length

polymorphism - RFLP) hay phưomg pháp dấu vân tay (Finger Printing)

Phuomg pháp lai Northern Blot

❖ Khuếch đại trình tự đặc hiệu nhờ phương pháp PCR (Polymerase Chain

Reaction) [12], [17]

Trước khi giải trình tự đoạn gen mong muốn, thì ta cần khuếch đại chúng bằng

phương pháp PCR. PCR là một phương pháp in vitro để tổng họp DNA từ mạch khuôn là

một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành

hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi đặc hiệu cho

đoạn DNA này. Kỹ thuật này do Karl Mullis và ctv (Mỹ) phát minh năm 1985. Hiện nay,

kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi để phát hiện, tạo ra các đột biến gen, chuẩn đoán bệnh,

phát hiện các mầm bệnh vi sinh vật có trong thực phẩm.

17

Tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi chuyên biệt để tổng họp một mạch

DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gen (gọi là trình tự

DNA mục tiêu) đặc trưng cho loài vi sinh vật mục tiêu hoặc gen quy định việc tổng họp

một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật này. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng

bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase, đoạn

mồi này được nối dài để hình thành mạch mới. Khi có sự hiện diện của hai mồi chuyên biệt

bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA trong phản ứng PCR, ở điều kiện đảm

bảo hoạt động của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được khuếch đại

thành một số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethibium

bromide.

Kỹ thuật PCR được coi là nền tảng của nhiều kỹ thuật phân tích DNA.

❖ Giải trình tự các gen mã hóa cho tiểu phần rRNA 16S

Muốn nghhiên cứu trình tự các nucleotide của một gen, một đoạn DNA, hoặc cả phân

đoạn DNA cần phải tiến hành giải trình tự. Một số phương pháp giải trình tự thường dùng

hiện nay:

Phương pháp hóa học (Phương pháp Maxam và Gilbert, 1977): Các đoạn DNA

được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ ở dầu 5’, và được xử lý bằng các chất hóa học nhằm

bẻ gãy các đoạn DNA tại các vị trí các base khác nhau.

Phương pháp dideoxy (Phương pháp Sanger,1977): dựa trên hoạt động của enzyme

DNA Polymerase xúc tác phản ứng kéo dài chuỗi polynucleotide, và dừng lại khi gặp các

dideoxynucleotide (ddNTP).

Giải trình tự DNA tự động'. Dựa vào sự phát tín hiệu huỳnh quang từ những dNTP

được đánh dấu. Ngoài ra, gần đây hai kỹ thuật mới được thiết lập cũng được sử dụng để

định danh vi sinh vật dựa trên vật liệu di truyền là Ribotyping và FAME (Fatty Acid

Methyl Ester):

❖ Kỹ thuật Rỉbotyping

Kỹ thuật này cũng phân tích ssu rRNA (nhưng không giải trình tự) giúp định danh vi sinh

vật đến mức loài, dựa trên sự sai khác trong trình tự nhận diện của các enzyme cắt giới hạn.

Gen mã hóa cho ssu rRNA được khuếch đại bằng PCR, cắt bằng một hoặc vài enzyme cắt

18

giới hạn, tách bằng điện di và lai bằng các mẫu dò. Các vạch lai là chuyên biệt cho từng

loài và chủng vi sinh vật, được đưa vào cơ sở dữ liệu và được sử dụng như là các mã vạch

để định danh vi sinh vật [].

❖ Kỹ thuật Fame (Fatty Acid Methyl Ester)

Kỹ thuật này dựa trên tính chuyên biệt về chủng loại và thành phàn các acid béo hiện diện

ừong màng tế bào vi khuẩn. Tính chuyên biệt này là do sự đa dạng về chiều dài mạch,

nhóm thế, vòng, hydroxyl, độ không bão hòa,.. .của acid béo trong màng. Việc phân tích

dẫn xuất methyl ester của các acid béo này ngày càng được dùng rộng rãi trong chuẩn đoán

bệnh, dịch tễ học, xét nghiệm vi sinh vật trong nước, thực phẩm... [4]

Chương 3

VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thòi gian và địa điểm

Thời gian tiến hành thí nghiệm từ ngày 03/2007 đến ngày 08/2007 Tất cả các thí

nghiệm được thực hiện tại Trại thực nghiệm Sinh học và Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh

học Phân tử, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia thành

phố Hồ Chí Minh.

3.2 Vật liệu

3.2.1 Mầu thí nghiệm

Nguồn mẫu để phân lập vi sinh vật (VSV) kích thích tăng trưởng ở thực vật là mẫu

lá, mẫu đất, mẫu nước tại Vườn quốc gia Cát Tiên thuộc địa phận huyện Tân Phú, Tỉnh

Đồng Nai vào tháng 4 năm 2007.

Chủng vi khuẩn chuẩn Methylobacteriưm extorquen JCM 2802T từ ngân hàng vi sinh

vật Nhật Bản.

E. coli DH5a từ Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Phân tử, Trường Đại học

Khoa học Tự nhiên. Đại học Quốc Gia Tp. HCM.

Cây thuốc lá (.Nicotiana tabacum L. cv Samsun) lấy từ Trại thực nghiệm Sinh học,

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.HCM, cơ sở Linh Trung-Thủ Đức, sử dụng để khảo

19

sát hoạt tính kích thích sự tăng trưởng thực vật của chủng vsv phân lập được trong điều

kiện nuôi cấy in vitro.

Hạt đậu xanh (Vigna radiata L., công ty cổ phần giống cây trồng miền Nam - 282, Lê

Văn Sĩ, Q.Tân Bình, Tp.HCM), được sử dụng để khảo sát khả năng nảy mầm của hạt.

3.2.2 Thiết bị dụng cụ

> Bể ổn nhiệt (Fisfer Scientiíĩc)

> Bộ điện di ngang Mupid-EX (advance)

> Cân phân tích

> Eppendoií, micropippette, microplate (Nikko)

> Hộp soi đèn tử ngoại uv (Vilber Lourmat)

> Kính hiển vi

> Máy đo quang phổ (Gene Quantpro)

> Máy lắc tròn

> Máy ly tâm Miko 22R (Hettich Zantrifugen)

> Lò Microwave

> Nồi hấp vô trùng autoclave

> Tủ ấm Prolabo

> Tủ cấy vô trùng

> Kính hiến vi huỳnh quang (Olympus)

Và một số dụng cụ cơ bản khác của phòng thí nghiệm sinh phân tử, vi sinh, nuôi cấy

mô thực vật.

3.2.3 Hóa chất

3.2.3.1 Môi trường phân lập và làm thuần vỉ sinh vật biến dưỡng methyl MMS.

Môi trường muối khoáng MS chưa có Methanol (Phụ lục 1) sau khi hấp vô trùng ở

nhiệt độ 121°c, áp suất 1 atm, để nguội và bổ sung thêm 1% Methanol.

Đối với môi trường MMS rắn thì bổ sung thêm Agar 20g/l trước khi hấp vô trùng.

Môi trường MMS không bổ sung vitamine hay các yếu tố tăng trưởng khác

3.2.3.2 Môi trường chọn lọc vỉ sinh vật cố định nittf (MSo)

Môi trường khoáng MS trong đó loại bỏ một số thành phần khoáng chứa nitrogen.

20

Khoáng MS đã được thay thế (Phụ lục 1)

Đường 30g/l

Đối với môi trường rắn thì bổ sung thêm Agar 20g/l trước khi hấp vô trùng ở 121°c,

áp suất 1 atm.

3.2.3.3 Môi trường nhân sinh khối vi khuẩn (CMS)

Môi trường khoáng MS - Murashine & Skoog, 1962 (Phụ lục 3) bổ sung thêm:

Đường sucrose...................................................................30g/l

Glycine..............................................................................2mg/l

Meo-inositol......................................................................100mg/l

Vitamine BI.......................................................................100ml/l

Cao thịt..............................................................................2g/l

Casein hydrolyase..............................................................2g/l

Nước cất............................................................................vừa đủ 1L

3.2.3.4 Các môi trường khác

❖ Môi trường khảo sát khả năng sử dụng nguồn carbon của các chủng vỉ sinh vật

phân lập được

Môi trường dịch thể MMS trong đó Methanol được thay thế bằng 1% các chất cung

cấp nguồn carbon và bổ sung thêm chất chỉ thị pH là bromothymol blue với nồng độ cuối

là 0,04%.

Các chất cung cấp nguồn carbon bao gồm: acetate, betain, citrate, D-glucose,

dimethylamine, ethanol, íructose, lactose, L-Abrabinose, L-glutamate, maltose,

methylamine, nitrate, sebacate, sucrose, trimethylamine, Nutrient agar.

❖ Môi trường YM broth

Quan sát hình thái nấm men

Yeast Extract......................................................................3,0g

Malt Extract.......................................................................3,0g

Peptone..............................................................................5,0g

Glucose..............................................................................10,Og

Nước cất............................................................................vừa đủ 1L

21

❖ Môi trường acetate agar

Quan sát bào tử nấm men

CH3COONa .......................................................................200g

Agar...................................................................................20g

Nước cất.............................................................................vừa đủ 1L

❖ Môi trường lên men đường

Glucose..............................................................................lOg

Pepton................................................................................lOg

NaCll..................................................................................lg

Meat extract.......................................................................lg

Chất chỉ thị pH Bromothymol Blue...................................0,018g/l

Nước Cất............................................................................vừa đủ 1L

❖ Môi trường đồng hóa nitrogen

Khảo sát khả năng đồng hóa nitrate

Bacto Yeast Cacbon base ..................................................117g/l

Bổ sung thêm KNO3 (0,78%)

Nguồn Nitrogen được lọc vô trùng

❖ Một số hóa chất khác

Bộ kit nhuộm gram của hãng MERK (Đức)

Bộ kit 14 thử nghiệm sinh hóa dùng để định danh trực khuẩn Gram âm của công ty

Nam Khoa

KOH 3% dùng để thử nghiệm String H202 30%

dùng trong thử nghiệm Catalase Glycerol để giữ

giống vi sinh vật

Các hóa chất dùng trong nghiên cứu về sinh học phân tử như: dung dịch CTAB 2X,

TE 0.1X, TAE 2X, Phenol:Chloroform (1:1), DEPC-H20, Tag DNA Polymerase, dNTP,

Buffer 10X,...3.3 Phư<mg pháp thí nghiệm

Phương pháp thực hiện được trình bài dưới bảng sau:

22

Sơ đồ 3.1: Qui trình thí nghiệm.

3.3.1 Phân lập và làm thuần

Vi sinh vật hiện diện trong tự nhiên ở các dạng quần xã gồm nhiều quần thể. Việc

nghiên cứu một quần thể vsv nhất định (tập họp các tế bào cùng loài) sẽ phụ

thuộc nhiều vào khả năng phân lập, làm thuần tế bào của quần thể, khả năng giữ giống

dùng cho các nghiên cứu tiếp theo. Hầu hết các nghiên cứu đều thực hiện trên chủng

thuần.

Phần lớn các phương pháp phân lập và làm thuần các chủng vsv đều dựa trên

23

một số kỹ thuật pha loãng kết họp với điều kiện nuôi cấy chọn lọc tạo ưu thế cho chủng

quan tâm. Theo Green P.N. (1992), Methylobacterium sp. là những vi khuẩn có khả

năng sử dụng Methanol làm nguồn carbon và năng lượng, vì thế môi trường MMS

(Methanol Minerol Salts) là môi trường thích họp để phân lập và làm thuần các chủng

vsv có khả năng sử dụng methanol.

Tuy nhiên, môi trường MMS chưa bổ sung Methanol có thành phần gần giống

với môi trường MS (Murashine & Skoog, 1962), vì vậy có thể sử dụng luôn môi trường

MS (Murashine & Skoog, 1962) bổ sung thêm 1% Methanol làm môi trường phân lập

và làm thuần vsv.Mặc khác các chủng vi sinh vật có khả năng cố định nitơ chúng tôi sử dụng môi

trường MS (Murashine & Skoog, 1962) nhưng loại bỏ các thành phần có chứa nitơ

(MSo).

3.3.1.1 Lấy mẫu và tăng sinh mẫu:

Các mẫu đất, nước, lá lấy từ khu vực rừng Bầu sấu thuộc vườn Quốc gia Cát

Tiên.

Mầu nước có thể trải trực tiếp trên môi trường MMS và MSo

Còn đối với mẫu đất và mẫu lá, tiến hành tăng sinh trên môi trường MMS, và

MSo lỏng lắc 100 vòng/phút từ 2 đến 3 ngày.

3.3.1.2 Phân lập chọn lọc

Hút 100 pl mẫu (nước, đất, lá) từ từng môi trường chọn lọc và trải lên môi trường

rắn MMS, MSo tương ứng, ủ ở nhiệt độ 25-30°C. Sau 2-4 ngày quan sát và chọn tất cả

các khuẩn lạc đơn đem đi làm thuần bằng cách cấy ria nhiều lần liên tiếp (3-4 lần) trên

đĩa môi trường rắn tương ứng.

3.3.1.3 Giữ giống

Sau khi thu được các chủng thuần đem tăng sinh trong môi trường CMS và giữ

giống với Glycerol 35-50%, bảo quản trong điều kiện -20°c.

24

3.3.2 Định tính

3.3.2.1 Khảo sát khả năng kích thích tăng trưởng thực vật của các chủng vsv trong

điều kiện in vừro và in vivo

*l* Khảo sát trên môi trường MS (Murashine & Skoog, 1962)

Mục đích:

Xác định khả năng kích thích sự tăng trưởng của thực vật của các chủng vi sinh

vật phân lập được.

Bố trí thí nghiệm:

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD (Completely

Randomized Design), đom yếu tố, và gồm 46 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức gồm 3

làn lặp lại, mỗi lần lặp lại gồm 5 mẫu. Kết quả là trị số của 3 lần lặp lại.

Vật liệu:

Các chửng vi sinh vật phân lập được trên môi trường MMS + 1% methanol, tăng

sinh trên môi trường CMS sau 4 ngày.

Chồi ngủ thuốc lá Nicotiana tabacum 2 tuần tuổi được nuôi cấy in vitro. Phương

pháp:

Chồi thuốc lá được cắt sao cho đồng nhất là 2 cm ngâm vào trong dịch vi sinh vật

(trừ mẫu đối chứng) trong 5 phút, sau đó cấy vào các ống nghiệm chứa môi trường MS.

Điều kiện nuôi cấy:

Nhiệt độ: 24 ± 2°c Thời gian chiếu

sáng: 16h Cường độ ánh sáng: 2000-

3000 lux Ẩm độ: 55%-60%

Chỉ tiêu ghi nhận:

Sau 14 ngày nuôi cấy kết quả được ghi nhận ở nghiệm thức đối chứng và có bổ

sung theo các chỉ tiêu sau :

Độ tăng chiều cao (mm) và độ tăng trọng lượng tươi (mg) của chồi: là hiệu của

chiều cao, trọng lượng tươi chồi thuốc lá sau 14 ngày thí nghiệm (chồi được lấy ra khỏi

ống nghiệm để đo) với chiều cao chồi ban đầu khi cấy vô ống nghiệm

Trọng lượng khô (mg): chồi cây sau khi đo trọng lượng tươi được sấy khô ở nhiệt

25

độ từ 45 - 50°c sau 12h và cân.

Chiều dài rễ: chồi thuốc lá sau 14 ngày được lấy ra khỏi ống nghiệm tiến hành đo

chiều dài rễ (mm)

Khảo sát trên môi trường MS không nỉttf (MSo)❖

Mục đích: Xác định khả năng kích thích sự tăng trưởng của thực vật của các

chủng vsv phân lập được trên môi trường không nitơ.

Bố trí thí nghiệm:

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD (Completely

Randomized Design), đơn yếu tố, và gồm 31 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức gồm 3 lần

lặp lại, mỗi làn lặp lại gồm 5 mẫu. Kết quả là trị số của 3 lần lặp lại.

Vật liệu:

Các chủng vi sinh vật phân lập được từ môi trường MSo tăng sinh trên môi

trường CMS sau 4 ngày.

Chồi thuốc lá Nicotiana tabacum được nuôi cấy trong 2 tuần Môi trường MSo được

giảm lượng đường (5 g/1) nhằm hạn chế sự phát triễn vượt mức của các chủng vi khuẩn

phân lập được.

Điều kiện nuôi cấy:

Nhiệt độ: 24 ± 2°c Thời gian chiếu

sáng: 16h Cường độ ánh sáng: 2000-

3000 lux Ẩm độ: 55%-60%

Phưo'ng pháp:

Dịch khuẩn được đem đi đo OD6i0nm để xác định mật độ tế bào.

Chồi cây thuốc lá được ngâm vào trong dịch vsv (trừ mẫu đối chứng) trong 5 phút,

sau đó cấy vào các ống nghiệm chứa môi trường MSo- Chỉ tiêu ghi nhận:

Sau 14 ngày nuôi cấy kết quả được ghi nhận ở nghiệm thức đối chứng và có bổ

sung theo các chỉ tiêu sau (Phương pháp ghi nhận chỉ tiêu giống như thí nghiệm khảo

sát trên môi trường MS):

Độ tăng chiều cao chồi (mm)

Độ tăng trọng lượng tươi (mg)

26

Trọng lượng khô (mg)

Chiều dài rễ (mm)

Khảo sát khả năng kích thích sự nảy mầm của hạt giống trong điều kiện ❖ in

vivo

Mục đích: Xác định khả năng tương tác kích thích sự sinh trưởng ở thực vật Bố trí

thí nghiệm:

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên CRD, đơn yếu tố, gồm 76 nghiệm

thức. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần 100 hạt. Kết quả là trị số của 3 lần

lặp lại.

Vật liệu:

Sinh khối vsv được thu nhận sau 4 ngày nuôi cấy Hạt giống đậu xanh

Giá thể: cát được rửa sạch và hấp vô trùng cho vào các khay nhựa.

Phưong pháp

Dịch vi khuẩn đem đi đo OD6i0nm để xác định mật độ tế bào, sau đó ly tâm thu sinh

khối.

ủ hạt (100hạt/50ml dịch khuẩn) với sinh khối vi khuẩn trong 1 giờ, sau đó đặt

chuyển sang các khay nhựa chứa giá thể cát. Đối chứng được thực hiện tương tự với

nước cất. Các khay nhựa được ủ ở nhiệt độ phòng. Sau 48-60 giờ ghi nhận tỷ lệ nảy

mầm của hạt so với đối chứng.

Chỉ tiêu ghi nhận

Tỉ lệ nảy mầm của hạt giống.

3.3.2.2 Xử lý thống kê

Số liệu thu được từ các thí nghiệm trên được xử lý thống kê bằng phàn mềm

Stagraphic 7.0

3.3.2.3 Quan sát hình thái

Mục tiêu: xác định hình đạng tế bào, khuẩn lạc, trên cơ sở đó sơ bộ phân chia các

nhóm vi sinh vật tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình định danh Tiến hành:

Quan sát sự phát triển và hình dạng của khuẩn lạc sau 7 ngày nuôi cấy trên môi

trường MMS, CMS, nhằm ghi nhận hình dạng, kích thước, màu sắc khuẩn lạc.

27

Quan sát vi sinh vật dưới kính hiển vi ở vật kính 40x. Ghi nhận đặc điểm về hình thái

của vi sinh vật như hình dạng kích thước, tế bào, hình thức sinh sản.

3.3.3 Định danh vi khuẩn

Sau khi nuôi cấy trên các môi trường chọn lọc, chúng ta có thể thu được các

khuẩn lạc đơn thuần khiết, còn gọi là “chủng thuần”. Chủng thuần là yêu cầu cần cho

việc định danh các vi sinh vật. Việc định danh này được thực hiện dựa trên các đặc

điểm về kiểu hình, cùng với các đặc tính sinh lý, sinh hóa cũng như khả năng biến

dưỡng một số cơ chất của các chủng vi sinh vật phân lập được, trong đó quan trọng

nhất là các thử nghiệm sinh hóa.

