KHỐI PHỔ LC MS mass spectrometry LC MS

8/11/2019 KHỐI PHỔ LC MS mass spectrometry LC MS

http://slidepdf.com/reader/full/khoi-pho-lc-ms-mass-spectrometry-lc-ms 1/36

KHỐI PHỔ & LC-MSMass Spectrometry & LC-MS

Phạm gia Huệ

Hà nội 07-08-2009

WWW.DAYKEMQUYNHON.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

W

W

W

D

YK

E

M

Q

U

Y

NH

O

N

U

C

OZ

C

O

M



Công cụ PT hay dùng nhất hiện nay.

K ỹ thuật cung cấp thông tin về:

1. Khối lư ợng và công thức phân tử 1 hợp chất

2. MS cùng với NMR và IR cho phép nghiên cứu cấu trúc phân

tử

3. Thành phần định tính và định lư ợng của một hỗn hợp.

4. Máy MS chuyển các Phân tử thành các ion ở thể khí và tách

chúng theo tỷ số m/z và ghi lại cư ờng độ từng ion, cho một

phổ khối.

5. PT đư ợc mẫu rất nhỏ, dạng rắn, lỏng, khí của các chất PTL

nhỏ cỡ (một số Da) tới các protein (cỡ trên 300 000 Da).

(Dalton (Da) = amu)

Khối phổ (MS) là gì?



W

W

W

D

YK

E

M

Q

U

YNH

O

N

U

C

OZ

C

O

M



Khối phổ (MS) là gì?

Nguyên lý cơ bản là

• sự tạo thành các ion,

• các ion này được tách hay lọc theo

tỷ lệ m/z (khối lượng/điện tích) của chúng,

• và được phát hiện.



W

W

W

D

YK

E

M

Q

U

YNH

O

N

U

C

OZ

C

O

M



Các thành phần một máy MS

Nguồn ion PT khối Detector ion

Phổ Khối

m/z S i g n a l I n t e n s i t y

Nạp mẫu

RR

LL

KK

Chân khôngcao

XXửử lýlý vvàà llưưuu ddữữliliệệuu

Tr ánh ion PT va chạm với các

phân tử trong không khí

C ư ờ n g

đ ộ t í n

h i ệ u



W

W

W

D

YK

E

M

Q

U

YNH

O

N

U

C

OZ

C

O

M



1. Nguồn ion hoá

Biến đổi chất PT, tạo thành các ion phân tử

(molecule) và các ion mảnh (fragment)

Hai k ỹ thuật chính hay dùng:

• Bắn phá electron (Electron Impact - EI):

tạo ion dùng chùm electron năng lư ợng

cao: phương pháp “cứng”

• Ion hoá hoá học (chemical ionization -CI)

tạo ion thông qua phản ứng với các ion

thuốc thử: phương pháp “mềm”



W

W

W

D

YK

E

M

Q

U

YNH

O

N

U

C

OZ

C

O

M



• V í dụ: Electron bắn phá methanol:tạo cation gốc methanol, một ion phân tử:

CH3OH + 1 e- CH3OH

+.

+ 2 e-• Chỉ một số (~0.01%) phân tử chất PT (M) đư ợc

ion hoá

• Phần lớn các ion phân tử bị phá thành các mảnhnhỏ hơn (cation, gốc, phân tử trung hoà nhỏhơn)

1.1. Bắn phá electron (EI)



W

W

W

D

YK

E

M

Q

U

YNH

O

N

U

C

OZ

C

O

M



++

Sợi đốt

Khu vực

Gia tốc ion

PT

khối

Chùm electron

1.1. Bắn phá electron (EI)



W

W

W

D

YK

E

M

Q

U

YNH

O

N

U

C

OZ

C

O

M



Chỉ các mảnh tích

điện được phát hiện

M

e-

2e-

M+•

Mẫu Cation gốc

/ Ion phân tử

• •

Bắn phá / ion hoá

[Mẹ]

70 eV

F1+• NF1

F2+

Mảnh

cation gốc

F2•

[Mảnh Con]

+

Phân mảnh

F1+ F1

•

Mảnh

trung hoà

+

+

Mảnh

cation

Mảnh

cation

Mảnh

gốc

Gốc

Các LK dễ gãy là các LK yếu nhất, tạo các mảnh bền



W

W

W

D

YK

E

M

Q

U

YNH

O

N

U

C

OZ

C

O

M



Phổ MS của

pentobarbital,

bắn phábằng electron

• Ion phân tử M+., có m/z 226, mất gần hết.

