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Klonierung, Überexpression, Reinigung und teilweise

Charakterisierung der ADP-Ribosyltransferasen ModA und

ModB des Bakteriophagen T4

Dissertation zur Erlangung des Grades

eines Doktors der Naturwissenschaften

der Fakultät für Biologie

der Ruhr-Universität Bochum

Angefertigt im Lehrstuhl der Biologie der Mikroorganismen/

Arbeitsgruppe Molekulare Genetik

Vorgelegt von:

Bernd Tiemann

aus Dortmund

Bochum

(1999)

Klonierung, Überexpression, Reinigung und teilweise

Charakterisierung der ADP-Ribosyltransferasen ModA und

ModB des Bakteriophagen T4

Dissertation zur Erlangung des Grades

eines Doktors der Naturwissenschaften

der Fakultät für Biologie

der Ruhr-Universität Bochum

Angefertigt im Lehrstuhl der Biologie der Mikroorganismen/

Arbeitsgruppe Molekulare Genetik

Vorgelegt von:

Bernd Tiemann

aus Dortmund

Bochum

(1999)

meinen Eltern

Danksagung

Mein besonderer Dank gilt meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. W. Rüger für sein

Interesse am Fortgang dieser Arbeit, der ständigen Diskussionsbereitschaft und seinen

wissenschaftlichen Anregungen, die diese Arbeit voran brachten.

Herrn Prof. Dr. M. Rögner danke ich für die Übernahme des Korreferats.

Danken möchte auch Herrn Prof. Dr. W. Klipp, an dessen Lehrstuhl diese Arbeit

angefertigt wurde.

Allen Mitarbeitern aus unserer Arbeitsgruppe Molekulare Genetik und des Lehrstuhls für

Biologie der Mikroorganismen danke ich für das ausgezeichnete Arbeitsklima und ihre

Unterstützung bei der Beschaffung diverser Vektoren und Bakterienstämme. Ganz

besonders danke ich Frau Ursula Aschke-Sonnenborn für ihre ständige Hilfsbereitschaft

und Herrn Heiko Koch, jetzt auch mit „Dr.“, für seine unermüdliche

Diskussionsbereitschaft und die etlichen Hinweise auf den Bommerholzer Wasserturm.

Abschließend möchte ich noch meinen Eltern danken, ohne deren Unterstützung weder das

Studium noch die Dissertation möglich gewesen wären.

Inhaltsverzeichnis

I

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis................................................................................................................ V

1 Einleitung......................................................................................................................... 1

1.1 Der Bakteriophage T4....................................................................................................... 1

1.1.1 Die Genexpression des Bakteriophagen T4............................................................. 3

1.2 ADP-Ribosyltransferasen.................................................................................................. 4

1.2.1 Die ADP-Ribosyltransferasen des Bakteriophagen T4 ........................................... 7

1.3 Aufgabenstellung ............................................................................................................ 12

2 Material und Methoden................................................................................................ 13

2.1 Geräteliste ....................................................................................................................... 13

2.2 Elektronische Datenverarbeitung.................................................................................... 14

2.3 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien........................................................................ 14

2.4 Biologisches Material ..................................................................................................... 15

2.4.1 Plasmide ................................................................................................................ 15

2.4.2 Oligonukleotide (Primer)....................................................................................... 17

2.4.3 Bakterienstämme ................................................................................................... 18

2.4.4 Bakteriophagen...................................................................................................... 18

2.5 Arbeiten mit Bakterien.................................................................................................... 19

2.5.1 Anzucht von Bakterien .......................................................................................... 19

2.5.2 Transformation in Escherichia coli ....................................................................... 21

2.5.2.1 Herstellung kompetenter Zellen für die Elektrotransformation ..................... 21

2.5.2.2 Elektrotransformation..................................................................................... 21

2.5.2.3 Herstellung hitzeschockkompetenter Zellen mittels CaCl2 ............................ 21

2.5.2.4 Hitzeschocktransformation............................................................................. 22

2.5.3 Überexpression von Proteinen in Escherichia coli................................................ 22

2.5.3.1 Überexpression mit λ-Phage CE6 .................................................................. 22

2.5.3.2 Überexpression mit M13-Phage mGP1-2 ...................................................... 23

2.5.3.3 Überexpression mit DE3 Stämmen ................................................................ 23

2.5.3.4 Überexpression aus pBAD-Vektoren ............................................................. 24

2.5.3.5 Überexpression in Gegenwart von Bakteriocinfreisetzungsprotein ............... 25

2.5.3.6 Coexpression von Chaperonen bei der Überexpression................................. 25

2.5.4 Plasmidstabilitätstest der pET-Vektoren und Modifikationen des Testverfahrens26

Inhaltsverzeichnis

II

2.5.4.1 Plasmidstabilitätstest der pET-Vektoren ........................................................ 26

2.5.4.2 Schnellüberprüfung auf Expressionsfähigkeit der Transformanden .............. 26

2.5.4.3 Schnellüberprüfung der Toxizität von ModA und ModB sowie deren

Mutanten......................................................................................................... 27

2.5.5 Aufschluß von Bakterien und Reinigung von Einschlußkörpern.......................... 27

2.6 Arbeiten mit DNA........................................................................................................... 28

2.6.1 Methoden der Plasmidisolierung ........................................................................... 28

2.6.2 Enzymatische Modifikationen von Plasmid-DNA................................................ 28

2.6.3 Polymerase Kettenreaktion (PCR)......................................................................... 28

2.6.4 Mutagenese............................................................................................................ 29

2.6.5 Agarose-Gelelektrophorese ................................................................................... 29

2.6.6 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen............................................. 30

2.6.7 DNA-Sequenzierung nach SANGER et al. (1977) .................................................. 30

2.7 Arbeiten mit Proteinen .................................................................................................... 30

2.7.1 Bestimmung von Proteinkonzentrationen ............................................................. 30

2.7.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese................................................................. 31

2.7.2.1 Coomassie Brillantblau Färbung .................................................................... 32

2.7.2.2 Silberfärbung .................................................................................................. 32

2.7.3 Aufreinigung von „His-Tag“-Proteinen ................................................................ 32

2.7.3.1 Immobilisierte Metallchelat-Affinitätschromatographie................................ 33

2.7.4 Renaturierung von Proteinen ................................................................................. 34

2.7.4.1 Renaturierung durch Verdünnung .................................................................. 34

2.7.4.2 Renaturierung durch Dialyse.......................................................................... 35

2.7.5 Transfer von Proteinen auf Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membranen (Western

Blot) ....................................................................................................................... 36

2.7.6 Nachweis von rekombinanten „His-Tag“ Proteinen ............................................. 37

2.8 ADP-Ribosyltransferase Aktivitätstest ........................................................................... 37

2.8.1 Aktivitätstest mit 32P-NAD+ .................................................................................. 37

2.8.2 Bestimmung der ADP-Ribosyltransferase Aktivität mit p-Nitrobenzylidin-

aminoguanidin (NBAG) ........................................................................................ 38

2.8.2.1 Herstellung von p-Nitrobenzylidin-aminoguanidin (NBAG) ........................ 39

2.9 Transkriptionsversuche ................................................................................................... 39

2.9.1 Transkription von pKWIII Plasmiden ................................................................... 40

Inhaltsverzeichnis

III

2.9.2 Transkription von genomischer DNA ................................................................... 41

3 Ergebnisse...................................................................................................................... 42

3.1 Computergestützte Auswertung der Proteinsequenzen von ModA und ModB.............. 42

3.2 Klonierung der beiden offenen Leserahmen zwischen den T4 Promotoren p11.815 und

p13.149............................................................................................................................ 43

3.2.1 Klonierungsversuche in die Vektoren pBluescript II KS/SK................................ 43

3.2.2 Klonierungsversuche in die Vektoren pT7-5 und pT7-6....................................... 44

3.2.3 Klonierungsversuche in den Vektor pGEX-3X..................................................... 45

3.2.4 Klonierungsversuche in die pET-Vektoren ........................................................... 45

3.2.5 Klonierungsversuche in den Vektor pBAD/HisB ................................................. 50

3.3 Anzucht von Transformanden in Gegenwart von ADP-Ribosyltransferase Inhibitoren 51

3.4 Identifizierung des Mod-Proteins, das die E. coli RNA-Polymerase modifiziert........... 52

3.5 Überexpression von Mod................................................................................................ 53

3.5.1 Überexpression aus pET-Vektoren........................................................................ 53

3.5.1.1 Überexpression mit λCE6 .............................................................................. 53

3.5.1.2 Überexpression mit mGP1-2 .......................................................................... 53

3.5.1.3 Überexpression aus DE3 Stämmen ................................................................ 53

3.5.2 Überexpression aus dem Vektor pBAD ................................................................ 56

3.6 Reinigung von ModA unter denaturierenden Bedingungen ........................................... 57

3.7 Nachweis des „His-Tags“ ............................................................................................... 58

3.8 Versuche zur Vermeidung von Einschlußkörpern .......................................................... 59

3.8.1 Veränderungen der Expressionsbedingungen ....................................................... 59

3.8.2 Überexpression in Gegenwart des Bakteriocinfreisetzungsproteins ..................... 60

3.8.3 Ausschleusen der exprimierten Proteine in den periplasmatischen Raum............ 60

3.8.4 Coexpression von Chaperonen .............................................................................. 61

3.8.5 Fusion von ModA mit Thioredoxin....................................................................... 61

3.9 Renaturierung von Einschlußkörpern ............................................................................. 61

3.9.1 Renaturierung durch Verdünnung ......................................................................... 61

3.9.2 Renaturierung durch Dialyse ................................................................................. 62

3.10 Reinigung von ModA unter nativen Bedingungen ......................................................... 62

3.11 Nachweis katalytisch aktiver Aminosäuren durch ortsgerichtete Mutagenese............... 63

3.12 Entfernung des Trx aus p32modA2 ................................................................................ 66

3.13 ADP-Ribosylierung durch ModA und ModB................................................................. 68

Inhaltsverzeichnis

IV

3.14 Bestimmung der ADP-Ribosyltransferase Aktivität von ModA .................................... 70

3.14.1 Herstellung von p-Nitrobenzylidin-aminoguanidin............................................... 70

3.14.2 Bestimmung von KM und Vmax .............................................................................. 71

3.15 Transkriptionsversuche mit alterierter und modifizierter E. coli RNA-Polymerase ...... 74

4 Diskussion ...................................................................................................................... 77

4.1 Klonierung von modA und modB.................................................................................... 77

4.2 Gründe für die Toxizität von ModA und ModB............................................................. 80

4.3 Expression von ModA und ModB .................................................................................. 81

4.3.1 Expression von ModA und ModB aus pET-Vektoren .......................................... 81

4.3.1.1 Expression aus p32modA-His ........................................................................ 84

4.3.2 Expression von ModA aus dem pBAD-Vektor..................................................... 85

4.4 Vermeidung von Einschlußkörpern ................................................................................ 86

4.5 Renaturierung von denaturierten Proteinen .................................................................... 89

4.6 Reinigung von ModA...................................................................................................... 91

4.7 Mutanten von ModA und ModB..................................................................................... 92

4.8 ADP-Ribosylierung durch ModA und ModB................................................................. 96

4.8.1 ADP-Ribosylierung der α-Untereinheit durch ModA........................................... 97

4.9 ADP-Ribosyltransferase Aktivität von ModA.............................................................. 100

4.10 Transkriptionsversuche mit alterierter und modifizierter E. coli RNA-Polymerase .... 103

5 Zusammenfassung....................................................................................................... 106

6 Literaturverzeichnis ................................................................................................... 108

Abkürzungsverzeichnis

V

AbkürzungsverzeichnisαCTD αααα-Carboxyterminale Domäne der E. coli RNA-PolymeraseA AdeninA. dest. destilliertes Wasser (Aqua destillata)Abb. AbbildungAmp AmpicillinAPS AmmoniumpersulfatATP Adenosin-5'-triphosphatbp BasenpaarBRP Bakteriocinfreisetzungsprotein (bacteriocin release protein)C CytosinCam ChloramphenicolcAMP zyklisches Adenosinmonophosphat (cyclic adenosin monophosphat)CT Cholera Toxin von Vibrio cholerae

CTP Cytidin-5'-triphosphatDa DaltondATP desoxy Adenosin-5'-triphosphatddH2O doppelt destilliertes WasserDMSO DimethylsulfoxidDNA Desoxyribonucleinsäure (desoxyribonucleic acid)dNTP desoxy Nucleosid-5'-triphosphatDRAG Dinitrogenase-Reduktase-ADP-Ribose-Glycohydrolase von

Rhodospirillum rubrum

DRAT Dinitrogenase-Reduktase-ADP-Ribosyltransferase von Rhodospirillum

rubrum

dsDNA Doppelstrang-DNA (double strand DNA)DT Diphtherie Toxin von Corynebacterium diphtherie

DTE DithioerythritolDTT DithiothreitolE. coli Escherichia coli

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure (ethylen diamin tetra acetic acidet al. und andere (et alius)G Guaningp GenproduktGST Glutathion-S-TransferaseGuHCl Guanidinium HydrochloridHRP Meerrettich-Peroxidase (horseradish peroxidase)IMAC immobilisierte Metallchelat-AffinitätschromatographieIPTG Isopropyl-β-D-thiogalaktosidKan Kanamycinkb Kilobasenkbp KilobasenpaarekDa Kilo Daltonkkat katalytische KonstanteKM Michaelis-KonstanteLT Escherichia coli hitzelabiles EnterotoxinMCS multiple Klonierungsstelle (multiple cloning site)min Minute(n)

Abkürzungsverzeichnis

VI

MOI Vielfache der Infektion (multiplicity of infection)NAD+ Nicotinamid-adenin-dinucleotid (oxidiert)NBAG p-Nitrobenzylidin-aminoguanidinNi-NTA Nickel-Nitrilotriessigsäure (Nickel-nitrilotriacetic acid)ODxxx optische Dichte bei xxx nm WellenlängeORF offener Leserahmen (open reading frame)oxi. oxidiertPAETA Pseudomonas aeruginosa Exotoxin APCR Polymerase Kettenreaktion (polymerase chain reaction)PDB 3D Struktur Proteindatenbank (Brookhaven Protein Data Base)PEG Polyethylenglykolpfu plaquebildende Einheit (plaque forming unit)PMSF PhenylmethylsulfonylfluoridPOPOP 1,4-Bis(5 phenyl-2 oxazol) benzenPPO 2,5-DiphenyloxazolPT Pertussis Toxin von Bordetella pertussis

PVDF Polyvinylidenfluoridred. reduziertRNA Ribonucleinsäure (ribonucleic acid)RNAP RNA-Polymerase von E. coli

RSA RinderserumalbuminRT RaumtemperaturSD Shine-DalgarnoSDS Natriumdodecylsulfat (sodium dodecyl sulfate)ssDNA Einzelstrang-DNA (single strand DNA)Str StreptomycinSV SäulenvolumenT ThyminTCA Trichloressigsäure (trichlor acetic acid)TEMED N,N,N',N'-TetramethylethylendiaminTet TetracyclinTris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanTrx ThioredoxinTTP Thymidin-5'-triphosphatU Enzymeinheit (Unit)UP stromaufwärts (upstream)Upm Umdrehungen pro MinuteUTP Uridin-5'-triphosphatv/v Volumen pro Volumen (volume per volume)Vmax Maximalgeschwindigkeitw/v Gewicht pro Volumen (weight per volume)x g Vielfache der Erdbeschleunigung (9,81 m/s2)

Einleitung

1

1 EinleitungWilhelm Roux stellte 1915 einen Katalog der funktionellen Merkmale des Lebens auf.

Zum Leben gehören nach seiner Definition ein Stoffwechsel, bestehend aus Aufnahme,

Assimilation, Dissimilation und Ausscheidung, Wachstum, Bewegung, bestehend aus

Erregbarkeit und spontaner Bewegungsfähigkeit, Vermehrung und Vererbung. Nach dieser

Definition können Bakteriophagen, das sind Viren, die Bakterien befallen, nicht als lebend

angesehen werden, da den Viren ein eigener Stoffwechsel fehlt und sie weder wachsen

noch erregbar sind. Für ihre eigene Vermehrung müssen die Viren deshalb den

Stoffwechsel des Wirtes unter ihre Kontrolle bekommen. Sie rekrutieren dabei

hauptsächlich die Ribosomen, die essentiell für die Proteinbiosynthese sind, und zum Teil

die RNA-Polymerase des Wirtes. Die Viren bestehen aus einer mehr oder weniger

komplexen Proteinhülle, in die das virale Erbmaterial verpackt ist. Das Erbmaterial besteht

entweder aus dsDNA (λ, T-Phagen), ssDNA (M13) oder RNA (HIV, f2). Die Phagenhülle

kann filamentös (M13), kugelig (Qβ, ΦX174) oder komplizierter aus einem Kopf- und

Schwanzteil (λ, T-Phagen) bestehen.

1.1 Der Bakteriophage T4

Der Bakteriophage T4 gehört zu den geradzahligen T-Phagen (T2, T4, T6) und sein Wirt

ist Escherichia coli. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten, daß der T4 aus einem

ikosaedrischen Kopf besteht, an dem ein etwa gleich langer Schwanz sitzt, der aus einer

kontraktilen Scheide mit einer zentralen Röhre besteht (Abb. 1.1). Zwischen Kopf und

Schwanz befindet sich der Kragen mit sechs „Whisker“. An der Basalplatte der Scheide

sitzen sechs Schwanzfasern zur Anheftung an spezifische Rezeptoren der

Bakterienzellwand. Das Genom besteht aus einer dsDNA mit 168.895 bp. Die DNA weist

eine terminale Redundanz von ca. 3 kbp auf und ist wegen der Verpackung nach dem

Kopf-Voll-Mechanismus zirkulär permutiert (STREISINGER et al., 1964; 1967). Eine

Eigenart der T4 DNA ist das Vorhandensein von glycosyliertem 5-Hydroxymethyl-Cytosin

statt des herkömmlichen Cytosins (Abb. 1.2), wodurch die Phagen DNA gegen den Verdau

durch bakterielle Nukleasen geschützt ist (WYATT & COHEN, 1952; TAKAHASHI et al.,

1979). Auf dem T4 Genom sind bisher ca. 150 Gene bekannt und es befinden sich dort

noch einmal ca. 150 offene Leserahmen dessen Funktionen noch nicht ermittelt werden

konnten (KUTTER et al., 1994). Diese Vielzahl der Gene erfordert eine zeitlich koordinierte

Expression für eine effiziente Phagenvermehrung.

Einleitung

2

Abb. 1.1 Schematische Darstellung des Bakteriophagen T4.

OCH2OH

HH

OH

H

OH

OH

HO

H

CH2N

N

NH2

R

O

alpha-Glucosid des 5-Hydroxymethyl-Cytosin

N

N

NH2

R

O

Cytosin

Abb. 1.2 Strukturvergleich zwischen Cytosin und glycosyliertem 5-Hydroxymethyl-Cytosin.

Die Entwicklung des Bakteriophagen T4 verläuft nach einem vorherbestimmten

Programm, wobei verschiedene Gruppen von Genen zu bestimmten Zeitpunkten nach der

Phageninfektion exprimiert werden. Die zeitliche Kontrolle der T4 Genexpression wird auf

der Ebene der Transkription durch drei unterschiedliche Promotortypen (frühe, mittlere

und späte) erreicht (Abb. 1.3). Für die RNA-Synthese wird während der gesamten T4

Infektion die wirtseigene DNA abhängige RNA Polymerase (EC 2.7.7.6) verwendet. Das

Core-Enzym der E. coli RNA-Polymerase bleibt während der gesamten T4 Infektion aktiv

und transkribiert die gesamte Phagen DNA (DIMAURO et al., 1969; HASELKORN et al.,

1969). Bis zu 13 phagenkodierte Proteine modifizieren die RNA-Polymerase oder

assoziieren mit ihr, was zu einer schrittweisen Erkennung der drei unterschiedlichen

Promotortypen und zu Antiterminationen führt (MOSIG & HALL, 1994; WILKENS & RÜGER,

1994; STITT & HINTON, 1994; WILLIAMS et al., 1994).

Einleitung

3

Promotorklasse „-35“-Region Abstand „-10“-Region

(1) E. coli TTGACA (16 - 18 bp) TATAAT

(2) T4 „früh“ GTTTACt/attcc (11 bp) GTGGTAt/c

a/tATa

(3) T4 „mittel“Mot-Box (-30 Region)

a/ta/tTGCTT

t/cA (12 – 17 bp) TATAAT

(4) T4 „spät“ ------ ------ TATAAATActatt

Abb. 1.3 Konsensussequenzen für die verschiedenen Promotoren von T4 und E. coli.(1) (HAWLEY & MCCLURE, 1983; HARLEY & REYNOLDS, 1987)(2) (LIEBIG & RÜGER, 1989)(3) (GUILD et al., 1988)(4) (KASSAVETIS et al., 1986)

1.1.1 Die Genexpression des Bakteriophagen T4

Die 37 bekannten frühen Promotoren des T4 werden von der E. coli RNA-Polymerase mit

dem σ70-Faktor erkannt. Diese Promotoren ähneln den E. coli Promotoren und weisen eine

erweiterte –10 Sequenz auf. Außerdem besitzen sie in den Bereichen „-42“ und „-52“

charakteristische A/T reiche UP-Elemente (WILKENS & RÜGER, 1994). Die unveränderte

RNA-Polymerase transkribiert in vitro nur von den frühen T4 Promotoren, die mittleren

und späten Promotoren werden von ihr nicht erkannt. Die erste Modifikation der RNA-

Polymerase erfolgt durch das gpAlt (Alteration). Alt liegt mit ca. 25 – 50 Kopien im

Phagenkopf vor und wird bei der Infektion mit der Phagen-DNA in die Zelle injiziert

(GOFF, 1979). In den ersten 30 Sekunden wird eine der beiden α-Untereinheiten ADP-

ribosyliert. Die zweite Untereinheit kann, wahrscheinlich auf Grund sterischer

Behinderung, nicht ribosyliert werden (ZILLIG et al., 1977). Durch diese „Alteration“

werden einige frühe Promotoren verstärkt abgelesen (KOCH et al., 1995). Vom Promotor

P13.149, der durch die „Alterierung“ am stärksten verstärkt wird, wird die zweite, bis vor

Beginn dieser Arbeit bekannte, ADP-Ribosyltransferase Mod (Modifikation) transkribiert.

Mod ADP-ribosyliert die zweite α-Untereinheit und beendet damit möglicherweise die

Transkription von den frühen Promotoren (WILKENS et al., 1997). Diese Modifikation

durch Mod ist vier Minuten nach der Infektion abgeschlossen (GOFF, 1974; HORVITZ,

1974b).

Durch die Bildung der frühen Genprodukte AsiA (Anti Sigma) und MotA (modifier of

transcription) wird von der frühen Transkription auf die mittlere Transkription

Einleitung

4

umgeschaltet. Die mittleren Promotoren haben eine –10 Region, die von σ70 erkannt wird,

aber keine –35 Region (STITT & HINTON, 1994). Die feste Bindung von AsiA an die σ70-

Untereinheit der RNA-Polymerase ist wichtig für den Übergang zwischen der frühen und

mittleren T4 Transkription. AsiA verhindert sowohl die Erkennung der Wirts- als auch der

frühen T4 Promotoren und stimuliert die Transkription von den mittleren Promotoren

(OUHAMMOUCH et al., 1994; 1995). Außerdem wird noch MotA benötigt, das die „Mot-

Box“ um Position –30 der mittleren Promotoren erkennt (OUHAMMOUCH et al., 1995;

MARCH-AMEGADZIE & HINTON, 1995). Die mittlere Transkription nutzt zum Teil immer

noch frühe Promotoren (HINTON, 1989; HSU & KARAM, 1990), jedoch werden die

Transkripte durch Antiterminationsfaktoren bis über 15 kb verlängert (SANSON & UZAN,

1993; BRODY & GEIDUSCHEK, 1970).

Die späte Transkription ist an die Replikation des T4 Genoms gekoppelt, da sie durch

Einzelstrangbrüche positiv beeinflußt wird (HERENDEEN et al., 1989). Die späten T4

Promotoren weisen nur eine –10 Region auf, die von dem T4 gp55 (σ-Faktor) erkannt

wird, aber noch Transkriptionsaktivatoren benötigt (BRODY et al., 1995; LEONETTI et al.,

1998). Dazu gehören gp45 die sogenannte „sliding clamp“, der gp44-gp62-Komplex (DNA

Ladefaktor) und gp33 (Co-Aktivator) (NOSSAL, 1994; YOUNG et al., 1994; TINKER et al.,

1994; HERENDEEN et al., 1990).

Nach etwa 25 Minuten sind ca. 150 neue Phagenpartikel zusammengebaut. Durch Lyse der

Wirtszelle werden diese dann für die Infektion neuer Wirte freigesetzt.

1.2 ADP-Ribosyltransferasen

ADP-Ribosylierung ist eine posttranslationale Modifikation bei der ein ADP-Riboserest

vom NAD+ auf unterschiedlichste Proteine übertragen wird (Abb. 1.4). Diese Reaktion

wird durch virale, bakterielle oder eukaryontische Mono- oder Poly-ADP-

Ribosyltransferasen (EC 2.4.2.30) katalysiert (DOMENIGHINI & RAPPUOLI, 1996). Poly-

ADP-Ribosyltransferasen sind bisher allerdings nur bei Eukaryonten in den Zellkernen

gefunden worden (SHALL, 1995)

Eine Poly-ADP-Ribosyltransferase ist im Nukleus von vielen Eukaryonten zu finden und

verrichtet dort wichtige Aufgaben. So hält sie die Genomintegrität während der

Excisionsreparatur von Basen aufrecht (DEMURCIA et al., 1997), hilft bei der DNA

Rekombination (SATOH et al., 1994) und der Zelldifferenzierung (FARZANEH et al., 1987).