3.3.3.1 Khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa

*l* Đặc điểm hình thái

> Đo kích thước tế bào

Sau khi nhuộm đơn bằng thuốc nhuộm Crytal Violet, quan sát dưới kính hiển vi ở vật

kính 40X, sử dụng kính trắc vi thị kính, vật kính để đo kích thước tế bào.

> Thử nghiệm gram

Phương pháp nhuộm Gram

Thực hiện theo phương pháp nhuộm vi khuẩn của Christian Gram Nguyên tắc: Dựa

vào khả năng lưu giữ phẩm màu Crystal Violet trên thành tế bào vi khuẩn sau khi rửa bằng

cồn. Vi khuẩn Gram dương có lớp vỏ tế bào dày tạo

bởi peptidoglycan, nhờ đó mà màu tím của Crytal Violet được gắn chắc vào tế bào (nhờ

iodine) nên không bị khử bởi cồn, do đó vẫn giữ được màu thuốc nhuộm ban đàu. Còn

vi khuẩn Gram âm có lớp vỏ tế bào mỏng hom (do có ít peptidoglycan hom), nhưng lại

có nồng độ lipid cao, khi rửa bằng cồn lớp chất béo này sẽ bị hòa tan kéo theo màu của

thuốc nhuộm ban đầu, tế bào không màu lại bắt với màu hồng đỏ của thuốc nhuộm

Fuschin.

Như vậy, sau khi nhuộm, vi khuẩn Gram âm có màu hồng đỏ; còn vi khuẩn Gram

dưomg có màu tím.

Các bước thực hiện:

- Nhỏ sinh khối vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường CMS lên lam kính sạch (nếu

28

mật độ vi khuẩn quá dày đặc thì có thể pha loãng ra) cố đđịnh tiêu bản vi khuẩn bằng

ngọn lửa đđèn cồn.

- Ngoài ra, ta cũng có thể sử dụng que cấy thu khuẩn lạc đom từ đìa môi trường

CMS, dàn đều lên giọt nước trên lam kính sạch.

- Nhuộm mẫu bằng dung dịch tím tinh thế (Crystal Violet) trong 3 phút, rửa lại

bằng nước.

- Nhuộm tiếp bằng dung dịch Lugol trong 1 phút, rửa lại bằng nước.

- Rửa mẫu bằng ethanol 95%: aceton (1:1) trong 30 giây, sau đó rửa lại bằng nước.

- Nhuộm tiếp mẫu bằng dung dịch Fuschin Ziehl trong 30-60 giây, rửa lại bằng

nước. Đe khô, quan sát sự bắt màu của vi khuẩn dưới kính hiển vi.

Phương pháp string test:

Nguyên tắc: Dựa vào khả năng tạo nhầy (kéo sợi) giữa sinh khối của vi khuẩn với

dung dịch KOH 3%. Dưới tác dụng của dung dịch kiềm loãng, vách tế bào của vi khuẩn

Gram âm bị phân hủy làm giải phóng DNA và tạo dịch nhầy (kéo sợi) String dưomg (vi

khuẩn Gram âm) khi có kéo sợi, còn String âm (vi khuẩn Gram dưomg) khi không có kéo

sợi.

Thực hiện:

Dùng que cấy thu sinh khối vi khuẩn nuôi cấy trên đĩa môi trường CMS trải lên

giọt dung dịch KOH 3% trên lam kính sạch (sinh khối càng nhiều thì hiện tượng quan

sát càng rõ). Ghi nhận khả năng kéo sợi của vi khuẩn.

Khả năng di động

Nguyên tắc: vi khuẩn có thể di động nhờ cấu trúc protein, gọi là tiên mao

(ílagella). Đây có thể là một trong những căn cứ có thể dùng để phân biệt các vi sinh

vật

Thực hiện: Có thể ghi nhận khả năng di động của vi khuẩn bằng 2 phưorng

pháp:

- Phương pháp 1: Thử nghiệm trong môi trường thạch mềm LDC (bộ thử nghiệm

sinh hóa IDS 14GNR). Neu vi khuẩn mọc theo đường cấy và lan ra cả bên ngoài đường

cấy thì vi khuẩn có khả năng di động. Ngược lại, nếu vi khuẩn chỉ mọc theo đường cấy

29

mà không lan ra ngoài thi không có khả năng di động. Tuy nhiên, hiện tượng quan sát

được không rõ, vi vậy cần tiến hành thí nghiệm 2.

- Phương pháp 2: quan sát các tế bào vi khuẩn dưới kính hiển vi: dàn đều sinh

khối vi khuẩn lên giọt nước trên lam kính sạch, và quan sát sự di động của tế bào vi

khuẩn.

3.3.3.2 Đặc điểm sinh lý

Xác định đường tương quan tuyến tính giữa giá trị OD và mật độ tế bào❖

Mục đích: làm cơ sở để xác định mật độ tế bào cho các thí nghiệm sau này dựa

trên nồng độ OD610nm (xác định gián tiếp mật độ tế bào bằng phương pháp đo độ đục).

Phương pháp này dựa trên nguyên tắc: khi pha lỏng có chứa nhiều phần tử không

tan thì sẽ hình thành một hệ huyền phù và có độ đục bởi sự hiện diện của các phần tử

ừong môi trường lỏng làm cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới. Do vậy tế

bào khi hiện diện trong môi trường cũng làm môi trường trở nên đục, độ đục của huyền

phù tỷ lệ với mật độ tế bào. Trong một giới hạn nhất định của của độ đục và mật độ tế

bào, có thể xác lập được quan hệ tỷ lệ tuyến tính giữa mật độ tế bào và độ đục [3].

Thực hiện:

Vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường CMS lỏng sau đó đem đi pha loãng và đo

ODgionm để được các nồng độ từ 0,1 đến 1,0.

Từ các nồng độ OD610nm tiến hành pha loãng bậc 10. Tùy nồng độ OD mà có thể

pha loãng từ 10'3 đến 10'12, từ mỗi nồng độ OD610nm chọn ra 3 độ pha loãng trải 0,1 ml

lên đĩa môi trường CMS. ủ 25-30°C trong 2-3 ngày, và đếm số khuẩn lạc phát triển trên

đĩa (trong khoảng từ 25-300 khuẩn lạc).

Tính số lượng tế bào trong 1 ml môi trường:

Nị=A xio X di

Trong đó: Ni: số lượng tế bào ở độ pha loãng dị

A : Số khuẩn lạc đếm được trên đĩa

di: Độ pha loãng

Dựng đường tưomg quan tuyến tính giữa ODgionm và logN/ml bằng phần mềm

Excel.

30

❖ Xác định đường cong tăng trưởng

Mục đích: Nhằm xác định thời gian thích họp để thu sinh khối vi khuẩn.

Thực hiện:

Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy lắc ở 25-30°C và tiến hành đo OD610nm

4giờ/làn trong vòng 60 giờ.

❖ Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ

Mục đích: xác định nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của các chủng vi khuẩn. Thực

hiện: dựa vào 2 phương pháp

Phưưng pháp 1: cấy vi khuẩn lên các đĩa môi trường rắn CMS, ủ ở các nhiệt độ

khác nhau 20,25, 30, 35,40°c, sau 3- 4 ngày ghi nhận sự phát triển của khuẩn lạc.

Phương pháp 2: cấy vi khuẩn ừong các ống nghiệm chứa môi trường CMS lỏng,

nuôi cấy ở các nhiệt độ khác nhau 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50°c trong 3 ngày và do

ODgiOnmDựa vào đường tương quan tuyến tính suy ra mật độ tế bào.

❖ Khảo sát ảnh hưởng của pHMục đích: xác định độ pH tối ưu cho sự phát triển của các chủng vi khuẩn.

Thực hiện:

Cấy vi khuẩn trong các ống nghiệm chứa môi trường CMS lỏng ở các độ pH từ

4,0-9,0 (cách nhau 0,5), nuôi cấy lắc 100 vòng/phút, sau 3 ngày ghi nhận nồng độ

ODgiOnm'

Dựa vào đường quan tuyến tính suy ra mật độ tế bào.

3.3.3.3 Đặc điểm sinh hóa ♦>

Khảo sát hoạt tính Catalase

Nguyền tắc: Phần lớn các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy ý chứa chuỗi điện tử

có cytochrome đều có enzyme catalase, nhờ đó bảo vệ tế bào khỏi các tổn thương bởi

các dẫn xuất độc tính cao của phân tử oxy. Các vi sinh vật này có khả năng biến dưỡng

năng lượng theo phương thức hô hấp với oxy là chất nhận điện tử cuối cùng trong

chuỗi điện tử tạo H2O2. Catalase thủy phân hydrogen peroxide (H2O2) thành H2Ơ và

giải phóng 02, gây hiện tượng sủi bọt khí.

Thực hiện: Nhỏ vài giọt H2O2 lên khuẩn lạc của vi khuẩn phát triển trên bề mặt

31

thạch. Quan sát và ghi nhận hiện tượng sủi bọt khí.

❖ Khảo sát hoạt tính Oxydase

Nguyên tắc: Cytochrome Oxydase là thành phần quan trọng trong chuỗi chuyển

điện tử hô hấp, với O2 là chất nhận điện tử cuối cùng nên chỉ hiện diện trong các loài vi

sinh vật hiếu khí hay hiếu khí tùy ý. Hoạt tính này được phát hiện nhờ thuốc thử p-

phenylenediamine bị oxy hóa thành họp chất indolphenol có màu xanh dương.

Thực hiện: dàn đều sinh khối vi khuẩn lên đĩa giấy có tẩm dung dịch

tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride (TMPD). Quan sát và ghi nhận sự

xuất hiện màu xanh dương sau vài phút.

❖ Khảo sát khả năng sử dụng các nguồn Carbon

Nguyên tắc: Trong quá trình biến dưỡng vi khuẩn sử dụng nguồn cung cấp

carbon để tăng trưởng, đồng thời tiết ra các chất làm thay đổi pH môi trường. Do khi sử

dụng chất chỉ thị pH là bromothymol blue thì khả năng sử dụng các nguồn

carbon của vi khuẩn được ghi nhận bằng sự đổi màu của môi trường nuôi cấy vi khuẩn.

Môi trường trung tính có màu xanh lá cây, môi trường acid có màu vàng, còn môi

trường kiềm có màu xanh dương.

Thực hiện:

Chất cung cấp nguồn Carbon: acetate, betain, citrate, D-glucose,

dimethylamine, ethanol, íructose, lactose, L-Abrabinose, L-glutamate, maltose,

methylamine, nitrate, sebacate, sucrose, trimethylamine, Nutrient agar.

Chất chỉ thị: bromothymol blue 0,04%.

Pha môi trường khoáng MS và 2ml/l chất chỉ thị pH trong nhiều erlen khác nhau

rồi hấp vô trùng, trong mỗi erlen bổ sung thêm 1% chất cung cấp nguồn Carbon bằng

cách lọc vô trùng, chỉnh pH môi trường về pH =7. Bơm vào từng giếng của Microplate

lml môi trường, đối với mỗi chất cung cấp carbon có thể sử dụng nhiều giếng khác

nhau trong đó có 1 giếng đối chứng, cấy 20pl dịch vi khuẩn vào các giếng của

Microplate, trừ giếng đối chứng.

ủ ở 25-30°C trong 4-5 ngày và đọc kết quả: đặt microplate lên tờ giấy trắng. Phản

ứng dương tính khi môi trường đối màu so với đối chứng (màu xanh lá cây).

32

Các thử nghiệm trong bộ sinh hóa IDS 14GNR❖

IDS 14GNR là bộ kit 14 thử nghiệm sinh hóa định danh trực khuẩn Gram âm,

được công ty Nam Khoa sản xuất nhằm giúp cho việc định danh các trực khuẩn Gram

âm được nhanh chóng và dễ dàng hơn.

Các thử nghiệm trong bộ kit IDS 14GNR bao gồm:

Thử nghiệm lên men Glucose: các vi sinh vật có khả năng lên men đường

Glucose sẽ tạo ra các sản phẩm có tính acid, làm thay đổi màu của chất chỉ thị

bramothymol blue.

Thử nghiệm khử nitrate: dựa trên sự tạo thành nitrite và cạn kiệt nitrate. Nitrite

được tạo thành từ nitrate sẽ phản ứng với thuốc thử sulphanilamide và N-

napthylethylenediamine hydrochloride ở pH acid cho họp chất có màu hồng đỏ. Ở

một số trường họp phản ứng không rõ, cần kiểm chứng lại sự cạn kiệt nitrate bằng bụi kẽm

kim loại.

Thử nghiệm ONPG: Các vi khuẩn chỉ lên men lactose khi có sự hiện diện của

gen mã hóa enzyme Ị3-galactosidase trong tế bào. Hoạt tính của enzyme này có thể

được xác định dựa vào cơ chất tổng họp o-nitrophenyl-D-galactopyranoside (ONPG).

Sự thủy phân của cơ chất đường này bởi |3-galactosidase sẽ phóng thích o-nitrophenol

có màu vàng.

Thử nghiệm urease: dựa trên khả năng tổng họp enzyme urease, xúc tác sự thủy

phân urea, giải phỏng NH3 và C02, làm tăng pH của môi trường, làm đổi màu chất chỉ

thị Phenol-Red. Phản ứng (+) khi có màu đỏ cánh sen.

Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate: sự biến dưỡng citrate bởi vỉ sinh

vật sẽ tạo ra C02, đồng thời phân giải muối ammonium, sinh NH3 làm kiềm hóa môi

trường, làm đổi màu của chất chỉ thị bromothymol blue.

Thử nghiệm Bile Esculin: dựa trên khả năng thủy phân glucoside trong esculin

thành esculetin và glucose khi có sự hiện diện của muối mật. Esculetin phản ứng muối

sắt trong môi trường tạo thành phức chất có màu đen hay màu nâu đen.

Thử nghiệm khả năng sinh H2S: dựa ừên khả năng khử họp chất Sodium

thiosulphate có trong môi trường để giải phóng H2S. Khí H2S tạo ra được phát hiện dựa

33

vào phản ứng kết tủa màu đen FeS giữa H2S với ion Fe2+ của chất chỉ thị Ferric

ammonium citrate.

Thử nghiệm khả năng sinh Indole: Tryptophan là một acỉd amỉne có thể bị oxy

hóa bởi một số vi sinh vật có hệ enzyme tryptophanase tạo nên các sản phẩm chứa gốc

indol. Việc phát hiện indol được thực hiện bằng phản ứng của phân tử này với các

thuốc thử chứa p-Dimethylaminpobenzaldehyde (p-DMABA). Nhân pyrol của indol

chứa nhóm CH2 sẽ kết họp với nhân benzen của p-DMABA tạo nên phức chất dạng

quinone có màu đỏ.

Thử nghiệm V-P (Voges-Proskauer): ừong điều kiện có oxy và pH kiềm, 2,3-

butanediol bị chuyển hóa thành acetonin, và acetonin tiếp tục bị oxy hóa thành

diacetyl dưới sự xúc tác của a-naphthol. Diacetyl kết hợp với nhân guanidine có trong

pepton kết tụ thành phức diacetyl-guanidine có màu đỏ.

Thử nghiệm khả năng biến dưỡng Malonate: Các vỉ sinh có khả năng biến

dưỡng manolate đồng thời có khả năng sử dụng ammonium làm nguồn đạm duy nhất.

Sự tăng trưởng của vi sinh vật ừên môi trường chứa Manolate làm nguồn carbon duy

nhất sẽ kéo theo việc sử dụng nguồn đạm này, làm phóng thích NH3 làm kiềm hóa môi

trường. Do vậy khả năng biến dưỡng manolate có thể được nhận thấy bằng sự chuyển

màu của chất chỉ thị bromothymol blue trong môi trường.

Thử nghiệm LDC (Lysine decarboxylase): Phản ứng được xúc tác bởi LDC sẽ

loại bỏ C02 ra khỏi lysine, CO2 sinh ra sẽ làm tăng pH của môi trường và được ghi

nhận qua sự đổi màu của chỉ thị pH (bromocresol purple).

Thực hiện:

Tạo dịch huyền phù sinh khối vi khuẩn trong 3-5ml nước cất, hoặc nước muối

sinh lý vô trùng (pha càng đục càng tốt)

Bom 200 pl dịch vi khuẩn vào các giếng của khay nhựa. Đối với ống LDC, dùng

que cấy vô trùng nhúng vào dịch vi khuẩn, sau đó cắm vào ống môi trường, dán miệng

ống lại.

Đem tất cả đi ủ ở nhiệt độ 25-30°C trong 2-3 ngày, bổ sung thêm thuốc thử (nếu

cần) và đọc kết quả theo bảng 3.1

34

Bảng 3.1: Hướng dẫn đọc kết quả trong bộ thử nghiệm sinh hóa IDS 14GNR

sttPhản ứng sinh

hóaThuốc thử Dương tính Ảm tính

1 Lên men glucose Không Vàng Tím

2 Khử Nitrate 1 Đĩa giấy tim nitrate Đỏ Vàng lợt

3 Galactosidase Không Vàng Không màu

4 Urease Không Đỏ cánh sen Đỏ nhạt/vàng

5 PDA 1 giọt FeCl3 Xanh lá đậm Vàng lợt

6 Citrate Không Xanh biển Xanh lá/vàng

7 Esculin Không Đen Không đen

8 Sinh H2S Không Đen Không đen

9 Sinh Indole Kovac Đỏ Không đổi màu

10

Voges-Poskauer 1 giọt KOH,

1 giọt Napthanol

Đỏ Vàng nhạt

11 Sử dụng Malonate Không Xanh biển Vàng/xanh lá

12 Oxydase Không Xanh dưomg Không đổi màu

13 LDC Không Tím Vàng

14MOT (di động) Không Nhòe đường cấy

Không nhòe đường

cấy

Khảo sát khả năng cố định đạm❖

Dreyíus (1988) và Abdoulaye Sy (2001) đã chứng minh rằng ở một số loài

Methylobacterium sp. có khả năng cố định đạm nhờ sự hiện diện của một số gen (gen

niflỉ và gen nođ) có vai trò tưomg tự như gen cố định đạm ở Rhizobium. Năm 2006,

Raja cũng đã chứng minh được 11 chủng Methylobacterium sp. có khả năng phát

triển trên môi trường khoáng MS không nitrogen, trong đó có 1 chủng chỉ có sự hiện

diện của gen nịỷH mà không có gen nod (gen tạo nốt sần ở rễ cây). Vì thế, chúng tôi

xem xét khả năng cố định đạm của các chủng phân lập được.

35

Phưong pháp: cấy vi khuẩn lên các erlen chứa môi trường dịch thể NMS có bổ

sung chất chỉ thị màu bromothymol blue 0,04%, nuôi cấy lắc 100 vòng/phút ở nhiệt

độ 25-30°C. Sau 4-5 ngày ghi nhận sự đổi màu của môi trường so với đối chứng.

Khảo sát khả năng sinh tổng hợp PHB❖

PHB (poly-beta-hydroxybutyrate) là nguồn carbon dự trữ ở vi khuẩn

Methylobacterium. PHB là một polymer chịu nhiệt có kha năng phân hủy sinh học. Vì

thế, việc định tính sự tích lũy PHB không những cần thiết cho mục tiêu phân loại mà

còn đánh giá tiềm năng sử dụng thu nhận PHB chủng vi khuẩn mới phân lập được [1]

Mục đích: Định tính khả năng sinh tống họp PHB của các chủng phân lập được.