• Tạo thành các mảnh m/z 197, 156, 141, 112, 98, 69, and 55,

• Các pic này là dấu vết các mảnh trong cấu trúc của phân tử M.• Pic lớn nhất trên phổ MS là pic cơ bả n (coi như có cư ờng độ 100%) . Cư ờng độ pic khác tính theo

% của pic cơ bản.

Pic cơ bản

Molecular ion peak M+.Pic ion phân tử

Khối lượng phân tử =226



W

W

W

D

YK

E

M

Q

U

YNH

O

N

U

C

OZ

C

O

M



1.2. Ion hoá học (CI) – PHƯƠ NG PHÁP mềm

• Tạo í t mảnh.

• Dùng thừa thuốc thử dạng khí như CH4.

• Chùm electrons (100–200 eV) chuyển CH4 thành các SP như CH5+

CH5+ là chất cho proton mạnh, phản ứng hoá học với

chất phân tích tạo ra phân tử proton hoá MH+, có nhiều trên phổ

MS ion hoá hoá học dùng methan

3544

44 2

CHCHCHCH

eCHeCH

..

.

MHCH M CH45

(M+1) peak



W

W

W

D

YK

E

M

Q

U

YNH

O

N

U

C

OZ

C

O

M



Pic của ion phân tử MH+ ở m/z 227 (M+1) là pic lớn thứ nhì.Ít các pic của mảnh so với phổ EI

Phổ ion hoá hoá học của

pentobarbital

Ion hoá

Hoá học

C ư ờ n g đ ộ t ư ơ n g đ ố i



W

W

W

D

YK

E

M

Q

U

YNH

O

N

U

C

OZ

C

O

M



2. Bộ Phân tích Khối

• Trái tim của máy khối phổ, có nhiệm vụ táchcác ion có trị số m/z khác nhau thành từng phầnriêng biệt.

• Phân loại:Bộ phân tích từ,Bộ phân tích tứ cực (Quadrupole)Bộ phân tích bãy ion tứ cực (Ion trap)

Bộ phân tích thời gian bay (TOF)

•Sau đây l à bộ phân tích từ



W

W

W

D

YK

E

M

Q

U

YNH

O

N

U

C

OZ

C

O

M



m/z = B2r 2e/2V

Focused ion M+Ion M+

Ionizing

voltage

2.1 Bộ phân tích từ

Sample

inletLow vacuum

Detector

Magnetic field

B

Focusing slits

Accelerating

voltage V

Where m = mass,e = electron charge,

z = # of charges/ion

r = radius of curvature

Increase BRadius r

zeB

mV2r

2



W

W

W

D

YK

E

M

Q

U

YNH

O

N

U

C

OZ

C

O

M



Ion Beam

Detector

Magnetic Field



W

W

W

D

YK

E

M

Q

U

YNH

O

N

U

C

OZ

C

O

M



2.2 Bộ phân tích tứ cực

(Quadrupole)

• Một số ion có tỷ số m/z xác

định cộng hưởng với thế xoay

chiều xác định có thể đi thẳng qua

khoảng không đến detector. Trong

khi đó.

•Các ion khác không sẽ có qu ĩ đạo

không ổn định, va chạm với các

cực và bị giữ lại ở đó.

•Bằng cách thay đổi thế xoay chiều áp vào các cực, các ion có tỷ số m/z khácnhau có thể vượt qua khoảng không để đến detector.