Außerdem ist sie an der Organisation des Chromatins beteiligt (REALINI & ALTHAUS,

Einleitung

5

1992). Es werden Histone und Proteine, die an der Replikation beteiligt sind, modifiziert.

Diese Proteine verlieren dadurch ihre Affinität zur DNA und es wird Platz für die DNA

Reparatur geschaffen. Außerdem scheint die Poly-ADP-Ribosyltransferase auch eine Rolle

während der Apoptose zu spielen (BERNARDI et al., 1995).

N

NN

N

NH2

O

OHOH

CH2

P OO

O

N+

NH2

O

O

OHOH

CH2P OO

O

O

O

NH

NH

NH2

NH2

+

Rest

Rest

+

N

NN

N

NH2

O

OHOH

CH2

P OO

O

O

OHOH

CH2P OO

O

O

NH

NH2

+

O

RestNH

NH

Rest

N

NH2

O

+

Transferase

+ H+

NAD Argininseitenkette ribosylierte Seitenkette Nicotinamid+

Abb. 1.4 Schema der NAD+: Arginin ADP-Ribosyltransferase katalysierten Reaktion. Ob essich bei dieser Reaktion um einen SN1 oder SN2 Mechanismus handelt konnte nochnicht geklärt werden (BELL & EISENBERG, 1996).

Mono-ADP-Ribosyltransferasen wurden ursprünglich als pathogenes Prinzip des

Diphtherie Toxins (DT), Cholera Toxins (CT), Pertussis Toxins (PT), Pseudomonas

aeruginosa Exotoxins A (PAETA) und anderer bakterieller Toxine entdeckt (HONJO et al.,

1968; MOSS & VAUGHAN, 1976; KATADA & UI, 1982; IGLEWSKI & KABAT, 1975). Sie

wurden außerdem z.B. in Erythrocyten von Truthähnen, in der Milz von Hühnern und in

Skelett- und Herzmuskeln von Säugetieren gefunden (OKAZAKI & MOSS, 1996). Mono-

ADP-Ribosyltransferasen von Eukaryonten scheinen u.a. an der Immunregulation beteiligt

zu sein (WANG et al., 1994).

Einige Gene der bakteriellen Toxine stammen jedoch aus Phagen. So stammt das

Strukturgen für das Cholera-Toxin aus einem filamentösen Phagen, der sich in das

Chromosom von Vibrio cholerae integriert hat (WALDOR & MEKALANOS, 1996). Ebenso

stammt das Gen für Diphtherie Toxin in Corynebacterium diphtherie vom lysogenen

Phagen β (UCHIDA et al., 1971).

Durch die ADP-Ribosylierung werden die Akzeptorproteine häufig inaktiviert. So

inhibieren DT und PAETA durch die ADP-Ribosylierung des eukaryontischen

Elongationsfaktors 2 (EF2) die Proteinsynthese, was zum Zelltod führt (PASSADOR &

Einleitung

6

IGLEWSKI, 1994). In manchen Fällen wird die Aktivität jedoch durch korrespondierende

ADP-Ribosyl-Hydrolasen wieder hergestellt. So z.B. bei dem photosynthetisch aktiven

Bakterium Rhodospirillum rubrum. Hier wird die Stickstoffixierung durch eine

Dinitrogenase-Reduktase-ADP-Ribosyltransferase (DRAT) und eine entgegen wirkende

Dinitrogenase-Reduktase-ADP-Ribose-Glycohydrolase (DRAG) reguliert (POPE et al.,

1985; LOWERY et al., 1986; Ludden, 1994).

Die verschiedenen bakteriellen ADP-Ribosyltransferasen zeigen keine Homologien in der

Aminosäuresequenz. Sie weisen aber drei ähnliche Regionen auf (DOMENIGHINI et al.,

1994). Region I enthält ein nukleophiles Arginin oder Histidin, was für die Bindung des

NAD+ essentiell ist. Der Austausch des His440 von PAETA oder des His21 von DT in der

Region I führt zu einem drastischen Aktivitätsverlust (HAN & GALLOWAY, 1995). Der

konservative Austausch des Arg7 im hitzelabilen Enterotoxin von E. coli (LT) und im CT,

bzw. des Arg9 im PT gegen Lysin führte zum vollständigen Verlust der Enzymaktivität

(LOBET et al., 1991; BURNETTE et al., 1988; 1991). Die Region II weist viele aromatische

und hydrophobe Aminosäuren auf, die an der hydrophoben Interaktion mit den

aromatischen Ringen des NAD+ beteiligt sein sollen. In der Region III befindet sich ein

vollständig konserviertes Glutamat, was für die katalytische Aktivität eine wichtige Rolle

spielt (DOMENIGHINI et al., 1994). So inhibierte z.B. der Austausch des Glu148 von DT oder

des Glu553 von PAETA die Enzymaktivität ohne den KM-Wert für NAD+ zu beeinflussen

(TWETEN et al., 1985; DOUGLAS & COLLIER, 1987).

Die Kristallisation von DT mit NAD+ lieferte Hinweise, daß in den bakteriellen ADP-

Ribosyltransferasen DT, PAETA, LT und PT ähnliche NAD+-Bindetaschen vorhanden

sind, auch wenn weniger als 10 % Aminosäurehomologien bestehen (Abb. 1.5). Diese

Bindetasche unterscheidet sich völlig von der Rossmannfaltung einiger Dehydrogenasen,

die NAD+ als Coenzym verwenden (BELL & EISENBERG, 1996; ROSSMANN et al., 1975).

DOMENIGHINI und RAPPUOLI (1996) haben das Modell der NAD+-Bindetasche auf alle

bisher bekannten Mono- und Poly-ADP-Ribosyltransferasen von Eukaryonten,

Prokaryonten und Viren ausgeweitet.

Einleitung

7

Abb. 1.5 Überlagerung der dreidimensionalen Strukturen des β/α Motivs, das die NAD+-Bindetasche von LT (grün), DT (rot), PAETA (blau) und PT (gelb) bildet. Dasgebundene NAD+ (himmelblau) ist so in die Grube eingeführt, wie es in der DTStruktur vorliegt. Die konservierten Aminosäuren, die für die Katalyse wichtigsind, sind in gelb angegeben. (aus DOMENIGHINI & RAPPUOLI, 1996)

Ob es sich bei dem ADP-Ribosylierungsmechanismus um eine SN1 oder SN2 Reaktion

handelt kann nicht genau bestimmt werden, da aufgrund der Kristalldaten beide

Reaktionstypen möglich sind (BELL & EISENBERG, 1996). Die bemerkenswerte

Konservierung der NAD+-Bindetasche und der Aminosäurereste, die an der Katalyse

beteiligt sind deuten aber auf einen ähnlichen Mechanismus für alle ADP-

Ribosyltransferasen hin (DOMENIGHINI & RAPPUOLI, 1996).

1.2.1 Die ADP-Ribosyltransferasen des Bakteriophagen T4

Bislang waren zwei ADP-Ribosyltransferasen beim Bakteriophagen T4 bekannt, das gpAlt

und das gpMod. Durch die ADP-Ribosylierung von Wirtsproteinen und evtl. auch T4

eigener Proteine kann der Vermehrungszyklus des Phagen womöglich effizienter

ausgeführt werden.

Eine der ersten ADP-Ribosylierungen findet an einer der beiden α-Untereinheiten der

wirtseigenen DNA abhängigen RNA-Polymerase statt. Diese „Alteration“ wird durch das

T4 Protein Alt katalysiert und ist bereits 30 Sekunden nach der Infektion abgeschlossen.

Die zweite Untereinheit kann, wahrscheinlich auf Grund sterischer Behinderung, durch das

relativ große gpAlt nicht ribosyliert werden (ZILLIG et al., 1977). Die ADP-Ribosylierung

der RNA-Polymerase durch Alt bewirkt, daß einige frühe T4 Promotoren verstärkt

Einleitung

8

transkribiert werden (KOCH et al., 1995). Der ADP-Ribosylrest wird hauptsächlich auf das

Arg265 der α-Carboxyterminalen Domäne (αCTD) übertragen (GOFF, 1974; OVCHINNIKOV

et al., 1977) (Abb. 1.6). Ein geringer Anteil der Markierung findet sich aber auch am

Arg191 oder Arg195 in der Aminoterminalen Domäne (GOFF, 1984). Unter in vitro

Bedingungen werden noch viele andere Proteine wie z.B. Hühnereiweiß-Lysozym,

Rinderserumalbumin, Histon F1 und ebenfalls in vivo die anderen RNA-Polymerase

Untereinheiten durch Alt ADP-ribosyliert (ROHRER et al., 1975; HORVITZ, 1974b). Unter

in vitro Bedingungen wurden aber auch noch viele andere E. coli Proteine durch ADP-

ribosyliert. Dies alles ist ein Hinweis darauf, daß die ADP-Ribosylierung durch Alt nicht

sehr spezifisch ist.

Das alt Gen befindet sich zwischen den Genen 30 (DNA Ligase) und 54

(Basisplattenprotein) auf der genomischen Karte von T4 (GOFF, 1979) (Abb. 1.7). Das Alt

Protein wird erst spät während der T4 Infektion als ein 79 kDa Vorläuferprotein gebildet

(HORVITZ, 1974b). Diese Vorstufe wird jedoch während des Zusammenbaus der

Phagenpartikel proteolytisch zum aktiven 67 kDa Alt Protein gespalten und 25 bis 50

Moleküle dieses Enzyms in den Phagenkopf verpackt. Bei der Infektion mit der Phagen

DNA wird das gpAlt mit in die Wirtszelle injiziert (HORVITZ, 1974a; ROHRER et al., 1975;

GOFF, 1979).

Abb. 1.6 Die 3D Struktur der αCTD der RNA-Polymerase dargestellt als „Cartoon“ (links)und „Strand“ (rechts) (mit RasMol generiert, PDB Kode: 1COO (JEON et al.,1995)). Es ist der Aufbau aus den vier α-Helices (H1 – H4) wiedergegeben unddas Arg265 ist hervorgehoben (links). In der rechten Abbildung sind die anderenArginine als mögliche Ribosylierungsstellen dargestellt.

Einleitung

9

Abb. 1.7 Genomische Karte des Bakteriophagen T4 (KUTTER et al., 1994).

Die ADP-Ribosylierung der zweiten α-Untereinheit erfolgt durch das gpMod

(Modifikation). Die Lage des mod Gens wurde durch Deletionskartierung auf den Bereich

zwischen den Genen 39 (DNA Topoisomerase Untereinheit) und 56 (dCTPase) auf der

genomischen Karte eingeschränkt (HORVITZ, 1974a) (Abb. 1.7). Die ADP-Ribosylierung

beider α-Untereinheiten am Arg265 ist nach vier Minuten durch dieses neusynthetisierte 23

kDa große Protein vollendet (GOFF, 1974; HORVITZ, 1974b). Nach diesen vier Minuten

fällt die Aktivität von Mod stark ab (SKORKO et al., 1977). Im Gegensatz zu Alt kann Mod

beide α-Untereinheiten modifizieren. Es modifiziert aber nicht die anderen Untereinheiten

der RNA-Polymerase. Diese ADP-Ribosylierung bleibt für den Rest der T4 Infektion

erhalten und wird nicht wieder rückgängig gemacht (HORVITZ, 1974a; GOFF & SETZER,

1980). Im Gegensatz zu Alt wirkt Mod spezifischer. Es wurde nur noch ein 13 kDa Protein

gefunden, das von Mod ribosyliert wird, ob es ein E. coli Protein oder ein T4 Protein ist

wurde jedoch nicht ermittelt (SKORKO et al., 1977). Die Modifikation der RNA-

Polymerase durch Mod verändert das Enzym dahingehend, daß E. coli Gene nicht mehr

transkribiert werden, die Transkription der T4 Gene aber unbeeinflußt bleibt.

Einleitung

10

Die Unterschiede zwischen Alteration und Modifikation sind folgende. (1) Die Alteration

benötigt keine Proteinsynthese, da Alt bei der Infektion mit der T4 DNA in die Zelle

gelangt. Für die Modifikation wird die Expression von Mod benötigt. (2) Die Modifikation

ist spezifischer als die Alteration, d.h. es werden nicht so viele Proteine durch Mod

markiert. (3) Mod ADP-ribosyliert beide α-Untereinheiten der RNA-Polymerase,

wohingegen Alt nur eine α-Untereinheit in der RNA-Polymerase markiert. (4) Mod hängt

an der α-Untereinheit nur an einer Aminosäureseitenkette einen ADP-Ribosylrest,

während Alt an verschiedenen Argininresten der α-Untereinheit einen solchen Rest setzt

(HORVITZ, 1974b).

Die biologischen Auswirkungen der ADP-Ribosylierung der RNA-Polymerase für den

Phagen sind nicht bekannt, da eine T4 alt-, mod

- Doppelmutante keine signifikanten

Auswirkungen während des Infektionszyklus zeigt (GOFF & SETZER, 1980). Es wurde

vermutet, daß die ADP-Ribosylierung der Wirts RNA-Polymerase an der Blockierung der

bakteriellen RNA-Synthese beteiligt sein könnte (MAILHAMMER et al., 1975; GOLDFARB &

PALM, 1981). Die Blockierung der bakteriellen RNA-Synthese findet in alt-, mod

-

Mutanten aber immer noch statt (GOFF & SETZER, 1980) und die konstitutive Expression

von Alt führt zu keiner Wachstumshemmung bei E. coli (KOCH et al., 1995).

Alt und Mod könnten evtl. unter nicht Laborbedingungen zu einem breiteren

Wirtsspektrum führen oder einen leichten Wuchsvorteil des T4 bewirken, der mit den

eingesetzten Methoden nicht erkannt werden kann (HORVITZ, 1974a; GOFF & SETZER,

1980).

An Hand von T4 Deletionsmutanten, die keine Mod-Aktivität mehr aufweisen, war vor

Beginn dieser Arbeit bereits vermutet worden, daß das Gen für die ADP-

Ribosyltransferase Mod zwischen den T4 Promotoren P11.815 und P13.149 liegen müßte.

Sequenzdaten aus diesem Bereich zeigten, daß hier zwei offene Leserahmen hinter dem

frühen Promotor P13.149 liegen, die durch ein ATGA verbunden sind, wobei das ATG das

Start-Codon des zweiten Gens und das TGA das Stop-Codon des ersten Gens darstellt

(Abb. 1.8). Es war bisher allerdings noch nicht gelungen einen dieser beiden Leserahmen

komplett zu klonieren. Eine Sequenzhomologiesuche in den Datenbanken gab keinen

Hinweis darauf, welcher dieser beiden Leserahmen für eine ADP-Ribosyltransferase

kodieren könnte. Erst „Threading-Experimente“, d.h. ein Alignment der

Sekundärstrukturen mit bekannten ADP-Ribosyltransferasen zeigte, daß beide Proteine

Einleitung

11

sehr wahrscheinlich zu den NAD(P)+-Arginin ADP-Ribosyltransferasen (EC 2.4.2.31)

gehören (Abb. 1.9) (BAZAN & KOCH-NOLTE, 1997; WILKENS et al., 1997). Es war bis

dahin nicht bekannt, welches der beiden Proteine die E. coli RNA-Polymerase ADP-

ribosyliert oder ob beide Proteine diese Reaktion unabhängig katalysieren können, bzw. ob

Mod sogar als Heterodimer vorliegt.

(1467 bps)

200 400 600 800 1000 1200 1400

AccI DraI

SpeIDraIHindIII

DdeIRsaI

RsaI

DraIDdeI

DraINsiI

PvuIIDdeI

NdeIEcoRI

PvuIIDdeI

DraIHincII

P13.149 ORF1ATGA

ORF2 P11.815

Abb. 1.8 Anordnung der beiden offenen Leserahmen zwischen den frühen Promotoren P11.815und P13.149. Des weiteren sind einige Schnittstellen für Restriktionsendonukleasenangegeben, die aus den Sequenzdaten ermittelt wurden.

α1 β2 α2β1 Ü b erh a n g S c h le ife

Toxa_Pseae GYVFVGY GTFLEAAQSIVFGGVRARSQD........................LDAIWRGF IAGDPALAYGYAQDQEPDA...

Dtx_Corbe ..NFSSY GTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYD.....................DDWKGF STDNKYDAAGYSVDNENPL...

Elap_Ecoli ..GDRLY ADSRPPDEIKRSGGLMPRGHNEYFDRGTQMNINLYDHARGTQTGFVRYDDGYV TSLSLRSAHLAGQSILSG....

Chta_Vibch ..DDKLY ADSRPPDEIKQSGGLMPRGQSEYFDRGTQMNINLYDHARGTQTGFVRHDDGYV TSISLRSAHLVGQTILSG....

Tox1_Borpe DPPATVY YDSRPPEDVFQNGFTAWGNND...........NVLDHLTGRSCQVGSSNSAFV TSSSRRYTEVYLEHRMQEAVEA

Parp_Chick HNRQLLW GSRTTNFAGILSQGLRIAPPEAPVT....................GYMFGKGI FADMVSKSANYCHTSQA.....

Alt_Bpt4 PKGITLY SQRMLPSIYEAMVKNRVF.............................YFRNFV TSLYP.NIFGTWMTDSSIGVLP

Alt_bpt6 PEGITVY AQSMTAPIYEALVKNKVF.............................YFRNFV TSLTP.IIFGRFGITHAGIGLL

ModA_Bpt4 PNDKPLW GVPAETKQVLNQGIDIITFDKVVSASY.................DKNIALHFA GLEYNTQVIFEFKAP.......

ModB_Bpt4 KSPYQLY GISKSTKELIKDLQVGEVFSTNRVDSF................TTSLHTACSF YAEYFTETILRLKTD.......

H Y

H Y

R S

R S

R S

H Y

R S

R S

R S

R S

Toxa_Pseae ........RGRIRN.GAL RVYVPRSLDAITQ..............PEEE......GGRL TILGWPLAERTVV.IPSA......

Dtx_Corbe ..........SGKA.GGV KVTYPGSRVVLSL..............PFAEG.....SSSV YINNWEQAKALSV.ELEINFE...

Elap_Ecoli ............YSTYYI VIATA..PNMFNVNDVLGVYS......PHP........YEQ VSALGGI.PYSQIYGWYRVN....

Chta_Viboh ............HSTYYI VIATA..PNMFNVNDVLGAYS......PHP........DEQ VSALGGI.PYSQIYGWYRVH....

Tox1_Borpe ERAGRGTG....HFIGYI EVRAD..NNFYGAASSYFEYVDTYGDNAGRILAGALATYQS YLAHRRI.PPENIRRVTRVYHNGI

Parp_Chick ............DPIGLI LGEVALGNHSVKGLGKTAPDPTAPLGNGISTGINDTCLLYN YIVYDV..AQVNLKYLLKLKFNYK

Alt_Bpt4 .DEKRLSVSIDKTDEGIG VITGADKVNVVLPGGSLAPS..................NEM VILPRGL.MVKVNKITDASYNDGT

Alt_Bpt6 EPEARNELTVDKNEEGIG AIDGAHKVNVVYPG.SLGIA..................TEA VILPRGL.MVKVNKITDASNNDGT

ModA_Bpt4 ..............MVFN QEYAIKALRCKEYNPNFKFP......DSHRYRNMELVSDEQ VMIPAGSVFRIADRYEYKKCSTYT

ModB_Bpt4 ..............KAFN SDHISDIILSSPNTEFKYTYEDTDGLDSERTDNLMMIVREQ WMIPIGKYKITSISKEKLHDSFGT

L E

V E

Y E

Y E

Y E

L E

W E

W E

F E

Y E

β3 β4 β5 β6

Abb. 1.9 Alignment von ausgesuchten ADP-Ribosyltransferasen eukaryotischer und prokaryotischerOrganismen sowie von T-Phagen (nach BAZAN & KOCH-NOLTE, 1997).Toxa_Pseae: Exotoxin A von Pseudomonas aeruginosa; Dtx_Corbe: Diphtherie Toxin vonCorynebacterium diphtherie; Elap_Ecoli: hitzelabile Enterotoxin A von Escherichia coli;Chta_Vibch: Cholera Toxin von Vibrio cholerae; Tox1_Borpe: Pertussis Toxin vonBordetella pertussis; Parp_Chick: Poly-ADP-Ribosyltransferase von Gallus gallus;Alt_Bpt4: Alt Protein von Phagen T4; Alt_Bpt6: Alt Protein von Phagen T6; ModA_Bpt4:ModA Protein von Phagen T4; ModB_Bpt4: ModB Protein von Phagen T4.

Aufgabenstellung

12

1.3 Aufgabenstellung

Das erste Ziel dieser Arbeit war es die beiden offenen Leserahmen zu klonieren und das

Gen für mod, der zweiten ADP-Ribosyltransferase des Bakteriophagen T4, zu

identifizieren. Nach der Klonierung sollte das gpMod überexprimiert und gereinigt werden.

Das gereinigte Protein sollte dann in einigen Aspekten wie Aktivität und Auswirkungen

auf die Transkription näher charakterisiert werden. Mit Hilfe ortspezifischer Mutagenese

sollten einige für die Katalyse als relevant postulierte Aminosäuren verifiziert bzw.

falsifiziert werden.

Außerdem sollte ein Reinigungsprotokoll für Mod erstellt werden, um es in ausreichender

Menge und Reinheit isolieren zu können. Dieses gereinigte Protein kann dann für

kristallographische Untersuchungen eingesetzt werden. Ein Vergleich mit den

Tertiärstrukturen anderer ADP-Ribosyltransferasen könnte das Wissen über die

Funktionsweise dieser Proteine erweitern.

Material und Methoden

13

2 Material und Methoden

2.1 Geräteliste

Elektrophoresezubehör:Agarose-Gelkammern:

Glasplatten, Kämme, KammernProtein-Gelkammern:

Mini-PROTEANII

Werkstätten der Ruhr-Universität Bochum

BioRad, Richmond (USA)Elektroporator:

Gene Pulse II BioRad, Richmond (USA)Geltrockner:

BiometraGel AirDryer

Biometra, GöttingenBioRad, Richmond (USA)

Inkubationsroller und –schüttler:New Brunswick Scientific G10Gio Gyrotory Shaker

New Brunswick (Can)New Brunswick (Can)

PCR-Cycler:Mini-Cycler™ Biozym, Hessisch Oldendorf

Photometer:PU 8730 UV/VISUV-Visible Spectrophotometer

Philips, Eindhoven (NL)Pharmacia LKB, Freiburg

Spannungsgeber:EPS 3500Power Pac 300

Pharmacia LKB, FreiburgBioRad, Richmond (USA)

Vakuumzentrifuge:Speed Vac Concentrator Uni Equip, München

Videodokumentation:Gel Print 2000i MWG-Biotech, Ebersberg

Western-Blot Apparatur:Mini-Trans-Blot-Kammer BioRad, Richmond (USA)

Zellaufschluß:Branson Sonifier 250

Branson Sonifier B-12French Pressure Cell Press

Branson, Danbury (USA)

SLM-Aminco, Rochester (USA)Zentrifugen:

Biofuge picoBiofuge 15 RSorvall RC-5B

Heraeus, OsterodeHeraeus, OsterodeDu Pont, Bad Homburg

Alle weiteren Geräte entsprachen dem üblichen Laborstandard.


14

2.2 Elektronische Datenverarbeitung

Zur Auswertung und Darstellung der Ergebnisse wurden folgende Computerprogramme

verwendet:

Microsoft® Office 97 Professional (Microsoft Corporation)

CorelDraw™ 6 oder 8 (Corel Corporation)

DNAStar (DNAStar Inc.)

Tina 2.09g (Raytest GmbH)

Diverse PDB-Betrachter wie RasMol , WebLab Viewer, Swiss PDB Viewer, MolMol

Die in dieser Arbeit wiedergegebenen Bilder wurden elektronisch in das Dokument

eingebunden. Die Originalgele wurden mit Hilfe einer Videodokumentationsanlage

digitalisiert. Im Verlauf der Datenerfassung und Datenverarbeitung kam es zu keiner

inhaltlichen Veränderung der Abbildungen.

2.3 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien

Acrylamid-Bisacrylamidstammlösungen:Long Ranger Gellösung 19:1 50% (Sequenzgele)Rotiphorese 29:1 40% (Proteingele)

FMC, Vallenbaek Strand (DK)

Roth, KarlsruheDNA-modifizierende Enzyme, Restriktionsenzyme,Nukleotide, Polymerasen, RNase-Inhibitor

MBI Fermentas, St. Leon-Rot; Gibco BRL,Neu-Isenburg; Boehringer, Mannheim

Molekularbiologische Kits:Quiaquick Gel Extraction KitNucleoSpin C+TT7 Sequenzing™ MixesQuickchange Mutagenese KitWizard™ Minipreps Plus

Qiagen, HildenMacherey-Nagel, DürenPharmacia, FreiburgStratagene, La Jolla (USA)Promega, Madison (USA)

Molekulargewichtsmarker:λ-Marker, EcoRI und HindIII geschnitten100 bp Leiter Plus10 kDa Leiter

MBI Fermentas, St. Leon-RotMBI Fermentas, St. Leon-RotGibco BRL, Neu-Isenburg

Oligonukleotide Gibco BRL, Neu-IsenburgPVDF-Membran:

Immobilon-P Millipore, EschbornRadiochemikalien:

α[32P]-UTP spez. Aktivität: 30 TBq/mmolα[35S]-dATP spez. Aktivität: 600 Ci/mmol[32P]NAD+ spez. Aktivität: 800 Ci/mmol

Hartmann Analytic GmbH, BraunschweigHartmann Analytic GmbH, BraunschweigNEN, Boston (USA)

Röntgenfilm:Fuji Medical X-Ray Film Fuji (Japan)

Alle anderen nicht aufgeführten Chemikalien wurden in Analyse-Qualität von den FirmenBiomol, Hamburg; J.T. Baker, Groß-Gerau; Merck, Darmstadt; Riedel-de Haën, Hannover;Serva, Heidelberg und Sigma, München bezogen.