Nguyên tắc: Sử dụng phẩm nhuộm chuyên biệt Nile Blue A để ghi nhận sự hiện diện các

hạt PHB trong tế bào vi khuẩn phân lập được. Với thuốc thử này, các hạt PHB ừong tế bào

sẽ bắt màu cam sáng trên nền tế bào màu đen khi quan sát dưới kính hiển vi phát huỳnh

quang ở bước sóng 460nm.

Vật liệu:

- Sinh khối của 2 chủng vi khuẩn phân lập được.

- Phẩm nhuộm Nile Blue A

- Dung dịch acid acetic 8%

Thực hiện:

Lấy 1-2 giọt huyền phù sinh khối vi khuẩn, đặt lên tấm lam sạch, hơ qua ngọn

lửa nhiều làn để cố định tế bào hên lam.

Nhuộm tế bào đã cố định bằng 1 giọt phẩm nhuộm Nile Blue A trong 15 phút

ở 55°c.

Rửa sạch phẩm thừa bằng nước cất, sau đó rửa lại 1 lần nữa bằng acid acetic

trong 1 phút. Dùng giấy thấm lau khô mẫu, cho 1 giọt nước lên lam, đậy lamen lại.

Quan sát sự bắt màu cam sáng của các hạt PHB bong tế bào vi khuẩn đã được xử lý

màu dưới kính hiển vi phát huỳnh quang ở bước sóng 460nm.

3.3.3.4 So sánh tính tưtfng đồng di truyền dựa trên hệ số Jascard (Sj)

Hệ số tương đồng laccard (Sj) cho phép xác định mức độ tương đồng của hai loài vi

khuẩn. Vì vậy, để xác định mối quan hệ họ hàng của chủng vi khuẩn phân lập được

36

với các loài được công bố thì việc tính toán giá trị hệ số Sj là cần thiết. Hệ số Sj được

tính theo công thức:

Sj= a/(a+b)

a: tổng số các đặc điểm tương đồng ở hai loài b: tổng số

đặc điểm khác biệt ở hai loài Giá trị của hệ số Sj nằm trong khoảng 0-1 (0-

100%). Nếu 2 loài có hệ số Sj >0,8 (80%) thì có khả năng thuộc cùng một loài.

3.3.3.5 Phân tích trình tự rDNA 16S

Tách chiết DNA❖

Mục đích: Thu nhận DNA bộ gen của các chủng phân lập được.

Thực hiện: theo quy trình tách chiết DNA bộ gen của các chủng vi khuẩn

Methylobacterium sp. [1].

- Ly tâm thu sinh khối

- Bổ sung 600pl CTAB nóng, đem vortex thật kỹ, ủ ở 65°c trong 60 phút, để cho

CTAB phá màng tế bào hoàn toàn.

- Ly tâm 13000 vòng/phút, trong 5 phút.

- Thu dịch nổi, biến tính lần 1 bằng 500pl phenol:chloroform (1:1), lắc nhẹ.

- Ly tâm 13000 vòng/phút, trong 5 phút.

- Thu dịch nổi, biến tính lần 2 bằng 500pl phenol:chloroform (1:1), lắc nhẹ.

- Ly tâm 13000 vòng/phút, trong 5 phút.

- Thu dịch nổi, tủa bằng lml ethanol tuyệt đối lạnh.

- Ly tâm 13000 vòng/phút ở nhiệt độ 4°c trong 5 phút.

- Rửa lại tủa bằng 500pl cồn 70°c.- Phơi mẫu cho khô cồn.

- Hòa tan tủa trong 20pl dung dịch TE 0,1X.

- Bổ sung 2pl dung dịch RNAse (lmg/ml), ủ 37°c bong 60 phút.

- Bảo quản ở nhiệt độ 4°c.

- Sản phẩm DNA bộ gen được đánh giá thông qua điện di qua gel agarose 1%, đo nồng

độ và xác định độ tinh sạch qua tỷ số OD260nm/OD280nm-

Khuếch đại trình tự rDNA 16S bằng phản ứng PCR❖

37

Để có thể định danh một cách chính xác các chủng vi khuẩn phân lập được ở

mức độ loài thì gần như toàn bộ thông tin về trình tự DNA mã hóa cho phân tử rDNA

16S phải được biết thật đầy đủ. Vì thế cần tiến hành các phản ứng PCR để khuếch đại

toàn bộ trình tự rDNA 16S từ khuôn là DNA bộ gen của các chủng vi khuẩn thu nhận

được ở trên. Các phản ứng PCR được thực hiện với các mồi khác nhau, bao gồm:

Cặp mồi 2F (5’ GAT CGG ccc GCG TCT GAT TAG 3’) và 2R (5’ CCG TCA

TTA TCG TCC CGG ACA 3’) đã được Nishio T, và cộng sự (1997) sử dụng trong

định danh cho chi Methylobacterium.

Khuếch đại trình tự rDNA 16S nguyên vẹn của các chủng vi khuẩn phân lập

được với các cặp mồi:

27F : 5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’

1525R: 5 ’-AAGGAGGTGWTCCARCC-3 ’

520F: 5 ’-CAGCAGCCGCGGTAATAC-3 ’

920F: 5 ’-AAACTCAAATGAATTGACGG-3 ’

520R: 5 ’-GTATTACCGCGGCTGCTG-3 ’

920R: 5 ’-CCGTCAATTCATTTGAGTTT-3 ’

Thành phần phản ứng PCR để khuếch đại trình tự rDNA 16S bao gồm:

Buffer (10X)................................................................2,5pl

Mg2+ (25mM)........................................................................l,5pl

dNTP (2mM)...........................................................................2,5pl

Mồi xuôi (1 Opmol/pl)............................................................1 pl

Mồi ngược (1 Opmol/pl).........................................................1 pl

DNA khuôn (100ng/pl)...........................................................lpl

Tag DNA polymerase (2U/pl).................................................lpl

DEPC-H20................................................................................vừa đủ 25pl

Thực hiện các phản ứng PCR:

- Định tính vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium bằng phản ứng PCR với cặp

mồi (2F, 2R), với sản phẩm tạo ra là đoạn DNA có kích thước khoảng 234 bp.

- Khuếch đại trình tự rDNA 16S nguyên vẹn của các chủng vi khuẩn phân lập

38

được với cặp mồi (27F-1525R).

- Tinh chế: sử dụng bộ kit tinh chế sản phẩm PCR của hãng Bio Basic, Canada.

- PCR với các cặp mồi bên trong để kiểm chứng sự bắt cặp chuyên biệt của các

cặp mồi trong. Vì kích thước sản phẩm PCR bằng cặp mồi (27F, 1525R) là 1500 Nu

là rất lớn. Khó giải trình tự một cách chính xác theo phưomg pháp giải trình tự trực

tiếp từ phản ứng PCR nên phải sử dụng các cặp mồi bên trong. Mục tiêu của các phản

ứng PCR này là chứng minh cặp mồi (520F, 920R) có khả năng bắt cặp với trình tự

rDNA 16S của vi khuẩn mục tiêu.

- Các phản ứng PCR được thực hiện với cùng một chu trình nhiệt như sau:

- Các sản phẩm PCR sẽ được điện di trên gel agarose 2% ở điện thế 50V trong

40 phút. Sau đó nhuộm bằng ethidium bromide trong 45 phút, và xem kết quả dưới

đèn

uv.- Những sản phẩm tốt sẽ được gửi đi giải trình tự (Macrogen, Hàn Quốc) để có

thể định danh chính xác đến mức độ loài.

Phân tích trình tự rDNA 16S.❖

Kết quả giải trình tự (phụ lục) sẽ được xử lý bằng phần mềm fast PCR để tạo

ra các trình tự rDNA nguyên vẹn của mỗi chủng vi khuẩn. Trình tự rDNA 16S nguyên

vẹn này sẽ được so sánh với các trình tự DNA của các chủng vi khuẩn khác trên ngân

hàng dữ liệu NCBI bằng phàm mềm BLAST. Trình tự của chủng khảo sát và các

chủng chuẩn được sắp gióng cột bằng chương trình CLUSTAL X phiên bản 1.81. Cây

39

phát sinh loài được bằng phương pháp neighbor-joining trong chương trình MEGA

phiên bản 2.1 với 1000 lần lặp lại.

3.3.4 Định danh nấm men

3.3.4.1 Khảo sát các đặc điểm hình thái nấm men

*l* Hình thái của tế bào sinh dưỡng

Sau khi phân lập và làm thuần chúng ta cần kiểm tra các đặc điểm hình thái của

tế bào nấm men qua các đặc điểm về hình dạng, kích thước và kiểu sinh sản.

Tế bào nấm men có nhiều hình dạng khác nhau như: hình tròn, hình trứng, hình

bầu dục, hình que...

về kích thước, nấm men là tế bào có kích thước lớn, lớn hơn tế bào vi khuẩn 5-

10 lần. Tế bào nấm men thường có chiều dài 9-lOp.m, chiều rộng 2-7pm

Cách thực hiện:

Nuôi cấy tế bào nấm men trong môi trường YM Broth ở nhiệt độ phòng, khoảng

24-48 giờ

Quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi, chú ý các đặc điểm về hình dạng

kích thước kiểu sinh sản, tế bào thường ở dạng đôi hay tạo chùm.

*l* Hình thái của khuẩn ty giả

Ở một số loài nấm men, chồi trương thành không tách ra khoải tế bào mẹ mà

tạo thành một chuổi tế bào gọi là khuẩn ty giả. Rất khó để phân biệt giữa khuẩn ty giả

và khuẩn ty thật, để phân biệt có thể dựa vào cách quan sát tế bào cuối cùng của

chúng. Khuẩn ty thật có độ khúc xạ và tế bào cuối cùng thường dài hơn tế bào cạnh

nó, còn khuẩn ty giả không có độ khúc xạ, không thấy rõ vách ngăn giữa các tế bào

(giả đốt) và tế bào cuối cùng thường ngắn hơn tế bào cạnh nó.

Sự hình thành khuẩn ty giả ở nấm men là do tác động của điều kiện môi trường

nghèo dinh dưỡng, thiếu oxy...

Cách thực hiện: (Phưomg pháp Dalmau).

- Trước tiên cần chuẩn bị lame, lamelle, đĩa Petri có giấy lọc ở dưới và một thanh chữ

u ở dưới đem hấp vô trùng.

- Hút nước đã hấp vô trùng bơm lên giấy lọc để giữ cho môi trường trong đĩa

40

petri không bị khô.

- Hút môi trường PDA đã hấp khử trùng và đã làm tan, trải trên miếng lame

- Dùng que cấy thẳng ria một đường lên miếng lame và đặt miếng lamelle lên chỗ vừa

cấy cho thật kín.

- Đem ủ ở nhiệt độ phòng, bổ sung nước cất vô trùng 3 ngày/lần đề tránh môi trường

thạch bị mất nước.

Kết quả: quan sát khuẩn ty giả dưới kính hiển vi.

❖ Hình thái bào tử nang

Bào tử nang của các loại nấm men rất khác nhau về số lượng bào tử trong nang,

hình dạng, màu sắc, kích thước. Sự hình thành bào tử nang thường được cảm ứng bởi

môi trường ức chế sự phát triển dinh dưỡng .

Cách thực hiện:

Cấy giống đã hoạt hóa vào môi trường Acetate agar và ủ ở nhiệt độ phòng trong

3 tuần.

Quan sát nang bào tử dưới kính hiến vi

3.3.4.2 Xác định một số đặc tính sinh hóa của nấm men

❖ Khả năng lên men Glucose

Lên men glucose là một trong những yếu tố quan trọng để bước đầu định danh

nấm men đến giống. Quá trình lên men có thể sinh khí hay không sinh khí, có thể tạo

acid hay tạo ethanol. Muốn xác định khả năng lên men cần xác định các yếu tố sau:

Khả năng sử dụng Glucose (màu môi trường có thay đổi)

Khả năng tạo ethanol (hình thành phức chất màu vàng với tinh thể iode trong điều

kiện kiềm)

Khả năng sinh khí (sự xuất hiện bọt khí trong ống Durham)

Cách thực hiện:

- Hút 2ml môi trường cơ bản vào ống nghiệm loại nhỏ có chứa ống Durham đã lấy hết

khí ra đem hấp khử trùng ở 121 °c trong 15 phút.

- Hút lml dung dịch đường Glucose đã lọc vô trùng trong điều kiện vô trùng.

- Cấy giống và ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày kiểm tra 12 tiếng/lần

41

Kết quả: Sinh khí: (+) có khí trong ống Duharm

(-) không có khí trong ống Durham Sinh

ethanol: (+) hình thành tinh thể màu vàng

(-) không hình thành tinh thể vàng với Ỉ2

❖ Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon

Kiểm tra đặc tính đồng hóa các nguồn cacbon là kiểm tra khả năng phát triển

của nấm men hên môi trường chỉ chứa một nguồn cacbon như là nguồn năng lượng

duy nhất. Thử nghiệm này có thể được thực hiện trên môi trường rắn hay lỏng. Tuy

nhiên môi trường lỏng thường được sử dụng nhiều hom.

Các nguồn carbon được khảo sát bao gồm: beatin, citrate, D-glucose, íructose,

lactose, L-glutamate, maltose, nitrate, sebacate, sucrose, trimethylamine, tartrate.

Thực hiện: các bước thí nghiệm được thực hiện như thí nghiệm khảo sát khả

năng đồng hóa các nguồn cacbon của vi khuẩn Kết quả:

Phản ứng dương tính khi môi trường đổi màu so với đối chứng (màu xanh lá

cây).

❖ Khả năng đồng hóa Nitrat

Nấm men có khả năng sử dụng các nguồn nitrogen. Khả năng sử dụng nguồn

nitrate là một tiêu chuẩn quan trọng trong việc định danh một số giống.

Cách thực hiện:

- Hút vào ống nghiệm nhỏ lml môi trường Bacto Yeast Cacbon base có bổ sung

chất chỉ thị màu Bromothymol Blue 2ml, hấp khử trùng ở 121°c trong 15 phút. Nguồn

nitrogen KNO3 được bổ sung bằng cách lọc vô trùng.

- Bơm vào từng giếng của Microplate lml môi trường, cấy 20pl dịch nấm men

vào các giếng của Microplate, trừ giếng đối chứng.

- ủ ở 25-30°C trong 4-5 ngày và đọc kết quả: đặt microplate lên tờ giấy trắng.

Phản ứng dương tính khi môi trường đổi màu so với đối chứng

Tổng hợp các đặc điễm và định danh❖

Căn cứ trên các đặc điểm hình thái, sinh lý của các chủng nấm men phân lập

được và dựa trên khóa phân loại Lodder [2]. Định danh tới mức độ giống các loài

42

khảo sát.

43

Chương IVKẾT QUẢ - THẢO LUẬN

4.1 Kết quả phân lập và làm thuần:

Từ 25 mẫu thu nhận từ Vườn Quốc gia Cát Tiên chúng tôi đã tiến hành phân lập và làm thuần trên 2 môi trường

MMS và MSo. Kết quả chúng tôi đã thu nhận được 45 chủng vsv trên môi trường MMS và 30 chủng trên môi trường

MSo.

4.2 Kết quả sàng lọc các chủng có khả năng tưong tác vói thực vật

4.2.1Khảo sát khả năng kích thích tăng trưững thực vật của các chủng vsv trong điều kiện in vitro

Khảo sát khả năng tưưng tác thực vật của các chủng vỉ sinh vật biến dưỡng methyl trên môi trường MS❖

(Murashine & Skoog, 1962)♦♦♦ Kết quả: Sau 14 ngày nuôi cấy, chúng tôi ghi nhận kết quả và chia các nghiệm thức làm 2 nhóm Âm tính (chồi ngủ

chết) có tất cả 37 nghiệm thức. Dương tính (chối ngủ sống) nhóm dương tính gồm có 9 nghiệm thức chồi phát triển. Ket

quả của 9 nghiệm thức này được ghi nhận và tiến hành thống kê so sánh với đối chứng (Bảng 4.1).

Chủng vi

sinh vật

Độ tăng của chiều

cao chồi (mm)Chiều dài rễ

(mm)

Độ tăng của

trọng lượng tưoỉ

(mg)

Trọng lượng

khô (mg)

Đc 13,73 ± l,87d 49,06 ± 7,49bc 486,00± ll,27d 78,33 ± 7,57c

601 Oa 8,86 ± l,35c 44,06 ± 6,9630 477,66 ± 60,45c 73,33 ± 8,50*

6012a 7,73 ± 0,96b 53,06 ± 6,58cd 430,33 ± 22,90* 59,33 ± 3,21a

6019a 18,73 ± 1,62* 55,85 ± 7,89d 600,66 ± 51,05d 108,00 ± 5,56e

6019b 19,26± l,58g 61,53 ± 7,83e 572,66 ± 59,41d 107,66 ± 10,10e

6020a 6,53 ± l,12a 51,13±6,66cd 399,66 ± 15,43a 53,00 ± 4,00a

6020C 7,86 ± 1,06^ 44,8 ± 7,32ab 377,33 ± 17,7830 58,66 ± 2,52a

44

602la 8,66 ± 1,45^ 40,06 ± 6,64a 437,66 ± 37,07* 63,33 ± 4,043*5

6027a 17,93 ± l,57f 73,60 ±6,26f 593,33 ± 10,69d 93,00 ± 5,13d

Bảng 4.1: Khảo sát klả năng tưomg tác thực vật của các chủng vi sinh vật

Trong cùng một hàng các giá trị trung bình có kỷ tự giong nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05)

Biểu đồ 4.2: So sánh ảnh hưởng của các chủng vi sinh vật lên trọng lượng tươi và trọng lượng khô cây thuốc lá trên

môi trường MS.

Ket quả khảo sát (Bảng 4.1) chúng tôi ghi nhận có 9 chủng vi sinh vật biến dưỡng methyl không gây chết ở chồi

thuốc lá.Trong đó các chủng 6019a, 6019b, 6027a đều có kết quả theo dõi tốt so với đối chứng và các mẫu khác theo các

chỉ tiêu ghi nhận.

Chủng 6019a: chồi thuốc lá cho kết quả dưomg tính tốt nhất ở trọng lượng tươi 600,66mg, trọng lượng khô 108 mg

Enmnu Độ tăng chiều cao cây — C h i ề u d à i r ê

Biểu đồ 4.1: So sánh ảnh hưởng của các chủng vi sinh vật lên chiều cao và chiều dài rễ cây thuốc lá trên môi trường MS.EĨSS3 Trọng lượng tươi — T r ọ n g lượng khô

Chủng vi sinh vật

biến dưỡng methyl trên môi trường MS (Murashine & Skoog, 1962)

45

chỉ tiêu về chiều dài rễ cũng cho kết quả cao hom so với đối chứng (Hình 4.1C).

Chủng 6027a: chồi thuốc lá có kết quả tốt nhất về chiều dài rễ so với đối chứng 73,6mm. Đặc biệt ở vùng vết cắt

chồi cấy có thấy sự hình thành của mô sẹo (Hình 4.2). Đây là dấu hiệu cho thấy khả năng tiết ra các phytohormone của

chủng 6027a. Riêng chỉ tiêu về trọng lượng tươi, trọng lượng khô, chiều cao cây đều cho kết quả dương tính so với đối

chứng (Bảng 4.1)Các chủng còn lại tuy không gây chết trên mô thực vật nhưng các chỉ tiêu tăng trưởng đều cho kết quả thấp hơn so với đối chứng

46

.

Từ kết quả thí nghiệm trên chúng tôi tiến hành chọn các chủng 6019a, 6019b, 6027a

để tiến hành định danh.

