Upload
vodang
View
218
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Enzymy
Ogólne właściwości
Kinetyka i inhibicja reakcji enzymatycznych
Regulacja aktywności enzymatycznej
Enzymy jako biokatalizatory
głównie białka (także RNA – rybozymy, DNA – DNA-zymy)
wytwarzane tylko przez żywe komórki (ale mogą działać pozakomórkowo)
przyspieszają reakcje biochemiczne, aby zachodziły z dostateczną
wydajnością (106-1011 razy) – wysoka efektywność
nie zużywają się, nie zmieniają się trwale podczas reakcji
działają selektywnie → regulują procesy metaboliczne
– wspomagają utrzymanie homeostazy
Enzymy jako biokatalizatory
nie zmieniają końcowego składu mieszaniny
(odtwarzają się po reakcji)
nie zmieniają stałej równowagi danej reakcji
odwracalnej
przyspieszają osiągnięcie równowagi w
reakcjach termodynamicznie możliwych
zmieniają mechanizm reakcji – tworzą związki
przejściowe
Enzymy zmieniają szybkość reakcji poprzez:
lokalne zwiększanie stężenia substratu i utrzymania substratów w konformacji,
która sprzyja specyficznym reakcjom chemicznym
dostarczenie reszt aminokwasowych, których grupy funkcyjne odgrywają
specyficzną rolę w katalizie
obniżenie energii aktywacji dla tworzenia stanów przejściowych
Nazewnictwo enzymów
Nazwy powszechnie używane:
oksydaza ksantynowa – (substrat)
lipaza (gr. lípos – tłuszcz)
rybonukleaza trzustkowa – (źródło)
lipaza wrażliwa na hormon – (regulacja)
proteaza cysteinowa (mech. działania)
pepsyna (gr. pepsis – trawienie) - (funkcja w organizmie)
lizozym (od lizujących właściwości wobec bakterii)
Nazewnictwo enzymów
hydrolaza acetylocholiny
przyrostek -aza substrat/y katalizowana reakcja
oksydoreduktaza alkohol:NAD
Nazewnictwo enzymów
Numer EC numer przypisany każdemu enzymowi wg zasad klasyfikacji opracowanej przez Komitet Nazewnictwa Międzynarodowej Unii Biochemii i Biologii Molekularnej (ang. International Union of Biochemistry and Molecular Biology, IUBMB), 1984
Enzyme Commission (Komisja Enzymatyczna) lub Enzyme Catalogue
XX.XX.XX.XX
klasa . podklasa . podpodklasa . nr w podpodklasie
2.6.1.1
2. -. -.- Transferazy 2. 6. -.- Przenoszące grupy azotowe 2. 6. 1.- Transaminazy (aminotransferases) 2.6.1.1 Transaminaza asparaginianowa
Klasyfikacja enzymów ze względu na rodzaj katalizowanej reakcji
EC 1- Oksydoreduktazy przenoszą ładunki (elektrony i jony H
3O+ - protony) z cząsteczki
substratu na cząsteczkę akceptora (dehydrogenazy, oksydazy)
EC 2 – Transferazy
przenoszą daną grupę funkcyjną (tiolową, aminową, itp.) z cząsteczki jednej substancji na cząsteczkę innej substancji (transaminazy, kinazy)
EC 3 – Hydrolazy
powodują rozpad substratu pod wpływem wody (hydroliza) rozczepienie wiązań C-C, C-O, C-N, innych
EC 4 – Liazy
powodują rozpad substratu bez hydrolizy rozszczepienie wiązań (C-C, C-O, C-N,inne) przez eliminację atomu i
wytworzenie wiązania podwójnego)
EC 5 – Izomerazy
zmieniają wzajemne położenie grup chemicznych bez rozkładu szkieletu związku (geometryczne zmiany w obrębie cząteczki)
EC 6 – Ligazy (syntetazy)
powodują syntezę (połączenie) różnych cząsteczek; powstają wiązania chemiczne przy udziale energii z ATP
Klasyfikacja enzymów ze względu na budowę chemiczna
Enzymy proste
zbudowane tylko z aminokwasów
grupa czynna – specyficzne zespoły aminokwasów
przykłady: proteazy, amylaza, RNaza
Enzymy złożone
złożone z części białkowej (apoenzym) i niebiałkowej (kofaktor)
cz. niebiałkowa trwale związana z białkową – grupa prostetyczna
gr. prostetyczna – integralna część enzymu
przykłady: katalaza, peroksydaza,oksydaza cytochromowa
cz. niebiałkowa luźno związana z białkową – koenzym
obie części dają łatwo się oddzielić