15

2.4 Biologisches Material

2.4.1 Plasmide

Plasmid/Vektor relevante Eigenschaften (Resistenz) ReferenzpBluescript II KS allgemeiner Klonierungsvektor (Amp)

pBluescript II SK allgemeiner Klonierungsvektor (Amp)SHORT et al., 1988

pT7-5 Expressionsvektor mit T7 Promotor (Amp)

pT7-6 Expressionsvektor mit T7 Promotor (Amp)

TABOR & RICHARDSON,1985

pGEX-3X Expressionsvektor, Fusionsprotein mit GST (Amp) SMITH & JOHNSON, 1988

pET-11d Expressionsvektor mit T7 Promotor und lac Operator(Amp)

pET-16b (+) Expressionsvektor mit T7 Promotor und lac Operator, N-terminaler His-Tag (Amp)

pET-22b (+) Expressionsvektor mit T7 Promotor und lac Operator,Signalsequenz für Periplasma (Amp)

STUDIER & MOFFATT, 1986ROSENBERG et al., 1987STUDIER et al., 1990DUBENDORFF & STUDIER,1991

pET-32b (+) Expressionsvektor mit T7 Promotor und lac Operator,Fusionsprotein mit Trx, C-terminaler His-Tag (Amp)

LA VALLIE et al., 1993

pLysS Exprimiert T7 Lysozym als Inhibitor für T7 Polymerase(Cam)

STUDIER, 1991

pSW1 Exprimiert „Bacteriocin Release Protein“ (Tet) VAN DER WAL et al., 1995

pBAD/His B Expressionsvektor mit araBAD Promotor und N-terminalen His-Tag (Amp)

GUZMAN et al., 1995

pGroESL Exprimiert GroEL und GroES (Cam) GOLOUBINOFF et al., 1989

pBN19 Exprimiert DnaK (Tet) BLUM et al., 1992

p13.149 pKWIII mit T4 Promotor p13.149 (Amp)

p8.182 pKWIII mit T4 Promotor p8.182 (Amp)

ptac pKWIII mit Promotor ptac (Amp)

WILKENS & RÜGER, 1996

pTKRI Exprimiert gpAlt des Bakteriophagen T4 (Kan) KOCH et al., 1995

p11modAB3 pET-11d mit modA kloniert über NcoI und BamHI(Mutation M125→K) (Amp)

diese Arbeit

p11modBB5 pET-11d mit modB kloniert über NcoI und BamHI (Amp) diese Arbeit

p11modB1 pET-11d mit modB kloniert über NcoI (Amp) diese Arbeit

p22modBB2 pET-22b mit modB kloniert über NcoI und BamHI (Amp) diese Arbeit

p16modA7 pET-16b mit modA kloniert über BamHI, N-terminalerHis-Tag (Amp)

diese Arbeit

p16modB1 pET-16b mit modB kloniert über NdeI und BamHI, N-terminaler His-Tag (Amp)

diese Arbeit

p16modA7-E165D p16modA7 mit Mutation E165→D (Amp) diese Arbeit

p16modA7-R72K p16modA7 mit Mutation R72→K (Amp) diese Arbeit

p16modB1-E173D p16modB1 mit Mutation E173→D (Amp) diese Arbeit

p16modB1-R73K p16modB1 mit Mutation R73→K (Amp) diese Arbeit

p32modA2 pET-32b mit modA kloniert über NcoI und XhoI als Trx-Fusionsprotein (Amp)

diese Arbeit

p32modA-His p32modA2 ohne NdeI Schnittstelle in modA und ohne trx

Anteil (Amp)diese Arbeit

pBADmodA2 pBAD/His B mit modA über XhoI und HindIII kloniert(Amp)

diese Arbeit

pBADmodA2-R72K pBADmodA2 mit Mutation R72→K (Amp) diese Arbeit

pBADmodA2-E165D pBADmodA2 mit Mutation E165→D (Amp) diese Arbeit


16

pET-11d

5674 bps

BamHIDra IIEcoRV

HindIIICla IEcoRIDra II

Xmn ISca IPvu IPst I

Acc IPvu IIXmn I

IIDraIIDra

IEag

IIPvuIIPvu

RVEcoHIIBss

IApa

IIDraIIBgl

IXbaINco

Amp

ori pBR322

lacI

T7 Prolac operator

pET-16b(+)

5711 bps

Dra IIXmn I

Sca IPvu I

Pst I

Acc IPvu IIXmn I

IIDraIIDra

IEag

IIPvuIIPvu

RVEcoHIIBss

IApa

IIDraIIBgl

INcoINdeIXho

HIBamIIDra

RVEcodIIIHin

IClaRIEco

Amp

ori pBR322

lacI

T7 ProHis-TagMCS

pET-32b(+)

5899 bps

Xmn ISca IPvu IPst I

Acc IPvu IIXmn I

IIDraIIPvu

IIPvucIIHin

HIIBss

IApa

IIDraIClaIXbaINde

IClaIXmnINde

IIBglIKpn

INcoRVEcoHIBamRIEco

ISacISal

cIIHinIAcc

dIIIHinINotIEagIXho IIDra

f1

Amp

ori pBR322

lacI

T7 ProtrxA

T7 Ter

pBAD/His B

4094 bps

Afl IIIBamHI

Nco INhe I

Rsa IBamHISac IXho IBgl IIPst IPvu IIKpn IRsa INde IEcoRIHin dIII

Xmn I

Xmn IHincIISca IRsa I

Pvu IIIIAflINdeIRsaIAcc

HIIBssINsi

RVEcoIRsaIRsa

ISspHIIBss

pBAD

MCS

Amp

ColE1

araC

Abb. 2.1: Die Abbildung gibt die wichtigsten, in dieser Arbeit verwendeten,Expressionsvektoren wieder.


17

2.4.2 Oligonukleotide (Primer)

Tabelle 2.1 Die angegebenen Oligonukleotide wurden für die PCR, zum Sequenzieren oder fürdie Mutagenese eingesetzt. Die farbig hervorgehobenen Basen geben entwedereingefügte Restriktionsschnittstellen für die gerichtete Klonierung oderBasenaustausche für die Mutagenese wieder.

Name Sequenz

1018 (PstI) TTCTGCAGTATACGGAGG

1021 (BglII) TAATGAGATCTAAGTCCTTCC

modA (EcoRV) CGGAGGATATCATGATTATT

7-5Vorn AATTCTCATGTTTGACAGCT

7-5Hinten GGCTTATCGAAATTAATACG

modBAnf ACGGAGGCTACCATGGTTATTAAT

modBEnde CACCGATGCATCCATGGATTTTAT

modAAnf TGAGGTAGTTCCATGGAATACTCA

modAEnde GCTTTAAAACTTCCATGGTATAATGA

modBEndBam GCACCGATGGATCCATTGATTTTA

modAEndBam TGGTATAATGGATCCAAGTCCTTC

modBNde ACGGAGGCTCATATGATTATTAAT

modABam TTGAATGAAGGATCCAGTAATGCA

Seq-AP AAACCAGATGACCATTCTTG

Seq-AT CAAGAATGGTCATCTGGTTT

Seq-BP GAATGAAGCTCTTCATAAGC

Seq-BT GCTTATGAAGAGCTTCATTC

Mut-A-E165→D1 GAACAAGACGTAATGATA

Mut-A-E165→D2 TATCATTACGTCTTGTTC

Mut-B-E173→D1 GAACAAGACTGGATGATT

Mut-B-E173→D2 AATCATCCAGTCTTGTTC

Mut-A-R72→K1 CTTTGGAAAGGTGTTCCA

Mut-A-R72→K2 TGGAACACCTTTCCAAAG

Mut-B-R73→K1 CAATTATATAAAGGTATATCA

Mut-B-R73→K2 TGATATACCTTTATATAATTG

T7-Promotor TAATACGACTCACTATAGGG

modANcoIAnf ATTGAGGTAGTTCCATGGAATACTCAG

modAXhoIEnd AGTCCTTCCACTCGAGATTAAATCCTTC

Mut-A-Nde1 CGTATCAGCTTCTTATGATAAAAATATAG

Mut-A-Nde2 CTATATTTTTATCATAAGAAGCTGATACG

modAAnfXhoI GGTAGTTGCTCGAGATACTRCAGTAATGC

modAEndHindIII GGTATAATGAATCTAAAAGCTTCCATTATAG


18

2.4.3 Bakterienstämme

Stamm Genotyp Firma ReferenzBL21 E. coli B

F- dcm ompT hsdS(rB- mB-) gal

Stratagene

BL21(DE3) E. coli BF- dcm ompT hsdS(rB- mB-) gal λ(DE3)

Stratagene

STUDIER &MOFFATT, 1986

BLR F- ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm ∆(srl-

recA)306::Tn10(TetR)Novagen

BLR(DE3) F- ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm ∆(srl-

recA)306::Tn10(TetR) λ(DE3)Novagen

C41(DE3) nicht näher definierte Mutante von BL21 (DE3)C43(DE3) nicht näher definierte Mutante von BL21 (DE3)

MIROUX &WALKER, 1996

DH5αF' F'Φ80d lacZ∆M15, recA1, endA1, gyrA96, thi-

1, hsdR17 (rK-, mK+), supE44, relA1, deoR,∆(lacZYA-argF)U169

Stratagene WOODCOCK et al.,1989

ED8739 F- metB supE supF hsdS (rK12- mK12-) Novagen BORCK et al., 1976STUDIER &MOFFATT, 1986

JM103 endA1 supE sbcBC thi-1 strA ∆(lac-pro) [F'traD36 lacI

qZ∆M15 proAB] (P1 lysogen)

Stratagene HANAHAN, 1983

JM109 e14-(McrA-) recA1 endA1 gyrA96 thi-1

hsdR17(rK- mK+) supE44 relA1 ∆(lac-proAB)[F'traD36 proAB lacI

qZ∆M15]

Stratagene YANISCH-PERRON

et al., 1985

LE392 F- hsdR514 (rK12- mK12+) mcrA supE44 supF58

lacY1 oder ∆(lacIZY) galK2 galT22 metB1

trpR55

Novagen MANIATIS et al.,1982

LMG194 F- ∆lacX74 gal E thi rpsL ∆phoA (PvuII)∆ara714 leu::Tn10 (TetR StrR)

Invitrogen

MV1190 ∆(lac-proAB) thi supE ∆(srl-

recA)306::Tn10(Tet)R [F':traD36 proAB

lacIq∆M15]

Stamm-sammlung

XL-1 Blue recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1

lac [F' proAB lacIqZ∆M15 Tn10 (TetR)]

Stratagene BULLOCK et al.,1987

2.4.4 Bakteriophagen

Phage Eigenschaft ReferenzλCE6 Enthält Gen für T7 RNA-Polymerase STUDIER & MOFFATT, 1986mGP1-2 Enthält Gen für T7 RNA-Polymerase TABOR & RICHARDSON, 1985


19

2.5 Arbeiten mit Bakterien

2.5.1 Anzucht von Bakterien

Nähr- und Lagermedien

LB-Medium 2x YT-Medium1 % (w/v) Bacto-Pepton 1,6 % (w/v) Bacto-Pepton0,5 % (w/v) Hefeextrakt 1 % (w/v) Hefeextrakt1 % (w/v) NaCl 0,5 % (w/v) NaClpH 7,5 pH 7,5

SOC-Medium Trypton-Phosphat-Medium (MOORE et al., 1993)2 % (w/v) Bacto-Pepton 2 % (w/v) Bacto-Pepton0,5 % (w/v) Hefeextrakt 1,5 % (w/v) Hefeextrakt10 mM NaCl 0,2 % (w/v) Na2HPO4

2,5 mM KCl 0,1 % (w/v) KH2PO4

10 mM MgCl2 0,8 % (w/v) NaCl10 mM MgSO4

20 mM Glucose vor Gebrauch 0,2 % Glucose dazupH 7,5

RM-Medium + Glucose 10 x M9 Salze1 x M9 Salze 60 g Na2HPO4

2 % (w/v) Casaminosäuren 30 g KH2PO4

0,2 % (w/v) Glucose 5 g NaCl1 mM MgCl2 10 g NH4Clfür 1 Liter 20 g Casaminosäuren in ad 900 ml A.dest.890 ml A.dest. autoklavieren, pH 7,4dann 100 ml 10 x M9 Salze

1 ml 1 M MgCl2

10 ml 20 % Glucose

M9-Medium Lösung 3100 ml Lösung 1 0,2 g CaCl2 x 2 H2O10 ml Lösung 2 ad 100 ml A. dest.

10 ml Lösung 3100 ml Lösung 4750 ml steriles A. dest. Lösung 4

35 g Na2HPO4 x 2 H2OLösung 1 15 g KH2PO4

20 g Glucose 2,5 g NaClad 500 ml A. dest. 5 g NH4Cl

ad 500 ml A. dest.

Lösung 2 pH 7,42,5 g MgSO4 x 7 H2O ad 100 ml A. dest.


20

β-Galaktosidase-Medium Lager-Medium 8 g LAB-Lemco Broth 0,3 % (w/v) KH2PO4

4 g NaCl 0,7 % (w/v) K2HPO4

10 g Casaminosäuren 0,05 % (w/v) Na-Citrat 5 g Pepton 0,01 % (w/v) MgSO4

ad 1 Liter A. dest. 55 % (w/v) GlyzerinpH 7,5

Für die Herstellung von Festplattenagar wurden den entsprechenden Medien 1,5 % (w/v)

Bacto-Agar zugegeben. Zur Selektion von plasmidtragenden Bakterien wurden den

Medien entsprechende Antibiotika zugesetzt.

Festplattenmedien mit ADP-Ribosyltransferase Inhibitoren

Manchem selektiv Festplattenagar wurden spezifische Inhibitoren wie

3-Methoxybenzamid (m-Anisamid) für poly-ADP-Ribosyltransferasen bzw.

1H,3H-Chinazolin-2,4-dion (Benzoylenharnstoff) für mono-ADP-Ribosyltransferasen in

Konzentrationen von 2 mM zugesetzt (BANASIK & UEDA, 1994). Abb. 2.2 gibt die

Strukturformeln der verwendeten Inhibitoren wieder.

CH3O CONH2

N

NH

O

O

3-Methoxybenzamid (m-Anisamid)

1H,3H-Chinazolin-2,4-dion (Benzoylen-Harnstoff)

Abb. 2.2 Strukturformeln der ADP-Ribosyltransferase Inhibitoren 3-Methoxybenzamidund 1H,3H-Chinazolin-2,4-dion.

Verfahren zur Anzucht der BakterienDie Anzucht von Übernacht-Kulturen erfolgte in Reagenzgläsern mit 5 ml Flüssigmedium,

je nach Versuchsvorgaben bei 30° C bis 37° C auf einem Inkubationsroller bei 220 Upm.


21

2.5.2 Transformation in Escherichia coli

2.5.2.1 Herstellung kompetenter Zellen für die Elektrotransformation

Es wurden 2 x 200 ml 2x YT-Medium in 1000 ml Erlenmeyerkolben mit 2 ml einer

frischen Übernacht-Kultur der entsprechenden Bakterien angeimpft und bei 37° C auf

einem Schüttler bis OD590 von 0,5 - 0,8 inkubiert. Anschließend verblieben die Zellen 15 –

30 min auf Eis und wurden weiterhin kalt gehalten. Die Zellen wurden bei 4000 x g für 15

min bei 4° C sedimentiert (Sorvall RC-5, GSA Rotor). Der Überstand wurde vollständig

entfernt und die Zellen in 200 ml eiskalten A. dest. gewaschen. Nach erneuter

Zentrifugation folgte ein weiterer Waschschritt mit 100 ml eiskaltem A. dest. und

Zentrifugation. Die Bakterien wurden nun in 4 ml 10 % Glyzerin aufgenommen und auf je

vier 2 ml Eppendorfgefäße verteilt. Nach einer Zentrifugation für 15 min bei 4° C und

3000 x g (Biofuge 15R, Rotor #3042) wurden die Bakterien in je 125 µl 10 % Glyzerin

suspendiert, in Aliquots zu 40 µl in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80° C

gelagert.

2.5.2.2 Elektrotransformation

Die elektrokompetenten Zellen wurden vorsichtig aufgetaut und zusammen mit der zu

transformierenden DNA in eine eisgekühlte Elektroporationsküvette (0,2 cm; Peqlab,

Erlangen) gegeben. Enthielt die DNA-Lösung Salze, mußte sie vorher auf einem

Nitrozellulosefilter (0,025 µm Porengröße, 13 mm ∅, Millipore, Erlangen) dialysiert

werden. Die Elektrotransformation (Gen Pulse II, BioRad) erfolgte bei 2,5 kV, 25 µF und

200 Ω. Nach erfolgtem Stromstoß lag die Zeitkonstante bei ca. 5 msec. Anschließend

wurden die Bakterien mit 1 ml SOC-Medium (2.5.1) versetzt und für 30 – 60 min bei

37° C auf einem Schüttler inkubiert. Je nach eingesetzter DNA Menge wurden 50 – 200 µl

der Bakteriensuspension auf entsprechende Selektivmedien ausplattiert.

2.5.2.3 Herstellung hitzeschockkompetenter Zellen mittels CaCl2

Zur Herstellung hitzeschockkompetenter Zellen wurden 400 ml LB-Medium 1 %ig mit

einer frischen Übernacht-Kultur angeimpft und bei 37° C auf einem Schüttler bis OD590

von ca. 0,375 inkubiert. Nach einer 10 minütigen Inkubation auf Eis wurden die Zellen für

7 min bei 4° C und 1600 x g (Sorvall RC-5, GSA Rotor) sedimentiert und die Zellen in

40 ml CaCl2-Lösung (60 mM CaCl2, 15 % (w/v) Glyzerin, 10 mM MOPS) suspendiert.

Nach einer weiteren Zentrifugation für 5 min bei 4° C und 1100 x g wurden die Zellen


22

noch einmal in 40 ml CaCl2-Lösung aufgenommen und 30 min auf Eis inkubiert, wieder

für 5 min sedimentiert und anschließend in 8 ml CaCl2-Lösung suspendiert. Die nun

kompetenten Zellen wurden in Aliquots zu je 100 µl aufgeteilt und bei –80° C gelagert.

2.5.2.4 Hitzeschocktransformation

100 µl der hitzeschockkompetenten Zellen wurden mit der zu transformierenden DNA

vermischt und 10 min auf Eis inkubiert. Anschließend erfolgte der Hitzeschock für 2 min

bei 42° C. Danach wurde 1 ml LB-Medium (2.5.1) zu den Bakterien gegeben. Die

phänische Expression erfolgte für 1 Stunde bei 37° C auf einem Inkubationsroller. Je nach

eingesetzter DNA wurden 50 – 200 µl der Bakteriensuspension auf entsprechende

Selektivmedien ausplattiert.

2.5.3 Überexpression von Proteinen in Escherichia coli

2.5.3.1 Überexpression mit λλλλ-Phage CE6

Herstellung von λλλλCE6 Stocklösungen

Der Wirtsstamm für die Vermehrung des λCE6 muß supF exprimieren, damit die Sam7

Lysismutation im Phagen unterdrückt wird. Als Wirtsbakterien wurden somit die Stämme

ED8739 oder LE392 verwendet, die in 10 ml LB-Medium (2.5.1) mit 0,2 % Maltose und

10 mM MgSO4 angezogen wurden bis sie eine OD600 von 1 erreicht hatten. Danach

wurden 5 ml der Wirtszellen mit 2 x 108 Phagenpartikeln gemischt und bei 37° C für 15

min ohne zu schütteln inkubiert. Das Bakterien/Phagen-Gemisch wurde in 500 ml LB-

Medium mit 10 mM MgSO4 überführt und bei 37° C mit 250 Upm auf einem Schüttler

inkubiert bis die Zellen lysiert waren (ca. 5 Stunden). Danach wurden 5 ml Chloroform

zugegeben und weitere 10 min geschüttelt. Anschließend wurden die Zelltrümmer bei

10.000 x g und 4° C für 10 min sedimentiert. Nach Zugabe von 7 % (v/v) DMSO

Endkonzentration zu der Phagensuspension konnte diese bei –70° C gelagert werden.

Induktion der Überexpression mit λλλλCE6

BL21 Zellen mit dem zu exprimierenden Plasmid wurden in LB-Medium mit 0,2 %

Maltose und entsprechendem Antibiotikum bei 37° C auf einem Schüttler angezogen bis

die OD600 zwischen 0,6 und 1 lag. Danach wurde MgSO4 zu einer Endkonzentration von

10 mM und λCE6 zu einer Endkonzentration von 2 – 4 x 109 pfu/ml („MOI“ 5-10)

zugegeben. Außerdem mußte 1 mM IPTG Endkonzentration verabreicht werden, um den


23

T7 Promotor auf den pET-Vektoren zu öffnen. Die infizierten Zellen wurden für weitere

drei Stunden inkubiert und anschließend durch Zentrifugation geerntet.

2.5.3.2 Überexpression mit M13-Phage mGP1-2

Herstellung von mGP1-2 Stocklösungen

Der Wirtsstamm für die Vermehrung von mGP1-2 muß F' sein und einen Amber

Suppressor tragen (z.B. JM103, JM109 oder MV1190). Die Wirtsbakterien wurden in

50 ml 2x YT-Medium bei 37° C bis zu einer OD590 = 0,1 angezogen, mit einem

Einzelplaque von mGP1-2 infiziert und 5 – 8 Stunden weiter inkubiert. Nach einer

Sedimentation der Zellen wurden zu den 50 ml Phagensuspension 3,5 g PEG 6000 gegeben

und die Phagen gefällt.

Induktion der Überexpression mit mGP1-2

MV1190 Zellen mit dem zu exprimierenden Plasmid wurden in 5 ml LB-Medium mit dem

entsprechenden Antibiotikum über Nacht bei 37° C angezogen. Von der Übernacht-Kultur

wurden 100 ml LB-Medium 1 %ig angeimpft, entsprechendes Antibiotikum zugegeben

und die Zellen bei leichtem Schütteln bis OD590 = 0,5 inkubiert. Danach wurden die Zellen

mit mGP1-2 infiziert („MOI“ ~ 10) und 1 mM IPTG Endkonzentration zugegeben, um die

Expression von den pET-Vektoren zu starten. Nach 1,5 bis 3 Stunden konnten die Zellen

geerntet werden.

2.5.3.3 Überexpression mit DE3 Stämmen

Zur Überexpression der Proteine aus pET-Vektoren wurden hauptsächlich

Bakterienstämme benutzt, die durch einen λ-lysogenen Phagen das Gen der T7 RNA

Polymerase im Genom integriert haben (BL21(DE3); BLR(DE3); C41(DE3); C43(DE3)

(2.4.3)). Einige dieser Stämme enthielten ebenfalls das Plasmid pLysS, das für T7

Lysozym kodiert, was einen natürlichen Inhibitor der T7 RNA Polymerase darstellt

(MOFFATT & STUDIER, 1987; STUDIER, 1991; ZHANG & STUDIER, 1997). In Abb. 2.3 sind

die Kontrollelemente des pET Systems wiedergegeben.

Für die Überexpression wurden die Zellen mit dem entsprechenden Plasmid unter

Selektionsdruck in verschiedenen Medien angezogen (LB-, 2x YT-, M9-, Trypton-

Phosphat-Medium (2.5.1)). Die Anzucht erfolgte bei Temperaturen zwischen 16° C und


24

45° C auf einem Schüttler bei 200 Upm. Bei Erreichen einer OD590 von 0,8 wurde die

Überexpression mit 0,5 - 1 mM IPTG Endkonzentration gestartet. Je nach verwendetem

Bakterienstamm wurden die Zellen für 0,5 – 16 Stunden weiter inkubiert. Die Zellen

wurden durch Zentrifugation (Sorvall RC-5B; Rotor GSA; 4000 x g, 20 min, 4°C)

geerntet, in Aufschlußpuffer (2.5.5) suspendiert und bei –20° C bis zur Weiterverarbeitung

gelagert.

Abb. 2.3: Kontrollelemente des pET Systems (nach Novagen, verändert).

2.5.3.4 Überexpression aus pBAD-Vektoren

Zur Überexpression aus pBAD-Vektoren wurde der E. coli Stamm LMG194 (2.4.3)

verwendet. Die mit dem entsprechenden pBAD-Plasmid transformierten Zellen wurden

unter Selektionsdruck in RM-Medium + Glucose oder β-Galaktosidase-Medium (2.5.1) bis

OD600 = 0,5 bei 37° C und 200-250 Upm auf einem Schüttler angezogen. Die Induktion

erfolgte mit 0,00002 % bis 0,2 % L-Arabinose Endkonzentration. Die induzierten Zellen

wurden nach 4 Stunden durch Zentrifugation (Sorvall RC-5B; Rotor GSA; 4000 x g, 20

min, 4°C) geerntet, in Aufschlußpuffer (2.5.5) suspendiert und bei –20° C bis zur

Weiterverarbeitung gelagert. In Abb. 2.4 ist eine schematische Darstellung der Regulation

des pBAD Promotors wiedergegeben.


25

AraC Dimer

keine Transkription

+ Arabinose

Transkription

Abb. 2.4: Regulation des pBAD Promotors.C: Carboxyterminus des AraC; N: Aminoterminus des AraC; O2, I1, I2:Bindestellen für AraC; CAP: (CAP)-cAMP Komplex; Pc: araC Promotor

2.5.3.5 Überexpression in Gegenwart von Bakteriocinfreisetzungsprotein

Das Plasmid pSW1 kodiert für das Bakteriocinfreisetzungsprotein BRP („bacteriocin

release protein“) dessen Bildung durch Zugabe von Mitomycin C induziert werden kann

(VAN DER WAL et al., 1995). Durch die Coexpression des BRP mit dem gpModA bzw.

gpModB sollten diese in das Medium freigesetzt und die Bildung von Einschlußkörpern

verhindert werden.