A: Đối chứng C: Chủng 6019b B: Chủng 6019a D: Chủng 6027a

Hình 4.2: Sự hình thành mô sẹo ở chồi thuốc lá khi

bổ sung chủng 6027a

47

Khảo sát khả năng tương tác thực vật của các chủng vỉ sinh vật trên môi trường ❖MS không nitơ (MSo)

Kết quả:

Sau 14 ngày nuôi cấy, chứng tôi ghi nhận và chia các nghiệm thức lảm 2 nhóm:

Âm tính: (chồi thuốc lá chết) có tất cả 24 nghiệm thức (tương ứng với 24 chủng vi

sinh vật phân lập được).

Dương tính: (chồi thuốc lá sống) gồm có 7 nghiệm thức có chồi thuốc lá phát triễn.

Kết quả của thí nghiệm này được ghi nhận trong bảng 4.2

Bảng 4.2 : Kết quả khảo sát khả năng kích thích sinh trương của các chủng vi sinh

vật trên chồi thuốc lá nuôi cấy in vitro trong môi trường MSo

Chủng vi

sinh vật

Độ tăng chiều cao

cây (mm)

Chiều dài rễ (mm)Độ tăng của trọng

lượng tươi (mg)

Trọng lượng

khô (mg)

Đc 3,2 ± 0,77d 63,26 ± 8,97b 269,00 ±27,05bc 37,66 ± l,53bc

ONlOa 2,8 ± l,08cd 69,80 ± 8,53bc 255,33 ±31,08bc 31,66 ± 2,52a

ONlla 2,2 ± 0,68a 26,53 ± 5,21a 205,00 ± 21,16a 41,00 ± 4,00c

ON16a 3,9 ± 0,70e 111,60 ± 8,39d 295,00 ± 2l,28c 47,33 ± l,53d

ON18a 2,3 ± 0,72ab 67,46 ± 4,17bc 226,33 ± 7,63ab 34,66 ± l,53ab

ON29b 4,4 ± 0,91e 70,73 ± 6,97c 347,66 ± 40,13d 62,33 ± 3,78e

ON18b 2,3 ± 0,82ab 68,06 ± 8,97bc 257,66 ±15,17bc 30,33 ± 4,24a

Biểu đồ 4.3: So sánh ảnh hưởng của vi sinh vật lên chiều cao và chiều dài rễ cây

thuốc lá trên môi trường MSo.

15153Trọng lượng tươi —♦—Trọng lượng khô

70

60

50

40

30

20

10

0

E

Trong cùng một hàng các giả trị trung bình có kỷ tự giống nhau không có sự khác biệt về mặt

thống kê (P>0,05)

48

Biểu đồ 4.4: So sánh ảnh hưởng của vi sinh vật lên trọng lượng tươi và trọng lượng

khô cây thuốc lá ừên môi trường MSo.

Chủng Các đặc điểm

49

Từ kết quả của 7 chủng không gây chết ở chồi thuốc lá chúng tôi tiến hành phân tích thống kê so sánh các chì tiêu đánh giá kích thích sinh trưởng thực vật so với đối chứng. Ket quả được ghi nhận ở bảng 4.2 và biểu diển trên sơ đồ 4.3 và sơ đồ 4.4

Chúng tôi ghi nhận chủng ON16a và ON29b có tương tác với thực vật. Trong đó

chủng ON16a có chiều dài rễ cao nhất so với tất cả các nghiệm thức: 111,6 mm. Các chỉ

tiêu khác điều cho kết quả dương tính so với đối chứng (Hình 4.3A).

Chủng ON29b có các chỉ tiêu so với đối chứng về: độ gia tăng chiều cao chồi 4,9

mm; trọng lượng tươi 347,66 mg; trọng lượng khô 62,33mg, các chỉ tiêu trên điều cao

hơn so với đối chứng và các nhóm còn lại. (Hình 4.3B)

Việc nuôi cấy mô thực vật trong điều kiện in vitro, thiếu nguồn nitrogen, đều lảm

cho cây chậm phát triễn và đôi khi gây chết cây vì nguồn nitrogen là yếu tố quan trọng

trong sự sống của thực vật. Nhưng ở 2 nghiệm thức có bổ sung các chủng sinh vật ON16a

và ON29b các chồi thuốc lá đều có rễ phát triển mạnh so với đối chứng, chiều cao, trọng

lượng tươi trọng lượng khô đều có sự khác biệt rất có ý nghĩa so với đối chứng và các

nghiệm thức còn lại. Như vậy, cà hai chủng này đều có khả năng cung cấp nguồn

nitrogen cho cây, giúp cây phát triển trong môi trường không có nitrogen. Vì 11 do đó,

chúng tôi chọn 2 chủng ON16a và ON29b vào nhóm vi sinh vật có khả năng cố định

nitrogen đế tiến hành định danh.

Hình 4.3: Kết quả tương tác của 2 chủng vi sinh vật ON16a (A), ON29b

(B) lên chồi thuốc lá.

4.2.2 Khảo sát khả năng kích thích sự nảy mầm của hạt giống

50

Kết quả sau 2 ngày ủ hạt chúng tôi ghi nhận tỉ lệ hạt nảy mầm của các nghiệm thức

so với đối chứng. Các vi sinh vật phân lập trên mỗi loại môi trường (MMS vàTỉ lệ hạt nảy mầm

(%)Chủng vi sinh vật

(Nhóm 2)

Tỉ lệ hạt nảy mầm

(%)

Đc 90,00 ± 1,53 Đc 90,00 ± 1,53*

6010a 50,33 ± 2,52de 6020c 45,66 ± 3,21b

6010b 71,66 ±2.52tgh 602la 99,66 ± 0,57m

601 la 39,33 ± 3,78bc 602lb 51,00 ± 5,29bc

601 lb 35,00 ± l,00b 6027a 86,00 ± 4,5 8**

601 lc 72,66 ± 3,05tgfu 6027b 45,66 ± 3,78b

6012a 99,66 ± 0,57m 6027c 81,66 ± 1,52hlJk

6012b 68,00 ± 4,58tg 6028a 77,00 ± l,00gh

6014a 73,33 ± 12,58ghl 6028b 49,33 ± 4,04b

6014b 81,66 ± 4,16^ 6028c 27,33 ± l,53a

6015a 84,33 ± 5,51^ 6030a 80,00 ± 1,73^

6015b 44,44 ± 7,05cd 6030b 56,00 ± 2,00cd

60 lóa 79,33 ± 6,1 l1Jk 603 la 85,33 ± 1,53JK*

6016b 76,33 ± 2,08taJ 603 lb 32,00 ± 2,00a

6017a 65,33 ± 4,04* 603 lc 59,33 ± 2,52“

6017b 76,33 ±2,51MJ 603 ld 45,33 ± 2,08b

6018a 65,66 ±2,51* 603 le 80,00±3,61*“J

6018b 81,00 ± 4,00* 603 lf 74,00 ± 5,56tg

6019a 32,66 ± 2,52b 6032a 66,66 ± 3,21e

601% 57,66 ± 4,72e 6033a 79,00±4,58g*“

6019c 54,66 ± l,53e 6033b 76,33 ± 3,21gh

6019d 74,33 ± 4,04ghlJ 6034a 84,66 ± 5,511JJa

6020a 46,00 ± 5,29cd 6035a 86,33 ± 2,08*

6020b 17,00 ± l,52a 6035b 69,33 ± 6,65ef

MSo) được chúng tôi chia làm 2 nhóm đế tiến hành thống kê so sánh với đối chứng nhằm

sàng lọc các chủng có khả năng kích sự nảy mầm ở hạt.

Kết quả các nghiệm thức được thống kê và ghi nhận ở các bảng 4.3 và 4.4 Bảng 4.3 : Kết

quả khảo sát khả năng kích thích nảy mầm của các chủng vi sinh vật biến dưỡng methyl

51

Trong cùng một hàng các giá trị trung bình có kỷ tự giống nhau không có sự

khác biệt về mặt thống kê (P>0,05)

Các chủng vi sinh vật biến dưỡng methyl khi khảo sát với hạt đậu xanh chỉ có

chủng 6012a, và 6021a cho cho kết quả dương tính so với đối chứng. Cả hai chủng

đều cho kết quả nảy mầm ở tỉ lệ 99,66% so với đối chứng là 90%.

Riêng các hạt đậu xanh trong nghiệm thức của chủng 6012a cho kết quả nảy

mầm đồng đều và cây con nảy mầm khá mạnh so với đối chứng (Hình 4.4). Kết quả

tương tự cũng được ghi nhận ở chủng 602la

Các nghiệm thức còn lại đều cho kết quả âm tính khi so sánh với đối chứng.

Sự khác biệt ở kết quả thu được cho thấy: chủng 6012a và 602la có khả năng

tương tác với thực vật đặc biệt là khả năng gia tăng tỉ lệ nảy mầm của hạt giống. Sự

kích thích này có thể do hoạt tính của sản phẩm trung gian mà vi khuẩn đã tạo ra

trong quá trình trao đổi chất. Các chất có tác dụng kích thích nảy mầm của hạt được

biết rõ hiện nay bao gồm các chất: nitrat potassium, calcium, thiourê, gibberellin,

cytokinin và ethylene. Như vậy, có thể trong quá trình trao đổi chất vi khuẩn đã tạo ra

một trong số các chất trên hay một chất nào khác có tác dụng tương tự như chất hóa

học này.

Theo kết quả này chúng tôi chọn chủng 6012a và 6021a vào nhóm vi sinh vật

biến dưỡng methyl có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật cần định danh.

52

Hình 4.4: Kết quả khảo sát khả năngkích thích nảy mầm của chúng 6012aso với đối chứng sau 2 ngày.

Bảng 4.4 : Kết quả khảo sát khả năng kích thích nảy mầm của các chủng vi sinh vật

phân lập ừên môi trường MSo

Chủng vi sinh vật

(Nhóm 1)

Tỉ lệ hạt nảy mầm

(%)

Chủng vi sinh vật

(Nhóm 2)

Tỉ lệ hạt nảy mầm

(%)

Đc 89 ± 2,00h Đc 89 ± 2,001

ONlOa 46,33 ± l,53a ON23a 84,66 ±3,05h

ONlla 76 ± 2,00ef ON25a 82,66 ±2,08gh

ONllb 74 ± 2,00e ON27a 71,33 ±l,52e

ON14a 65 ± 3,00d ON28a 99,33 ±1,15*

ON16a 93 ± 3,05‘ ON28b 83,33 ±2,08gh

ON16b 73 ± 4,58e ON29a 62,33 ±2,5lc

ON18a 79,33 ±2,52tg ON29b 95,66 ±l,15Jk

ON18b 67 ±3,00“ ON30a 95 ±2,00

ON19a 59 ±4,04c ON31a 77 ±3,00t

ON19b 74 ±2,00e ON33a 80,66 ±2,52tg

ON20a 98 ±1,0Ơ ON33b 52 ±2,64a

ON21a 88 ±l,53h ON33c 57 ± 2,64a

ON21b 54 ±2,00b ON19c 66,33 ±3,05d

ON22a 65 ±2,00d ONa 71,66 ±2,08e

ON22b 81 ±2,52g ONb 78 ±2,64f

ONc 84,66 ±l,53h

Trong cùng một hàng các giá trị trung bình có kỷ tụ giống nhau không có sự khác biệt về mặt

thong kê (P>0,05)

53

Kết quả khảo sát khả năng kích thích sự nảy mầm của các chủng vi sinh vật phân

lập ừên môi trường MSo được ghi nhận và thống kê kết quả trong (Bảng 4.4)

Kết quả chúng tôi ghi nhận được ở

các chủng ON16a, ON20a, ON28a, và ON29b cho kết quả dưomg tính so với đối

chứng

Ở các nghiệm thức của chủng ON28a và ON20a hạt nảy mầm khá đồng đều cây

mầm cao lớn hom so với đối chứng. Riêng chủng ON20a cây mầm phát triễn mạnh

nhất (Hình 4.5)

Chủng ON16a và ON29b có tỉ lệ nảy mầm cao nhưng hạt nảy mầm không đồng

đều. Tuy nhiên 2 chủng này qua khảo sát kích thích tăng trưởng ở chồi thuốc lá khá tốt.

Các chủng còn lại đều cho tỉ lệ nảy mầm thấp hom so với đối chứng.

Từ kết quả này chúng tôi chọn cả 4 chủng ON16a, ON20a, ON28a, ON29b vào

nhỏm vi sinh vật cỏ khả năng cố định nitơ và kích thích sinh trưởng thực vật.ON20a Đc

Hình 4.5: Kết quả khảo sát khả năng kích hạt nảy mầm của chủng ON20a so với đốichứng.

Kết quả:

Sau quá trình sàng lọc các chủng vi khuẩn có khả năng kích thích sự sinh trưởng

của thực vật trên hai hệ thống sàng lọc (kích thích sự phát triển của chồi thuốc lá trong

điều kiện in vitro, và gia tăng tỉ lệ nảy mầm của hạt đậu xanh) chúng tôi đã chọn được

9 chủng vi sinh vật ừong 2 nhóm:

54

1. Nhóm vi sinh vật có khả năng biến dưỡng methyl gồm 5 chủng gồm: 6012a,

6019a, 6019b, 6021a, 6027a.

2. Nhóm vi sinh vật có khả năng cố định nitơ gồm các 4 chủng vi sinh vật ON16a,

ON20a, ON28a, ON29b.

Các chủng trong 2 nhóm vi sinh vật này đều có khả năng kích thích sinh trưởng

cao ở thực vật. Chúng tôi tiến hành quan sát hình thái để bước đàu phân nhóm vi sinh

vật, tạo tiền đề cho định danh các chủng vi sinh vật này.

4.3 Định danh vỉ sinh vật

4.3.1 Kết quả quan sát hình thái

55

4.3.2

Hình

dạng

Kích

thước

(mm)

Màu

sắc

khuẩn

lạc

Hình

dạng tế

bào

Khả năng

di động

Cấu

tạo

vách

tế

bào

Kích

thước tế

bào

(pm)

NhânKiểu sinh

sản

6012aTrơn 0,5-

1,4

Hồng

đỏ Que Có - 3-4 - -

6019aTrơn

2-4,5

Hồng

phấn

Nâu

camKhông Dày 11-13 Có

Nảy

chồi

6019b

Trơn

lồi

2-3

NâuBầu

dụcKhông Dày 8-9 Có

Nảy

chồi

602laNhày

2-4 CamBầu

dục Không Dày 10-11 CóNảy

chồi

6027aTrơn 0,5-

1,5Hồng Que Có - 1-3 - -

ON16aTrơn

2,5-4

Hồng

phấn

Bầu

dục Không Dày 9-11 CóNảy

chồi

ON20aNhày

2-4

Trắng

đục

Hình

trứng Không Dày 8-9 CóNảy

chồi

ON28aTrơn

2-5 Hồng Que Không Dày 13-14 CóNảy

chồi

ON29bTrơn

2-4

Hồng

phấn

Hình

trứng Không Dày 11-12 CóNảy

chồi

Bảng 4.5: Bảng t lống kê các đặc t iếm hình thái của các chủng vi sinh vật có khả

năng tương tác với thực vật

Kết quả quan sát hình thái khuẩn lạc 2 chủng 6012a và 6027a có kích thước khuẩn

lạc nhỏ, các chủng còn lại đều có kích thước khuẩn lạc lớn hơn nhiều so với hai chủng

6012a và 6027b. Đồng thời khi quan sát dưới kính hiển vi 40x các chủng 6012a và 6027a

56

có cấu tạo hình que, vách tế bào và nhân không rõ ràng, kích thước tế bào khi quan sát

bằng trắc vi thi kính ở vật kính 40x chỉ từ 1-2 (|un), và chủng đều có khả năng di dộng,

nên 2 chủng này là vi khuẩn.

Các chủng cỏ kích thước lớn hon so với hai chủng 6012a và 6027a đều có vách tế

bào rõ ràng và nhân thật, đặc biệt các chủng này đều sinh sản bằng cách nảy chồi. Từ kết

quả quan sát hình thái chúng tôi tạm thời chọn các chủng 6019a, 6019b, 602la, ON20a,

ON16a, ON28a, ON29a, vào nhóm nấm men.

4.3.3 Định danh vỉ khuẩn

4.3.2.1 Kết quả khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa ❖

Đặc điểm hình thái

Từ 25 mẫu (gồm nước, đất, lá) chúng tôi tiến hành phân lập trên môi trường

Methanol mineral salts (MMS) và thu được 2 chủng vi khuẩn có khả năng biến dưỡng

methyl, đồng thời các vi khuẩn này đều có sắc tố hồng trên môi trường MMS. Theo

Green (1992) các vi khuẩn biến dưỡng methyl, sử dụng methanol lảm nguồn cacbon cung

cấp năng lượng, có sắc tố hồng trên môi trường phân lập thì rất có khả năng là các chủng

thuộc chi Methylobacterium [11].

Tuy nhiên, để định danh chính xác hom 2 chủng vi khuẩn trên có phải là vi khuẩn

Methyỉobacterium sp. chúng tôi tiến hành khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh

hóa của 2 chủng 6012a và 6027a.

Kết quả thử nghiệm Gram

Theo các công trình nghiên cứu của Green (1992) và Gallego (2005), vi khuẩn

Methyỉobacterium sp. là những vi khuẩn Gram âm và một số có Gram biến đổi. Vì vậy,

thí nghiệm này nhằm xác định Gram của 2 chủng vi khuẩn phân lập được mà nghi ngờ là

Methylobacterium sp.

Hai chủng 6012a và 6027a được tiến hành nhuộm Gram và kết quả cho thấy cả 2

chủng đều bắt màu Gram âm (hồng đỏ). Tuy nhiên, muốn có kết quả chính xác hom, phải

tiến hành thêm các thử nghiệm khác (chẳng hạn String-test), vì một số vi khuẩn Gram

dưcmg có thể xuất hiện dưới dạng Gram âm do quá trình khử màu quá lâu hoặc sử dụng

quá nhiều cồn để khử màu, hoặc do tế bào quá già mất khả năng giữ màu của thuốc

nhuộm Crystal Violet. Hơn nữa, thuốc nhuộm để lâu ngày cũng có thể ảnh hưởng đến kết

57

quả nhuộm Gram.

Khi tiến hành thử nghiệm String test chủng 6012a cho kết quả dương tính (có khả

năng kéo sợi) vì vậy có thể kết luận chủng 6012a là vi khuẩn gram âm. Chủng 6027a cho

kết quả String test âm tính hay dương tính tùy vào thời thử nghiệm, vì vậy chúng tôi kết

luận chủng 6027a là vi khuẩn có gram biến đổi.

Bảng 4.6 : Các đặc điểm hình thái cơ bản của 2 chủng vi khuẩn

Chủng

6012a 6027aĐặc điềm hình thái

Tính di động Có Có

Màu sắc khuẩn lạc Hồng đỏ Hồng

Gram Âm Biến đổi

Đường kính tế bào (ịim) 0,4-1,1 0,5-1

Đường kính khuẩn lạc (mm) 0,5-1,4 0,5-1,5

Chiều dài tế bào (ịim) 3-4 1-3

6012a 6027íi

Hình 4.6: Hình thái tế bào qua kính hiển vi vật kính 100X. ❖

Đặc điểm sinh lýĐường tương quan tuyến tính giữa gi trị OD và mật độ tế bào

58

Đồ thị 4.1: Đường tương quan tuyến tính giữa giá trị OD610nm và mật độ tế bào.

Đường cong tăng trưởng

Ket quả của đường tương quan tuyến tính giữa OD610nm và mật độ tế bào log(N/ml)

được sử dụng để tính mật độ tế bào theo thời gian.