żadna z nich nie jest czynna katalitycznie
ponowne połączenie przywraca aktywność
przykład: dehydrogenazy
Budowa enzymu
substrat - H2O
2
centrum aktywne centrum
aktywne
substrat
Centrum aktywne zgrupowanie wlaściwych reszt aa (często z odległych łańcuchów polipeptydowych) o odpowiednim ułożeniu przestrzennym decyduje o właściwościach katalitycznych enzymu determinuje wysoką sprawność katalityczną odpowiada za specyficzność reakcji
Budowa enzymu
metalo-β-laktamaza, MβL (model wstęgowy)
centrum aktywne = miejsce wiązania + miejsce katalityczne
miejsce wiązania substratu
miejsce katalityczne (grupa czynna)
Specyficzność enzymów
Specyficzność substratowa
określa, jaki rodzaj substratu ulega
przemianie przy udziale danego enzymu
zależy od budowy miejsca wiązania
Specyficzność działania
katalizowanie reakcji tylko jednego typu
katalizowanie tylko jednego z wielu możliwych przekształceń danej substancji
(cz. białkowa enzymu)
zależna od budowy centrum katalitycznego
enzym i jego substrat są do siebie
geometrycznie dopasowane w taki sposób, że
idealnie pasują do siebie jak klucz i zamek
model wyjaśnia specyficzność enzymów
nie wyjaśnia, w jaki sposób stabilizowany jest stan
przejściowy podczas reakcji enzymatycznej
Model "klucza i zamka" (Emil Fisher, 1894)
Model indukowanego dopasowania (Daniel Koshland, 1958)
pod wpływem przyłączenia substratu enzym przybiera
konformację niezbędną do katalizy (jak rękawiczka
zakładana na rękę)
powoduje to zbliżenie i ustawienie w odpowiedniej pozycji
substratu i grup czynnych enzymu, a także niekiedy wzrost
naprężeń w substracie, co ułatwia rozerwanie określonych
wiązań (kataliza przez odkształcanie substratu)
enzymy reagują z tylko jedną odmianą
stereoizomeryczna danego
substratu
połaczenie enzymu z substratem musi zachodzić co
najmniej w 3 miejscach
nawet symetryczna cząsteczka staję się „asymetryczną” dla
centrum aktywnego – możliwe jest tylko jedno „właściwe”
położenie substratu
STEREOSPECYFICZOŚĆ
Model "trzypunktowego dołączenia" (Alexander G. Ogston, 1948)
Teoria kinetyczna – teoria zderzeń
1. reakcja może zajść tylko wtedy, gdy reagujące cząsteczki się zderzają 2. dla każdej reakcji istnieje bariera energetyczna, która musi być przekroczona, aby zaszła reakcja 3. reagujące cząsteczki muszą mieć dostateczną ilość energii, aby przekroczyć tę barierę Wszystko, co zwiększa energię lub częstość zderzeń substratów, zwiększa szybkość reakcji.
Enzymy jako biokatalizatory
Enzymy zmieniają szybkość reakcji poprzez:
• lokalne zwiększanie stężenia substratu i utrzymania substratów w konformacji,
która sprzyja specyficznym reakcjom chemicznym
• dostarczenie reszt aminokwasowych, których grupy funkcyjne odgrywają
specyficzną rolę w katalizie
• obniżenie energii aktywacji dla tworzenia stanów przejściowych
Enzymy ustawiają substrat w przestrzeni w sposób najbardziej
sprzyjający zajściu reakcji
Zapewniają ścisłą orientację przestrzenna reagujących cząsteczek
(eliminowana jest przypadkowość sposobu ich zetknięcia)
Zwiększają bliskość substratów i ich lokalne stężenie
Kinetyka reakcji enzymatcznej
opisuje mechanizmy wiązania substratów przez enzymy oraz ich przekształcania w produkty kinetyka Michaelisa-Menten - dwuetapowy przebieg reakcji katalizowanej przez enzymy
substraty wiążą się odwracalnie z enzymem, tworząc ze stałą szybkości k1, kompleks enzym-substrat (ES)
kompleks ES może się rozpaść na dwa różne sposoby. Może
dysocjować do E i S ze stałą szybkości k-1 lub może dojść do chemicznej zmiany substratów i uwolnienia produktów ze stałą szybkości k2, przy czym zakłada się, że produkt reakcji nie może ulec powrotnemu przekształceniu w wyjściowy substrat.