Cotransformanden mit pSW1 und entsprechenden pET-Vektoren in BL21(DE3) bzw.

BLR(DE3) wurden von einer Übernacht-Kultur 1 %ig in 1x YT-Medium mit 15 µg/ml

Tetracyclin und 100 µg/ml Ampicillin angeimpft. Anschließend wurden die Zellen bei

37° C auf einem Schüttler inkubiert. Bei Erreichen einer OD590 von 0,6 wurde die

Expression des BRP durch Zugabe von 10 – 300 ng/ml Endkonzentration Mitomycin C

induziert. 30 min später erfolgte die Induktion der pET-Vektoren mit 1 mM IPTG

Endkonzentration. Die Expression wurde für weitere 3 Stunden fortgesetzt, die Zellen

sedimentiert und der Proteinanteil im Überstand und den Zellen in einem SDS-

Polyacrylamidgel (2.7.2) analysiert.

2.5.3.6 Coexpression von Chaperonen bei der Überexpression

Weitere Versuche zur Vermeidung von Einschlußkörpern schlossen die Coexpression von

Chaperonen ein. Dazu wurden die Plasmide pGroESL (GOLOUBINOFF et al., 1989) und

pBN19 (BLUM et al., 1992a; 1992b) verwendet. Das Plasmid pGroESL kodiert für die


26

Hitzeschockproteine GroES und GroEL während pBN19 für das HSP70 Chaperon DnaK

kodiert.

Für die Überexpression wurden Cotransformanden der pET-Vektoren mit pGroESL bzw.

pBN19 in BL21(DE3) verwendet. Die Anzucht erfolgte bei 37° C auf einem Schüttler bis

zu einer OD590 von 0,6 - 0,8. Die Coexpression wurde durch Zugabe von 1 mM IPTG

Endkonzentration induziert und die Zellen für 3 Stunden weiter inkubiert. Anschließend

wurden die Zellen geerntet, aufgeschlossen und der Gehalt an löslichen bzw. unlöslichen

Proteinen auf SDS-Polyacrylamidgelen (2.7.2) analysiert.

2.5.4 Plasmidstabilitätstest der pET-Vektoren und Modifikationen desTestverfahrens

2.5.4.1 Plasmidstabilitätstest der pET-Vektoren

Kurz vor der Induktion der pET-Vektoren kann man die Kultur auf den Anteil der

Bakterien untersuchen, die das Plasmid noch tragen und exprimieren können. Dazu wurden

Verdünnungen der Bakterien auf unterschiedliche Agar-Platten ausplattiert, siehe Tabelle

2.2. Für diesen Test wurden die Stämme BL21(DE3) und BLR(DE3) verwendet.

Tabelle 2.2: Übersicht über die verwendeten Agar-Platten im Plasmidstabilitätstest und die zuerwarteten Kolonienzahlen.

LB-Agar-Platte Verdünnung erwartetesWachstum in %

Wachstum von

ohne Zusatz 2 x 10-4 100 alle Zellen

mit 100 µg/ml Amp 2 x 10-4 100 Zellen mit Plasmid

mit 1 mM IPTG 10-3 < 2 Zellen ohne Plasmid oderMutanten, die die Ziel-DNAnicht mehr exprimieren können

mit 100 µg/ml Ampund 1 mM IPTG

10-3 < 0,01 Mutanten, die die Ziel-DNAnicht mehr exprimieren können

2.5.4.2 Schnellüberprüfung auf Expressionsfähigkeit der Transformanden

Der Plasmidstabilitätstest (2.5.4.1) konnte leicht modifiziert auch zur Schnellüberprüfung

auf die Expressionsfähigkeit von Transformanden herangezogen werden. Dazu wurden die

Transformanden in einem Raster auf LB-Agar mit 100 µg/ml Ampicillin und auf LB-Agar

mit 100 µg/ml Ampicillin und 1 mM IPTG übertragen. Die Transformanden, die nicht auf

dem IPTG haltigen Agar wuchsen wurden von dem Ampicillin haltigen Agar für die

Überexpression angeimpft.


27

2.5.4.3 Schnellüberprüfung der Toxizität von ModA und ModB sowie deren Mutanten

Eine weitere Modifikation des Plasmidstabilitätstests (2.5.4) konnte Hinweise über die

Toxizität von ModA, ModB und deren Mutanten geben. Für diesen Test wurde der Stamm

C41(DE3) (MIROUX & WALKER, 1996) verwendet. Dieser Stamm ist eine nicht näher

definierte Mutante von BL21(DE3) und hat die Fähigkeit unter induzierten Bedingungen

auf Agar-Platten zu wachsen, da entweder die Prozessivität oder die Menge der gebildeten

T7 RNA Polymerase verringert ist.

Zur Überprüfung der Toxizität wurden die zu untersuchenden Plasmide in C41(DE3)

transformiert und auf Selektiv-Agar und Selektiv-Agar mit 1 mM IPTG ausplattiert.

2.5.5 Aufschluß von Bakterien und Reinigung von Einschlußkörpern

Die aus einer 500 ml Expressionskultur geernteten Bakterien (ca. 2,5 g) wurden in 10 –

30 ml Aufschlußpuffer suspendiert und entweder mit Ultraschall (Branson Sonifier B-12,

bei 100 W) auf Eis für 6 mal 30 sec oder mit der French Presse (Cell Typ 40 K) bei

2000 psig aufgeschlossen.

Nach erfolgtem Aufschluß wurden die Einschlußkörper bei 3000 x g (Sorvall RC-5, GSA

Rotor) für 20 min bei 4° C von den Zellresten und den löslichen Proteinen getrennt. Die

Einschlußkörper wurden anschließend in 30 ml „Inclusionbody“-Waschpuffer

resuspendiert und 30 min auf Eis mit gelegentlichem vortexen inkubiert. Nach einer

weiteren Sedimentation der Einschlußkörper bei 10.000 x g für 20 min bei 4°C konnten

diese dann entweder im Aufschlußpuffer mit 6 M GuHCl oder im „Inclusionbody“-

Denaturierungspuffer aufgelöst werden. Schwer lösliche Bestandteile wurden durch eine

Zentrifugation bei 20.000 x g für 30 min sedimentiert oder die Lösung durch einen 0,45

µm Filter gegeben.

Aufschlußpuffer „Inclusionbody“-Waschpuffer (HLODAN et al., 1991)50 mM NaH2PO4 50 mM Tris-HCl pH 7,5300 mM NaCl 2 mM EDTA10 mM Imidazol 100 mM NaClpH 8,0 1 M Harnstoffnach dem Autoklavieren 0,05 % (w/v) Deoxycholatsäurefrisch dazu: 1 mM DTT1 mM DTT 1 mM PMSF2 mM PMSF 0,5 mg/ml Lysozym


28

„Inclusionbody“-Denaturierungspuffer100 mM Tris2 M HarnstoffpH 12,0

2.6 Arbeiten mit DNA

2.6.1 Methoden der Plasmidisolierung

Zur Isolation von Plasmid-DNA aus E. coli wurden diverse Plasmid Isolations Kits der

Firmen Qiagen (Hilden), Macherey-Nagel (Düren) und Promega (Madison USA) unter

Befolgung der entsprechenden Protokolle verwendet.

Des weiteren wurde die Methode von BIRNBOIM & DOLY (1979) oder zur Schnellisolation

von Plasmid-DNA die Methode von GOODE & FEINSTEIN (1992) eingesetzt.

2.6.2 Enzymatische Modifikationen von Plasmid-DNA

Enzymatische Modifikationen von Plasmid-DNA wie Restriktionsverdau, Ligation,

Dephosphorylierung, S1-Verdau, Mungbohnen Nuklease-Verdau und Modifikationen mit

dem Klenow-Fragment erfolgten nach den Angaben der entsprechenden Enzymhersteller

(Gibco BRL, Neu-Isenburg; MBI Fermentas, St. Leon-Rot; Boehringer, Mannheim) oder

nach AUSUBEL et al. (1993).

2.6.3 Polymerase Kettenreaktion (PCR)

Zur Amplifikation der Gene modA und modB aus dem T4 Genom wurde die Polymerase

Kettenreaktion verwendet. Es wurde T4 DNA verwendet, die nicht das 5-Hydroxymethyl-

Cytosin sondern Cytosin beinhaltet (Cyt-DNA aus T4 alc563 [42- (amC87), 56- (amE51),

denB- (amS19), alc (unf39)]. Die PCR wurde in einem Mini-Cycler (Biozym) nach

folgendem Standard Protokoll durchgeführt:

1) 30 sec 95° C2) 2 min 5° - 10° C unter der Schmelztemperatur der Primer3) 1 min 72° C4) gehe zu 1) 35 mal5) 10 min 72° C


29

Die Reaktionsansätze setzten sich im Allgemeinen folgendermaßen zusammen:

Komponente µlT4 Cyt-DNA (XhoI-hydrolysiert) 10 ng/µl 210 x Puffer 10je 2,5 mM dNTP´s 1050 mM MgCl2 5Anfang-Primer (10 pmol/µl) 5Ende-Primer (10 pmol/µl) 5Taq-Polymerase 2 U/µl 1A. dest. 62

2.6.4 Mutagenese

Die ortsspezifische Mutagenese der Gene modA und modB erfolgte mit dem

„QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit“ von Stratagene. Dabei wurden die unter

2.4.2 aufgeführten Mutageneseprimer (Mut...) verwendet. Die Mutagenese erfolgte in

einem Mini-Cycler (Biozym) in Anlehnung des Herstellers. Da die Mutageneseprimer

laut Angabe von Stratagene eine zu niedrige Schmelztemperatur haben, wurde das PCR-

Protokoll wie folgt geändert:

1) 30 sec 95° C2) 1 min 40° C

2 min ↓68° C

3) 13 min 68° C 4) gehe zu 1) 16 mal

Nach erfolgter Mutagenese wurde das methylierte, nicht mutierte Parental-DNA Template

durch DpnI hydrolysiert. Die verbliebenen mutagenisierten Plasmide wurden in E. coli

XL1-Blue transformiert und auf Selektiv-Medium ausplattiert. Zur Überprüfung der

erfolgreichen Mutagenese wurden die Plasmide isoliert und sequenziert (2.6.1; 2.6.7).

2.6.5 Agarose-Gelelektrophorese

Die Auftrennung von DNA-Fragmenten erfolgte je nach Größe der zu trennenden

Fragmente in 0,6 – 1,5 % (w/v) Agarose in TAE-Puffer mit 0,5 µg/ml Ethidiumbromid.

Die Gelelektrophorese fand in einer horizontalen Elektrophoresekammer (9 x 10 cm) bei

80 mA für 0,5 – 2 Stunden statt. Vor dem Auftragen der Proben wurden diese mit

entsprechenden Mengen 10 x DNA-Probenpuffer versetzt. Als Größenstandards wurde

EcoRI/HindIII-verdaute λ-DNA und eine 100 bp Plus Leiter eingesetzt (2.3).


30

10 x TAE-Puffer 10 x DNA-Probenpuffer400 mM Tris-HCl pH 7,6 25 % (w/v) Glyzerin10 mM Essigsäure 0,05 % (w/v) Bromphenolblau2 mM EDTA in TAE-Puffer

2.6.6 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen

Die Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen erfolgte mittels des „QIAquick

Gel Extraction Kit“ (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers.

2.6.7 DNA-Sequenzierung nach SANGER et al. (1977)

Die DNA Sequenzierung erfolgte mit den „T7 Sequencing Mixes“ (Pharmacia, Freiburg)

unter Einsatz von α[35S]dATP nach Angaben des Herstellers. Die Auftrennung der

Reaktionsgemische erfolgte in 6 %igen Polyacrylamidgelen (290 x 600 x 0,35 mm) mit

7 M Harnstoff in 1,2 x TBE-Puffer. Als Laufpuffer dienten der Anoden-Puffer (0,6 x TBE)

und der Kathoden-Puffer (0,6 x TBE, 90 mM Na-Phosphat). Die Proben wurden bei 35 W

für 2,5 Stunden bzw. 5,5 Stunden aufgetrennt, das Gel auf Whatman Papier gezogen und

auf einem Geltrockner getrocknet. Anschließend erfolgte eine Exposition mit einem

Röntgenfilm für 1 bis 2 Tage.

10 x TBE-Puffer0,89 M Tris0,83 M Borsäure25 mM EDTApH 8,3

2.7 Arbeiten mit Proteinen

2.7.1 Bestimmung von Proteinkonzentrationen

colorimetrisch nach BRADFORD (1976)

Die Bestimmung der Proteinkonzentrationen von Proteingemischen erfolgte

photometrischen nach der Methode von BRADFORD (1976). Dazu wurden 1-20 µl der

Probe mit A. dest. auf 200 µl gebracht, mit 2 ml Bradfordreagenz versetzt und 10 min im

Dunkeln inkubiert. Die Messung erfolgte bei einer OD595 und die Proteinkonzentration

wurde nach einer mit Rinderserumalbumin erstellten Eichgeraden ermittelt.


31

Bradfordreagenz10 % (v/v) Phosphorsäure5 % (v/v) Ethanol0,01 % (w/v) Coomassie Brillantblau G-250

spektroskopisch

Die Bestimmung der Proteinkonzentrationen von gereinigten Proteinen erfolgte bei einer

OD280. Die benötigten Werte (1A280= ) zur Berechnung der jeweiligen Konzentrationen

wurden dem Programm Protean aus dem DNAStar Programmpaket entnommen.

2.7.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Die Auftrennung von Proteinen erfolgte in einem diskontinuierlichen Gelsystem (Mini-

PROTEANII) nach LAEMMLI (1970) nach Angaben des Herstellers. Für die Auftrennung

der Proteine wurden 4 %ige Sammelgele und 10 - 15 %ige Trenngele, je nach

Versuchsziel, verwendet. Die Proben wurden mit 5 x SDS-Probenpuffer versetzt und für 5

bis 10 min gekocht. Die Elektrophorese erfolgte im Tris-Glycin Laufpuffer bei 200 V für

50 min. Anschließend wurden die Gele mit Coomassie Brillantblau (2.7.2.1) oder Silber

(2.7.2.2) gefärbt.

Sammelgel (4 %) Trenngel (13 %)0,5 ml Rotiphorese 29:1 (40 %) 3,25 ml Rotiphorese 29:1 (40 %)1,25 ml 4 x Sammelgelpuffer 2,5 ml 4 x Trenngelpuffer3,25 ml A. dest. 4,25 ml A. dest.

25 µl 20 % (w/v) SDS 40 µl 20 % (w/v) SDS25 µl 10 % (w/v) APS 40 µl 10 % (w/v) APS10 µl TEMED 20 µl TEMED

4 x Sammelgelpuffer 5 x SDS-Probenpuffer0,5 M Tris-HCl pH 6,8 100 mM Tris 50 % (w/v) Glyzerin

25 % (v/v) β-Mercaptoethanol4 x Trenngelpuffer 15 % (w/v) SDS1,5 M Tris-HCl pH 8,8 0,01 % (w/v) Bromphenolblau

pH 6,8Tris-Glycin Laufpuffer 25 mM Tris 190 mM Glycin0,1 % (w/v) SDS


32

2.7.2.1 Coomassie Brillantblau Färbung

Nach der Gelelektrophorese wurden die Gele für 5 – 15 min in der Coomassie-Färbelösung

gefärbt und mit der Entfärbelösung der Gelhintergrund bis zum gewünschten Grad

entfärbt.

Coomassie-Färbelösung Entfärbelösung45 % (v/v) Methanol 30 % (v/v) Methanol9 % (v/v) Eisessig 7,5 % (v/v) Eisessig0,25 % (w/v) Coomassie Brillantblau

2.7.2.2 Silberfärbung

Zur Silberfärbung von Proteingelen wurde die Methode nach BLUM et al. (1987) verändert

von NESTERENKO et al. (1994) angewendet. Dazu wurde das Trenngel 5 min im Fixierer

inkubiert, mit ddH20 gespült (3 x 5 sec; 1 x 5 min; 3 x 5 sec). Nach einer Vorbehandlung

mit 50 % Azeton für 5 min und 1 min in der Na2S2O3-Lösung wurde erneut mit ddH2O

gespült (3 x 5 sec). Die Färbung erfolgte für 8 min in der Färbelösung. Nach erfolgter

Spülung mit ddH2O (2 x 5 sec) wurde das Gel für 10 – 20 sec im Entwickler entwickelt

und die Reaktion durch Austausch der Lösung gegen 1 % Essigsäure gestoppt.

Fixierer Na2S2O3-Lösung60 ml 50 % (v/v) Azeton in ddH2O 100 µl 10 % (w/v) Na2S2O3 in ddH2O1,5 ml 50 % (w/v) TCA in ddH2O 60 ml ddH2O25 µl 37 % Formaldehyd

Färbelösung Entwickler0,16 g AgNO3 1,2 g NaCO3

0,6 ml 37 % Formaldehyd 25 µl 37 % Formaldehyd60 ml ddH2O 25 µl 10 % (w/v) Na2S2O3 in ddH2O

60 ml ddH2O

2.7.3 Aufreinigung von „His-Tag“-Proteinen

Die Proteine ModA und ModB, sowie deren modifizierte Varianten, wurden durchweg als

Einschlußkörper synthetisiert und lagen nur zu einem nicht mehr detektierbaren Anteil

löslich im Cytoplasma vor. Die Reinigung der Proteine erfolgte aus den Einschlußkörpern

(2.5.5) unter denaturierenden Bedingungen im Aufschlußpuffer mit 6 M GuHCl (2.5.5).

Renaturierte Proteine wurden unter nativen Bedingungen über eine immobilisierte

Metallchelat-Affinitätschromatographie gereinigt.


33

2.7.3.1 Immobilisierte Metallchelat-Affinitätschromatographie

Zur Reinigung der „His-Tag“ Proteine wurde die von PORATH et al. (1975; PORATH, 1992)

eingeführte immobilisierte Metallchelat-Affinitätschromatographie (IMAC) verwendet.

Hier wird die hohe Affinität von aufeinanderfolgenden Histidinen (6-10 Stück) zu

zweiwertigen Ionen ausgenutzt. Die gebundenen Proteine können anschließend mit

Imidazol oder bei pH 6,0 eluiert werden.

• Reinigung unter denaturierenden Bedingungen

Zum Einsatz kamen die Säulenmaterialien Ni-NTA (Nickel-Nitrilotriessigsäure, Qiagen),

Talon (Co2+ beladen, Clontech) und His•Bind Resin (Novagen). Die Handhabung der

Säulenmaterialien erfolgte nach Angaben des jeweiligen Herstellers mit 2 ml

Säulenmaterial in 5 ml Polypropylen-Säulen. Nach erfolgter Äquilibrierung der Säule mit

5 Säulenvolumen (SV) Aufschlußpuffer mit 6 M GuHCl erfolgte die Bindung der Proteine

an das Säulenmaterial nach dem „Batch-Verfahren“ bei Raumtemperatur (RT). Nachdem

die Säule mit 5 SV Aufschlußpuffer mit 8 M Harnstoff gewaschen war erfolgte die

Renaturierung der gebundenen Proteine auf der Säule. Dazu wurden 4 SV

Renaturierungspuffer mit 6 M Harnstoff, 4 SV Renaturierungspuffer mit 3 M Harnstoff bei

RT und 5 SV Renaturierungspuffer bei 4° C über die Säule gegeben. Die Elution der

Proteine erfolgte mittels eines Imidazol-Stufengradienten (50 – 300 mM) im

Aufschlußpuffer in 50 mM Schritten. Die gesammelten Fraktionen (0,5 bis 1 SV) wurden

mit Hilfe eines SDS-Polyacrylamidgels auf ihren Proteingehalt hin analysiert, die

entsprechenden Fraktionen vereinigt und gegen Dialyse-Puffer 1 oder Dialyse-Puffer 2

dialysiert.

Aufschlußpuffer Renaturierungspuffer50 mM NaH2PO4 20 mM Tris300 mM NaCl 500 mM NaCl10 mM Imidazol 20 % (v/v) GlyzerinpH 8,0 2 mM red. Glutathion

0,2 mM oxi. Glutathion0,5 mM PMSFpH 7,4


34

Dialyse-Puffer 1 Dialyse-Puffer 210 mM Tris-HCl 50 mM Tris-Acetat1 mM EDTA 500 mM NH4Cl50 % (v/v) Glyzerin 1 mM EDTApH 8,0 10 mM β-Mercaptoethanol

40 % (v/v) Glyzerin

• Reinigung unter nativen Bedingungen

Für die Reinigung unter nativen Bedingungen wurde die Ni-NTA Matrix (Qiagen) nach

Angaben des Herstellers verwendet. Als zu reinigendes Proteingemisch wurden unter

pH 12,0 denaturierte und anschließend über Dialyse renaturierte Einschlußkörper (2.7.4.2)

verwendet. Die gesamte Reinigung erfolgte bei 4° C. 2 ml Säulenmaterial wurden mit

Lysis-Nativ-Puffer äquilibriert, das Proteingemisch über die Säule gegeben und diese mit

6 SV Lysis-Nativ-Puffer gespült. Die Elution der gebundenen Proteine erfolgte mit je 5 SV

Qia-Elute-Puffer mit 50 mM, 80 mM, 100 mM und 250 mM Imidazol. Es wurden

Fraktionen von 2 ml gesammelt und auf einem SDS-Polyacrylamidgel auf ihren

Proteingehalt analysiert. Geeignete Fraktionen wurden vereinigt und gegen Dialyse-

Puffer 2 über Nacht dialysiert. Anschließend wurden die Proteine bei –20° C gelagert.

10 x Lysis-Nativ-Puffer 10 x Qia-Elute-Puffer500 mM NaH2PO4 500 mM NaH2PO4

3 M NaCl 3 M NaCl100 mM Imidazol pH 8,0pH 8,0

2.7.4 Renaturierung von Proteinen

Da die Bindung der Proteine unter denaturierenden Bedingungen an den oben erwähnten

Säulenmaterialien (2.7.3.1) nicht sehr effektiv war wurden alternative

Renaturierungsmethoden angewendet.

2.7.4.1 Renaturierung durch Verdünnung

Bei dieser Methode wurden die im Aufschlußpuffer mit 6 M GuHCl (2.5.5) gelösten

Einschlußkörper langsam in 100 ml Renaturierungspuffer 2 bei RT unter ständigem

Rühren getropft. Anschließend wurden die Proteine durch Zentrifugationsfiltration

(Ultrafree-15 Centrifugal Filter Device Biomax-10K, Millipore, Eschborn)

aufkonzentriert.


35

Renaturierungspuffer 250 mM Tris-HCl pH 8,0100 mM Glycin0,5 % (v/v) Triton X-1000,01 % (v/v) Tween 2020 % (v/v) Glyzerin100 mM Mg-Acetat100 mM KCl0,5 mM PMSF15 mM β-Mercaptoethanol

2.7.4.2 Renaturierung durch Dialyse

• Die im Aufschlußpuffer mit 6 M GuHCl (2.5.5) aufgelösten Einschlußkörper wurden

auf eine Proteinkonzentration von 1 mg/ml gebracht. Die Dialyse erfolgte in

Dialyseschläuchen mit einer Ausschlußgröße von 12 - 16 kDa (Dialysemembran

Type20, Biomol, Hamburg) gegen 1 Liter Dialyse-Renaturierungs-Puffer mit

stufenweiser Verringerung der Harnstoffkonzentration (6 M → 4 M → 2 M → 0 M).

Dialyse-Renaturierungs-Puffer100 mM NaH2PO4

10 mM Tris50 mM Glycin100 mM KCl2 mM MgCl2

0,005 % (v/v) Tween 200,5 mM PMSFpH 8,0

• Die im „Inclusionbody“-Denaturierungspuffer (2.5.5) aufgenommenen

Einschlußkörper wurden auf eine Proteinkonzentration von 1 mg/ml bzw. 3 mg/ml für

die Trx-Fusionsproteine gebracht. Die Dialyse erfolgte in Dialyseschläuchen mit einer

Ausschlußgröße von 12 - 16 kDa (Dialysemembran Type20, Biomol, Hamburg) gegen

1 Liter Lysis-Puffer über Nacht bei 4° C.

Lysis-Puffer50 mM NaH2PO4

300 mM NaCl2 M HarnstoffpH 8,0


36

2.7.5 Transfer von Proteinen auf Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membranen(Western Blot)

Die in einem SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennten Proteine wurden in einer Mini-Trans-

Blot-Kammer (BioRad) auf eine PVDF-Membran übertragen. Dazu wurde die PVDF-

Membran 5 sec in Methanol getaucht, 2 min mit A. dest. abgespült und 2 – 3 min im

Towbin-Puffer äquilibriert. Der Blot wurde wie in Abb. 2.5 zusammengesetzt und in der

Blot-Kammer fixiert. Nach Zugabe des eiskalten Towbin-Puffers erfolgte die Übertragung

der Proteine auf die Membran für 15 min bei 150 mA und 30 min bei 300 mA. Nach

erfolgtem Transfer konnten die rekombinanten „His-Tag“ Proteine mit einem Ni-NTA-

Konjugat nachgewiesen werden (2.7.6).

Towbin-Puffer (TOWBIN et al., 1979)25 mM Tris192 mM Glycin20 % (v/v) Methanol

Abb. 2.5 Schematische Anordnung der Western-Blot Apparatur.


37

2.7.6 Nachweis von rekombinanten „His-Tag“ Proteinen

Zum Nachweis der rekombinanten „His-Tag“ Proteine wurde das „Ni-NTA HRP

Konjugat“ der Firma Qiagen verwendet. Das Ni-NTA mit der gekoppelten Meerrettich-

Peroxidase (Horseradish Peroxidase, HRP) erlaubt die Detektion der rekombinanten

Proteine anhand von Chemilumineszenz, die zur Schwärzung eines Röntgenfilmes

eingesetzt wird.