Dựa vào đường cong tăng trưởng, ta có thể thấy trên môi trường CMS, chủng

6012a pha ổn định kéo dài hơn, có mật độ tế bào ở pha ổn định cao hơn, thời gian

Đồ thị 4.2: Đường cong tăng trưởng của 2 chủng vi khuẩn phân lập được.

59

vào pha log nhanh hom chủng 6027a. Thời gian thích hcrp để thu sinh khối của hai chủng

là ngày thứ 3

Biểu đồ 4.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tăng trưởng của hai chủng vi

khuẩn trên môi trường dịch thể CMS sau 3 ngày nuôi cấy.

log(N/ml) 143 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7

pH

Biểu đồ 4.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tăng trưởng của hai chủng vi khuẩn

trên môi trường dịch thể CMS sau 3 ngày nuôi cấy.

□ Chủng 6012a □ Chủng 6027a

1

ị 11

•: 1

ran Ũ 1

13

12

11

10

9

8

7

:

i ■ un

7,5 8 8,5

log(N/ml) □ Chủng 6012a □ Chủng 6027a

60

Hình 4.7: Khảo sát ngưỡng nhiệt độ phát triển của vi

khuẩn 6012a và vi khuẩn 6027a.

Mật độ tế bào thường thay đổi theo pH và nhiệt độ của môi trường. Theo Green và

ctv (1992), điều kiện nhiệt độ và pH thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn

Methyỉobacterium vào khoảng 25-37°C tối ưu là 30°c , và pH trung tính [44]. Kết quả

trên hình 4.7 ta có thể thấy chủng 6027a có nhiệt độ phát triễn tốt nhất từ 25-35°C, riêng

chủng 6012a có khả năng phát triển ở nhiệt độ 30-40°C (Biểu đồ 4.5). Điều này cũng phù

hcrp khả năng thích nghi với môi trường sống của 2 chủng vi khuẩn, bởi cả 2 chủng đểu

được phân lập từ vùng rừng mưa nhiệt đới nóng ẩm Cát Tiên. Và pH thích họp cho sự

phát triển của chủng 6012a trong khoảng từ 5,5 đến 7,5 và chủng 6027a là 5,5-8 (Biểu đồ

4.6).

Đặc điểm sinh hóa❖

Khả năng sữ dụng nguồn cacbon

Đặc điểm khảo sát bao gồm đặc điếm biến dưỡng cacbon và thử nghiệm sinh hóa

Ảnh hưởng bải nhiệt độ

61

khác. Theo Green và Bousfeld (1982), hầu hết các vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium

đều có thể sử dụng acetate, ethanol, methanol; một số loài có thể sử dụng glycerol, L-

arabinose, D-xylose, D-glucose, D-fructose, L-glutamate, sebacate, D-tartrate, citrate,

monomethylamine, trimethylamine, làm nguồn cung cấp carbon và năng lượng. Kết quả

khảo sát khả năng sử dụng nguồn carbon của các chủng phân lập được cũng cho ta thấy

cả hai chủng 6012a và 6027a đều có những đặc điểm đặc trưng của chi Methylobacterium

như sử dụng D-glucose, D-fructose, L-arabinose, monomethylamine, trimethylamine,

betaine, ethanol, xylose. (Bảng 4.7)

Chủng 6012a cho kết quả dương tính với lactose. Chủng 6027a cho kết quả không

rõ ràng, Tuy nhiên, ta có thể xác định lại khả năng sử dụng nguồn đường này qua thử

nghiệm galactosỉdase (ONPG) trong bộ kit sinh hóa IDS 14GNR của công ty Nam Khoa.

Bảng 4.7 : Đặc điểm biến dưỡng carbon của hai chủng 6012a và 6027a

STT Nguồn Carbon 6012a 6027a

1 Acetate +-

2 Betaine + +

3 Citrate + -

4 D-glucose + +

5 Dimethylamine - +

7 Fructose + +

8 Lactose + d

9 L-Abrabinose + +

10 L-glutamate -

+

11 Maltose + +

12 Methylamine + +

13 Nitrate + -

14 Sebacate - -

15 Sucrose + +

16 Tartrate - +

62

17 Trimethylamine + +

18 Methane d d

19 Xylose + +

20 Ethanol + +

(+): có sử dụng; (-): không sử dụng; (d): không rõ; M. organophilum (M)

Các thử nghiệm trong bộ kít sinh hóa IDS 14GNR Dựa vào bảng kết quả thử

nghiệm IDS 14GNR (Bảng 4.8), (Hình 4.8), ta thấy chủng 6027a cho kết quả tạo vòng

indol rất rõ. Vì thế, chủng 6027a có khả năng tổng hợp phytohormone, kết quả này phù

hợp với kết quả khảo sát khả năng kích thích sinh trưởng ở thực vật. Chủng 6027a có khả

năng tạo mô sẹo từ mặt cắt ở chồi cấy. Chủng 6027a còn có khả năng sử dụng lactose khi

cho phản ứng dưomg tính với galactosidase, đồng thời nó cho kết quả dưong tính lên men

glucose, không tiết enzyme urease.

Chủng 6012a có khả năng khả năng tiết ra enzyme Urease, hoạt tính Catalase,

Oxidase dưomg tính, và không có khả năng sinh H2S.

Cả hai chủng đều có khả năng di động khi đường cấy trong môi trường thạch

mềm của LDC bị nhòe.

Bảng 4.8: Bảng kết quả thử nghiệm sinh hóa IDS 14 GNR và hoạt tính Catalase

63

STT Phản ứng sinh hóa 6012a 6027a

1 Lên men glucose -

+

2 Khử Nitrate - -

3 Galactosidase + +

4 Urease - -

5 PDA - -

6 Citrate -

+

7 Esculin - -

8 Sinh H2S- -

9 Sinh Indole d +

10 V oges-Poskauer - -

11 Sử dụng Malonate - -

12 Oxydase + +

13 LDC + +

14 MOT (di động) + +

15 Catalase + +

(+): có sử dụng; (-): không sử dụng; (d): không rõ

6012a6027a

*♦* lKắrtí^^t]iy*^aăil|Ị|iĩftglÌÌífcndạỉrti hóa IDS 14 GNR của hai chủng vỉ khuẩn.

64

Qua việc tiến hành thí nghiệm khảo sát khả năng cố định đạm của 2 chủng vi khuẩn

phân lập được, chúng tôi thu được các kết quả như sau:

Trên dịch lỏng NMS có bổ sung bromothymol blue, sau 3 ngày nuôi cấy lắc 100

vòng/phút ở 25-30°C. Kết quả có sự phát triển vi khuẩn làm thay đổi pH của môi trường,

thể hiện qua sự thay đổi màu của môi trường (Hình 4.9). Sự phát triển của 4 chủng này trên

môi trường MS không Nitrogen, chứng tỏ cả 4 chủng này đều có khả năng cố định đạm, tự

cung cấp nguồn nitrogen để phát triển.

Hình 4.9: Ket khảo sát khả năng cố định nitơcủa hai chủng 6012a và 6027a.

Sinh tổng họp PHB❖

Sau khi nhuộm sinh khối vi khuẩn với thuốc nhuộm Nile Blue A, và quan sát qua

kính hiển vi huỳnh quang bước sóng 460nm, kết quả cho thấy: trong 2 chủng quan sát thì

chỉ có 6012a bắt màu rất tốt, chứng tỏ chủng 6012a có khả năng tích lũy một lượng lớn

PHB (Hình 4.10), chủng 6027a không bắt màu cam sáng.

6012a Đối chứng 6027a

65

Hình 4.10: Kết quả định tính PHB của chủng 6012a dưới kính hiển vi huỳnh quang bươc

sóng 460nTT1

Theo Ackermann (1995), đa số các loài vi khuẩn thuộc chi Methylobaterium đều có

khả năng sinh tổng hợp PHB, nhưng lượng PHB tạo ra ở mỗi loài khác nhau và phụ thuộc

vào môi trường nuôi cấy. Như vậy, dựa trên trên kết quả thu được, ta có thể kết luận chủng

6012a có khả năng sinh tổng hợp PHB.

Nhựa PHB có rất nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau [1]. Vì vậy, nếu có

điều kiện nên định lượng chính xác lượng PHB do những chủng này tiết ra là bao nhiêu để

từ đó có thể thu nhận và đưa vào sản xuất ứng dụng .

Qua khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của hai chủng 6012a và 6027a

tưomg đồng với các đặc điếm của Methylobacterium organophilum (loài chuẩn của chi

Methylobacterium). Vì vậy, cả hai chủng trên đều thuộc chi Methyỉobacterium. Tuy nhiên

cần phân tích trình tự rDNA 16S để có cơ sở vững chắc hom.

Bảng 4.9: Bảng tổng kết các đặc điểm hình thái sinh lý sinh hóa của 2 chủng vi khuẩn

STT Đặc điểm 6012a 6027a

1 Tính di động Có Có

66

2 Màu sắc khuẩn lạc Hồng đỏ Hồng

3 Gram Ảm Biến đổi

5 Đường kính khuẩn lạc (mm) 0,5-1,4 0,5-1,5

4 Đường kính tế bào (|im) 0,4-1,1 0,5-1

6 Chiều dài tế bào (ịim) 3-4 1-3

7 Tính di động Có Có

8 pH 5,5-7,5 5,5-8

8 Nhiệt độ thích hợp 30-40 25-35

9 Acetate + -

10 Betaine + +

11 Citrate +-

12 D-glucose + +

13 Dimethylamine - +

14 Fructose + +

15 Lactose + d

16 L-Abrabinose + +

17 L-glutamate 1 +

17 Maltose + +

18 Methylamine + +

19 Nitrate + -

20 Sebacate - -

21 Sucrose + +

22 Tartrate 1 +

23 Trimethylamine + +

24 Methane d d

25 Xylose + +

26 Ethanol + +

26 Lên men glucose 1 +

67

27 Khử Nitrate - -

28 Galactosidase + +

29 Urease - -

30 PDA - -

31 Citrate - +

32 Esculin - -

33 Sinh H2S- -

34 Sinh Indole d +

35 V oges-Poskauer - -

35 Sử dụng Malonate- -

36 Oxydase + +

37 LDC + +

38 MOT (di động) + +

39 Catalase + +

40 Khả năng cố định Nitrogen + +

41 Tích lũy PHB + -

4.3.2.2 Phân tích trình tự rDNA 16S ❖

Tách chiết DNA

Muốn phân tích trình tự rDNA 16S thì trước hết phải có được DNA bộ gen của các

chủng cần phân tích. Vì vậy, bước đầu tiên phải tiến hành tách chiết DNA bộ gen của vi

khuẩn theo quy trình của Roger s.o và Bendich A.J. (1994). Kết quả thu

được cho thấy: DNA bộ gen của 2 chủng vi khuẩn 6012a, 6027a đạt chất lượng để thực

hiện phản ứng PCR (Hình 4.11) (Bảng 4.10).12 3 41 5

68

DNA tổng số

Hình 4.11: DNA bộ gen của các chủng vi khuẩn.

Giếng 1: Chủng 6012a

Giếng 2: chủng 6027a

Giếng 3: thang lOObp- l,5kb

Giếng 4: Methylobacterium extorguens JCM 2802T

Giếng 5: E.coli DH5a

Bảng 4.10: Nồng độ và độ tinh sạch DNA bộ gen của 4 chủng phân lập được ghi nhận

qua máy đo Nanodrop

Chủng 6012a 6027a

Nồng độ DNA(ng/pl) 1335,2 1253,4

Độ tinh sạch DNA 1,81 1,80

Kết quả khuếch đại trình tự 16S rDNA bằng phản ứng PCR❖

PCR với cặp mồi 2F, 2R: cặp mồi này cho kết quả dương tính ở cả 7 loài

Methylobacterium.[Nishio 1997]. Vì vậy, cặp mồi này có thể được dùng để định danh vi

khuẩn cỏ thuộc chi Methylobacterium. Kết quả điện di PCR cho thấy cả 2

chủng vi khuẩn phân lập được đều cho kết quả dương tính cho vạch tại vị trí 234bp

(Hình 4.12). Vì vậy, cả 2 chủng này đều thuộc chi Methylobacterium.

69

Hình 4.12: Sản phẩm PCR với cặp mồi (2F,2R).

1: DNA khuôn E. coli DH5a (chứng âm)

2: DNA khuôn M. extorguens JCM 2802T (chứng dương)

3: DNA khuôn chủng 6012a 4: DNA khuôn chủng 6027b

5: Thang DNA 100 bp

Các phân tích trên trình tự rDNA 16S nguyên vẹn, chúng tôi chỉ có điều kiện tiến

hành trên chủng 6012a với các kết quả như sau:

+ Khuếch đại trình tự 1500Nu với cặp mồi (27F,1525R).

Hình 4.13: Sản phẩm PCR với cặp mồi 27F-1525R.

1: Thang DNA 100 bp -1,5 kb

2: DNA khuôn M. extorquens JCM 2802T (chứng dương)

3: DNA khuôn chủng 6012a 4: Không có DNA khuôn (chứng âm)

Qua hình 4.13 cho thấy, chúng tôi đã khuếch đại thành công trình tự rDNA 16S của chủng 6012a. Sản phẩm này

được tinh chế và tiến hành kiểm tra sự bắt cặp của các cặp mồi trong (520F, 920R)

Kiểm chứng sự bắt cặp của các cặp mồi trong

Sản phẩm rDNA 16S có kích thước 1500 Nu là rất lớn. Nếu giải trình tự DNA này thì sẽ cho kết quả chính xác ở

các trình tự cuối. Thông thường, với phương pháp giải trình tự trực tiếp thi tín hiệu rõ và chính xác trong khoảng 500

nucleotìde. Vì thế, phải sử dụng trình tự được giải mã với các cặp mồi bên trong (520F; 520R; 920F; 952R), cặp mồi bao

ngoài (27F, 1525R) để có thể thu được một

1

trình tự rDNA 16S trọn ven. Nhưng trước khi giải trình tự phải kiểm tra cặp mồi bên trong

có bắt cặp trên trình tự rDNA 16S của chủng 6012a.

Ket quả được minh họa ở hình:

Hình 4.14: Sản phẩm PCR với cặp mồi 520F-920R.

1: không có DNA khuôn (chứng âm)

2: DNA khuôn M. extorquens JCM 2802T (chứng dưomg)

3: DNA khuôn chủng 6012a 4: Thang DNA 100 bp - 1,5 kb

Giếng 3 dưomg tính, với trình tự DNA khoảng 500 nucleotide. Như vậy. các cặp mồi

bên trong có bắt cặp trên trình tự rDNA 16S của chủng 6012a và các cặp mồi (27F, 520F,

520R, 920F, 920R và 1525R) thích hcrp để khuyếch đại và giải trình tự rDNA 16S của chủng

6012a.

Giải trình tự❖

Kết quả giải trình tự (được trình bày ở Phụ lục) sau khi xử lý bằng phần mềm fast

PCR cho thấy trình tự rDNA 16S của chủng 6012a đã được giải chính xác và gần như nguyên

vẹn (1479 nucleotide). Kết quả so sánh với tất cà các trình tự trên

4 5QQ bp

* 400 bp

2

ngân hàng gen và phần mềm BLAST cho thấy chủng 6012a có độ tương đồng di

truyền khá cao so với các loài M. extorquens, M. dichloromethanicum, M. zaừnanii, M.

Chloromethanicum (Bảng 4.11). Ket quả vẽ cây phát sinh loài (Hình 4.6) cho thấy chủng

6012a có mối quan hệ gần với loài M. zatmanii. Nhưng khi so sánh hệ số tương đồng di

truyền Jaccard (Sj) với 4 loài Methylobacterium sp. trên thì độ tương đồng khá nhỏ (40-

60%) (Bảng 4.11).

Kết quả này có thể khẳng định chủng 6012a là một loài mới khác với loài M.

zaừnanii.

Bảng 4.11: Hệ số tương đồng di truyến của chủng 6012a với các loài Methylobacterium sp.

đã được công bố

Loài

Độ tưong đồng di truyền

dựa trên BLAST (NCBI)

(%)

Độ tương đồng di truyền

dựa trên hằng số Jascard(%)

M. extorquens 99 40

M. dichloromethanicum 99 60

M. zaừnanii 99 60

M. chloromethanicưm 99 50

68

3

------------------M. chloromethanicum CM4T (AF198624)

M. dichloromethanicum DSM 6343T (AB17563 M. zatmanii JCM 2819T

(D32230)

10ũ r M. fujisawaense DSM 5686T (AJ250801)

63^- M. oryzae CBMB20T (AY683045)

--------------------Methylorhabdus multiiorans DM13T (AF0048

0.01

Hình 4.15: Mối quan hệ phát sinh loài của chủng 6012a với tất cả các chủng chuẩn của các

loài Methylobacterium đã và sẽ công bố trong năm 2007 dựa trên trình tự rDNA 16S nguyên

vẹn.

96Ị

39

99

57

50

55

3255

19

60

91

í 1

-6012 (Nam cattien)

----------------M. lusitanum RXVIT (AY009403)------------M. podarium FM4T

(AF514774)

M. populi BJ001T (AY251818)

97I— M. thiocyanatum ALL/SCN-

PT(U58018) M. aminovorans JCM 8240T

(AB175629)

M. extorquens JCM 2802T (D32224)

— M. rhodesianum JCM 2810T

(D32228)

17

9ỉr'3 L_

M. suomiense NCIMB 13778T(AB175645)

------M. salsuginis NCCB

100140T(EF015478)

---------M. rhodinum JCM 2811T (D32229)

M. aquaticum GR16T (AJ635303)

80

100

- M. isbiliense AR24T (AJ888239)

--------M. nodulans ORS 2060T (AF220763)

M. organophilum JCM 2833 (D32226)

100 I-----M. adhaesiium AR27T (AM040156)

'-----M. goesingense ÍEII3T (AY364020)

M. jeotgali S2R03-9T (DQ471331)

--------------M. hispanicum GP34T

(AJ635304)80

95

-----M. mesophilicum JCM 2829 (D32225)

-----M. radiotolerans JCM 2831 (D32227)

4

Cây phát sinh loài được xây dựng bằng phương pháp neighbor-joining; chữ số ở giao

điểm các nhánh là phần trăm bootstrap từ 1000 lần lặp lại; Methylorhabdus multivorans

DM13T là chủng ngoài nhóm.

Kết quả định danh 2 chủng vi khuẩn có khả năng kích thích sinh trưởng ở thực vật cho

thấy cả 2 chủng vi khuẩn 6012a và 6027a đều thuộc chi Methylobacterium sp. Riêng chủng

6012a sau khi phân tích trình tự rDNA 16S 1479 nucleotide có thể kết luận 6012a là một loài

mới. Kết quả này sẽ chính xác hom khi có điều kiện xác định thành phần G+C, tỉ lệ phần

trăm lai DNA-DNA của chủng 6012a và M. zatmanii và thành phần acid béo.

4.3.4 Định danh nấm men

Các chủng nấm men có khả năng kích thích sinh trưởng trên thực vật phân lập ở vườn

Quốc Gia Cát Tiên được chúng tôi định danh dựa trên khóa phân loại Lodder trên cơ sở các

đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa đặc trưng.

4.3.3.1 Quan sát các đặc điểm hình thái nấm men

Định danh nấm men bằng phương pháp truyền thống, trước tiên cần xác định các đặc

điểm hình thái của nấm men như: màu sắc khuẩn lạc, hình dạng tế bào, sự tạo thành bào tử

nang, khuẩn ty giả, khuẩn ty thật,, kiểu sinh sản...

Sau khi tiến hành quan sát hình thái nấm men ừên chúng tôi thu được các kết quả sau:

Tất cả các chủng nấm men quan sát đều có khả năng sinh sản kiểu nảy chồi đa hướng.