Czynniki wpływające na szybkość reakcji enzymatycznych
zwiększają energię kinetyczna reagujących cząsteczek obniżają barierę energetyczną zwiększają częstość zderzeń
stężenie substratu stężenie produktu stężenie enzymu temperatura pH obecność inhibitorów i aktywatorów
Wpływ stężenia substratu na szybkość reakcji enzymatycznej
zwiększenie liczby cząstek mających dostateczną energię zwiększenie prawdopodobieństwa zderzeń ogółem, a przez to zderzeń efektywnych wzrost prędkości reakcji mam miejsce do momentu wysycenia wszystkich cząsteczek enzymu
Wpływ temperaurty na szybkość reakcji enzymatycznej
zwiększenie energii kinetyczne reagujących cząsteczek
zwiększenie ilości cząsteczek o energii wyższej niż bariera energetyczna
zwiększenie częstości zderzeń
wzrost możliwości wytwarzania połączeń,
które są mało prawdopodobne
w normalnych warunkach
zbyt wysoka temperatura
– denaturacja białka enzymatycznego
gorączka, hipotermia – zmiana aktywności enzymów organizmu
Wpływ pH na szybkość reakcji enzymatycznej
optymalne wartości zwykle w przedziale 5,0 – 9,0
zmiana ładunków elektrycznych grup dysocjujących lub zwiększenie/zmniejszenie
liczby wiązań jonowych wewnąrz- i międzyłańcuchowych → zmiana układ
łańcucha
zmiana ładunków elektrycznych w cząsteczkach substratów
denaturacja białka enzymatycznego przy dużych i małych wartościach pH
kwasica, zasadowica – zmiana aktywności enzymów organizmu
Inhibicja
Inhibicja odwracalna:
kompetycyjna
niekompetycyjna
akompetycyjna
Inhibicja nieodwracalna - cząsteczki inhibitora wiążą się z enzymem trwale
(np. kowalencyjnie), co doprowadza do sytuacji zablokowania aktywności
danej cząsteczki enzymu na stałe
Zjawisko hamowania aktywności enzymów przez różnego rodzaju związki (inhibitory) Mechanizm kontrolny dla procesów fizjologicznych!
Inhibicja kompetycyjna (współzawodnicząca)
inhibitor i substrat współzawodniczą o miejsce aktywne cząsteczki enzymu
związanie przez enzym cząsteczki inhibitora uniemożliwia związanie
substratów (i vice versa)
maksymalna szybkość reakcji, Vmax, nie zmienia się
V max może być osiągnięta poprzez zwiększenie stężenia substratów,
które przezwycięży inhibicję
wraz ze wzrostem stężenia inhibitora rośnie wartość Km
1/v0
1/Vmax
-1/KM
Inhibicja kompetycyjna (współzawodnicząca)
inhibitor jest strukturalnie bardzo podobny do prawdziwego substratu dla
danego enzymu
przykład: metotreksat – inhibitor kompetycyjny reduktazy dihydrofolianu
(dihydrofolian → tetrahydrofolian)
kwas foliowy (koenzym) metotreksat
Inhibicja kompetycyjna (współzawodnicząca)
Glikol etylenowy – składnik płynów
niezamarzających do chłodnic silników
Etanol
inhibitor kompetycyjny dla
dehydrogenazy alkoholowej
stos. w zatruciach glikolem
HO
OH
ethylene glycol
Alcohol dehydrogenase
HO
O
glycoaldehyde
O
OH
HO
glycolic acid
O
OH
O
glyoxylic acid
O
OHO
HO
oxalic acid
Inhibicja niekompetycyjna
inhibitor wiąże się do wolnego enzymu, jednak nigdy do jego miejsca
aktywnego → brak konkurencji z substratem
kompleksy enzym-inhibitor (EI) i enzym-inhibitor-substrat (EIS) są
enzymatycznie nieaktywne
wiązanie inhibitora całkowicie niezależne od substratu → wartość Km ł
pozostaje stała, wartość Vmax maleje
1/v0
1/Vmax -1/KM
1/[S]
Inhibitory nieodwracalne - „trucizny” enzymów
inhibitor wiąże się kowalencyjnie (a więc nieodwracalnie) do łańcuchów
białkowych enzymu lub tak silnie, że dysocjacja kompleksu EI jest bardzo
powolna→ trwałe unieczynnienie enzymu
chemiczna modyfikacja aminokwasów w enzymie
nie daje się odwrócić ani przez usuniecie inhibitora ze środowiska, ani przez
zwiększenie ilości substratu
penicylina - inhibitor enzymów
zawierających serynę
aspiryna – inhibitor cyklooksygenazy
zw. fosforoorganiczne (insektycydy) –
inhibitory acetylocholinoesterazy
Kontrola (regulacja) aktywności enzymatycznej
Wpływ na ilość:
regulacja syntezy enzymów (indukcja lub represja genu kodującego białko
enzymu) i degradacji (półokres rozpadu białka t ½)
Wpływ na rozmieszczenie przestrzenne:
kompartmentacja
Wpływ na aktywność katalityczną:
przez sprzężenie zwrotne (hamowanie)
przez efektory allosteryczne (enzymy allosteryczne - regulatorowe)
przez zmianę struktury enzymu
odwracalne modyfikacje kowalencyjne (fosforylacja, defosforylacja),
aktywacja proteolityczna (proenzymy = zymogeny)
kompleksy (układy) wieloenzymowe
Kompartmentacja
fizyczne rozdzielenie przeciwstawnych szlaków metabolicznych
w obrębie komórki:
biosyteza kw. tłuszczowych – cytozol
utlenianie kw. tłuszczowych – mitochodrium
w organizmie:
niektóre szlaki tylko w wyspecjalizowanych typach komórek
kompartmentacja chemiczna
przeciwstawne szlaki biegną poprzez inne metabolity pośrednie –
rozdzielenie molekuł przeznaczonych do szlaku katabolicznego i
anabolicznego
Regulacja przez sprzężenie zwrotne
produkt hamuje proces enzymatyczny, w którym powstał
zwykle dotyczy szlaków syntezy (etapu
imitującego)
hamowany jest początkowy etap syntezy
inhibitor: ostatnia mała cząsteczka przed
utworzeniem związku wielkocząsteczkowego
Hamowanie przez sprzężenie zwrotne
produkt powoduje represję genu
kodującego dany enzym
nie wpływa na jego aktywność katalityczną,
ale na jego ilość
przykład: cholesterol i reduktaza HMG-CoA
Efektory allosteryczne
zwykle nie podobne od substratów czy koenzymów danego enzymu
łączą się z miejscem allosterycznym („inna przestrzeń”)
powodują zmiany konformacyjne w białku enzymatycznym (podjednostki
z którą się łączą) → zmiana powinowactwa innych podjednostek do substratu
enzymy allosteryczne nie dają się opisać kinetyką M-M → krzywa
sigmoidalna
Karbamoilotransferaza asparaginianowa (ATCaza)
katalizuje pierwszą reakcje na szlaku syntezy pirymidyn
złożona z 5 podjednostek – 3 regulatorowe i 2 katalityczne
- CTP
+ ATP
no effector
Efektory allosteryczne
Modyfikacje kowalencyjne
odwracalne zmiany struktury cząsteczki enzymu
przebiega po zakończeniu translacji
modyfikacje kowalencyjne - dodawanie dodatkowych grup funkcyjnych:
fosforylacja
glikozylacja
ADP-rybozylacja
metylacja
zmiana właściwości funkcjonalnych białek
(zmiana konfrmacji, ładunku)
zmiana sprawności katalitycznej,
powinowactwa do substratu,
wewnątrzkomórkowej lokalizacji,
regulacji przez ligandy allosteryczne
w momencie fizjologicznego zapotrzebowania
proenzym (zymogen)
nieaktywny prekursor enzymu
do uaktywnienia wymaga jedno- lub kilkustopniowej proteolizy – powstanie
centrum katalitycznego (odcięcie fragmentu, przecięcie łańcucha
polipeptydowego → zmiana konformacji)
przykłady:
pepsynogen (→ pepsyna)
trypsynogen (→ trypsyna)
proinsulina (→ insulina)
prokolagen (→ kolagen)
czynniki krzepnięcia i fibrynolizy
możliwe szybkie zaktywowanie w momencie zapotrzebowania
ochrona tkanek produkujące proenzymy przed samostrawieniem
Ograniczona proteoliza - proenzymy
Enzymy wielofunkcyjne i kompleksy wieloenzymowe
Enzym wielofuncyjny jeden łańcuch polipeptydowy posiadający co najmniej dwie różne aktywności katalityczne i
dwa miejsca aktywne
Przykład: syntaza kw. tłuszczowych – 3 domeny (1- transferaza acetylowa, syntaza ß-
ketoacylowa, transferaza malonylowa; 2- reduktaza ketoacylowa, dehydrataza, reduktaza
enoilowa, 3- tioesteraza)
Kompleks wieloenzymowy układ kilku białek eznymatycznych o różnych aktywnościach katalitycznych połaczone
niekowalencyjnie
Przykład: synataza kw. tłuszczowych u E.coli (α6β6)
Intemediaty przenoszone bezpośrednio z jednego miejsca
aktywnego na drugie bez rozpraszania składników reakcji
(reagujące cząsteczki nie ulegają rozcieńczeniu w cytozolu, nie
muszą odnajdywać się w przypadkowym procesie dyfuzji)
Oddzielenie intermediatów od innych substancji – ochrona
przed reakcjami współzaodniczącymi