Nach erfolgtem Transfer der Proteine auf die PVDF-Membran (2.7.5) wurde diese der

Reihe nach 2 mal 10 min in TBS-Puffer, eine Stunde im Blocking-Puffer, 3 mal 10 min in

TBS-Tween-Puffer, eine Stunde in TBS-Tween-Puffer mit Ni-NTA-Konjugat-Stocklösung

(1:1000 verdünnt) und 3 mal 10 min in TBS-Tween-Puffer inkubiert.

Danach wurde die Membran mit 1 ml ECL (Amersham, Braunschweig) überschichtet und

in durchsichtige Folie eingeschlagen. Die Detektion der „His-Tag“ Proteine erfolgte mit

einem Röntgenfilm, der für 5 – 20 sec auf der Folie exponiert wurde.

Nach erfolgter Detektion konnten die Proteine auf der PVDF-Membran mittels der

Coomassie Brillantblau Färbung sichtbar gemacht werden (2.7.2.1).

TBS-Puffer TBS-Tween-Puffer10 mM Tris-HCl pH 7,5 20 mM Tris-HCl pH 7,5150 mM NaCl 500 mM NaCl

0,05 % (v/v) Tween 20

Blocking-Puffer3 % (w/v) RSAin TBS-Puffer

2.8 ADP-Ribosyltransferase Aktivitätstest

2.8.1 Aktivitätstest mit 32P-NAD+

Die ADP-Ribosyltransferase Aktivität der gpModA und gpModB sowie deren modifizierte

Varianten wurde in einem leicht veränderten ADP-Ribosyltransferasetest nach ROHRER et

al. (1975) ermittelt. Die Versuchsansätze setzten sich im Allgemeinen wie in Tabelle 2.3

beschrieben zusammen. Alle Reaktionen fanden in einem Volumen von 100 µl für 30 min

bei 15° C statt. Nach erfolgter Inkubation wurden die Proteine mit 40 µl 50 %iger (w/v)

Trichloressigsäure gefällt und die Proteine durch ein Zentrifugation (13.000 Upm, 10 min,

RT) sedimentiert. Das Sediment wurde anschließend mit 70 % (v/v) Azeton gewaschen


38

(Zentrifugation für 5 min bei RT), getrocknet, in 80 µl SDS-Probenpuffer aufgenommen

und 15 min gekocht. Ein Aliquot von 15 – 20 µl wurde auf einem SDS-Polyacrylamidgel

aufgetrennt (2.7.2), das Gel mit Coomassie Brillantblau gefärbt (2.7.2.1) und getrocknet.

Das getrocknete Gel wurde dann mit einem Röntgenfilm und Verstärkerfolien bei –80° C

für 2 Tage bis 4 Wochen exponiert.

Tabelle 2.3 Allgemeine Zusammensetzung des ADP-Ribosyltransferase Aktivitätstests.lösliche Proteine aus BLR (DE3) (100 µg)

10 x Transferasepuffer32P-NAD+ (1 µCi )

E. coli RNA-Polymerase (20 µg optional)

ADP-Ribosyltransferase (5 – 10 µg gereinigtes Enzym oder 100 µg

lösliches Protein einer Überexpression)

10 x Transferasepuffer500 mM Tris-Acetat pH 7,5100 mM Magnesium-Acetat220 mM NH4Cl10 mM EDTA10 mM β-Mercaptoethanol

2.8.2 Bestimmung der ADP-Ribosyltransferase Aktivität mit p-Nitrobenzylidin- aminoguanidin (NBAG)

Zur Bestimmung der KM und Vmax Werte von gpModA wurde die photometrische Methode

von SOMAN et al. (1983) angewendet. Dabei wurde die ADP-Ribosylierung von NBAG

(2.8.2.1) durch die kontinuierliche Absorptionszunahme bei 370 nm über einen Zeitraum

von einer Stunde bei RT gemessen. Eine Änderung der Absorption um 0,1 Einheiten

entspricht dabei einer Menge von 5 x 10-2 µmol Produkt in 1 ml Reaktionsansatz. Die

allgemeine Zusammensetzung der Reaktionsgemische ist Tabelle 2.4 zu entnehmen.

Tabelle 2.4: Allgemeine Zusammensetzung des NBAG-Tests.0,4 M Tris-Acetat pH 7,4 50 µl160 mM DTE 200 µlADP-Ribosyltransferase 30 – 100 µgA. dest. ad 400 µl für 10 – 30 min

vorinkubieren25 mM NAD+ 0 – 400 µl20 mM NBAG in 36 mM DTE 0 – 20 µlA. dest. ad 1000 µl


39

2.8.2.1 Herstellung von p-Nitrobenzylidin-aminoguanidin (NBAG)

Das p-Nitrobenzylidin-aminoguanidin wurde in Anlehnung an das Protokoll von BAIOCCHI

et al. (1963) für die Synthese von Guanylhydrazone hergestellt.

Eine 0,11 M Lösung von Aminoguanidin Bicarbonat (in 125 ml A. dest.) wurde mit HCl

angesäuert (pH 5 – 6) und auf 60° C erwärmt. Eine gleiche molare Menge

p-Nitrobenzaldehyd (in 100 ml Ethanol) wurde unter Rühren zugegeben und 16 Stunden

bei RT weiter gerührt. Die Feststoffe wurden in einem Rotationsverdampfer gesammelt

und in Ethanol bei 60° C bis zur Sättigungsgrenze gelöst. Die bei der Abkühlung

entstandenen Kristalle stellten das gewünschte NBAG dar (Rekristallisation). Abb. 2.6 gibt

die Strukturformeln der eingesetzten Chemikalien wieder, sowie deren Farbgebungen in

Lösung.

N

O

O

O

p-Nitrobenzaldehyd (in Lösung gelb)

OH

O

OH NH

NH

NH2

NH2

Aminoguanidin Bicarbonat (in Lösung klar)

NH

NH

NH2

NN

O

O

p-Nitrobenzylidin-aminoguanidin (NBAG) (in Lösung rötlich)

Abb. 2.6 Strukturformeln von p-Nitrobenzaldehyd, Aminoguanidin Bicarbonat und demsynthetisiertem p-Nitrobenzylidin-aminoguanidin, sowie deren Farbgebung in Lösung.

2.9 Transkriptionsversuche

Für die Transkriptionsversuche wurde die von U. Aschke-Sonnenborn nach der Methode

von BURGESS & JENDRISAK (1975) isolierte E. coli RNA-Polymerase eingesetzt.

Um Veränderungen im Transkriptionsverhalten der unveränderten und durch ModA

modifizierten E. coli RNA-Polymerase festzustellen wurden Transkriptionsversuche

unternommen. Für die Versuche wurden pKWIII Plasmide mit dem artifiziellen Promotor

ptac und den frühen T4-Promotoren p8.182 und p13.149 verwendet. Außerdem wurde die


40

Transkription von genomischer T4-Wildtyp DNA (isoliert von U. Aschke-Sonnenborn)

und genomischer E. coli DNA (isoliert mit NucleoSpin C+T) untersucht.

2.9.1 Transkription von pKWIII Plasmiden

Die in vitro Transkription von den pKWIII Plasmiden erfolgte in Form einer

zeitabhängigen Kinetik. Dazu wurden 7,2 pmol Gesamtvektor bzw. 0,36 pmol der über

PvuII herausgeschnittenen Promotoren verwendet. Die Transkription erfolgte über 60 min

bei RT in einem 500 µl Ansatz (Tabelle 2.5) wobei nach 0, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 und 60

min je ein Aliquot von 50 µl des Ansatzes mit 150 µl 20 mM EDTA gestoppt wurde. Um

den Einfluß von ModA auf die Transkription zu untersuchen wurde 10 min nach dem

Reaktionsstart ModA zum Ansatz zugegeben. Die einzelnen Aliquots wurden anschließend

auf DE81 Filter (Whatman) gesaugt und diese 3 mal in 0,5 M NaH2PO4, pH 7,0 gewaschen

(pro Filter 5 ml). Zur Bestimmung der eingebauten Radioaktivität wurden die getrockneten

Filter in 5 ml Szintilationsflüssigkeit gegeben und die Radioaktivität auf den Filtern in

einem Szintilationszähler bestimmt.

Tabelle 2.5: Allgemeiner Reaktionsansatz für die in vitro Transkription von pKWIII Plasmiden.pKWIII Plasmid bzw.

Promotorfragment

7,2 pmol

0,36 pmol

10 x RNA-Polymerase-Puffer 50 µl

RNase-Inhibitor (50 U/µl) 50 U

ADP-Ribosyltransferase ModA 10 – 500 ng

NAD+ (25 mM) 5 µl

E. coli RNA-Polymerase 0,36 pmol (173 ng)

A. dest. ad 420 µl

3 NTP-Mix (ATP, CTP, GTP) (je 5 mM) 40 µl

UTP (1 mM) 37,5 µl

α32P-UTP (10 µCi/µl) 2,5 µl

10x RNA-Polymerase-Puffer Szintilationsflüssigkeit400 mM Tris-HCl pH 8,0 5 g 2,5-Diphenyloxazol (PPO)100 mM MgCl2 0,22 g 1,4-Bis(5 phenyl-2 oxazoyl) benzen500 mM KCl (POPOP)5 mM DTT ad 1 Liter Toluol0,5 mg/ml RSA


41

2.9.2 Transkription von genomischer DNA

Die Transkriptionsversuche von genomischer DNA erfolgten mit isolierter E. coli RNA-

Polymerase und mit löslichen Gesamtzellextrakten. Für die löslichen Gesamtzellextrakte

wurden E. coli Zellen unter induzierten Bedingungen mit den Plasmiden pET16b(+)

(Kontrolle), p16modA7 (gpModA) und pTKRI (gpAlt) bis zu einer OD590 von 0,65 bei

37° C auf einem Schüttler angezogen. Durch die Anzucht der Bakterien unter induzierten

Bedingungen sollte die E. coli RNA-Polymerase durch die Genprodukte ModA bzw. Alt

ADP-ribosyliert vorliegen. Die Reaktionen erfolgten in 50 µl Ansätzen, deren allgemeine

Zusammensetzung der Tabelle 2.6 zu entnehmen ist. Die Transkription erfolgte für 30 min

bei 37° C und wurde anschließend mit 150 µl 20 mM EDTA gestoppt. Die Ansätze wurden

auf DE81 Filter (Whatman) gesaugt und wie unter 2.9.1 beschrieben weiter behandelt.

Tabelle 2.6: Allgemeiner Reaktionsansatz für die Transkription von genomischer DNA.T4-Wildtyp DNA bzw. E. coli DNA 2 µg

10 x RNA-Polymerase-Puffer (2.9.1) 5 µl

RNase-Inhibitor (50 U/µl) 10 U

NAD+ (25 mM) 0,5 µl

RNA-Polymerase bzw.

löslicher Proteinrohextrakt

60 - 173 ng

30 – 110 µg

A. dest. ad 42 µl

3 NTP-Mix (ATP, CTP, GTP) (je 5 mM) 4 µl

UTP (1 mM) 3,75 µl

α32P-UTP (10 µCi/µl) 0,25 µl

Ergebnisse

42

3 ErgebnisseNach den „Threading-Experimenten“ sollten die beiden unbekannten Leserahmen für

ADP-Ribosyltransferasen kodieren. Es soll an dieser Stelle vorweggenommen werden, daß

sich im Laufe der Arbeit gezeigt hat, daß beide Polypeptide ADP-Ribosyltransferasen sind.

Dabei kodiert der zweite Leserahmen für die bereits bekannte ADP-Ribosyltransferase

Mod, die nun als ModA bezeichnet wird. In Anlehnung daran wurde das zweite Protein als

ModB bezeichnet (Abb. 3.1).

m o d B m o d A

P 1 3 .1 49 P 11 .8 1 5

N d e IH in dIII E c o R I

1 3 .1 3 3 k b 1 2 .5 1 3 k b 11 .9 1 3 k b

(20 7 a a , 2 4 .2 k D a) (20 0 a a , 2 3 .3 k D a)

ATGA

Abb. 3.1 Anordnung der Leserahmen von modB und modA zwischen den PromotorenP13.149 und P11.815. Die Angaben in kb entsprechen den Positionen auf dergenomischen Karte des T4.

3.1 Computergestützte Auswertung der Proteinsequenzen von ModA und ModB

Die folgenden Angaben über die rekombinanten Proteine ModA, His-ModA, ModB und

His-ModB wurden mit dem Programm Protean aus dem DNAStar Paket ermittelt.

His-ModA Analyse

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220

Alpha, Regionen - Chou-FasmanA

Beta, Regionen - Chou-FasmanB

Turn, Regionen - Chou-FasmanT

Alpha, Regionen - Garnier-RobsonA

Beta, Regionen - Garnier-RobsonB

Turn, Regionen - Garnier-RobsonT

Coil, Regionen - Garnier-RobsonC

Hydrophobizitäts Plot - Hopp-Woods0

3

-3.4

hydrophobe Regionen - Hopp-WoodsG

Hydrophilizitäts Plot - Hopp-Woods0

3

-3.4

hydrophile Regionen - Hopp-WoodsW

Hydrophobizitäts Plot - Kyte-Doolittle0

4.5

-4.5

hydrophobe Regionen - Kyte-DoolittleG

Hydrophilizitäts Plot - Kyte-Doolittle0

4.5

-4.5

hydrophile Regionen - Kyte-DoolittleW

Faktor Xa (Protease)

Hydrophilizitäts Plot - Hopp-Woods0

3

-3.4

hydrophile Regionen - Hopp-WoodsW

Hydrophobizitäts Plot - Kyte-Doolittle0

4.5

-4.5

hydrophobe Regionen - Kyte-DoolittleG

Hydrophilizitäts Plot - Kyte-Doolittle0

4.5

-4.5

hydrophile Regionen - Kyte-DoolittleW

His-ModB Analyse

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220

Alpha, Regionen - Chou-FasmanA

Beta, Regionen - Chou-FasmanB

Turn, Regionen - Chou-FasmanT

Alpha, Regionen - Garnier-RobsonA

Beta, Regionen - Garnier-RobsonB

Turn, Regionen - Garnier-RobsonT

Coil, Regionen - Garnier-RobsonC

Hydrophobizitäts Plot - Hopp-Woods0

3

-3.4

hydrophobe Regionen - Hopp-WoodsG

Faktor Xa (Protease)

A B

Abb. 3.2 Vorhersagen über die Sekundärstrukturen und die Verteilung hydrophober undhydrophiler Bereiche innerhalb der Proteine His-ModA (A) und His-ModB (B).Dargestellt sind die Verteilungen dieser Regionen über die Aminosäurekette nach denAlgorithmen von CHOU & FASMAN (1978), GARNIER & ROBSON (1978), HOPP &WOODS (1981) sowie KYTE & DOOLITTLE (1982).

Ergebnisse

43

Außerdem weisen beide Proteine noch eine potentielle Glykosylierungsstelle auf. Bei

ModA liegt diese bei Aminosäure Leu34 und bei ModB bei Aminosäure Tyr131.

Tabelle 3.1: Einige wichtige Eckdaten der Proteine ModA, His-ModA, Trx-ModA, ModB undHis-ModB.

ModA His-ModA Trx-ModA ModB His-ModBMolekulargewicht: 23.349,50 Da 25.947,10 Da 41.434,10 Da 24.244,5 Da 26.766,10 DaLänge in Aminosäuren: 200 222 366 207 2281 A280 = 0,95 mg/ml 1,12 mg/ml 1,07 mg/ml 0,94 mg/ml 1,04 mg/mlisoelektrischer Punkt: 6,04 6,53 5,95 5,31 6,41Ladung bei pH 7,0: - 2,49 - 3,49 -11,04 - 7,16 - 5,16

Die Übereinstimmung in der Aminosäuresequenz von ModA und ModB beträgt 25 %

identische bzw. 47 % homologe Aminosäuren (Abb. 3.3).

Abb. 3.3 Alignment der Aminosäuresequenzen von ModA und ModB. Es werden 25 %identische und 47 % homologe Aminosäuren gefunden. (nach CuraBLASTP über denCuratools Server (ALTSCHUL et al., 1990))

3.2 Klonierung der beiden offenen Leserahmen zwischen den T4 Promotorenp11.815 und p13.149

3.2.1 Klonierungsversuche in die Vektoren pBluescript II KS/SK

Zur Klonierung der beiden offenen Leserahmen wurden die Gene einzeln über eine PCR

aus dem T4 Genom amplifiziert (2.6.3). Die benutzten Primer enthielten zur gerichteten

Klonierung in die Vektoren entsprechende Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen.

Die Klonierung der Gene sollte zum Einen in Richtung des lacZ-Gens und zum Anderen

entgegen der Leserichtung von lacZ erfolgen. Keiner dieser Klonierungsversuche war

erfolgreich, was zu der Überzeugung führte, daß beide Genprodukte eine toxische Wirkung

auf E. coli haben müssen, zumal es kein Problem darstellte Teilsequenzen bis 2/3 der Gene

Ergebnisse

44

in diese Vektoren zu klonieren. Da die pBluescript Vektoren von der E. coli RNA-

Polymerase gut abgelesen werden können (Blau/Weiß-Selektion) zeigen sie eine hohe

Transkriptionsrate der lacZ Region. Versucht man hier ein Gen zu klonieren, dessen

Genprodukt toxisch ist, wird dieses sofort transkribiert und translatiert, so daß es zu keiner

Vermehrung der Bakterien kommt.

Aus diesem Grund sollten die nächsten Klonierungsversuche mit Expressionsvektoren

durchgeführt werden, deren klonierte Gene unter der Kontrolle eines T7 Promotors stehen,

der nicht von der E. coli RNA-Polymerase erkannt wird. Eine weitere Option war es, ein

Fusionsprotein zu generieren. Es bestand die Möglichkeit, daß durch die Fusion mit einem

anderen Protein die Toxizität der beiden Zielproteine stark eingeschränkt sein könnte.

3.2.2 Klonierungsversuche in die Vektoren pT7-5 und pT7-6

Die Amplifikation der beiden Gene erfolgte wieder unabhängig voneinander mittels PCR.

Für die gerichtete Klonierung waren ebenfalls Restriktionsschnittstellen durch die Primer

eingefügt worden. Da vor dem zu exprimierenden Gen der T7 Promotor Φ10 liegt, und

dieser nicht von der E. coli RNA-Polymerase erkannt wird, bestand Hoffnung, die Gene

kloniert zu bekommen. Letzten Endes erwiesen sich die Vektoren pT7-5 bzw. pT7-6 aber

auch nicht als geeignet für die Klonierung der beiden Gene. Die „Low-Level“ Expression

in diesen Vektoren ist anscheinend zu hoch.

Bei TOMASCHEWSKI (1988) führte die Einführung einer Struktur zur

Transkriptionstermination (poly(dA)•poly(dT)) in den Vektor pT7-6 zum Erfolg der

Klonierung von Gen 49 (Endonuklease VII) aus dem Bakteriophagen T4. SHIGESADA &

IMAI (1982) haben gezeigt, daß eine poly(dA)•poly(dT) Abfolge mit poly(dA) in 5'→3'

Richtung in Gegenwart von ρ (Roh) die Transkription um 64 % hemmt. Deshalb sollte

ebenfalls versucht werden durch die Einführung einer solchen Struktur zur

Transkriptionstermination die Klonierung der Gene zu ermöglichen. Dazu wurde in der

PvuII Schnittstelle der Vektoren pT7-5 und pT7-6, die direkt vor dem Φ10 Promotor liegt,

eine poly(dA)•poly(dT) Sequenz eingefügt. Dafür wurde poly(dA)•poly(dT) DNA

(Sigma) mit Ultraschall behandelt und Fragmente von 100 bis 300 bp aus einem

Agarosegel isoliert (2.6.6), die Fragmente mit S1-Nuklease behandelt und in die mit PvuII

geschnittenen und dephosphorylierten Vektoren ligiert. Nach einer Restriktionsanalyse auf

inserierte poly(dA)•poly(dT) DNA wurde durch Sequenzierung die Orientierung dieser

DNA ermittelt. Die Sequenzierung einzelner Klone ergab, einen Einbau von 80 bis 130 bp

Ergebnisse

45

poly(dA)•poly(dT). Die Klone mit der passenden poly(dA) Orientierung wurden für die

weiteren Klonierungsexperimente verwendet (Klone mit Richtiger Orientierung von

poly(dA): pT7-5AT7, 9, 10, 11, 16, pT7-6AT11).

Die Klonierung der beiden Gene in die neu generierten pT7-xAT Vektoren gelang

allerdings nicht, was dafür spricht, daß die Transkriptionstermination durch

poly(dA)•poly(dT) nicht effektiv genug ist und eine „Low-Level“ Transkription der beiden

Gene immer noch letal für E. coli ist.

3.2.3 Klonierungsversuche in den Vektor pGEX-3X

Eine andere Idee die Toxizität der Genprodukte zu unterbinden war es ein Fusionsprotein

zu generieren. Es bestand Hoffnung, daß durch die Fusion mit der Glutathion

S-Transferase (GST, 27 kDa) die beiden Mod Proteine (24 kDa bzw. 23 kDa) ihre

Toxizität nicht mehr entfalten können. Dazu wurde der Expressionsvektor pGEX-3X

verwendet, dessen Expression von dem tac-Promotor kontrolliert wird. Die Gene sollten

über die SmaI Schnittstelle des Vektors in den Leserahmen für die GST kloniert werden.

Die Klonierung der beiden Gene in diesen Vektor war ebenfalls nicht möglich.

Anscheinend ist das GST-Fusionsprotein auch toxisch und die „Low-Level“ Expression

unter nicht induzierten Bedingungen von dem induzierbaren tac-Promotor immer noch zu

hoch, was eine Beeinträchtigung des Wachstums von E. coli bewirken könnte.

3.2.4 Klonierungsversuche in die pET-Vektoren

Die Expression von pET-Vektoren unterliegt einer sehr stringenten Kontrolle (2.5.3.3). Die

Zielgene stehen wie bei den pT7-x Vektoren unter der Kontrolle eines starken

Bakteriophagen T7 Promotors. Direkt hinter dem T7 Promotor befindet sich allerdings als

zusätzlicher Transkriptionsschutz der lac Operator, so daß in diesen Vektoren unter nicht

induzierten Bedingungen die Transkription vollständig unterdrückt sein sollte.

Vektor pET-11d

Die Gene sollten zuerst in den Vektor pET-11d kloniert werden, da hier die Proteine in

ihrer ursprünglichen Form ohne größere Modifikation (z.B. Fusion mit anderen

Aminosäuren) exprimiert werden können. Die Gene modA und modB wurden mittels PCR

amplifiziert (Primer: modAAnf – modAEndBam bzw. modBAnf – modBEndBam (2.4.2)).

Die verwendeten Primer enthielten die Erkennungssequenz für die Restriktionsenzyme

NcoI und BamHI, um die PCR-Produkte gerichtet in den Vektor pET-11d zu klonieren.

Ergebnisse

46

Nach erfolgter Transformation in XL1-Blue wurden von einigen Transformanden die

Plasmide isoliert und einer Restriktionsanalyse unterzogen. Zur Identifizierung von

einklonierten modA wurde mit EcoRI und zur Identifizierung von modB mit HindIII die

DNA hydrolysiert.

erwartete Fragmente nach EcoRI-Hydrolyse erwartete Fragmente nach HindIII-HydrolysepET-11d p11modAB pET-11d p11modBB5674 bp 5676 bp 5674 bp 5729 bp

578 bp 578 bp

Wie sich zeigte, ist die Transkriptionskontrolle der pET-Vektoren stringent genug, um die

Gene modA bzw. modB zu klonieren. Es wurden die Plasmide p11modAB3 (pET11d,

modA über NcoI und BamHI 3. Klon) und p11modBB5 (pET11d, modB über NcoI und

BamHI 5. Klon) erhalten (Abb. 3.4).

p11modAB

6254 bps

EcoRVRsa I

HindIIIBsp106ICla IEcoRI

HincIIScaIRsa I

Pvu IPst I

Rsa IAcc I

Pvu II

IEag

IIPvuIIPvu

cIIHinRVEcoHIIBss

IApaIRsa

IIBglIXbaINcoINsi

IIPvuINdeRIEco

IIPvuHIBam

Amp

pBR322

lacI

T7 Promotor

modA

p11modBB

6307 bps

EcoRVRsa I

HindIIIBsp106ICla IEcoRI

HincIIScaIRsa I

Pvu IPstI

Rsa IAcc I

Pvu IIIEag

IIPvuIIPvu

cIIHinRVEcoHIIBss

IApaIRsa

IIBglIXbaINco

ISpedIIIHin

IRsaIRsa

HIBam

Amp

pBR322

lacI

T7 Promotor

modB

Abb. 3.4 Vektorkarten von p11modAB und p11modBB.

Vektor pET-16b(+)

Um die rekombinanten Proteine ModA und ModB schnell und einfach zu isolieren,

wurden die entsprechenden Gene in den Vektor pET-16b(+) kloniert. Dieser Vektor erlaubt

die Fusion rekombinanter Proteine mit einem N-terminalen „His-Tag“ aus 10 Histidinen.

Das Gen modA wurde wegen einer internen NdeI Schnittstelle über BamHI (Primer:

modABam - modAEndBam (2.4.2)) und das Gen modB über NdeI und BamHI (Primer:

modBNde - modBEndBam (2.4.2)) so in den Vektor pET-16b(+) kloniert, daß ein N-

terminales Fusionsprotein mit „His-Tag“ entstand. Nach erfolgter Restriktionsanalyse (wie

bei pET-11d) erhielt man die Klone p16modA7 und p16modB1 (Abb. 3.5).