Sau đây là các đặc điểm hình thái của từng chủng:

6019a: khuẩn lạc màu hắng đục, tế bào hình bầu dục, nảy chồi đa hướng, nang bào tử

hình thoi, mỗi nang có chứa trên 2 bào tử, nang bào tử không có phần phụ hình roi.

6019b: có khuẩn lạc màu nâu cam, tế bào hình bầu dục, kiểu sinh sản là nảy chồi đa

hướng, nang bào tử hình cầu nhẵn khó vỡ, có 1 đến 2 bào tử.

6021a: có khuẩn lạc màu cam hồng, tế bào hình bầu dục, tế bào nảy chồi nhiều phía,

không có nang bào tử, với đông bào tử.

ON16a: có khuẩn lạc màu hồng phấn, tế bào hình bầu dục, sinh sản nảy chồi đa

hướng, nang bào tử hình bầu dục dễ vỡ

ON20a: có khuẩn lạc hắng đục, tế bào hình trứng, có kiểu sinh sản là nảy chồi

đa hướng, nang bào tử hình cầu nhẵn khó vỡ có 1 đến 2 bào tử.

5

ON29b: màu hồng cam, nảy chồi đa hướng, nang bào tử hình sao thổ, chín dễ

vỡ, có nhiều hom 2 hai bào tử.

ON28a: khuẩn lạc nâu cam sần sùi, không tạo nang bào tử, có bào tử đom, tạo

thành khuẩn ty thật và sinh bào tử đốt.

Bảng 4.12: Đặc điểm hình thái của các chủng nấm men.

6

4.3.3.2 Các đặc điểm sinh lí, sinh hóa

Các kết quả về đặc điểm sinh 11, sinh hóa: khả năng đồng hóa các nguồn

cacbon, khả năng sử dụng nitrat, khả năng lên men đường glucose được trình bày

ừong các bảng sau:

Chủng6019a 6019b 602 la ON16a ON20a ON29b ON28a

Sinh khí 0 0 0 0 0 0 0

Sinh ethanol - - - - - - -

Bảng 4.13: Khả năng đồng hóa nguồn carbon và đồng hóa nitrat

Đặc tínhChủng

6019a 6019b 6021 a ON16a ON20a ON29b ON28a

Đồng hóa nguồn carbon

Glucose + + + - + + +

Fructose + + +-

+ + +

Maltose + + + - + + +

Succrose + + - + + + +

Lactose + + + + + + +

Glutamate + + + + + + +

Sebacate + + d - - - -

Citrate + D +- - - -

Betain + + + + - - -

Trimethylamin - - - - - - -

Tartrate + + + + + + +

Inositol + + - - - + +

Đồng hóa Nitrate- - - - - - -

Từ các đặc điểm hình thái sinh lý, sinh hóa của các chủng nấm men có khả năng

kích thích sinh trưởng trên thực vật, và dựa vào khóa phân loại nấm men đến giống

Bảng 4.12: Khả năng lên men đường Glucose

Có sinh ethanol: (+) Sinh khí: (K)Không sinh ethanol: (-) Không sinh khí: (0)

(+): có sử dụng; (-): không sử dụng; (d): không rõ

7

của Lodder chúng tôi có các kết quả ghi nhận sau:

Chủng 6019a: khuẩn lạc màu trắng đục, tế bào hình bầu dục, nảy chồi đa hướng,

nang bào tử hình thoi, mỗi nang có chứa trên 2 bào tử trở lên, không phần phụ hình

roi, không lên men Glucose, không đồng hóa nitrate, nên có nhiều điểm tưomg đồng

với giống Cocidiascusc.

Chủng 6019b: có khuẩn lạc màu nâu cam, tế bào hình bầu dục, kiểu sinh sản là

nảy chồi đa hướng, nang bào tử hình cầu nhẵn khó vỡ, có trên 2 bào tử, không lên men

glucose, không đồng hóa nitrate, nên có nhiều điểm tương đồng với giống Pichia.

Chủng 6021a: có khuẩn lạc màu cam hồng, tế bào hình bầu dục, tế bào nảy chồi

nhiều phía, không tạo nang bào tử, với đông bào tử, không lên men glucose, không

đồng hóa inositol, có tạo thành họp chất tạo tinh bột khi khảo sát thêm với thuốc thử

Lugol, nên chủng này có nhiều điểm tương đồng với giống Rhodotorula.

Chủng ONlổa: có khuẩn lạc màu hồng phấn, tế bào hình bầu dục, sinh sản nảy

chồi đa hướng, nang bào tử hình bầu dục dễ vỡ, không lên men glucose, không đồng

hóa nitrate, nên có nhiều điểm tương đồng với giống Pichia.

Chủng ON20a: có khuẩn lạc trắng đục, tế bào hình trứng, có kiểu sinh sản là

nảy chồi đa hướng, nang bào tử hình cầu nhẵn khó vỡ có 1 đến 2 bào tử, không lên

men glucose, không đồng hóa nitrate, có nhiều điểm tương đồng với giống Pichia.

Chủng ON29b: màu hồng cam, nảy chồi đa hướng, nang bào tử hình trứng, chín

dễ vỡ, có nhiều hơn 2 hai bào tử, không lên men glucose, không đồng hóa nitrate, có

nhiều điểm tương đồng với giống Pichia.

Chủng ON28a: khuẩn lạc nâu cam sần sùi, không tạo nang bào tử, sinh sản bằng

cách nảy chồi nhiều hướng, có bào tử đơn, tạo thành khuẩn ty thật và sinh bào tử đốt,

không lên men glucose, không đồng hóa niừate, có nhiều điểm tương đồng với giống

Endomycopsis.

Chương V

KỂT LUẬN - ĐỀ NGHỊ

7.1 Kết luận

Qua đề tài chúng tôi thu được các kết quả như sau:

8

Phân lập và làm thuần trên 2 môi trường chọn lọc MMS (khoáng MS+1%

methanol) và môi trường MSo (môi trường MS loại bỏ các thành phần chứa nitrogen)

chúng tôi thu được 75 chủng vi sinh vật từ vườn Quốc Gia Cát Tiên. Trong đó có 45

chủng trên môi trường MMS và 30 chủng trên môi trường MSo.

Qua khảo sát trên 2 hệ thống sàng lọc (chồi thuốc lá trong điều kiện in vitro, kích

thích hạt nảy mầm của hạt đậu xanh trong điều kiện in vivo), chúng tôi chọn lọc được

9 chủng vi sinh vật có khả năng kích thích sinh trưởng ừên thực vật bao gồm:

+ 2 chủng vi khuẩn (6012a; 6027a) và 3 chủng nấm men (6019a; 6019b; 602la)

biến dưỡng methyl

+ 4 chủng nấm men (ON16a; ON20a; ON28a; ON29b) có khả năng cố định nitơ

Ket quả định danh:

+ Chủng 6012a và 6027a được định danh tới cấp độ giống là vi khuẩn thuộc chi

Methylobacterium. Riêng chủng 6012a có thế là một loài mới.

+ Các chủng 6019a, 6019b, 6021a, ON16a, ON20a, ON28a, ON29b là nấm men

và có đặc điểm tưomg đồng với các giống nấm men sau:

- Các chủng 6019b, ON16a, ON20a, ON29b có điểm tưomg đồng với giống

Pichia

- Chủng 6019a có điểm tưomg đồng với giống Cocidiascusc

- Chủng 602la có điểm tương đồng với giống Rhodotorula

- Chủng ON28a có điểm tương đồng với giống Endomycopsis

7.2 Đề nghị

Từ các kết quả thu được, chúng tôi có những đề nghị sau:

Tiếp tục định tới cấp độ loài hai chủng vi khuẩn 6012a và 6027a và các chủng

nấm men: 6019a, 6019b, 6021a, ONlỗa, ON20a, ON28a, ON29b.

Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động của các chủng này lên sự kích thích sinh

trưởng ở thực vật.

Chọn lọc các chủng có hoạt tính cao, triển khai nghiên cứu ứng dụng các chủng

này vào quá trình sản xuất nông nhiệp.

9

TÀI LIỆU THAM KHẢO

________ ______ Ị___IT11 • 1« Ạ rpi A ■* Tm

Ạj

Tài liệu Tiêng Việt

1. Kiều Phương Nam (2005), “Phân lập, định danh và klhảo sát sự tác động của

vi khuẩn Methylobacterium sp. lên sự phát sinh hình thái ở thực vật”, Luận văn

Thạc sĩ Sinh học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, ĐHQG Tp. Hồ Chí Minh.

2. Nguyễn Đức Lượng (2002), “Thí nghiệm công nghệ sinh học, tập 2, Thí

nghiệm vi sinh vật học”, NXB Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh, ừ. 3 - 67,

260 -291,445

3. Tràn Linh Thước (2002), “Phưomg pháp phân tích vi sinh vật trong nước,

thực phẩm và mỹ phẩm”, Nhà xuất bản Giáo Dục, ừ. 43-100

4. Tràn Linh Thước, (2002), “Thực tập vi sinh vật học”, nhà xuất bản đại học

quắc gia Tp. Hồ Chỉ minh: 418 - 462

5. Trần Linh Thước (2004), “Vi sinh vật học cơ sở”, Trường Đại học khoa học tự

nhiên, ĐHQG Tp. Hồ Chí Minh

Tài liệu nước ngoài

6. Ashelford, K. E., Day, M. J., & Fry, J. c. (2003). Elevated abundance of

bacteriophage iníecting bacteria in soil. Appl. Environ. Microbiol., 69, 285-

289.

7. Araùujo W.L., Maccheroni W.Jr., Aguilar-Vildoso C.I Abdoulaye Sy,

Giraud E., Jourand p., Garica N., Willems A., De Lajudie p., Prin Y.,

Neyra M., Gillis M., Boivin-Masson c., Dreyfus B. (2001 ),”Methylotrophic

10

Methylobacterium bacteria nodulate and fix-nitrogen in symbiosis with ỉegumes”,

Joumal of Bacteriology, vol. 183, No. 1, pp.214-220.

8. Barroso P.A.V., Saridakis H.O., Azevedo J.L. (2001), “Variability and

interractions between endophytìc bacteria and fungi isolated from leaf tissues

of citrus rootstocks”, Cannada Joumal Microbiol, Vol. 47, pp. 220-236

9. Green p. N., (1962), “The Genus Methylobacterium. In Balows A., Truper H.

G., Dworkin M., Harder V., Schleifer K. H. (et) The Prokaryote, 2nd

ed„ Springer-Yerlag, Berlin: 2342-2345.

10. Holland M. Ả., Polacco J. c. (1994). “PPFMs and other covert contaminants: is

there more to plant physiology than just plant?”, Plant Physiology, Vol. 45, pp.

197-20911. Holt J.G., Krieg N.R., Sneath P.H.A., Staley J.T., Williams S.T.

(1994),”Bergey’s Manuaỉ of Determinative Bacterioỉogy”, Ninth Edition, The

Williams and Willins Company, pp. 88-145.

12. Kato Y., Asahara M., Arai D., Goto K., Yokota A. (2005), “Reclassitĩcation of

Methylobacterìum chloromethaneicum and Methylobacterium dichloromethanicum as

later subjective synonyms of Methylobacterium extorquens and of Methylobacterium

lusitanum as a later subjective synonym of Methyỉobacterium rhodesianurri”, J.Gen.

Appl. Microbiol., Vol.51, pp 287-289.

13. Khaled A. El-Tarabily, Krishnapillai Sivasithamparam (2006) Potentìal of

yeasts as biocontrol agents of soil-bome íungal plant pathogens and as plant

growth promoters (The Mycological Society of Japan and Springer- Verlag

Tokyo

14. Kobayashi, D. Y., & Palumbo, J. D. (2000). Bacterial endophytes and ứieir

effects on plants and uses in agriculture. In c. w. Bacon & J. F. White, Jr. (Eds.),

11

Microbial Endophytes (pp. 199-233). New York: Marcel Dekker, Inc.

15. Koenig R. L., Morris R. o., Polacco J. c. (2002). “tRNA is ứie source of low-

level trans-zeatin production in Methylobacterium spp”, Journal of bacteriology,

Vol. 184, No. 7, pp. 1832-1842

lổ.Madhaiyan M., Poonguzhali s., Lee H.S., Hari K., Sundaram S.P., Sa T.M.

(2005), “Pink-pigmented íacultative methylotrophic bacteria accelerate

germination, growứi and yield of sugarcane clone Co86032 (Saccharum

officinarum L.), Biol Fertil Soils, 41: 350-358.

17. Omer z., s. Tombolini R., Gerhardson B., (2004), “Plant colonization by

pink-pigmented íacultative meửiylotxophic bacteria (PPFMs)”, FẼMS

Microbiology Ecology 47: 319 -326.

18. Samuel s. Gnamanickam, (2006) “ Plant-Associated Bacteria”. Springer

19. Vessey. J. K, (2003). “Plant growứi promoting rhizobacteria as biofertilizers”

Plant Soil, 255, 571-586.

Tài liệu từ internet

20. http://www.micro.biol.ethz.ch/research/vorholt

21. httpT :T//www.bandwidthmarket.com/resources/patents/apps/200/s~/200100

01Q95.html22. httpT:T//www.istc.ru/istc/db/pra.nsf/pran/2152

23. httpT :T//www.vaec.gov.vn

Phụ lục 1: Các loại môi trường

1/ Thành phần môi trường Methanol Minerol Salts (MMS):K2HPO4....................... ............1.20 g

KH2PO4................ ............0.62 g

CaCl2.6H20................ ............0.05 g

MgS04.7H20.............. ............0.20 gNaCl .............0,10 g

FeCl3.6H20................ ............1.0 mg

(NH4)2so4........... ............0.5 pg

CUS04.5H20.............. ............5.0 ịig

MnS04.5H20.............. ............10.0 pg

Na 2MO04.2H20 ........ ............10.0 pg

H3BO3 .............10.0 pg

ZnS04........................ ............70.0 pg

COC12.6H20 ............. ............5.0 pgNước cất................... ............vừa đủ lOOOml

pH = 7.0Bổ sung thêm 1% Methanol sau khi hấp vô trùng.

PHỤ LỤC

2

Skoogl: (mg/I)

KNO3........................... .........1900

NH4NO3...................... .........1650

KH2PO4....................... .........170

CaCl2.6H20................... .........440

MgS04.7H20................. .........370

Skoog II: (mg/1)FeS04.7H20................... .........27,85

Na 2EDTA3................... .........7,25

Skoog III: (mg/I)MnS04.4H20................ .........22,3

ZnS04.7H20................. .........8,6

H3BO3 ..........6,2

KI................................ .........0,83

Na 2MO04.2H20 ........... .........0,25

CUS04.5H20................. .........0,025

COC12.6H20 ................ .........0,025Nước cất...................... .........vừa đủ lOOOml

3/ Thành phầnmôi trường MSo (None-nitrogen MS)

Skoog I: (mg/I)KC1............................. .........1900

KH2PO4.......................... .........170

CaCl2.6H20.................. .........440

MgS04.7H20................. .........370Skoog II: (mg/I)

FeS04.7H20.................. .........27,85

Na 2EDTA3.................. .........7,25

Skoog III:(mg/1)

MnS04.4H20................. .........22,3

ZnS04.7H20................. .........8,6H3BO3 ..........6,2

KI................................. .........0,83

Na 2MO04.2H20 ........... .........0,25

CUS04.5H20................. .........0,025

COC12.6H20 ................ .........0,025Nước cất...................... .........vừa đủ lOOOml

Phụ lục.2: Khảo sát khả năng tương tác thực vật của các chủng vi sinh vật biến dưỡng methyl

trên môi trường MS

Chiều cao chồi thuốc lá so với đối chứngAnalysis of variance

Sơurce of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level

Between groups 3333.8370 8 416.72963 204.152 .0000Within groups 257.2000 126 2.04127

Total (corrected) 3591.0370 134

Table of means for TLAMMS1. chieu cao byTLAMMS1 . NT

stnd. Error stnd. Error 95 %LSDLevel Count Average (internal) (pooled s) intervalsfor mean

0 15 13.733333 .4827172 .368896513.217005 14.2496621 15 8.866667 .3500567 .36889658.350338 9.3829952 15 7.733333 .2481679 .36889657.217005 8.2496623 15 18.733333 .4193722 .368896518.217005 19.2496624 15 19.266667 .4078593 .368896518.750338 19.7829955 15 6.533333 .2905933 .36889656.017005 7.0496626 15 7.866667 .2737163 .36889657.350338 8.3829957 15 8.666667 .3737413 .36889658.150338 9.1829958 15 17.933333 .4078593 .368896517.417005 18.449662

Total 135 12.148148 .1229655 . 122965511.976039 12.320258

Multiple range analysis for 'rLAMMSl.chieu cao by TLAMMS1.NT

Method: 95 Percent LSDLevel Count Average Homogeneous Groups

5 15 6.533333 X2 15 7.733333 X6 15 7.866667 XX

4

7 15 8.666667 XX1 15 8.866667 X0 15 13.733333 X8 15 17.933333 X3 15 18.733333 XX4 15 19.266667 Xcontrast difíerence limits0-1 4^86667 1.03266 *

o 1 ISJ 6.00000 1.03266 *

o 1 -5.00000 1.03266 *1o

-5.53333 1.03266 *0-5 7.20000 1.03266 *0-6 5.86667 1.03266 *0-7 5.06667 1.03266 *001o

-4.20000 1.03266 *

Chiều dài rễAnalysis of variance

Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level

Between groups Within groups

12556.000 8 6340.933 126

1569.5000 31.187 .0000 50.3249

stnd. Errorstnd. Error 95 %LSD

Level Count Average (internal)(pooled s) intervalsfor mean

0 15 49.066667 1.9333333 1.8316635 46.502968 51.6303651 15 44.066667 1.7980589 1.8316635 41.502968 46.6303652 15 53.066667 1.7000467 1.8316635 50.502968 55.6303653 15 55.866667 2.0397634 1.8316635 53.302968 58.4303654 15 61.533333 2.0210009 1.8316635 58.969635 64.0970325 15 51.133333 1.7206496 1.8316635 48.569635 53.6970326 15 44.800000 1.8903263 1.8316635 42.236301 47.3636997 15 40.066667 1.7139947 1.8316635 37.502968 42.6303658 15 73.600000 1.6177586 1.8316635 71.036301 76.163699

Total 135 52.577778 . 6105545 .6105545 51.723212 53.432344

Multiple rangeanalysis for TLAMMSR.Cd re 2 by TLAMMSR.NT

Method: 95 Percent LSDLevel Count Average Homogeneous Groups

7 15 40.066667 X1 15 44.066667 XX6 15 44.800000 XX0 15 49.066667 XX5 15 51.133333 XX2 15 53.066667 XX3 15 55.866667X

Total (corrected) 18896.933 134Table of means for TLAMMSR.Cd_re_2 by TLAMMSR.NT

5

contrast difíerence limits0-1 5^00000 5.12740

o 1 -4.00000 5.127400-3 -6.80000 5.127400-4 -12.4667 5.127400-5 -2.06667 5.127400-6 4.26667 5.12740

o 1 9.00000 5.12740

o 1 0 0 -24.5333 5.12740

• Trọng lượng tưo'iAnalysis of variance

Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level

Betvỉeen groups 211571.41 8 26446.426 19.056 .0000Within groups 24981.33 18 1387.852

Total (corrected) 236552.74 26

Table of means for TLAMMST. .rm tuoi by TLAMMST.NT

stnd. Error stnd. Error 95 %LSDLevel Count Average (internal) (pooled s) intervalsfor mean