W

W

W

D

YK

E

M

Q

U

YNH

O

N

U

C

OZ

C

O

M



2.2 Bộ phân tích tứ cực

Bẫy ion (Quadrupole Ion trap)

• Bẫy ion tứ cực hoạt động theo nguyên lý của bộ phân tích

khối tứ cực; chỉ có một điểm khác là các ion được lưu giữvà đưa dần ra khỏi bẫy

• Bằng cách thay đổi thế xoay chiều áp vào các cực, các

ion có tỷ số m/z khác nhau có thể vượt qua khoảng không

để đến detector.



W

W

W

D

YK

E

M

Q

U

YNH

O

N

U

C

OZ

C

O

M



2.3 Bộ phân tích tứ cực Chập Ba (Triple Quadrupole)

Ba bộ tứ cực nối tiếp nhau:

Ở Q1: Ở các ion được tách

Ở Q2: Với áp suất cao, các ion bị phân ly do va chạm với khí tr ơ có mặt

như nitơ, argon, heli. Bộ Q2 tạo ra phân ly do va chạm chúng bị phân

mảnh tiếp tạo ra các ion nhỏ hơn, ion con (daughter ions).

Ở Q3: làm nhiệm vụ tách các ion con

DetectorQ

1 2Q 3

Q



W

W

W

D

YK

E

M

Q

U

YNH

O

N

U

C

OZ

C

O

M



Độ phân giải của máy khối phổ

• Đó là khả năng của máy có thể phân biệt được 2 pic có

khối lượng gần nhau m1 và m2. Độ phân giải R là:

R = m 2 / (m 2 - m 1)

• Hai pic cạnh nhau đươ c coi là đ ã tách riêng khi phần chồng lấp giữ ahai pic đ ó nhỏ hơ n 10% pic nhỏ.

• Bộ phân tích từ hội tụ đơn có tr ị số R khoảng 5000.

• Cần có máy với độ phân giải cao hơn để phân biệt các

ion có khối lượng gần nhau.

• Ví dụ: để phân biệt 2 ion có m1= 280,2881 và m2= 280,2768

máy MS cần có R= 25 000



W

W

W

D

YK

E

M

Q

U

YNH

O

N

U

C

OZ

C

O

M



2.3 Bộ phân tích Thời gian bay (TOF: Time Of Flight)

Nguyên tắc:

• Dùng bộ phận gia tốc ion đẩy ion bay tới

detector, đo thời gian bay

• Thời gian bay được chuẩn hóa theo tỷ lệm/z



W

W

W

D

YK

E

M

Q

U

YNH

O

N

U

C

OZ

C

O

M





Xác định tạp



W

W

W

D

Y

K

E

M

Q

U

YN

H

O

N

U

C

OZ

C

O

M



3. Detector

Nhân electron (electron multiplier):

Tác động của một ion lên bề mặt các

dynode khác để tạo ra các electron

ngày càng nhiều electron.

1 106 (hình bên)

Nhân quang (photomultiplier):

Các electron tạo ra theo cách trên va

chạm với một bề mặt phát quang

để tạo ra photon. Các photon này

được thu nhận v à số lượng củachúng tỷ lệ với cường độ tín hiệu



W

W

W

D

Y

K

E

M

Q

U

YN

H

O

N

U

C

OZ

C

O

M



WS 2005

Máy MS tứ cực chập 3 (Trip Quad)

TSQ

(Thermo)



W

W

W

D

Y

K

E

M

Q

U

YN

H

O

N

U

C

OZ

C

O

M



Waters Micromass Q-Tof Premier

1

2

3

4



W

W

W

D

Y

K

E

M

Q

U

YN

H

O

N

U

C

OZ

C

O

M



Waters Micromass Q-Tof Premier

1. Phun: Z-spray sạch hơn

2. T-Wave = ion optics = ion guide: tạo thành

hình ống hướng ion vào giữa, ít mất mát

ion trên đường đi

3. T-Wave thứ hai: cho MS2

4. TOF: Lựa chọn V mode/ W mode



W

W

W

D

Y

K

E

M

Q

U

YN

H

O

N

U

C

OZ

C

O

M



GC-MS

Tách bằng GC Xác định bằng MSCó thư viện phổ chuẩn

Mass spectrometer acts as a detector for GC

Interface



W

W

W

D

Y

K

E

M

Q

U

YN

H

O

N

U

C

OZ

C

O

M



LC-MS

• Tách bằng LC Xác định bằng MS

• Khó khăn: loại ảnh hưởng của dung môi và các

thành phần trong pha động; không có thư viện phổ

• Để ghép nối giữa LC và MS:

• giao diện ion hoá hoá học ở áp suất thường APCI

(atmospheric pressure chemical ionisation)

• giao diện phun điện ESI (electrospray)



W

W

W

D

Y

K

E

M

Q

U

YN

H

O

N

U

C

OZ

C

O

M



ion hoá hoá học ở áp suất thường APCI

• Nitơ được dùng để phun sương pha

động tạo thành một sol khí hay khí dung (aerosol) của

khí nitơ và các giọt nhỏ dung môi .

• Sol khí này dược đưa qua một khu vực

được đốt nóng. Ở đây dung môi bị loại và các

chất được ion hoá nhờ các phản ứng ion-phân tử ở áp

suất khí quy

ển, các electron và các ion s

ơc

ấp

được t

ạora do phóng điện.



W

W

W

D

Y

K

E

M

Q

U

YN

H

O

N

U

C

OZ

C

O

M



APCI: Atmospheric Chemical Ionization



W

W

W

D

Y

K

E

M

Q

U

YN

H

O

N

U

C

OZ

C

O

M



giao diện phun điện ESCác giọt dung dịch thu nhỏ và tăng điện tích.Các phân tử dung môi không tích điện bị loại



W

W

W

D

Y

K

E

M

Q

U

YN

H

O

N

U

C

OZ

C

O

M



Ion hóa bằng phun điện ESI

(Electrospray Ionization)



W

W

W

D

Y

K

E

M

Q

U

YN

H

O

N

U

C

OZ

C

O

M



LC-MS

• Tách bằng LC Xác định bằng MS

• Khó khăn: loại ảnh hưởng của dung môi và các

thành phần trong pha động; không có thư viện phổ

• Để ghép nối giữa LC và MS:

• giao diện ion hoá hoá học ở áp suất thường APCI

(atmospheric pressure chemical ionisation)

• giao diện phun điện ES (electrospray)



W

W

W

D

Y

K

E

M

Q

U

YN

H

O

N

U

C

OZ

C

O

M



Ví dụ Ứng dụng LC-MS

• Phát hiện tạp chất trong các thuốc tổng hợp,

• LC: pha động ACN-amoni ethanoat, C18

• giao diện phun điện.

• Sắc đồ TIC: ion mẹ r ửa giải ở phút thứ 17,7 và các pictạp ra tr ước và sau đó.

•

• MS: Chất ra ở 8,35 ph cho phổ khối có các picthuộc ion (M+H)+ xuất hiện ở m/z = 225 và 227 theo tỷlệ 3:1 cho thấy sự có mặt của nguyên tử clo. Chất tạp làquinazolin có 3 nhóm thế.



W

W

W

D

Y

K

E

M

Q

U

YN

H

O

N

U

C

OZ

C

O

M



Ví dụ Ứng dụng LC-MS

Sắc đồ TIC

MS pic phút

8,35



W

W

W

D

Y

K

E

M

Q

U

YN

H

O

N

U

C

OZ

C

O

M



Trình bày dữ liệu

• Dạng TIC (Total Ion Chromatogram)

• Dạng SIM (Single Ion Monitoring)

m/z xác định Tất cả Tất cả



W

W

W

D

Y

K

E

M

Q

U

YN

H

O

N

U

C

OZ

C

O

M



Trình bày dữ liệu

• Dạng TIC (Total Ion Chromatogram)

• Dạng SIM (Single Ion Monitoring)

• Dạng MRM (Multiple Reaction Monitoring)

m/z xác địnhTất cảm/z xác định



W

W

D

Y

K

E

M

Q

U

YN

H

O

N

U

C

OZ

C

O

M

Documents

KHỐI PHỔ LC MS mass spectrometry LC MS