Ergebnisse

47

Bei der Klonierung von modA hätte das Gen in zwei möglichen Orientierungen in den

Vektor eingebaut werden können (Klonierung nur über eine Schnittstelle). Bei den

Restriktionsanalysen von ca. 20 Klonen fand sich aber kein Klon mit einer inversen

Orientierung des Gens, was evtl. dafür spricht, daß das Gen in inverser Orientierung

abgelesen werden konnte und die Toxizität von gpModA zu tragen kam.

p16modB

6370 bps

Ssp IHincII

Sca IRsa I

Pvu IPst I

Rsa IAcc I

Pvu II

IEagIIPvu

IIPvucIIHin

RVEcoHIIBss

IRsa

IIBglIXbaINcoINde

ISpeISsp

dIIIHinIRsaIRsa

HIBamRVEco

IRsadIIIHin

RIEco

Amp

pBR322

lacI

T7 Promotor

His-modB

p16modA

6320 bps

Ssp IHincII

Sca IRsa I

Pvu IPst I

Rsa IAcc I

Pvu II

IEagIIPvu

IIPvucIIHin

RVEcoHIIBss

IRsa

IIBglIXbaINcoINdeIXho

HIBamINsi

IIPvuINdeRIEco

IIPvuHIBam

RVEcoIRsadIIIHin

RIEco

Amp

pBR322

lacI

T7 Promotor

His-modA

Abb. 3.5 Vektorkarten von p16modA und p16modB.

Vektor pET-22b(+)

Um das toxische gpModB aus dem Cytoplasma zu entfernen, wurde modB in den Vektor

pET-22b(+) über NcoI und BamHI kloniert (Primer: modBAnf – modBEndBam (2.4.2)) es

entstand der Vektor p22modBB2 (Abb. 3.6). Dieser Vektor besitzt die „pelB Leader-

Sequenz“ für den Proteinexport in den periplasmatischen Raum.

Auf eine Klonierung von modA in diesen Vektor wurde verzichtet (3.8.3).

Ergebnisse

48

p22modBB

6158 bps

Rsa IPvu I

Pst I

Rsa IAcc I

Pvu IIIIPvuIIPvu

cIIHinRVEcoHIIBss

IApaIRsa

IIBglIXbaINdeINco

ISpedIIIHin

IRsaIRsa

INcoRVEco

HIBamRIEco

ISacIAcc

cIIHinISal

dIIIHinINotIEagIXho

Amp

pBR322lacI

T7-PromotorpelB leader

modB

Abb. 3.6 Vektorkarte von p22modBB.

Vektor pET-32a(+)

Die rekombinanten Mod-Proteine werden ausschließlich als Einschlußkörper exprimiert.

Um dem entgegenzuwirken sollten N-terminale Thioredoxin (Trx)-Fusionsproteine

generiert werden. Dazu wurde das Gen modA nach einer PCR (Primer: modANcoIAnf –

modAXhoIEnd (2.4.2)) über NcoI und XhoI in den Vektor pET-32b(+) kloniert. Die

Restriktionsanalyse erfolgte mit PvuII.

erwartete Fragmente nach PvuII-HydrolysepET-32a(+) p32modA

4807 bp2939 bp2132 bp

999 bp 999 bp282 bp

93 bp 93 bp

Als exemplarisches Beispiel einer dreifachen Restriktionskontrolle auf das korrekt

klonierte Gen dient Abb. 3.7. Für die Analyse wurden die Restriktionsschnittstellen so

ausgewählt, daß sie zum Einen in dem zu klonierenden Gen und zum Anderen auf dem

Vektor lagen (hier NdeI bzw. PvuII, siehe auch Abb. 3.8). Des weiteren wurde das Insert

über die Klonierungsstellen wieder herausgeschnitten (hier NcoI und XhoI).

Ergebnisse

49

Abb. 3.7 Restriktionsanalyse des Klones p32modA2 auf einem 0,8 %igen Agarosegel.Erwartete Fragmentgrößen nach Restriktion mit NdeI: 5673 bp, 427 bp, 345 bp;PvuII: 2939 bp, 2132 bp, 999 bp, 282 bp, 93 bp (aufgrund der geringen Größe nichtzu sehen); NcoI+XhoI: 5846 bp, 599 bp. Als Größenstandard dienten eine 100 bpLeiter Plus (links) und λ/EcoRI+HindIII (rechts).

Nach erfolgter Expression erhielt man ein Fusionsprotein mit folgendem Aufbau: Trx-

6His-ModA-6His also ein Trx-Fusionsprotein mit einem internen und einem C-terminalen

„His-Tag“. Abb. 3.8 gibt die Karte des so generierten Vektors p32modA wieder.

Wahrscheinlich auf Grund der hohen Expressionsrate wurde das Trx-Fusionsprotein aber

immer noch als Einschlußkörper exprimiert (3.8.5).

Ergebnisse

50

p32modA6445 bps

Xmn ISca I

Pvu IPst I

Acc IPvu II

Xmn IIIPvu

IIPvucIIHin

HIIBss

IApa

IClaIXbaINde

IClaIXmnINdeIIBglIKpnINcoINsi

IIPvuINdeRIEco

IIPvuIXho

amp

pBR322lacI

T7 Promotor

Trx-ModA

Abb. 3.8 Vektorkarte von p32modA.

3.2.5 Klonierungsversuche in den Vektor pBAD/HisB

Um die Bildung von Einschlußkörpern zu vermeiden, wurde versucht von der starken

Expression, von dem T7 Promotor aus, wegzukommen. Hierfür bot sich der Vektor

pBAD/HisB an. Die Expression klonierter Gene aus dem Vektor pBAD/HisB steht unter

der Kontrolle des regulierbaren, Dosis abhängigen Promotors PBAD. Je nach verabreichter

Menge L-Arabinose kann hier die Genexpression von schwach bis stark reguliert werden.

Außerdem konnte mit diesem Vektor auch eine Fusion mit einem N-terminalen „His-Tag“

erreicht werden.

Das Gen modA wurde mit dem Primerpaar modAAnfXhoI – modAEndHindIII (2.4.2)

amplifiziert und über die Schnittstellen XhoI und HindIII in den Vektor pBAD/HisB

kloniert. Die Restriktionsanalyse erfolgte mit RsaI.

erwartete Fragmente nach RsaI-HydrolysepBAD/HisB pBADmodA

1565 bp 1565 bp1464 bp

957 bp 957 bp848 bp663 bp 663 bp44 bp17 bp 17 bp

Dieser Vektor erwies sich ebenso wie die pET-Vektoren als genügend stringent reguliert,

um die Aufnahme des modA Gens zu tolerieren. Man erhielt somit das Plasmid

Ergebnisse

51

pBADmodA2 (Abb. 3.9). Das Gen modB wurde von F. KAISER im Rahmen seiner

Diplomarbeit (1999) in diesen Vektor kloniert.

pBADmodA

4666 bps

Afl IIIBam HI

Nco INhe IRsa IBam HIXho I

Nsi IPvu II

Nde IEcoRI

Pvu II

HindIII

HincIISca IRsa I

Pvu I

IIIAflINdeIRsaIAcc

INsi

RVEcoIRsaIRsa

pBAD

His-modA

amp

ColE1

araC

Abb. 3.9 Vektorkarte von pBADmodA.

Sämtliche Klone wurden durch Sequenzierung auf Fehler hin überprüft, die bei der PCR

oder beim Klonieren der Gene aufgetreten sein könnten. Dabei erwiesen sich alle Klone bis

auf p11modAB3 als fehlerfrei. Der Klon p11modAB3 weist eine Punktmutation im modA

Gen an der Stelle Met125 auf. Hier ist das entsprechende Codon ATG zu AAG verändert,

was einen Aminosäureaustausch von Methionin nach Lysin (Met125→Lys) bewirkt.

Aktivitätstests und Vergleiche mit dem Ribosylierungsmuster von His-ModA konnten aber

zeigen, daß diese Mutation keinen deutlichen Einfluß auf die Aktivität bzw. auf das

Erkennungsmuster von Zielproteinen hat.

3.3 Anzucht von Transformanden in Gegenwart von ADP-RibosyltransferaseInhibitoren

Bei den Klonierungsexperimenten mit den Vektoren pBluescript II KS/SK, pT7-x und

pGEX-3X wurden den Selektivagarplatten teilweise die ADP-Ribosyltransferase

Inhibitoren 3-Methoxybenzamid bzw. 1H,3H-Chinazolin-2,4-dion in Konzentrationen von

2 mM zugesetzt. Diese Inhibitoren sollten die ADP-Ribosylierung von Wirtsproteinen

verhindern und somit den Klonierungserfolg in diese Vektoren ermöglichen. Diese

Maßnahme führte allerdings zu keinem Erfolg, sei es, daß die Substanzen nicht von den

Bakterien aufgenommen wurden, sie abgebaut oder nicht spezifisch genug für ModA bzw.

ModB waren.

Ergebnisse

52

3.4 Identifizierung des Mod-Proteins, das die E. coli RNA-Polymerasemodifiziert

Die ersten Überexpressionsversuche aus den Vektoren p11modAB3 und p11modBB5

wurden mit dem Phagen λCE6 durchgeführt (3.5.1.1). Nach der Überexpression lag der

größte Teil der exprimierten Proteine als Einschlußkörper, also in einer inaktiven Form,

vor. Da aber zu erwarten war, daß ein geringer Prozentsatz als lösliches und somit aktives

Protein vorhanden war, wurden die ersten Aktivitätstests nach ROHRER et al. (1975) (2.8.1)

mit löslichen Proteinüberständen einer Expressionskultur durchgeführt.

Dazu wurden 300 µg löslicher Proteinrohextrakt mit 35 µg gereinigter E. coli RNA-

Polymerase in Gegenwart von 32P-NAD+ inkubiert, auf einem SDS-Polyacrylamidgel

aufgetrennt und das mit Coomassie Brillantblau gefärbte und getrocknete Gel auf einem

Röntgenfilm exponiert (Abb. 3.10). Nach Auswertung des Autoradiogramms konnte das

zweite Protein des Leserahmens (hier schon als ModA bezeichnet) als dasjenige

identifiziert werden, das die E. coli RNA-Polymerase modifiziert. Des weiteren konnte

gezeigt werden, daß das andere Protein (bereits als ModB bezeichnet), wie von BAZAN &

KOCH-NOLTE (1997) vorhergesagt, ebenfalls eine ADP-Ribosyltransferase ist. Da nun

bekannt war, daß ModA (definiert als „A“, da dieses Protein zuerst in der Literatur als

Mod beschrieben wurde) die E. coli RNA-Polymerase modifiziert, wurde verstärkt an

diesem Protein weitergearbeitet.

Abb. 3.10 SDS-Polyacrylamidgel (links) und Autoradiogramm (rechts) der ADP-Ribosylierung von RNAP und löslicher Proteine mit löslichen Rohextrakten einerÜberexpression von ModA und ModB. An der rechten Seite sind die Lauffrontenvon den Untereinheiten der RNAP wiedergegeben.

Ergebnisse

53

3.5 Überexpression von Mod

Im Allgemeinen gestaltete sich die Überexpression der Genprodukte ModA und ModB auf

Grund ihrer Toxizität als schwierig. Teilweise neigten die Kulturen der DE3-Stämme dazu,

vor der Induktion der Expression, zu lysieren und Phagen freizusetzen. Um mit weniger

toxisch wirkenden Proteinen zu arbeiten wurden im Laufe dieser Arbeit Mutanten beider

Proteine hergestellt (3.11).

3.5.1 Überexpression aus pET-Vektoren

3.5.1.1 Überexpression mit λλλλCE6

Da die Genprodukte ModA und ModB sehr toxisch für E. coli sind, wurden die ersten

Überexpressionen mit einem λ–Phagen, der das Gen für die T7 RNA-Polymerase trägt

(λCE6) (STUDIER & MOFFATT, 1986) durchgeführt (2.5.3.1). Die Induktion der

Überexpression von selbst hergestellten Phagenstocklösungen erwies sich allerdings als

ineffektiv, so daß für die Überexpression Bakterienstämme eingesetzt wurden, die den

λ-Phagen DE3 lysogen im Genom tragen (3.5.1.3).

3.5.1.2 Überexpression mit mGP1-2

Eine Alternative die T7 RNA-Polymerase in die Wirtsbakterien zu bekommen ist der M13-

Phage mGP1-2 (STUDIER & MOFFATT, 1986) (2.5.3.2). Mit diesem Phagen ließ sich in F'

Bakterien aber keine Überexpression der gewünschten Genprodukte ModA bzw. ModB

erzielen.

3.5.1.3 Überexpression aus DE3 Stämmen

Zur erfolgreichen Überexpression von gpModA und gpModB wurden DE3 Stämme

eingesetzt (2.5.3.3). Diese E. coli Stämme enthalten den λ-Phagen DE3 lysogen im

Genom, er trägt das lacI Gen, den lacUV5 Promotor und das Gen für die T7 RNA-

Polymerase.

Zum Einsatz kamen die E. coli Stämme BL21(DE3), BLR(DE3), C41(DE3) und

C43(DE3), die zum Teil das Plasmid pLysS beinhalteten. Dieses Plasmid kodiert für das

T7 Lysozym, einem natürlichen Inhibitor der T7 RNA-Polymerase und sollte deshalb eine

stringentere Kontrolle vor Induktion der Überexpression gewährleisten. Abb. 3.11 zeigt als

Ergebnisse

54

Beispiel eine Überexpression aus p16modA7 in E. coli BL21(DE3), der zusätzlich das

Plasmid pLysS enthielt.

Abb. 3.11 Überexpression von His-ModA (p16modA7) in BL21(DE3) pLysS.Spur 1: 10 kDa-LeiterSpur 2: Rohextrakt von Zellen kurz vor der InduktionSpur 3: Rohextrakt von Zellen 3 Stunden nach Induktion mit 1 mM IPTG

Trotz der stringenten Expressionskontrolle hat der mit den Plasmiden p16modA7 oder

p16modB1 transformierte Bakterienstamm BL21(DE3) unter nicht induzierten

Bedingungen einen deutlichen Wuchsnachteil (Abb. 3.12), der auf die klonierten Gene

modA bzw. modB zurückzuführen ist .

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5

Stunden

OD

590

BL21 (DE3)

pET16b(+)

p16modB1

p16modA7

Abb. 3.12 Wuchskurven von BL21(DE3) mit den Plasmiden pET16b(+), p16modA7 (ModA)oder p16modB1 (ModB).

Ergebnisse

55

Der Plasmidstabilitätstest (2.5.4.1) zeigte immer zuverlässig an, ob eine Überexpression

von ModA oder ModB stattgefunden hatte oder nicht. Wuchsen auf den LB-Agarplatten

mit 1 mM IPTG sehr viele Kolonien, vergleichbar mit der LB-Amp-Agarplatte, konnte auf

einem SDS-Polyacrylamidgel auch keine Überexpression nachgewiesen werden. Fanden

sich auf der IPTG-haltigen Platte im Vergleich mit der LB-Amp-Agarplatte wenige

Kolonien (2 - 6%) wurden die rekombinanten Proteine auch immer überexprimiert.

Im Verlauf der Überexpression von gpModA oder gpModB kam es zur Bildung von

Einschlußkörpern. Abb. 3.13 zeigt exemplarisch die Überexpression und die Isolation der

Einschlußkörper von der Mutante His-ModA-R72K aus dem Vektor p16modA7-R72K.

In Abb. 3.14 ist aus einer typischen Überexpression aus p16modA7 der Anteil des

überexprimierten Proteins His-ModA vom Gesamtproteingehalt bestimmt worden. Die

densitometrische Auswertung dieser Gelspur mit dem Programm Tina2.09 ergab einen

Anteil des rekombinanten Proteins von ca. 40 % der Gesamtproteinmenge.

68 kDa

25 kDa

14,4 kDa

1 2 3 4 5 6

Abb. 3.13 Überexpression aus p16modA7-R72K in BLR(DE3) pLysS und Isolation derEinschlußkörper. Spur 1: Größenstandard (RSA, 68 kDa; α-Chymotrypsin,25 kDa; Lysozym, 14,4 kDa); Spur 2: Gesamtzellextrakt; Spur 3: löslicheProteine; Spur 4: Sediment; Spur 5: Überstand nach waschen derEinschlußkörper; Spur 6: gereinigte Einschlußkörper.

Ergebnisse

56

Abb. 3.14: Überexpression von His-ModA und densitometrisches Profil über die Gelspur.

Da die rekombinanten „His-Tag“-Proteine als Einschlußkörper exprimiert wurden, fand die

Reinigung der Proteine unter denaturierenden Bedingungen statt (2.7.3.1, 3.6).

3.5.2 Überexpression aus dem Vektor pBAD

Die Expressionsversuche von ModA aus dem Vektor pBAD erfolgten nach Angaben des

Herstellers mit L-Arabinose wie unter 2.5.3.4 beschrieben. Selbst bei 0,2 % Arabinose

Endkonzentration kam es aber zu keiner erkennbaren Expression des Zielproteins, obwohl

der Promotor bereits mit 0,004 % Arabinose (Angabe des Herstellers) induziert werden

kann. Die gleichen Ergebnisse lieferten die Expressionen der Mutanten ModA-R72K (aus

pBADmodA2-R72K) und ModA-E165D (aus pBADmodA2-E165D). An Hand einer

Wuchskurve (Abb. 3.15) zeigte sich, daß ModA bei einer Arabinosekonzentration von 0,2

% wahrscheinlich exprimiert wurde, wenn auch in sehr geringen Mengen, da hier ein

deutlicher Wuchsnachteil bei pBADmodA2 in LMG194 gegenüber dem induzierten

pBAD/HisB in LMG194 zu verzeichnen ist.

Ergebnisse

57

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Stunden

OD

590 pBAD/HisB 0%

pBAD/HisB 0,2 %

pBADmodA2 0 %

pBADmodA2 0,2 %

Abb. 3.15 Wuchskurven von LMG194 mit den Vektoren pBAD/HisB und pBADmodA2 unter nichtinduzierten und induzierten (0,2 % Arabinose) Bedingungen. Die %-Angaben in derLegende beziehen sich auf die Arabinosekonzentration.

3.6 Reinigung von ModA unter denaturierenden Bedingungen

Die rekombinanten Proteine His-ModA und His-ModB aus den Vektoren p16modA7 bzw.

p16modB1 wurden als Einschlußkörper exprimiert (Abb. 3.13) und lagen somit als

inaktive Formen dieser Proteine vor. Diese Einschlußkörper wurden wie unter 2.5.5

beschrieben isoliert und im Aufschlußpuffer mit 6 M GuHCl aufgelöst. Aus einer 500 ml

Überexpressionskultur erhielt man, je nachdem wie gut die Expression war, ca. 80 – 250

mg isolierte Einschlußkörper.

Die denaturierten Proteine wurden anschließend an eine Ni-NTA Säulenmatrix gebunden

und durch schrittweise Verringerung des denaturierenden Agenz im Aufschlußpuffer auf

der Säule renaturiert (2.7.3.1). Die Elution der Proteine erfolgte mit einem Imidazol

Stufengradienten, wobei die Proteine bei einer Imidazolkonzentration von 250 mM von der

Säule eluierten.

Bei diesem Verfahren stellte sich allerdings heraus, daß die denaturierten „His-Tag“-

Proteine nur sehr schlecht an dem Ni-NTA Säulenmaterial banden. Pro Säulenlauf ließen

sich nur 0,8 bis 1,6 mg Protein, statt den zu erwarteten 50 mg von einer 5 ml Säule,

isolieren. Ein Ausweichen auf alternative Säulenmaterialien wie Talon (Clontech) oder

His•Bind (Novagen) brachte ebenfalls keine Verbesserung der Bindung.

Ergebnisse

58

Das Trx-ModA Fusionsprotein band unter denaturierenden Bedingungen viel besser an der

Ni-NTA Matrix als His-ModA unter gleichen Bedingungen. Das Trx-ModA hat außer dem

C-terminalen „His-Tag“ am ModA noch einen internen „His-Tag“ zwischen dem Trx und

ModA. Zum Vergleich des Aufbaus beider Proteine siehe Tabelle 3.2. Es wurde nun

vermutet, daß der C-terminale „His-Tag“ für die bessere Bindung am Säulenmaterial

verantwortlich ist. Da das Thioredoxin, wie sich noch zeigen wird, keinen Einfluß auf die

Löslichkeit von ModA hat, sollte dieses aus dem Vektor entfernt werden und das

rekombinante Protein ModA-His exprimiert werden (3.12).

Tabelle 3.2: Aufbau der Proteine His-ModA und Trx-ModA.His-ModA Trx-ModA

10 Histidine – ModA Trx – 6 Histidine – ModA – 6 Histidine

3.7 Nachweis des „His-Tags“

Zunächst wurde vermutet, daß die exprimierten Proteine ihren „His-Tag“ evtl. verloren

hatten und somit nicht mehr am Säulenmaterial binden konnten. Dies sollte durch eine

Western Blot Analyse nachgeprüft werden (2.7.6). Dazu wurde ein Ni-NTA HRP Konjugat

(Qiagen) verwendet. Der Nachweis erfolgte über Chemilumineszenz (ECL von

Amersham). In Abb. 3.16 sieht man den deutlichen Nachweis des „His-Tags“ am

rekombinanten Protein His-ModA. Obwohl das verwendete Ni-NTA Konjugat das

Vorhandensein des „His-Tags“ eindeutig belegen konnte, blieb nur sehr wenig von dem

Protein an der entsprechenden Ni-NTA Matrix der Säulen haften. Der Blot zeigt aber auch,

daß nur ein kaum detektierbarer Anteil des Fusionsproteins sich in der löslichen Fraktion

befindet. Dieser Anteil war zu gering, um das native Protein in größeren Mengen aus der

löslichen Proteinfraktion zu reinigen.

Das Problem mit den denaturierten Proteinen, die nicht an dem Säulenmaterial haften

bleiben ist bekannt (Steinert, Forschungsabteilung Qiagen, persönliche Mitteilung). Es sind

zwei andere Proteine bekannt, die unter denaturierenden Bedingungen nicht an der Ni-

NTA Matrix binden. Diese Proteine binden aber unter nativen Bedingungen an dem

Säulenmaterial und können so gereinigt werden. Eine Erklärung für dieses Phänomen

konnte nicht gegeben werden, da unter denaturierenden Bedingungen der „His-Tag“ frei

zugänglich und die Bindung an die Matrix ohne Einschränkungen möglich sein sollte.

So wurde im Folgenden versucht die Expressionsbedingungen der Art zu gestalten, daß

zumindest ein Teil der exprimierten Proteine in löslicher Form vorliegt.

Ergebnisse

59

M 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

50 kDa

30 kDa

20 kDa

Abb. 3.16 Western Blot zum Nachweis des „His-Tags“ an dem rekombinanten Protein His-ModA. PVDF-Membran, mit Coomassie gefärbt (links) und dazugehöriger Film(rechts). Spur 1: BLR(DE3) pLysS (negativ Kontrolle); Spur 2: Gesamtzellextraktnach Überexpression von His-ModA; Spur 3: lösliche Proteine nach derÜberexpression; Spur 4: Überstand der gewaschenen Einschlußkörper; Spur 5:isolierte Einschlußkörper.

3.8 Versuche zur Vermeidung von Einschlußkörpern

Es gibt verschiedene Methoden die Bildung von Einschlußkörpern zu verhindern. C.H.

SCHEIN (1991) hat sechs verschiedene Wege aufgelistet, über die man die Proteinfaltung

während der Überexpression verbessern kann. Als erstes sollte man die

Wuchsbedingungen verändern, dann die Fusion zu einem Solubilisierungslinker herstellen

oder das Protein ausschleusen. Des weiteren könnte man Chaperone oder Foldasen

coexprimieren und man sollte „klebrige Proteinsequenzen“, also solche mit einer hohen

Adhäsion (z.B. L-R-E, R-G-D-(V, S oder T) ), vermeiden. Zum Schluß könnten auch noch

Mutationen in die Primärstruktur der Proteinsequenz eingebracht werden, hier sind die

Methoden der Vorhersage jedoch noch nicht ausgereift.

Im Folgenden wurden einige dieser Wege beschritten.

3.8.1 Veränderungen der Expressionsbedingungen

Die Anzuchtbedingungen zu verändern schien erst einmal das einfachste Mittel zu sein die

Bildung der Einschlußkörper zu verhindern. Dazu wurden die unter 2.5.1 beschriebenen

Nährmedien bei Temperaturen von 16° C, 20° C, 30° C, 37° C und 45° C für die

Überexpression verwendet. Außerdem wurde die Induktion der Expression mit 0,5 mM,

0,75 mM und 1 mM IPTG durchgeführt. Die Expression der Proteine fand im Stamm

C41(DE3) statt.

Ergebnisse

60

Den größten Erfolg zum löslichen Protein zu kommen versprach dabei das Trypton-

Phosphat-Medium. MOORE et al. (1993) verwendeten dieses Medium, um die dCMP

Deaminase des T4 von einem pET-Vektor aus in löslicher Form zu exprimieren, wobei

Versuche mit anderen Medien nur zur Bildung von Einschlußkörpern geführt hatten.

Im Falle der Proteine ModA und ModB ließ sich jedoch in keinem Versuchsansatz der

Anteil an löslichem Protein steigern. Es mußte also ein anderer Weg gewählt werden.

3.8.2 Überexpression in Gegenwart des Bakteriocinfreisetzungsproteins

Die Expression des Bakteriocinfreisetzungsproteins (BRP) initiiert die Freisetzung

periplasmatischer und cytosolischer E. coli Proteine in das Kulturmedium.

Überexprimierte Proteine sollten somit nicht im Cytoplasma akkumulieren und als

Einschlußkörper aggregieren können.

Für die Versuche wurde das Plasmid pSW1 mit p16modA7 in BLR(DE3) cotransformiert

und wie unter 2.5.3.5 beschrieben angezogen. Es wurden Gesamtzellextrakte nach erfolgter

Überexpression bei verschiedenen Gaben von Mitomycin C mit den Gelen der zugehörigen

Kulturüberstände verglichen. Bei der Auswertung der SDS-Polyacrylamidgele zeigte sich,

daß bei einer Konzentration von 50 ng/ml Mitomycin C E. coli Proteine aus den Bakterien

in das Medium ausgeschleust wurden. Obwohl in den Gesamtzellextrakten eine deutliche

Überexpression zu verzeichnen war, fand sich im Überstand kein ausgeschleustes His-

ModA wieder.