0 3 486.00000 6.506407 21.508540 454.03960 517.960401 3 477.66667 34.901449 21.508540 445.70627 509.627062 3 430.33333 13.220355 21.508540 398.37294 462.293733 3 600.66667 29.475037 21.508540 568.70627 632.627064 3 572.66667 34.299336 21.508540 540.70627 604.627065 3 339.66667 9.024658 21.508540 307.70627 371.627066 3 377.33333 10.268615 21.508540 345.37294 409.293737 3 437.66667 21.403530 21.508540 405.70627 469.62706

8 3 593.33333 6.173420 21.508540 561.37294 625.29373

Total 27 479.48148 7.169513 7.169513 468.82802 490.13495

Multiple! range analỵsis for TL.AJMMST.rm tuoi bỵ TLAT4MST.NT

Method: 95 Percent LSDLevel Count Average Homogeneous Groups

5 3 339.66667 X6 3 377.33333 XX2 3 430.33333 XX7 3 437.66667 XX1 3 477.66667 X0 3 486.00000 X4 3 572.66667 X8 3 593.33333 X

1515

48

61.53333373.600000

6

3 3 600.66667 X

contrast difference limits

7

0 - 1 8.33333 63.92080 - 2 55.6667 63.92080 - 3 -114.667 63.9208★0 - 4 -86.6667 63.9208★0 - 5 146.333 63.9208★0 - 6 108.667 63.9208★0 - 7 48.3333 63.92080 - 8 -107.333 63.9208★

• Trọng lượng khô

Sơurce of variationSum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level

Between groups 211571.41 8 26446.426 19.056 .0000Within groups 24981.33 18 1387.852

Total (corrected) 236552.74 26

LevelCount Average stnd. Error

(internal)stnd. Error {pooled s)

95 % intervals

LSDfor mean

0 3 78.33333 4.3716257 3.7957091 72.69314 83.973531 3 73.33333 4.9103066 3.7957091 67.69314 78.973532 3 59.33333 1.8559215 3.7957091 53.69314 64.973533 3 108.00000 3.2145503 3.7957091 102.35980 113.640204 3 107.66667 5.7831172 3.7957091 102.02647 113.306865 3 53.00000 2.3094011 3.7957091 47.35980 58.640206 3 58.66667 1.4529663 3.7957091 53.02647 64.306867 3 63.33333 2.3333333 3.7957091 57.69314 68.97353

8 3 89.00000 5.1316014 3.7957091 83.35980 94.64020

Total 27 76.74074 1.2652364 1.2652364 74.86068 78.62081

Multiple! range analysis for TLAMMST.rm tuoi by TLAMMST.NT

Method: 95 Percent LSDLevel Count Average Homogeneous Groups

5 3 339.66667 X6 3 377.33333 XX2 3 430.33333 XX7 3 437.66667 XX1 3 477.66667 X0 3 486.00000 X4 3 572.66667 X8 3 593.33333 X3 3 600.66667 X

0 - 4 -86.6667 63.9208*0 - 5 146.333 63.9208*0 - 6 108.667 63.9208*ũ - 7 48.3333 63.92080 - 8 -107.333 63.9208*

Analysis of variance

Table of means for TLAMMSK.TL_kho by TLAMMSK.NT

contrast difference limits0-1 8!33333 63.92080-2 55.6667 63.92080-3 -114.667 63.9208 *

Phụ lục 3: Khảo sát khả năng tương tác thực vật của các vi sinh vật có khả năng cố định nitơ

trên môi trường MSo

• Chiều cao chồi thuốc láAnalysis of variance

Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level

Betvỉeen groups 69.314286 6 11.552381 17.016Vỉithin groups 66.533333 98 . 678912

Total ( corrected) 135.84762 104

Table of raeansfor TLAMSOH.Chieucao by TLAMSOH.NT

stnd. Error stnd. Error 95 %LSDLevel Count Average(internal) (pooled s) intervalsfor mean

0 15 3.2000000.2000000 .2127458 2.9014017 3.49859831 15 2.8000000.2794553 .2127458 2.5014017 3.09859832 15 2.2000000.1745743 .2127458 1.9014017 2.49859833 15 3.9333333.1817027 .2127458 3.6347350 4.23193164 15 2.3333333.1868706 .2127458 2.0347350 2.63193165 15 4.4666667.2363747 .2127458 4.1680684 4.76526506 15 2.3333333.2108185 .2127458 2.0347350 2.6319316

Total 105 3.0380952.0804104 .0804104 2.9252357 3.1509548

Multiple range analysis for TLAMSOH.Chieucao by TLAMSOH.NT

Method: 95 Percent LSDLevel Count Average Homogeneous Groups

2 15 2.2000000 X4 15 2.3333333 XX6 15 2.3333333 XX1 15 2.8000000 XX0 15 3.2000000 X3 15 3.9333333 X5 15 4.4666667 X

contrast difíerence limits0-1 0^40000 0.59720

o 1 1.00000 0.59720 *0-3 -0.73333 0.59720 *1o

0.86667 0.59720 *0-5 -1.26667 0.59720 *

o 1 ơ> 0.86667 0.59720 *

• Chiêu dài rê

Source of variationSum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig

Between groups 54775.048 6 9129.1746 160.713Within groups 5566.800 98 56.8041

Total (corrected) 60341.848 104

LevelCount Average stnd. Error

(internal)stnd. Error {pooled s)

95 % intervalsLSDfor mean

0 15 63.26667 2.3165382 2.4763736 59.79096 66.742371 15 69.80000 2.5358384 2.4763736 66.32430 73.275702 15 26.53333 1.3447133 2.4763736 23.05763 30.00904

Analysis of variance

Table of means for TLAMSOR.chieu_dai by TLAMSOR.NT

9

3 15 108.80000 3.7786367 2.4763736 105.32430 112.275704 15 68.33333 2.5348366 2.4763736 64.85763 71.809045 15 70.73333 1.8007053 2.4763736 67.25763 74.209046 15 68.06667 2.3185929 2.4763736 64.59096 71.54237

Total 105 67.93333 .9359813 . 9359813 66.61964 69.24703Multiplerange analysis for TLAMSOR.chieu dai by TLAMSOR.NT

Method: 95 Percent LSDLevel Count Average Homogeneous Groups

2 15 26.53333 X0 15 63.26667 X4 15 67.46667 XX6 15 68.06667 XX1 15 69.80000 X5 15 70.73333 X3 15 111.60000 X

contrast difference limits0-1 -6.53333 5.62289 *C

M1o

36.7333 5.62289 *0-3 -48.3333 5.62289 *0-4 -4.20000 5.622890-5 -7.46667 5.62289 *

o 1 ơ> -4.80000 5.62289

• Trọng lượng tưoi

Analysisof variance

Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level

Betvỉeen groups 38975.905 6 6495.9841 10.109within groups 8996.667 14 642.6190

Total (corrected) 47972.571 20

Table of meansfor TLAMSOT.rm tuoi by TLAMSOT.NT

stnd. Error stnd. Error 95 % LSDLevel Count Average (internal) (pooled s) intervalsfor mean

0 3 269.00000 15.620499 14.635790 246.79786 291.202141 3 255.33333 17.947454 14.635790 233.13119 277.535472 3 205.00000 12.220202 14.635790 182.79786 227.202143 3 295.00000 12.288206 14.635790 272.79786 317.202144 3 226.33333 4.409586 14.635790 204.13119 248.535475 3 347.66667 23.168465 14.635790 325.46453 369.86881

6 3 257.66667 8.762293 14.635790 235.46453 279.86881

Total 21 265.14286 5.531809 5.531809 256.75124 273.53448

Multiple! range analysis for TLAMSOT.rm tuoi by TLAMSOT.NT

Method:Level

95 Percent Count

LSDAverage

Homogeneous Groups

2 3 205.00000 X4 3 226.33333 XX1 3 255.33333 XX6 3 257.66667 XX0 3 269.00000 XX3 3 295.00000 X5 3 347.66667 X

contrast difference limits0-1 13.6667 44.4043

o 1 64.0000 44.4043 *0-3 -26.0000 44^40431o

42.6667 44.40430-5 -78.6667 44.4043 *

o 1 ơ> 11.3333 44.4043

Trọng lượng khô

Source of variationSum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig

Betvỉeen groups 2240.2857 6 373.38095 48.401within groups 108.0000 14 7.71429

Total (corrected) 2348.2857 20

LevelCount Average stnd. Error

(internal)stnd. Error (pooled s)

95 % intervals

LSDfor mean

0 3 37.666667 .8819171 1.6035675 35.234093 40.0992401 3 31.666667 1.4529663 1.6035675 29.234093 34.0992402 3 41.000000 2.3094011 1.6035675 38.567427 43.4325733 3 47.333333 .8819171 1.6035675 44.900760 49.7659074 3 34.666667 .8819171 1.6035675 32.234093 37.0992405 3 62.333333 2.1858128 1.6035675 59.900760 64.7659076 3 30.333333 1.8559215 1.6035675 27.900760 32.765907

Total 21 40.714286 . 6060915 . 6060915 39.794859 41.633712

Analysis of variance

Table of raeans for TLAMSOK.TL_kho by TLAMSOK.NT

Multiple range analysis for TLAMSOK.TL_kho by TLAMSOK.NT

Method: 95 Percent LSDLevel Count Average Homogeneous Groups

6 3 30.333333 X1 3 31.666667 X4 3 34.666667 XX0 3 37.666667 XX2 3 41.000000 X3 3 47.333333 X5 3 62.333333 X

contrast difference limits0-1 6^00000 4.86515 *

o 1 -3.33333 4.865150-3 -9.66667 4.86515 *1o

3.00000 4.865150-5 -24.6667 4.86515 *

o 1 ơ> 7.33333 4.86515 *

Phụ lục 4: Khảo sát khả năng kích thích nảy mầm hạt đậu xanh của các chủng vi sinh vật phân

lập trên 2 môi trường chọn lọc MMS và MSo

Tỉ lệ nảy mầm của đậu xanh khi tương tác vói vỉ sinh vật phân lập trên môi

trường MMS.

Nhóm 1:Analysis of varianceSource of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig

Betvỉeen groups 26259.200 23 1141.7043 55.253within groups 971.167 47 20.6631

Total (corrected) 27230.366 70

LevelCount Average stnd. Error

(internal)stnd. Error {pooled s)

95 % intervalsLSDfor mean

0 3 90.333333 .8819171 2.6244441 86.599166 94.067501 3 50.333333 1.4529663 2.6244441 46.599166 54.067502 3 71.666667 1.4529663 2.6244441 67.932499 75.400833 3 39.333333 2.1858128 2.6244441 35.599166 43.067504 3 35.000000 .5773503 2.6244441 31.265833 38.734175 3 72.666667 1.7638342 2.6244441 68.932499 76.400836 3 99.666667 .3333333 2.6244441 95.932499 103.400837 3 68.000000 2.6457513 2.6244441 64.265833 71.734178 3 73.333333 7.2648316 2.6244441 69.599166 77.067509 3 81.666667 2.4037009 2.6244441 77.932499 85.4008310 3 84.333333 3.1797973 2.6244441 80.599166 88.0675011 3 44.333333 4.3333333 2.6244441 40.599166 48.0675012 3 79.333333 3.5276684 2.6244441 75.599166 83.0675013 3 76.333333 1.2018504 2.6244441 72.599166 80.0675014 3 65.333333 2.3333333 2.6244441 61.599166 69.06750

Table of raeans for MMS1H.SHNM by MMS1H.NT

12

15 3 76.333333 1.4529663 2.6244441 72.599166 80.0675016 3 65.666667 1.4529663 2.6244441 61.932499 69.4008317 3 81.000000 2.3094011 2.6244441 77.265833 84.7341718 3 32.666667 1.4529663 2.6244441 28.932499 36.4008319 3 57.666667 2.7284509 2.6244441 53.932499 61.4008320 3 54.666667 .8819171 2.6244441 50.932499 58.4008321 3 74.333333 2 3333333 2.6244441 70.599166 78.0675022 3 46.000000 3.0550505 2.6244441 42.265833 49.7341723 2 17.500000 .5000000 3.2142745 12.926598 22.07340

Total 71 64.718310 .5394718 .5394718 63.950727 65.48589Method:Level

95 Percent Count

LSDAverage Homogeneous Groups

23 2 17.500000 X18 3 32.666667 X4 3 35.000000 X3 3 39.333333 XX

11 3 44.333333 XX22 3 46.000000 XX1 3 50.333333 XX

20 3 54.666667 X19 3 57.666667 X14 3 65.333333 X16 3 65.666667 X7 3 68.000000 XX2 3 71.666667 XXX5 3 72.666667 xxxx8 3 73.333333 XXX

21 3 74.333333 xxxx13 3 76.333333 XXX15 3 76.333333 XXX12 3 79.333333 XXX17 3 81.000000 XX9 3 81.666667 XX

10 3 84.333333 XX0 3 90.333333 X6 3 99.666667 X

contrast difference limits0-1 40.0000 7.46833 *0-2 18.6667 7.46833 *0-3 51.0000 7.46833 *0-4 55.3333 7.46833 *0-5 17.6667 7.46833 *0-6 -9.33333 7.46833 *0-7 22.3333 7.46833 *0-8 17.0000 7.46833 *0-9 8.66667 7.46833 *0 - 1 0 6.00000 7.468330 - 1 1 46.0000 7.46833 *0 - 1 2 11.0000 7.46833 *0 - 1 3 14.0000 7.46833 *0 - 1 4 25.0000 7.46833 *0 - 1 5 14.0000 7.46833 *0 - 1 6 24.6667 7.46833 *0 - 1 7 9.33333 7.46833 *0 - 1 8 57.6667 7.46833 *0 - 1 9 32.6667 7.46833 *0 - 2 0 35.6667 7.46833 *0 - 2 1 16.0000 7.46833 *0 - 2 2 44.3333 7.46833 *

13

Nhóm 2:Analysis of variance

Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level

Betvỉeen groups 26528.000 23 1153.3913 96.451 .0000Vỉithin groups 574.000 48 11.9583

Total ( icorrected) 27102.000 71

Table of means for MMS2H.SHNM by MMS2H.NT

stnd. Error stnd. Error 95 %LSDLevel Count Average (internal) (pooled s) intervalsfor mean

0 3 90.333333 .8819171 1.9965248 87.494158 93.1725124 3 45.666667 1.8559215 1.9965248 42.827491 48.5058425 3 99.666667 .3333333 1.9965248 96.827491 102.5058426 3 51.000000 3.0550505 1.9965248 48^160824 53.8391827 3 86.000000 2.6457513 1.9965248 83.160824 88.8391828 3 45.666667 2.1858128 1.9965248 42.827491 48.5058429 3 81.666667 .8819171 1.9965248 78.827491 84.5058430 3 77.000000 .5773503 1.9965248 74.160824 79.8391831 3 49.333333 2.3333333 1.9965248 46.494158 52.1725132 3 27.333333 .8819171 1.9965248 24.494158 30.1725133 3 80.000000 1.0000000 1.9965248 77.160824 82.8391834 3 56.000000 1.1547005 1.9965248 53.160824 58.8391835 3 85.333333 .8819171 1.9965248 82.494158 88.1725136 3 32.000000 1.1547005 1.9965248 29.160824 34.8391837 3 59.333333 1.4529663 1.9965248 56.494158 62.1725138 3 45.333333 1.2018504 1.9965248 42.494158 48.1725139 3 80.000000 2.0816660 1.9965248 77.160824 82.8391840 3 74.000000 3.2145503 1.9965248 71.160824 76.8391841 3 66.666667 1.8559215 1.9965248 63.827491 69.5058442 3 79.000000 2.6457513 1.9965248 76.160824 81.8391843 3 76.333333 1.8559215 1.9965248 73.494158 79.1725144 3 84.666667 3.1797973 1.9965248 81.827491 87.5058445 3 86.333333 1.2018504 1.9965248 83.494158 89.1725146 3 69.333333 3.8441875 1.9965248 66.494158 72.17251

Total 72 67.833333 .4075389 .4075389 67.253789 68.41288

Multiple range analysis for MMS2H.SHNM by MMS2H.NT

Method: 95 Percent LSDLevel Count Average Homogeneous Groups

32 3 27.333333 X36 3 32.000000 X38 3 45.333333 X24 3 45.666667 X28 3 45.666667 X31 3 49.333333 X26 3 51.000000 XX34 3 56.000000 XX37 3 59.333333 X41 3 66.666667 X46 3 69.333333 XX

14

40 3 74.000000 XX

43 3 76.333333 XX30 3 77.000000 XX42 3 79.000000 XXX33 3 80.000000 XXX39 3 80.000000 XXX29 3 81.666667 xxxx44 3 84.666667 xxxx35 3 85.333333 XXX27 3 86.000000 XX45 3 86.333333 XX0 3 90.333333 X25 3 99.666667 Xcontrast difíerence limits0 - 2 4 44.6667 5.67835*0 - 2 5 -9.33333 5.67835*0 - 2 6 39.3333 5.67835*0 - 2 7 4.33333 5.67835

Tỉ lệ nảy mầm của đậu xanh khi tương tác vói vi sinh vật phân lập trên

môi trường MSo.

Nhóm 1:Analysis of varianceSource of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig

Betvỉeen groups 9191.9167 15 612.79444 91.633within groups 214.0000 32 6.68750

Total (corrected) 9405.9167 47

LevelCount Average stnd. Error

(internal)stnd. Error {pooled s)

95 % intervalsLSDfor mean

0 3 89.000000 1.1547005 1.4930394 86.849029 91.150971 3 46.333333 .8819171 1.4930394 44.182363 48.484302 3 76.000000 1.1547005 1.4930394 73.849029 78.150973 3 74.000000 1.1547005 1.4930394 71.849029 76.150974 3 65.000000 1.7320508 1.4930394 62.849029 67.150975 3 93.333333 1.7638342 1.4930394 91.182363 95.484306 3 73.000000 2.6457513 1.4930394 70.849029 75.150977 3 79.333333 1.4529663 1.4930394 77.182363 81.484308 3 67.000000 1.7320508 1.4930394 64.849029 69.150979 3 59.333333 2.3333333 1.4930394 57.182363 61.4843010 3 74.000000 1.1547005 1.4930394 71.849029 76.1509711 3 98.000000 .5773503 1.4930394 95! 849029 100.1509712 3 88.333333 .8819171 1.4930394 86.182363 90.4843013 3 54.000000 1.1547005 1.4930394 51.849029 56.1509714 3 65.000000 1.1547005 1.4930394 62.849029 67.1509715 3 81.666667 1.4529663 1.4930394 79.515696 83.81764

Total 48 73.958333 .3732599 .3732599 73.420591 74.49608

* denotes a statistically significant difference.