3.8.3 Ausschleusen der exprimierten Proteine in den periplasmatischen Raum

Mit dem Vektor pET-22b(+) ist es möglich, die zu exprimierenden Proteine mit einer

Leitsequenz („pelB-Leader“) für den periplasmatischen Raum zu versehen und die

Proteine dorthin zu transportieren. Dies wurde mit ModB ausprobiert, das aus dem Vektor

p22modBB2 exprimiert wurde. Da sich auch hier wieder nur die Bildung von

Einschlußkörpern nachweisen ließ, wurde auf eine Klonierung von modA in diesem Vektor

verzichtet.

Ergebnisse

61

3.8.4 Coexpression von Chaperonen

Einige Proteine benötigen sogenannte Chaperone, die sie bei der Faltung zur aktiven Form

unterstützen oder es erst ermöglichen die aktive Form einzunehmen. Damit bei einer

Überexpression die vorhandenen Chaperone nicht austitriert werden, kann man diese

coexprimieren und die „Faltungshelfer“ somit in ausreichender Menge zur Verfügung

stellen. Zum Einsatz kamen die Chaperone GroES/GroEL und DnaK. Bei der

Coexpression von GroES/GroEL mit His-ModA bzw. Trx-ModA (2.5.3.6) zeigte sich, daß

die Chaperone sehr gut überexprimiert wurden, die Expression von His-ModA bzw. Trx-

ModA aber nicht zu erkennen war. Die Coexpression mit DnaK und His-ModA lieferte

von beiden Proteinen eine gute Überexpression, wobei von DnaK ca. die Hälfte löslich und

die andere Hälfte als unlösliches Protein vorlag. His-ModA fand sich nur in der

unlöslichen Proteinfraktion wieder.

3.8.5 Fusion von ModA mit Thioredoxin

Thioredoxin (109 Aminosäuren, 11.675 Da) ist ein Protein, was noch bei einer

Konzentration von 40 % des gesamten Zellproteins in Lösung vorliegen kann. Deshalb

erschien es geeignet die Bildung der Einschlußkörper zumindest teilweise zu unterbinden.

Wie unter 3.2.4 bereits beschrieben wurde das Gen modA in den Vektor pET-32b(+)

kloniert. Bei der Überexpression des Fusionsproteins zeigte sich aber, daß die

Aggregationsfähigkeit von ModA die Fähigkeit der Löslichkeit des Thioredoxins

überschreitet und man kein lösliches Fusionsprotein vorfand.

3.9 Renaturierung von Einschlußkörpern

Da es nicht möglich war, durch die Anzuchtbedingungen während der Expression einen

größeren Teil der rekombinanten Proteine in Lösung zu halten, sollten Bedingungen

gefunden werden, unter denen sich die denaturierten Proteine in ihre aktive Form

zurückführen ließen.

3.9.1 Renaturierung durch Verdünnung

Es wurden, wie unter 2.7.4.1 beschrieben, die in 7 M GuHCl aufgelösten Einschlußkörper

langsam unter ständigem Rühren in einem Renaturierungspuffer getropft. Dabei sollte

anfangs die Konzentration der Proteine so gering sein, daß sie sich während ihres

Faltungsprozesses nicht gegenseitig behindern und sie sich somit ungestört in ihre aktive

Ergebnisse

62

Form falten lassen. Nach Zentrifugation und Einengung der löslichen Fraktion über

Zentrifugationsfiltration fand sich kein nennenswerter Anteil der Proteine in Lösung

wieder, fast 100 % der eingesetzten Proteine wurden wieder sedimentiert.

3.9.2 Renaturierung durch Dialyse

Wurden die in GuHCl gelösten Einschlußkörper stufenweise gegen einen Dialyse-

Renaturierungs-Puffer dialysiert (2.7.4.2), flockten die Proteine bei weniger als 2 M

Harnstoff im Puffer aus.

Wurden die Einschlußkörper bei einem pH von 12,0 denaturiert (2.5.5) und durch Dialyse

der pH Wert auf 8 gebracht (2.7.4.2) hatte man kaum Verluste durch ausgefallene Proteine

während der Dialyse. Bei Proteinkonzentrationen < 1 mg/ml für ModA oder His-ModA

konnten fast 100 % der Proteine in Lösung gehalten werden. Für das Trx-ModA

Fusionsprotein liegt diese Konzentration bei < 3 mg/ml. Bei höheren Konzentrationen

neigen die Proteine auch hier wieder dazu ein Präzipitat zu bilden.

Mit dieser letzten Methode hatte man nun die Möglichkeit größere Mengen der

rekombinanten Proteine in eine lösliche Form zu überführen.

3.10 Reinigung von ModA unter nativen Bedingungen

Da nun größere Mengen löslicher rekombinanter Proteine zur Verfügung standen, wurde

die Reinigung von His-ModA unter nativen Bedingungen wiederholt (2.7.3.1). Das Ni-

NTA Säulenmaterial wurde nach Angabe des Herstellers (Qiagen) mit den entsprechenden

Puffern verwendet. Unter nativen Bedingungen banden die „His-Tag“-Proteine viel besser

an der Säule als unter denaturierenden Bedingungen. Ein Teil der Proteine eluierte jedoch

bereits bei einer Konzentration von 100 mM Imidazol von der Säule, der größte Teil

jedoch erst bei 250 mM Imidazol. Die Fraktionen mit dem gewünschten Protein wurden

vereinigt und gegen Dialyse-Puffer 2 (2.7.3.1) dialysiert. Die Reinheit der Proteine wurde

densitometrisch mit dem Programm Tina2.09 über ein silbergefärbtes SDS-

Polyacrylamidgel bestimmt (Abb. 3.17). Nach einer solchen Auswertung ist das Protein zu

ca. 95 % sauber.

Ergebnisse

63

Abb. 3.17: Analyse zur Reinheit durch densitometrische Auswertung eines silbergefärbten 13%igen SDS-Polyacrylamidgels. In der Spur wurden 3 µg gereinigtes His-ModAaufgetragen. Als Marker diente eine 10 kDa-Leiter.

3.11 Nachweis katalytisch aktiver Aminosäuren durch ortsgerichteteMutagenese

Nach dem strukturellen Alignment von BAZAN & KOCH-NOLTE (1997) (Abb. 1.9) wurden

vier katalytisch essentielle Aminosäuren für die Proteine ModA und ModB vorhergesagt.

Für ModA sind dies die Aminosäuren Arginin 72, Serin 109, Phenylalanin 129 und

Glutamat 165 (Abb. 3.18). Für ModB wurden die Aminosäuren Arginin 73, Serin 111,

Tyrosin 131 und Glutamat 173 postuliert (Abb. 3.18). Durch den Austausch der

Aminosäuren Arg72 bzw. Glu165 für ModA und Arg73 bzw. Glu173 für ModB sollten

Mutanten generiert werden, deren ADP-Ribosylierungs-Aktivität stark eingeschränkt sein

sollte. Die Mutagenese erfolgte mit dem „QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit“

von Stratagene (2.6.4). Es wurden jeweils nur homologe Aminosäuren ausgetauscht, also

Arginin gegen Lysin und Glutamat gegen Aspartat. Nach erfolgter Mutagenese erhielt man

die Klone p16modA7-R72K, p16modA7-E165D, p16modB1-R73K und p16modB1-

E173D. Diese Mutanten wurden einem Plattentest zur Überprüfung ihrer Toxizität

unterzogen (2.5.4.3). Dabei stellte sich heraus, daß die Bakterien (C41(DE3)) mit den

mutierten Plasmiden unter induzierten Bedingungen auf den Agar-Platten wuchsen,

wohingegen Bakterien mit den Originalplasmiden kein Wachstum zeigten. Die Größe der

Ergebnisse

64

Kolonien unter induzierten und nicht induzierten Bedingungen kann hier als Maß der

Toxizität dienen. In einer Kooperation mit der Gruppe um Rimas Nivinskas (Litauen)

wurden weitere Mutanten hergestellt, eine Auflistung findet sich in Tabelle 3.3.

Dieser Test funktioniert nur in dem Stamm C41(DE3). Der Stamm C43(DE3), einer

anderen BL21(DE3) Mutante, zeigte mit den Originalplasmiden unter induzierten

Bedingungen ein Wachstum, wenn auch die Kolonien sehr klein blieben. In den Stämmen

BL21(DE3) oder BLR(DE3) findet man unter induzierten Bedingungen kein Wachstum

auf den Agar-Platten, egal ob die exprimierten Proteine eine toxische Wirkung haben oder

nicht.

Tabelle 3.3 Auflistung der in dieser Arbeit hergestellten Mutanten (fett) und der in derArbeitsgruppe von Rimas Nivinskas erzeugten Mutanten. Der Grad derToxizität kann an Hand der Koloniegröße im Vergleich zum Wuchs unterinduzierten und nicht induzierten Bedingungen ermittelt werden.

Mutation Koloniegröße(% von nicht induziert)

ModAR72K 50E165D 50R72AS109AF127AF129AE163A

100

E165A 70-80N128A 20Q116A 10Q164A 5

ModBR73K 50E173D 50

Mit diesem Plattentest konnte nachgewiesen werden, daß die Aminosäuren Arg72 und

Glu165 bei ModA und Arg73 und Glu173 bei ModB essentiell für die Aktivität der Proteine

sind. Selbst ein homologer Austausch dieser Aminosäuren senkte die Aktivität der Proteine

dermaßen, daß die Bakterien unter induzierten Bedingungen noch Kolonien von 50 % der

Größe wie unter nicht induzierten Bedingungen hervorbrachten. Wurden bei ModA die

Aminosäuren Arg72 bzw. Glu165 gegen Alanin ausgetauscht, ergab sich für R72A kein

Unterschied mehr in der Koloniegröße zwischen induziert und nicht induziert, für E165A

lag sie bei 70-80 %, also auch höher als bei dem konservativen Austausch E165D.

Ergebnisse

65

1 ATT ATT AAT CTT GCA GAT GTT GAA CAG TTA TCT ATA AAA GCT GAAATG

1 M I I N L A D V E Q L S I K A E

49 AGC GTT GAT TTT CAA TAT GAT ATG TAT AAA AAG GTC TGT GAA AAA TTT

17 S V D F Q Y D M Y K K V C E K F

97 ACT GAC TTT GAG CAG TCT GTT CTT TGG CAA TGT ATG GAA GCC AAA AAG

33 T D F E Q S V L W Q C M E A K K

145 AAT GAA GCT CTT CAT AAG CAT TTA AAT GAA ATC ATT AAA AAG CAT TTA

49 N E A L H K H L N E I I K K H L

193 ACT AAA TCG CCT TAT CAA TTA TAT CGT GGT ATA TCA AAA TCG ACA AAA

65 T K S P Y Q L Y R G I S K S T K

241 GAA CTC ATT AAA GAT TTA CAA GTT GGA GAA GTG TTT TCA ACG AAC AGG

81 E L I K D L Q V G E V F S T N R

289 GTA GAT TCA TTT ACT ACT AGT TTG CAT ACA GCG TGT TCT TTT TCT TAT

97 V D S F T T S L H T A C S F S Y

337 GCT GAA TAT TTC ACT GAA ACA ATA CTT CGT TTA AAA ACT GAT AAA GCT

113 A E Y F T E T I L R L K T D K A

385 TTT AAT TAT TCT GAC CAT ATC AGC GAT ATT ATA CTT TCT TCT CCT AAT

129 F N Y S D H I S D I I L S S P N

433 ACT GAG TTT AAG TAC ACG TAT GAA GAT ACT GAT GGA TTA GAT TCA GAG

145 T E F K Y T Y E D T D G L D S E

481 CGT ACT GAT AAC TTA ATG ATG ATT GTG CGT GAA CAA GAA TGG ATG ATT

161 R T D N L M M I V R E Q E W M I

529 CCA ATT GGA AAG TAT AAA ATA ACT TCT ATT TCA AAA GAA AAA TTA CAC

177 P I G K Y K I T S I S K E K L H

577 GAT TCA TTT GGA ACA TTT AAA GTT TAT GAT ATT GAG GTA GTT GA (A)A TG

193 D S F G T F K V Y D I E V V E -

1 M

624 AAA TAC TCA GTA ATG CAA CTA AAA GAT TTT AAA ATA AAA TCA ATG GAT

2 K Y S V M Q L K D F K I K S M D

672 GCA TCG GTG CGT GCT TCT ATT CGT GAA GAA TTA CTT TCT GAA GGG TTT

18 A S V R A S I R E E L L S E G F

720 AAT TTA TCT GAA ATT GAA CTT TTA ATT CAT TGT ATT ACT AAT AAA CCA

34 N L S E I E L L I H C I T N K P

768 GAT GAC CAT TCT TGG TTA AAT GAA ATA ATC AAA TCT CGT TTG GTT CCA

50 D D H S W L N E I I K S R L V P

816 AAC GAT AAA CCT CTT TGG AGA GGT GTT CCA GCT GAG ACT AAA CAA GTA

66 N D K P L W R G V P A E T K Q V

864 TTA AAT CAA GGA ATT GAT ATT ATT ACA TTT GAT AAA GTC GTA TCA GCT

82 L N Q G I D I I T F D K V V S A

912 TCA TAT GAT AAA AAT ATA GCT CTA CAT TTT GCT TCT GGT TTA GAG TAT

98 S Y D K N I A L H F A S G L E Y

960 AAC ACA CAA GTT ATT TTT GAA TTC AAA GCT CCT ATG GTA TTC AAT TTC

114 N T Q V I F E F K A P M V F N F

1008 CAG GAG TAT GCT ATA AAA GCT CTA CGC TGT AAA GAA TAC AAT CCA AAC

130 Q E Y A I K A L R C K E Y N P N

1056 TTT AAG TTT CCG GAT AGT CAT CGT TAT CGT AAT ATG GAA TTA GTT TCA

146 F K F P D S H R Y R N M E L V S

1104 GAT GAA CAA GAA GTA ATG ATA CCA GCT GGA AGT GTA TTT AGA ATT GCA

162 D E Q E V M I P A G S V F R I A

1152 GAT AGA TAT GAG TAT AAA AAG TGT TCA ACA TAC ACT ATC TAT ACT CTT

178 D R Y E Y K K C S T Y T I Y T L

1200 GAT TTT GAA GGA TTT AAT CTA TAA TGG AAG GAC TTA GAT TCA TTA TAC

194 D F E G F N L - W K D L D S L Y

M o dB

M o dA

Abb. 3.18 DNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz der Gene modB und modA. DieStart-Codons sind fett und unterstrichen dargestellt. Die als katalytisch aktivpostulierten Aminosäuren sind durch ein Fünfeck markiert. Das (A) in der Sequenzan Position 624 wurde in die nächste Zeile transferiert, um in den neuenLeserahmen für ModA zu gelangen.

Ergebnisse

66

3.12 Entfernung des Trx aus p32modA2

Das rekombinante Fusionsprotein Trx-ModA zeigte unter denaturierenden Bedingungen

ein sehr viel besseres Bindeverhalten an der Ni-NTA Matrix als His-ModA. Diese

verbesserte Bindung wurde auf den C-terminalen „His-Tag“ zurückgeführt. Da das Trx

keine Wirkung auf die Löslichkeit von ModA hatte, sollte das Gen trxA aus dem Vektor

entfernt werden, um es nach der erfolgten Reinigung nicht durch eine Protease abspalten

zu müssen.

Das Gen trxA sollte aus dem Plasmid p32modA2 über die Schnittstellen NdeI und NcoI

entfernt werden. Da im Gen modA aber eine interne NdeI Schnittstelle vorhanden ist,

wurde diese durch eine ortsspezifische Mutagenese (2.6.4) mit den Primern Mut-A-Nde1

und Mut-A-Nde2 (2.4.2) eliminiert, ohne die Aminosäuresequenz zu verändern. Das so

erzeugte Plasmid p32trx-modA-NdeI wurde dann für die Deletion von trxA eingesetzt.

Dazu wurde das Plasmid mit NdeI und NcoI restringiert, die überhängenden Enden unter

Zuhilfenahme des Klenow-Fragments aufgefüllt und der Vektor ligiert. Nach erfolgter

Transformation wurden einige Transformanden mittels einer Restriktionsanalyse mit RsaI

oder PvuII auf das verkürzte Plasmid hin untersucht.

Überexpressionsversuche mit diesen so verkürzten Plasmiden zeigten aber keine

Expression des Proteins ModA-His. Nach Deletion des trxA Gens fanden sich zwischen

der Shine-Dalgarno Region (SD-Region) und dem Start-Codon ATG 10 Nukleotide, vor

der Deletion befanden sich dort nur 8 Nukleotide. Nach CHEN et al. (1994) spielt der

Abstand zwischen der Ribosomenbindestelle und dem Start-Codon aber eine wichtige

Rolle für eine effiziente Translation. Deshalb wurde im zweiten Ansatz das Gen trxA wie

in Abb. 3.19 dargestellt eliminiert. Nach dieser Vorgehensweise sollte man wieder einen

Spacer von 8 Nukleotiden erhalten. Von diesem Plasmid ließ sich eine gute

Überexpression von ModA-His induzieren.

Ergebnisse

67

p32 trx-modA-NdeI

6445 bps

Pvu IIIIPvu

IIPvu

INcoIIPvu

RIEcoIIPvu

IXho

amp

orilacI

T7 Pro

trx-His

modA-His

T7 Ter

Fragment 1

6098 bps

Pvu IIIIPvu

IIPvu

IIPvuRIEco

IIPvuIXho

'trx-His

modA-His

T7 Ter

amp

orilacI

T7 Pro

Fragment 2

5968 bps

Pvu IIIIPvu

IIPvu

IIPvuRIEco

IIPvuIXho

modA-His

T7 Ter

amp

orilacI

T7 Pro

p32 modA-His

5968 bps

Pvu II

IIPvuIIPvu

IIPvuRIEco

IIPvuIXho

amp

ori

lacI

T7 Pro

modA-HisT7 Ter

NcoI +Klenow Auffüllung

Ligation

Nde I

Nco I

NdeI + S1-Nuklease

Nde I del

Nde I

Abb. 3.19 Deletion von trxA aus dem Vektor p32trx-modA-NdeI. Die deletierte NdeISchnittstelle im Gen modA ist in Magenta hervorgehoben, die verwendetenSchnittstellen NdeI und NcoI sind in Rot dargestellt.

Wie sich bei einer späteren Sequenzierung herausstellte sind in dem Plasmid

p32modA-His 12 bp zusätzlich deletiert (Abb. 3.20), so daß die Translation von dem

zweiten ATG stattfand und das Protein um die ersten fünf Aminosäuren verkürzt vorlag.

Hier fand eine gute Translation trotz eines Spacers von 11 Nukleotiden zwischen der SD-

Region und dem AUG statt.

erwartete Sequenz aagaaggagatatacac atg gaa tac tca gta atg caa cta

M E Y S V M Q L

gefundene Sequenz aagaaggaga....... ... ..a tac tca gta atg caa cta

M Q L

Abb. 3.20 Zusätzliche Deletion im Vektor p32modA-His. Die Ribosomenbindestelle und das Start-Codon sind jeweils Fett dargestellt.

Die erwartete bessere Bindung von ModA-His an der Ni-NTA Matrix unter

denaturierenden Bedingungen konnte allerdings nicht bestätigt werden. So muß die

verbesserte Bindefähigkeit des Trx-ModA Fusionsproteins auf die Anwesenheit beider

„His-Tags“ zurückzuführen sein (Tabelle 3.2).

Ergebnisse

68

3.13 ADP-Ribosylierung durch ModA und ModB

Die ADP-Ribosylierung wurde nach der Methode von ROHRER et al. (1975) (2.8.1) mit32P-NAD+ durchgeführt. Die löslichen E. coli Proteine wurden in einem 13 %igen SDS-

Polyacrylamidgel aufgetrennt und ein Autoradiogramm des gefärbten und getrockneten

Gels angefertigt. Von Alt (von H. Koch zur Verfügung gestellt) und ModA konnte

gereinigtes Protein eingesetzt werden, für ModB wurden die löslichen Proteine einer

Kultur eingesetzt, die ModB überexprimiert hatte.

Abb. 3.21 zeigt die unterschiedlichen Ribosylierungsmuster der drei T4 ADP-

Ribosyltransferasen Alt, ModA und ModB. Man erkennt, daß sich alle drei Muster

unterscheiden. In einigen Bereichen findet man Signale auf gleicher Höhe (Abb. 3.21,

Tabelle 3.4). Die Kontrolle weist ebenfalls eine markierte Bande bei ca. 70 kDa auf, was

auf eine E. coli eigene ADP-Ribosyltransferase hindeutet. Von ModA war bekannt, daß es

die α-Untereinheit der E. coli RNA-Polymerase markiert. Diese Markierung findet sich im

Gel bei einer Größe von ca. 42 kDa wieder. Außerdem vollzieht ModA eine

Autoribosylierung (Bande bei ca. 28 kDa). Die anderen markierten Proteine werden im

Moment identifiziert.

Im Rahmen seiner Diplomarbeit fand R. DEPPING (1998), daß es sich bei der durch ModB

stark markierten Bande bei ca. 70 kDa um das S1-Protein der kleinen Untereinheit der

Ribosomen handelt. Auch hier findet die Identifizierung der anderen markierten Proteine

zur Zeit statt.

Vergleichende Tests mit den unveränderten Proteinen ModA bzw. ModB aus p11modAB3

bzw. p11modBB5 und den „His-Tag“ Proteinen His-ModA und His-ModB oder dem

Fusionsprotein Trx-ModA ergaben immer identische Ribosylierungsmuster für ModA

bzw. ModB. Dies deutet darauf hin, daß der „His-Tag“ und das Thioredoxin keinen

Einfluß auf die Erkennung der Zielproteine haben und die Transferasen immer noch aktiv

sind.

Die beiden Mutanten ModA-R72K und ModA-E165D zeigten in diesem Test nur wenige

sehr schwache Banden auf dem Röntgenfilm, was auf eine niedrigere Restaktivität der

beiden Proteine schließen läßt (siehe auch 3.11).

Ergebnisse

69

Abb. 3.21 Ribosylierungsmuster von löslichen E. coli Proteinen in Gegenwart von Alt, ModA oderModB. A: 13% SDS-Polyacrylamidgel mit Coomassie Brillantblau gefärbt. B:Autoradiogramm von A. Die Expositionsdauer für Alt betrug 4 Tage, die der anderenSpuren 9 Tage. Die starke Markierung auf der Höhe der S1-Untereinheit in der Alt Spurstammt von der Autoribosylierung von Alt. Ob das S1 Protein auch von Alt ribosyliertwird, wird zur Zeit noch untersucht.

Tabelle 3.4 Molekulargewichte der durch ModA oder ModB markierten Proteinbanden. Wennbekannt, wurden die entsprechenden Proteine in Klammern angegeben.

ModA ModB79 kDa 72 kDa

(S1-Untereinheit)56 kDa 50 kDa50 kDa 46 kDa42 kDa

(α–Untereinheit)42 kDa

35 kDa 36 kDa28 kDa

(Autoribosylierung ModA)29 kDa

22 kDa 28 kDa14 kDa 27 kDa

22 kDa21 kDa14 kDa

Es wurde ebenfalls untersucht, ob es im Zusammenspiel der drei ADP-Ribosyltransferasen

zu synergetischen Effekten kommt. Dazu wurden die Ribosylierungsmuster der einzelnen

Transferasen mit den Mustern verglichen, die entstehen wenn mehr als eine Transferase im

Reaktionsansatz tätig ist. In Abb. 3.22 ist das Ergebnis dieses Versuchs wiedergegeben.

Ergebnisse

70

Man erkennt, daß sich die Bandenmuster lediglich aufaddieren, und es zu keiner neuen

Markierung kommt. Daraus folgt, daß alle drei ADP-Ribosyltransferasen unabhängig

voneinander agieren und keine auf die Anwesenheit der anderen angewiesen ist.

Abb. 3.22 Vergleich der Ribosylierungsmuster von Alt, ModA und ModB sowie die Muster nachEinsatz von Kombinationen dieser Proteine. A: 13% SDS-PolyacrylamidgelCoomassie Brillantblau gefärbt. B: Autoradiogramm von A. Als Marker wurde eine10 kDa Leiter verwendet, außerdem sind die Positionen der Untereinheiten der E. coli

RNA-Polymerase angegeben.

3.14 Bestimmung der ADP-Ribosyltransferase Aktivität von ModA

3.14.1 Herstellung von p-Nitrobenzylidin-aminoguanidin

Über einen photometrischen Test sollten die Werte für die Michaelis Konstante (KM) und

die Reaktionsgeschwindigkeit (Vmax) ermittelt werden. Für diesen Test mußte zunächst das

Substrat p-Nitrobenzylidin-aminoguanidin (NBAG) synthetisiert werden (2.8.2.1). Zur

Überprüfung des Substrates wurde ein Absorptionsspektrum aufgenommen (Abb. 3.23). Es

fanden sich die bei SOMAN et al. (1983) angegebenen Absorptionsmaxima bei 315 nm in

0,1 N HCl und 375 nm in 0,1 N NaOH.

Ergebnisse

71

Abb. 3.23 λ-Scan von NBAG im Bereich zwischen 230 nm bis 550 nm. NBAG in 0,1 N NaOH

NBAG in Tris-Acetat pH 7,4NBAG in 0,1 N HCl

3.14.2 Bestimmung von KM und Vmax

Nachdem das NBAG für den photometrischen Aktivitätstest hergestellt war, wurde die

ADP-Ribosylierung des NBAG in Abhängigkeit zur Proteinkonzentration ermittelt. Es

ergab sich unter den gewählten Versuchsbedingungen (2.8.2) ein linearer Zusammenhang

zwischen der Absorptionsänderung und der ModA Konzentration (Abb. 3.24). Dies war

ein Hinweis darauf, daß es während des Versuchs zu keiner Limitierung der Substrate kam.