Table of means for EĩATMSol. SHNM by HATMSol.NT

Multiple range analysis for HATMM01.SHNM by HATMSol.NT

Method:Level

95 Percent Count

LSD

AverageHomogeneous Groups

1 3 46.333333 X13 3 54.000000 X9 3 59.333333 X4 3 65.000000 X

14 3 65.000000 X8 3 67.000000 X6 3 73.000000 X3 3 74.000000 X

10 3 74.000000 X2 3 76.000000 XX7 3 79.333333 XX

15 3 81.666667 X12 3 88.333333 X0 3 89.000000 X5 3 93.333333 X

11 3 98.000000 X

contrast difference limits0-1 42.6667 4.30194 *0-2 13.0000 4.30194 *0-3 15.0000 4.30194 *0-4 24.0000 4.30194 *0-5 -4.33333 4! 30194 *0-6 16.0000 4.30194 *0-7 9.66667 4.30194 *0-8 22.0000 4.30194 *0-9 29.6667 4.30194 *0 - 1 0 15.0000 4 ! 30194 *0 - 1 1 -9.00000 4.30194 *0 - 1 2 0.66667 4.301940 - 1 3 35.0000 4.30194 *0 - 1 4 24.0000 4.30194 *0 - 1 5 7.33333 4.30194 *

Nhóm 2Analysis of variance

Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level

Betvỉeen groups 8718.8235 16 544.92647 103.313 .0000Vỉithin

groups 179.3333 34 5.27451

Total (corrected) 8898.1569 50

Table ■ of means for MS0NH0M2.,SHNM by MS0NH0M2.NT

stnd. Error stnd. Error 95 %LSDLevel Count Average (internal) (pooled s) intervalsfor mean

0 3 89.000000 1.1547005 1.3259600 87.094134 90.9058716 3 84.666667 1.7638342 1.3259600 82.760800 86.5725317 3 82.666667 1.2018504 1.3259600 80.760800 84.5725318 3 71.333333 .8819171 1.3259600 69.427467 73.2392019 3 99.333333 .6666667 1.3259600 97.427467 101.2392020 3 83.333333 1.2018504 1.3259600 81.427467 85.2392021 3 62.333333 1.4529663 1.3259600 60.427467 64.23920

16

22 3 95.666667 .6666667 1.3259600 93.760800 97.5725323 3 95.000000 1.1547005 1.3259600 93.094134 96.9058724 3 77.000000 1.7320508 1.3259600 75.094134 78.9058725 3 80.666667 1.4529663 1.3259600 78.760800 82.5725326 3 52.000000 1.5275252 1.3259600 50.094134 53.9058727 3 57.000000 1.5275252 1.3259600 55.094134 58.9058728 3 66.333333 1.7638342 1.3259600 64.427467 68.2392029 3 71.666667 1.2018504 1.3259600 69.760800 73.5725330 3 78.000000 1.5275252 1.3259600 76.094134 79.9058731 3 84.666667 .8819171 1.3259600 82.760800 86.57253

Total 51 78.274510 .3215925 .3215925 77.812269 78.73675

Multiple range analysis for MS0NH0M2.SHNM by MS0NH0M2.NT

Method: 95 Percent LSDLevel Count Average Homogeneous Groups

26 3 52.000000 X27 3 57.000000 X21 3 62.333333 X28 3 66.333333 X18 3 71.333333 X29 3 71.666667 X24 3 77.000000 X30 3 78.000000 X25 3 80.666667 XX17 3 82.666667 XX20 3 83.333333 XX16 3 84.666667 X31 3 84.666667 X0 3 89.000000 X

23 3 95.000000 X22 3 95.666667 XX19 3 99.333333 X

contrast difference limits0 - 16 4!33333 3.81173 *0 - 17 6.33333 3.81173 *0 - 18 17.6667 3.81173 *0 - 19 -10.3333 3.81173 *0 - 20 5.66667 3.81173 *0 - 21 26.6667 3.81173 *0 - 22 -6.66667 3.81173 *0 - 23 -6.00000 3.81173 *0 - 24 12.0000 3.81173 *0 - 25 8.33333 3.81173 *0 - 26 37.0000 3.81173 *0 - 27 32.0000 3.81173 *0 - 28 22.6667 3.81173 *0 - 29 17.3333 3.81173 *0 - 30 11.0000 3.81173 *0 - 31 4.33333 3.81173 *

17

gagtttgatcatggctcagagcgaacgctggcggcaggcttaacacatgcaagtcgaacgggcaccttcgggtgtcagtggcagacgggtgagtaacacgtgggaacgtgcccttcggttcggaataactcagggaaacttgagctaataccggatacgcccttttggggaaaggtttactgccgaaggatcggcccgcgtctgattagcttgttggtggggtaacggcctaccaaggcgacgatcagtagctggtctgagaggatgatcagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgcaagcctgatccagccatgccgcgtgagtgatgaaggccttagggttgtaaagctctttgtccgggacgataatgacgtgtaccggaagaataagccccggctaacttcgtgcCAGCAGCCGCGGTAATACgaagggggctagcgttgctcggaatcactgggcgtaaagggcgcgtaggcggccgattaagtcgggggtgaaagcctgtggctcaaccacagaattgccttcgatactggttggcttgagaccggaagaggacagcggaactgcgagtgtagaggtgaaattcgtagatattcgcaagaacaccagtggcgaaggcggctgtctggtccggttctgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgaatgccagccgttggcctgcttgcaggtcagtggcgccgctaacgcataaggcattccgcctggggagtacggtcgcaagattaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgcagaaccttaccatcccttgacatggcatgttacctcgagagatcggggatcctcttcggaggcgtgcacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccacgtccttagttgccatcattcagttgggcactctagggagactgccggtgataagccgcgaggaaggtgtggatgacgtcaagtcctcatggcccttacgggatgggctacacacgtgctacaatggcggtgacagtgggacgcgaaaccgcgaggtcgagcaaatccccaaaaaccgtctcagttcggattgcactctgcaactcgggtgcatgaaggcggaatcgctagtaatcgtggatcagcacgccacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagttggtcttacccgagggagatgcgccaccctcaaggatgcaggcgaccacggtagggtcagcgactggggtgaagtcgtaacaaggtagccgtaggggaacctgcggctggacacctccttagag

Phụ lục 6: Kêt quả giải trình tựÍVIACROTGEN

Fũe: 070823-02_D17_6012-27F.abỉ Aun Enđed: 2007/8/241:41:1 Signal 0:962Ả:872 C:1122 T:l 010 *dwcmg 'hnr&cieimivSữỉiỊple: 6012_27F Lam: 77 Basespacing: 14.63 823 bases in 9894 scans Pageỉof2

f ịiỉft"Ái II ị\i' fjị Ẫ . . 1« I Ị Ấ Ị Ị ; V

130HGGATAC

"ẵ.ể

140 150>1’ CCTTTTGGG GA/ AGÕri

4ằ ẳ

169 170 ISO 190T/'C TG CCGAAG G ATC GGCCCGCG TCTG ATTAGC TTG ĨTC

ti

200 210 220 230 240 250GTGGGGTAÃC GGCC TACCÃ AGGCGACGÃT CAGTAGCTGGTC

TGAGAGGATGArCAGC c

'te tíầẤkk!&ầỂấMíể

2B0 270 293 290 300 319 320 330 349 3E0ACACTG GG ACTGAGíCACGGCCCÀGACTCC TACGGGAGGCÃGCAGTGGGGÃATATT GGACÃATGGGC GCÃAGCCTGATCCAGCCATGCCGCG TG A3TGACTGAAGGCCT

iứktlLm , MÀ\JA vh.,vềầmhùầ í k

330 370rÃGGGTTGTAAAGCTC TTT

360 330 409TGTCCGGG ACG AĨAAT G AC GGTACCG

J,ý MA ẲÁ '>

41Ũ 420 439 440 450 4B0 479 480 <01 5 DOG AAG AAĨÃAGCCCCGGCTAACTTCGTGC CAGCAGCCÕÕGGTAAT ACGĂAG GGG GCTÃGC GTTGCTCGGA ATCAGTGGGCGTAA^ữGGC

GCGT AG GCG G

i i\/:ìí.fiN'W ,Ú\Ánlm. AMiKừ,- r'"'ưùì A/

510 530 530 540 550 56D 57D 509 590 600 6LŨ 629 CCGATTí AGTCGGGGGTGÃ iQCCTGTGGCTCAACC*ỊC ÃG A ATTGCCTTCG T CTGGTTGGCTTGÁGÃCCGGA G/GG,"CAGCGG- ■'■.CTGCG AGTGTỹ~GAGGTGA TTCGTAG \TATTCGC."„'G

tìd____AJ\'V___________________ ._LẰ___L 'MYỈVÍ\,Jr\ /Vi..

ÍVIACHOYGENFìle: 070823-02_E17_6012-152SRabỉ Rm Ended 20O7Ỉ8Ỉ23 22:23:40 Sĩgnal G:970Ầ: 722 C:1341 T:ỉ 103 Mmaqr Ituv ha mcsSampỉe: 60r2_lS25R Lane: 75 Basê ĩpacing: 14.03 849 bases in 10139 scans Pagelof2

2SŨ 270 230 290 300 310 330 333 340 3E0 3 BO S7D aaci

TCGACcTCGCGGTTTCGCGTCCCACTGTCACCGCCATTGTAGCACGTGTGTÃGCCCĨ.TCCCGT . 'GGGCCATG /GGACTTGACGTC'.TCCÂC.'',CCTTÕCTCGCGGCTTATCÀCCGGCÃGTCTCCCT

ầẤtiầãPAÌư^ằ ,ưềMhJụí........ỂưắMỂỉttlMa390 490 410 420 430 440 450 4B3 470 489 490 5ŨŨ

G íGTGCcCAACTGAATG ATGGCAACTAAGGACGTGGGTTGCGCTCGTTGCÓGGACTTAACCCAACATCTCÃCGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTGCAÕGccTCCGA'G GG

:jjLầẨứí._.ầỉéíầẩỉA^L_________________.. ô

510 520 539 500 550 500 571 500 539 6 90 619 630AĨCCCÕG/lTCTCTCGaGGT a\C ATGC cATGTCAaGGGaTGGTa,-GGTTctgcgcgtTGCTTCGaÁTtaaACCaCaTGCTCCáCCGCĨ tgtocgggcõoc cgtc A'TTCCTTTG/gttttaatcit

VA-yẠtt. r\:P,. /YMMrt___________________________ứAi___£

lũ 2D 30 40 50 69 70 93 50 10] 1LŨ 120 130rww SÉT NttíỉU ©<EC ữ.GG JSG13.TCJSOCTCTMBGNGGlSff rcTCcc T5GATG ©GÍG CATCCTTGAGG GTG GCGCÃ’ c TCCC TCGGG TAAGACCAÃCTCCCATGGTG7G ACGGGCG

1 0 2 9 3 0 4 0 5 0 6 0 7 9 6 9 9 0 L Ũ D 1 1 0 1 3 0c ÍCTT :'Ĩ5Jc C TTS GTTG-ĨO.TGGCĨrCG TAGGAT XCTCCG TTCÃ3G TTGGGC CTCC CCGTT G TGATG cc■ ■■CCTGCCC Ĩ TCGG TTCGG ĨC7j'j<£ TCA.GGG • AC T"TG Í-.GC TAA TAC

File: 070823-02_GÌ7J012-9

Sampỉe: Ổ012_920R Lan

10 20 NNNNN ÀCAT © cx CA GG3<

20Rabl Run Ended: 2007/3/23 22:23:40 Signcd G:2273 Ả:ỈS0ó e: 73

Basespacing: 14.42 S55 bases in 10171 scans Pữge 1

30 40 50 EO 70ATŨC TTA TGCG TTGCGGỎGCaCTG AGCTGCAAGG\

GGCGAACGGCTGGC

■ ■ .

IV2:3877 T.-268Ỉ 0/2

30 90 100 llũiTTCATCG TTTACGGCG TGGACTACCAG GG

TATCTAAlẽCK

lACRo"ìj<3ENItAcinĩ/Hi' íAi3jfíj>b (KTJWÌJÕ.'.

120iTTTGC TCCCCAC

'í ta

130 140G c TÍTCGC GC c TCAGCG

TCA

'Ểếằềấấ

150 160 170 100 190GAACC GGiCCAG ACÃGC CGC c TTÕGCCAC TG G

TGĨTCTTGCGAATArC TJ

l ỉấiảỂíá: killl

2C0 210 220 230 240 250c GAATTTCACC TCTACACTCGCAG ĨTQC GC TGTCCTCTTCCGGTCTCAAGC

CAÃ

!Ì ầầĩil ÌN tỉWí M i i2BŨ 2~ CCAG

TATCGÃAGGCÂÀTTCT

Ằkll M

iD 2 B0 290 300 310 320 GrTG GTTGÁGC CACAGGCTTTCACC CCCG AC TT,A,TCGGCCGCCTACG CGCƠ

\Mầi]ằvmẩtiiềW

330 340 350 360TTTACGCCC4GTG ATTCCG/GCAACGC TAGC CCCCTTCGTV

i370TTACCGCỖGCTGO

V mấ

3ỄO 330TG GCACG A AG7T AGC

CGGGG

\ịjMẤ

4CO 410 420 430 440 450 430 470 4BO 490 KũCTT ÃTTCTTCCGGTACCGTCATTATCGTC CCG GACAÁAAGAGCTTTAGAACC CTÃAG GCC TTCATCACTCACG CG GCÁTG GCTGG ATCAG GCTTGCGC CCAT

TG

1 Ấ ĩA |\ /tom* Aấ \A n Ấnm j«1:,Vftĩ,A,W

510 520 530 540 550 5B0 570 500 530 G00 610 630TCCAAT ATTÕC CCACTGC TGCCTC CCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCT CAGTCC CAGTGTG GCTG ATCATC CTCTCAGACCAGCTACTG ATCGT CGC CT TGGTAG GC CGT TÃCCCỠC CAAC AAGC

lírếTĩíẩứrĩvĩA/ú f \ ú m ,/As,VvA-/\ MAÍVA / À A A 'Á A/A

File: 070823-02_F17J012- Sample: 6012J20F La

10 20 TTG NNNN CGATG TCT3GM’

52ÔF.abỉ Run Ended 200778/241:41:1 Signaỉ G:2541 ±2301C: ve: 73 Basespaãng: 13.84 S49 baĩẾS in 10183 scans Page.

30 40 50 60 70 : Tì GGG5 TAìGGGOGOG TữGCGGCCG ATTÃAG TCG GGGGTGAAA3CCTG TGG

■im m

MACROTGENĨ9MT.214Í Brthíto., »/-BO B0 10D 110 12Ũ

CTC c: c s 77GCCTTCG TvCTGG 5GCTTG G c:c;- ỉ 5'S c 'ỉ

m, ì ị ầ ể A130 140 150 100 170 130 ISO CG GẢAC TGCG AG TGTAGAGGIG AAAT rc GTAGÃTATTC GCAAG ÃACACCAG TGGCGAAGGCG GÕ TG TC T

n É Ấ M : ! u ' k ầ l ầ ấ u ắ lể300 210 220 230 240 250

GTCCGGTTCTGACGC TG AG GC GCGAAASG GTGGGGAGGAAACAG G ATTAGATAC

ì ề M í ấ ầ . A u

930 27cc TG G T AGTCCACGC CG

TA

4MÍ A »

200 290 300 310 320 "ACG ATG AỊĨGCCAGC CGTTGGCCTGCTTKi GGTCAGTGGCGCCGC TAACC

k / í ì i l k ! / ề i Ẳ í t

33D 340 350 360 370 ICATTAAG CĂĨTCC GC CTGGGG/GTACGGTCG CAAGATTAAAACTCAAAGG AATTG

«rt(A AM.I. 'ihầi \ỉi ,t Aầ

360 390 400 410 430 430 440 45] 460 470 430 491 500ACGGGGGCCC GCAC/AGCGGTGG ÃGC ATGTGGTTTAATTC GA/.GC AACGCG CÃG AACCTTACCÃTCCCTTG ACATG GCATGT TÃCCT CG AG AGẢTCGGGG ATC ÕTCTTCG G AGGCGTGCACACÃ

M Vử Mhẩ Ểè ■ iAỀM/MvẠk510 320 530 540 5ED 5BO 57D 330 590 BOO 610 Bao

<3 GTGCTGC,vTGGCTGTCGTCAGCrCSrGTCGTG AG ATGTTGGGTT.GTOC CGCAÀCGlGCG: iCCC/"GGTCCTTAGTTQCCATCẤTTCAGTTGGGC/CTCTAGGGÂÕÃCTGCOG GTGÃT ■ GCC

MACRÒỊGEN

Fiie: 070823-02_A18_6012-920F. abl Run Ended: 2007/8/24 0:2:11 SignaỉG:2664Ấ:2082 C:2S91 T.2121Sample: Ố0Ỉ2_920F Lane: 79 Base spaãng: 14.03 852 bases in 10344 scans Pagel of2

30 30 40 50 GO ra ao so 100 110 120TTTTTT <E c ACG GG '3 GGTT ATK3G AGC OGCGữ'í3 AicCTTACG'.TCCCTTG AỮLTCGCATGTTAC0TCG AG ÀG"-TCGGGG ATCC TC TTCGG/GGCGĨGCACACAG õ TG CTGC ATGG

130 140 150 1Ẽ0 ìra 160 190 2CO 210 220 230 2«c TG TCG TCAGC TCGTGTCGTGAGATGTTGõẽnv .STCCCGCAACGAGCGCAÀCCCACG TCCTTAGTTŨCCATCATTCAG TTG GGCACTCĨÍIGGGAGĨGCCGGIGkliU-.GCCGCGAGG.ÃAG

250 2BO 270 290 290 300 310 320 330 340 350 360 37D

GTGTG GATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTAOGGG/ỠGGGCTACÁCÃOGIQCTAC, ?TGGCGGTGACAGTGGGACGÕG/,ACCGCGĂỮGTŨGAGC~ ■'ATOCOC",'Ã vCCGTCTCÃGTTCAG ATTG

330 390 430 410 420 430 440 450 4EC' 470 460 400CACTCTGCAACT CGG GTOCÃTG A AG GCGG AÃTC GCT AG r AATCGTGG AT CÃGCACGC CACGGTG AATAC GTTCC OG GGCCTTG TACACAC CGCC CG TCACA.CCA.TGG G AGTTGGT CT TAC CCG A

OSG CGÕTGCGCCAACCGC/CYSG A3 GCÃGGCGACCACGGTVG GGTC.AGCGÀCTGGGGTGÀAGTCGrẢÃCAAGGT AGC CGTA3GGGAJ£ CTGCGGCTGGA.c AC c TCCT T/GAGHMHNHNKNMHIMHN

iW -A- i\A\Ả*r\^Aí\ Awf-\ix ,yỴV\ _ rtk 'rA

MAOROTGENFile: 07082Ĩ-02_HÌ 1_601 ĩ-520Rabl Rim Ended: 2007/8/241:41:1

Sigral G:2023 Â: ỉ 743 C:3210T:2252 c,Satnple: 6012_520R Lane: 73 Basespaciììg: 14.219999 859 bases in 10407sams Page ỉ of 2

250 260 270 aaa 290 301 310 320 330 3® 350 3GD 370

cGGGCCGATCCTTCGGCAG T/' ÃACCTTTOCữĨAý'.Ằ,''GGGCGT,',rCCGGr/ TTV' GCTCA, GTTTCCCTGAGTTATTCCGA ,CCG,'ỔGGCACGTTCCCACGTGTTACTCACCCG TCTGCC/-CTG ỉ-cACC

ÉỂỀằầÉẾỀẾẾ&ềỂỀỂẵỂầấmấỂiẾằẩàềầ 510 520 530 540 550 560 570 53Ũ 590 6CO 610 620

cCHMHNHNGÕlũHbrCCMCõõ GGGMN3 GGGNCCNN ccc<EHtN13303NGCãĩí<D(C c <£CNHNNNGGHHNHHHCHC c N «5 GG3G NGN ÍMHIKNNNIMÍHNNHNNNbMWbItINWNN(E NTC

HỈ1HKN

10 2D 30 « 50 B0 TO 80 90 100 110 120NSNNN « <Ẽr 'TGGGC TTT TTCGG TLCG TÕVTTMCG TCÕCGG ỈC ỉ; ữ GCTTTiO iCCCTi GGC CTTCATCACTCÀCGCGGCATGGC TGG ATCAGGGTTGCGCCCATTGTCCAt TÃT TCCC

330 390 400 410 420 430 440 450 «0 4TO 400 490 500cG / GGTGCccG TTCGACTTGCẢTGTGTTAÀGÕCTGCCGCCAGCGTTCGCTCTGAGCC/IKLST c AAACTCT/. GG AGGTGNTCCHGCCHGHGNÍ^MHGNHCÌIMÌÍCHCHNMGGHNGNGGNCCNHN c