Im weiteren Verlauf zur Bestimmung von Vmax und KM wurde einmal die Konzentration an

NAD+ konstant gehalten und die Konzentration von NBAG variiert (Abb. 3.25, Abb. 3.26)

und entsprechend die Konzentration von NBAG konstant gehalten und die Konzentration

von NAD+ variiert (Abb. 3.27, Abb. 3.28). Die Absorptionsänderung wurde jeweils über

einen Zeitraum von einer Stunde ermittelt. Aus der Geradengleichung (y = mx +b) des

Lineweaver-Burk-Diagramms ergaben sich die Werte für Vmax = 1/b und KM = m/b. In

Tabelle 3.5 sind die ermittelten Werte zusammengefaßt. Unter diesen

Versuchsbedingungen ergab sich für die Abhängigkeit von NBAG ein Vmax-Wert von 5,34

mol Produkt . h-1 . mol ModA-1 und ein KM-Wert von 219 µM. Für die Abhängigkeit von

NAD+ ergaben sich für Vmax 20,04 mol Produkt . h-1 . mol ModA-1 und für KM 258 µM.

Ergebnisse

72

y = 0,0009x

R2 = 0,9955

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0,035

0,04

0,045

0,05

0 10 20 30 40 50 60

ModA (µg/ml)

∆ A

bsor

ptio

n be

i 37

0 nm

Abb. 3.24 Effekt der Enzymkonzentration auf die Rate der ADP-Ribosylierung von NBAG. DieReaktion fand über einen Zeitraum von 60 min statt. Es sind die Geradengleichungund das Bestimmtheitsmaß der Ausgleichsgeraden angegeben. (Endkonzentrationen:10 mM NAD+; 32 mM DTE; 0,4 mM NBAG; 20 mM Tris-acetat pH 7,4)

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45

[NBAG](mM)

V

(mol

Pro

dukt

/(h

* m

ol M

odA

))

Abb. 3.25 Darstellung der Reaktionsgeschwindigkeit V von ModA als Funktion der NBAGKonzentration nach Michaelis-Menten.

Ergebnisse

73

y = 0,0409x + 0,1872

R2 = 0,9986

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

-10 -5 0 5 10 15 20 25

1/[NBAG](1/mM)

1/V

(1

/(m

ol P

rodu

kt/(

h *

mol

Mod

A))

Abb. 3.26 Doppeltreziproke Darstellung der Reaktionsgeschwindigkeit V von ModA alsFunktion der NBAG Konzentration nach Lineweaver-Burk. Außerdem sind dieGeradengleichung und das Bestimmtheitsmaß der Ausgleichsgeraden angegeben.

0

5

10

15

20

25

0 1 2 3 4 5 6

[NAD] (mM)

V

(mol

Pro

dukt

/(h*

mol

Mod

A))

Abb. 3.27 Darstellung der Reaktionsgeschwindigkeit V von ModA als Funktion der NAD+

Konzentration nach Michaelis-Menten.

Ergebnisse

74

y = 0,0129x + 0,0499

R2 = 0,9986

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

0,18

-6 -4 -2 0 2 4 6 8 10

1/[NAD](1/mM)

1/V

(1

/mol

Pro

dukt

/(h

* m

ol M

odA

))

Abb. 3.28 Doppeltreziproke Darstellung der Reaktionsgeschwindigkeit V von ModA alsFunktion der NAD Konzentration nach Lineweaver-Burk. Außerdem sind dieGeradengleichung und das Bestimmtheitsmaß der Ausgleichsgeraden angegeben.

Tabelle 3.5 Vmax- und KM-Werte von ModA sowie kkat und die Spezifitätskonstante (kkat/KM)für die Substrate NBAG und NAD.

Vmax(mol Produkt . h-1 . mol ModA-1)

KM(µM)

kkat(s-1)

kkat/KM(l . mol-1 . s-1)

NBAG 5,34 219 0,00148 7NAD 20,04 258 0,005567 22

3.15 Transkriptionsversuche mit alterierter und modifizierter E. coli RNA-Polymerase

WILKENS & RÜGER (1996) konnten zeigen, daß in einem in vivo System die Transkription

von vielen frühen T4 Promotoren durch Alt ADP-ribosylierte (alterierte) E. coli RNA-

Polymerase gesteigert werden kann. Nun sollte mit in vitro Versuchen die Auswirkung

durch ModA ADP-ribosylierter (modifizierter) RNA-Polymerase auf die Transkription

untersucht werden (2.9).

Die ersten Versuche mit gereinigter E. coli RNA-Polymerase, die mit Alt

(Positivkontrolle) bzw. ModA ribosyliert wurde, und T4 Wildtyp DNA erbrachte keine

eindeutigen Ergebnisse. Eine Steigerung der Transkriptionsrate durch Alt, wie es zu

erwarten gewesen wäre, konnte in diesem System nicht nachgewiesen werden. Eine

Transkriptionskinetik von T4 DNA bzw. ausgesuchten, klonierten frühen T4 Promotoren

(2.9.1) zeigte in diesem in vitro System ebenfalls keine eindeutige Änderung in der

Transkriptionsrate. Die Kinetik wurde über 60 min aufgenommen, wobei nach 10 min Alt

Ergebnisse

75

oder ModA dem Reaktionsansatz zugesetzt wurde und die Einbaurate an α32P-UTP mit

einer Kontrollreaktion ohne Alt oder ModA verglichen wurde.

Es schien in diesem System evtl. eine weitere unbekannte Komponente, wie ein

„Mittlerprotein“ zu fehlen. Wahrscheinlicher ist aber, daß aufgrund der geringen

Reaktionsgeschwindigkeiten von ModA bzw. Alt kein Effekt auf die Transkription

gefunden werden konnte (Tabelle 4.3). Deshalb wurden E. coli Kulturen mit den

Plasmiden pET-16b (Kontrolle), p16modA7 (ModA) und pTKRI (Alt) unter induzierten

Bedingungen bis zu einer OD590 von 0,65 angezogen und geerntet. Während des

Wachstums der Bakterien sollte die RNA-Polymerase in Gegenwart des Vektors pET-16b

unverändert, in Gegenwart des Vektors p16modA7 modifiziert und bei pTKRI alteriert

vorliegen. Für die folgenden Transkriptionsexperimente wurden die Zellen aufgeschlossen

und die lösliche Proteinfraktion in unterschiedlichen Mengen eingesetzt (2.9.2). Um die

Transkription von mitgeschleppter genomischer E. coli DNA in der löslichen

Proteinfraktion zu bestimmen, wurden Kontrollversuche ohne Zugabe zusätzlicher DNA

durchgeführt. Die Versuchsansätze wurden in Hinblick auf den Einbau der hier

gemessenen Radioaktivität rechnerisch korrigiert. Die Transkription wurde mit T4 Wildtyp

DNA und mit genomischer E. coli DNA durchgeführt und verglichen. In Abb. 3.29 sind

die Ergebnisse zusammengefaßt. Man sieht für die T4 DNA, daß die alterierte RNA-

Polymerase die Transkription bei Zugabe von mehr löslichem Protein steigert. Gibt man

mehr lösliches Protein von der Kontrolle (normale RNA-Polymerase) dazu, kann man

keine Änderung feststellen, bei einer noch höheren Proteinkonzentration findet man

schließlich eine geringere Transkription. Bei der modifizierten RNA-Polymerase findet

man von Anfang an bereits eine nur geringe Transkription (ca. 30 % von Alt), die bei

Zugabe von mehr löslichem Protein auch nicht stark gesteigert werden kann. Im Vergleich

dazu sieht man bei der E. coli DNA, daß alterierte RNA-Polymerase keinen Einfluß auf die

Transkription von dieser DNA hat. Allerdings zeigt die Kontrolle aber auch keinen Einfluß

auf die Transkription, wenn man die Proteinmenge steigert. Es wäre zu erwarten gewesen,

daß bei Zugabe von mehr Protein, also auch mehr RNA-Polymerase, mehr Transkript

gebildet wird. Die Transkription mit modifizierter RNA-Polymerase zeigt hier auch wieder

den geringsten Einbau an Radioaktivität, der sich ebenfalls durch Zugabe von mehr Protein

nicht steigern läßt.

Ergebnisse

76

Abb. 3.29 Transkription von T4 DNA und E. coli DNA mit unveränderter, alterierter undmodifizierter E. coli RNA-Polymerase in löslichen E. coli Proteinrohextrakten. Imlinken Bild ist die Transkription von T4 DNA und im rechten Bild die Transkriptionvon der E. coli DNA wiedergegeben. Zum besseren Vergleich wurde die eingebauteRadioaktivität in % angegeben, wobei der höchste Wert bei 30 µg löslichem Proteinauf 100 % gesetzt wurde. Die dargestellten Ergebnisse sind Mittelwerte aus zwei bisdrei unabhängigen Untersuchungen.

Die Auswirkungen einer alterierten und modifizierten RNA-Polymerase ließen sich nicht

untersuchen, da ModA in Gegenwart des Plasmides pTKRI nicht exprimiert wurde.

Diskussion

77

4 DiskussionZur Untersuchung von Proteinen werden diese in größeren Mengen benötigt. Aus den

natürlichen Quellen können aber oft nicht ausreichend Proteine isoliert werden. Hier liefert

die Gentechnik die entsprechenden Methoden, um über Klonierung und Expression der

gewünschten Gene an die gesuchten Proteine zu gelangen. Anschließend können die

gesuchten Proteine rekombinant hergestellt und isoliert werden, um Untersuchungen mit

ihnen durchzuführen.

4.1 Klonierung von modA und modB

Für die ADP-Ribosyltransferase Mod war der Locus auf dem T4 Genom bekannt (KUTTER

et al., 1994). Mod sollte zwischen den Genen 39 und 56, genauer hinter dem frühen

Promotor P13.149 liegen. An dieser Stelle befindet sich ein Operon, das aus zwei offenen

Leserahmen besteht. Eine Homologiesuche in den Datenbanken brachte keinen Aufschluß

darüber, welche der beiden Sequenzen für eine ADP-Ribosyltransferase kodiert, da keine

signifikante Übereinstimmung zu bekannten ADP-Ribosyltransferasen gefunden werden

konnte. Erst ein Alignment über die Sekundärstruktur mit anderen ADP-

Ribosyltransferasen zeigte, daß beide Leserahmen für NAD(P)+-Arginin ADP-

Ribosyltransferasen (EC 2.4.2.31) kodieren sollen (BAZAN & KOCH-NOLTE, 1997).

Das erste Ziel dieser Arbeit war somit beide Leserahmen zu klonieren, um die

entsprechenden Proteine rekombinant herzustellen. Des weiteren sollte die Sequenz, die für

das seit langem bekannte Mod kodiert, identifiziert werden. Das bekannte gpMod ist

dasjenige, welches die E. coli RNA-Polymerase ribosyliert (SEIFERT et al., 1969; SKORKO

et al., 1977). Es bestand aber auch die Möglichkeit, daß beide Enzyme die RNA-

Polymerase ribosylieren, oder daß Mod als Heterodimer aus beiden Proteinen aufgebaut

ist.

Die Klonierung der vollständigen Gene in einen allgemeinen Klonierungsvektor

(pBluescript II) gelang nicht, was zu der Überzeugung führte, daß beide Genprodukte für

E. coli toxisch sein müssen. Nach einer Beobachtung von BOUET et al. (1994) sind viele

Gene des Phagen T4 extrem toxisch für E. coli, was eine Klonierung dieser Gene sehr

erschwert. Klonierungen des Gens modA von MOSIG et al. (1998) lieferten nur inaktive

Mutanten des Gens, was ebenfalls auf die Toxizität des Proteins hindeutete.

Diskussion

78

Eine Klonierung in Vektoren bei denen die Expression unter der Kontrolle eines T7

Promotors steht, der nicht von der E. coli RNA-Polymerase erkannt wird (DUNN &

STUDIER, 1983; HAWLEY & MCCLURE, 1983), sollte eine frühzeitige Expression der Gene

unterbinden. Die T7 RNA-Polymerase ist bei der Elongation der RNA-Ketten fünf mal

schneller als die E. coli RNA-Polymerase (CHAMBERLIN & RING, 1973; GOLOMB &

CHAMBERLIN, 1974), was eine hohe Transkriptionsrate zur Folge hat. In einigen Fällen

kann die, von der T7 RNA-Polymerase katalysierte, Transkription sogar so hoch sein, daß

die Transkription von der Wirts RNA-Polymerase nicht konkurrieren kann und die

gesamte Transkription in der Zelle nur noch durch die T7 RNA-Polymerase stattfindet

(STUDIER & MOFFATT, 1986). Bei effizienten Translationssignalen kann so innerhalb von

drei Stunden das zu exprimierende Protein 50 % oder mehr des gesamten Zellproteins

ausmachen (STUDIER & MOFFATT, 1986).

Die ersten Klonierungsversuche, mit einem Gen unter der T7 Promotor Kontrolle,

erfolgten mit den Expressionsvektoren pT7-5 und pT7-6 (TABOR & RICHARDSON, 1985).

Eine Klonierung der kompletten Leserahmen von modA bzw. modB in diese Vektoren war

ebenfalls nicht möglich. Hier liegt die „Low-Level“ Expression der Gene so hoch, daß ein

toxisches Genprodukt das Wachstum der Zellen verhindert. Diese geringe Expression

findet von stromaufwärts vom T7 Promotor liegenden Sequenzen statt, die von der E. coli

RNA-Polymerase als schwache Promotoren erkannt werden können (eine T7 RNA-

Polymerase war zu diesem Zeitpunkt nicht in den Zellen vorhanden). Selbst durch die

Einführung einer Struktur für die ρ-abhängige Transkriptionstermination, einer

poly(dA)•poly(dT) Sequenz, die bei TOMASCHEWSKI (1988) die Klonierung des für E. coli

letalen T4 Gens 49 (Endonuklease VII) erlaubte, brachte nicht den gewünschten Erfolg.

Dabei sollte mit poly(dA) in 5'→3' Richtung die Transkription um 64 % gesenkt werden,

bei einer Orientierung des poly(dT) in 5'→3' Richtung wird die Transkription nur um 23 %

gesenkt und eine poly[d(A-T)] Sequenz zeigt keine Transkriptionsänderung (SHIGESADA &

IMAI, 1982).

Auch die Generierung eines Fusionsproteins mit der GST (Vektor pGEX-3X) brachte kein

Ergebnis. Anscheinend zeigt der Vektor pGEX-3X auch eine gewisse „Low-Level“

Expression, die Expression des klonierten Gens erfolgt hier von dem induzierbaren

artifiziellen tac-Promotor von E. coli. Das GST-Mod-Fusionsprotein scheint immer noch

aktiv und somit toxisch für die Zelle zu sein.

Diskussion

79

Nach diesen ersten Klonierungsversuchen war es unwahrscheinlich, daß Mod als

Heterodimer aus den beiden Proteinen aufgebaut sein sollte, da jede Komponente für sich

aktiv ist und eine letale Wirkung auf E. coli zeigt.

Die Zugabe von ADP-Ribosyltransferase Inhibitoren (3.3) in die Selektivagarplatten sollte

die Klonierung in die oben erwähnten Vektoren ermöglichen. Dazu wurden als Inhibitoren

3-Hydroxybenzamid (für Poly-ADP-Ribosyltransferasen) und Benzoylenharnstoff (für

Mono-ADP-Ribosyltransferasen) zugesetzt. Bei 1 mM Endkonzentration sollte eine

Hemmung von > 92 % erfolgen (BANASIK & UEDA, 1994). Diese Maßnahme zeigte

allerdings keine Auswirkung auf die Klonierungsergebnisse. Es konnten keine Klone mit

vollständigen mod Genen gefunden werden. Entweder wurden die Inhibitoren nicht von

den Zellen aufgenommen oder sie wurden abgebaut. Als weitere Möglichkeit kommt noch

in Betracht, daß sie zwar inhibitorisch auf andere ADP-Ribosyltransferasen wirken, aber

keinen hemmenden Effekt auf gpModA oder gpModB zeigen.

Erst in einem stringent kontrollierten Expressionssystem (pET-Vektoren (STUDIER &

MOFFATT, 1986), pBAD-Vektoren (GUZMAN et al., 1995)) konnten beide Gene vollständig

kloniert werden. Die Stringenz der pET-Vektoren wird zum Einen durch einen T7

Promotor, der wie bereits erwähnt, nicht von der E. coli RNA-Polymerase erkannt wird,

und zum Anderen durch den direkt hinter dem T7 Promotor liegenden lac-Operator

gewährleistet (STUDIER et al., 1990). Ist der Lac-Repressor an der Operatorsequenz

gebunden, wird die „Low-Level“ Transkription, die von der E. coli RNA-Polymerase

ausgeht, reprimiert. Eine Erhöhung der Stringenz während der Expression in DE3-

Stämmen wird durch die konstitutive Expression von T7 Lysozym (Vektoren pLysS oder

pLysE) erreicht, was einen natürlichen Inhibitor der T7 RNA-Polymerase darstellt

(MOFFATT & STUDIER, 1987; STUDIER, 1991; ZHANG & STUDIER, 1997). Durch Zugabe

von IPTG fällt der Lac-Repressor von der Operatorsequenz ab und es kann von diesem

Promotor transkribiert werden (Abb. 2.3).

Bei dem, durch Arabinose induzierbaren, pBAD-Vektor erfolgt eine strikte Kontrolle der

Expression durch das AraC Dimer und die Aktivierung der Transkription durch das CAP

Protein (GUZMAN et al., 1995). Beide Komponenten steuern die Expression, die von dem

PBAD-Promotor ausgeht und gewährleisten eine stringente Kontrolle (Abb. 2.4). In diesem

Diskussion

80

Expressionssystem soll zugleich eine proportionale Steuerung der Expression durch die

Induktorkonzentration (Arabinose) möglich sein (LEE, 1980; LEE et al., 1987).

Für die anschließende Reinigung der rekombinanten Proteine (4.6) wurden unter anderem

Fusionen mit einem C-terminalen oder N-terminalen „His-Tag“ generiert.

Wegen der Toxizität von ModA bzw. ModB für E. coli wurden Überlegungen angestellt,

ob nicht ein anderes Expressionssystem verwendet werden sollte. Es bestand die

Möglichkeit ein eukaryontisches System zu verwenden. Da man hier aber oft mit „Shuttle-

Vektoren“ arbeitet, die vorher in E. coli vermehrt werden, war ein Erfolg fraglich. Gegen

das eukaryontische Expressionssystem sprachen auch die potentiellen

Glykosylierungsstellen in den beiden Proteinsequenzen: Es war nicht abzusehen, welchen

Einfluß eine mögliche Glykosylierung auf die Aktivität der Proteine haben könnte.

Eine Expression in Gram-positiven Bakterien z.B. Bacillus subtilis schien ebenfalls nicht

einfacher zu sein, da die ADP-Ribosylierung sehr unspezifisch ist und die toxische

Wirkung auch hier zur Entfaltung kommen könnte. Besonders für ModA ist hier

anzuführen, daß die α-Untereinheit der B. subtilis RNA-Polymerase ein dem Arg265

äquivalentes Arginin an der Position 261 aufweist. Dieses Arg261 könnte mit großer

Wahrscheinlichkeit ebenfalls von ModA ADP-ribosyliert werden und vielleicht toxisch für

B. subtilis sein.

4.2 Gründe für die Toxizität von ModA und ModB

Es überrascht, daß das gpAlt nicht ebenfalls eine toxische Wirkung auf E. coli hat, da im

Gegensatz zu ModA oder ModB viel mehr E. coli Proteine ADP-ribosyliert werden (Abb.

3.21). Alt kann konstitutiv exprimiert werden, ohne den Wuchs von E. coli negativ zu

beeinflussen (KOCH et al.,1995). Die Toxizität von ModA bzw. ModB muß also auf die

Ribosylierung unterschiedlicher Zielproteine zurückzuführen sein.

ModA

ModA ADP-ribosyliert beide α-Untereinheiten der RNA-Polymerase von E. coli. Durch

diese Modifikation werden keine UP-Element-abhängigen und CAP-abhängigen

Promotoren von E. coli mehr erkannt (siehe 4.8.1). Ob die Toxizität von ModA alleine auf

die Nichterkennung dieser Promotoren zurückzuführen ist, kann nur vermutet werden. Da

Diskussion

81

von ModA noch eine Vielzahl anderer Proteine modifiziert werden, die noch nicht

identifiziert sind, gibt es bis jetzt keine bessere Erklärung.

ModB

Vom T4 gpModB ist bisher nur bekannt, daß es das S1 Protein der 30S Untereinheit der

Ribosomen modifiziert (DEPPING, 1998). Der Phage T7 phosphoryliert die

Translationsinitiationsfaktoren IF1, IF2, IF3 und das S1 Protein von E. coli. Durch diese

Phosphorylierung soll der Translationsapparat des Wirtes bevorzugt die Phagen mRNA

rekrutieren (ROBERTSON & NICHOLSON, 1992). Durch eine ADP-Ribosylierung von S1

könnte ein solcher Mechanismus auch für den T4 zutreffen, zumal eine effiziente mRNA

Bindung durch die 30S Untereinheit ohne S1 nicht möglich ist (KOLB et al., 1977; BONI et

al., 1991; TZAREVA et al., 1994). Also könnte die Toxizität von ModB durch eine

verschlechterte Translation der E. coli mRNA verursacht sein. Durch ein ADP-

ribosyliertes S1 könnte die E. coli mRNA vielleicht nicht mehr an die 30S Untereinheit

geladen werden. Genauso gut könnte die ADP-Ribosylierung aber auch eine essentielle

Funktion im Stoffwechsel von E. coli stören und somit die Vermehrung der Bakterien

verhindert sein.

4.3 Expression von ModA und ModB

4.3.1 Expression von ModA und ModB aus pET-Vektoren

Für die Expression aus pET-Vektoren wird die T7 RNA-Polymerase benötigt. Es gibt

mehrere Möglichkeiten die T7 RNA-Polymerase bereitzustellen und die Expression zu

induzieren. Eine Möglichkeit besteht darin die RNA-Polymerase mittels Phagen in die

Zelle zu bekommen. Dazu werden die Phagen CE6 (λ-Derivat) bzw. mGP1-2 (M13-

Derivat) verwendet. Die Induktion der Expression mit den Phagen CE6 bzw. mGP1-2 war

nicht sehr effektiv und brachte nicht den gewünschten Erfolg. Bei der Verwendung von

CE6 konnte nur eine geringe Überexpression erreicht werden. Womöglich war die

Infektionsrate, die mit einer „MOI“ von fünf angegeben war, zu gering und nicht alle

Bakterien konnten ModA bzw. ModB produzieren. Ebenso könnte aber auch in diesem

besonderen Fall die Expression der T7 RNA-Polymerase vom Phagengenom durch die

ADP-Ribosyltransferasen gestört worden sein. Bei der Infektion mit dem M13 Phagen

mGP1-2 wurde kein Mod exprimiert. Gründe dafür konnten nicht festgestellt werden. Da

Diskussion

82

die Expression der T7 RNA-Polymerase im Phagen mGP1-2 aber unter der Kontrolle des

CAP-abhängigen lac Promotors steht, könnte eine effektive Expression der T7 RNA-

Polymerase durch eine ADP-ribosylierte E. coli RNA-Polymerase unterbunden werden

(siehe auch 4.8.1). D.h. es wird anfangs etwas T7 RNA-Polymerase gebildet, durch das

Auftreten der ersten ModA Proteine, die die E. coli RNA-Polymerase ribosylieren, kann

jedoch kein weiteres Transkript für die T7 RNA-Polymerase synthetisiert werden und die

Expression des Zielproteins bleibt gering. Es gibt keine Hypothese warum ModB nach der

Infektion von mGP1-2 nicht exprimiert wurde, da die Zielproteine von ModB und die

Folgen ihrer ADP-Ribosylierung nicht bekannt sind.

Eine bessere Alternative waren DE3-Stämme, die den λ-Phagen DE3 lysogen im Genom

tragen, hier steht die Transkription der T7 RNA-Polymerase unter der Kontrolle des

Promotors lacUV5. Die Expression aus BLR(DE3), BL21(DE3) und seinen Mutanten

C41(DE3) und C43(DE3) hat ebenfalls den Vorteil, daß diesen Stämmen die Gene lon und

ompT fehlen, die für die Lon-Protease bzw. die äußere Membran-Protease OmpT kodieren,

die die Proteine während der Reinigung degradieren könnten (GRODBERG & DUNN, 1988).

Die Expression eines beliebigen Gens in einem E. coli – T7 RNA-Polymerase System hat

jedoch meistens toxische Auswirkungen auf E. coli, auch wenn das Genprodukt selbst

nicht giftig ist. Diese Toxizität während einer Protein Überexpression soll durch die

Entkoppelung von der Transkription und der Translation verursacht werden (IOST &

DREYFUS, 1995; MAKAROVA et al., 1995). Im E. coli Stamm C41(DE3) liegt das

Grundniveau der mRNA Synthese des klonierten Gens fünf mal niedriger als bei

BL21(DE3) und unter induzierten Bedingungen sogar 10 mal niedriger (MIROUX &

WALKER, 1996). Durch diese geringere mRNA Synthese findet keine Entkoppelung von

Transkription und Translation mehr statt. Unter induzierten Bedingungen vermehren sich

plasmidtragende C41(DE3) oder C43(DE3) weiter, während BL21(DE3) ihr Wachstum

einstellen (MIROUX & WALKER, 1996). Wie die Wuchskurven in Abb. 3.12 zeigen, weist

der Stamm BL21(DE3) einen deutlichen Wuchsnachteil mit kloniertem modA oder modB

unter nicht induzierten Bedingungen auf. Dieses verzögerte Wachstum hängt

möglicherweise mit dem oben erwähnten höheren Grundniveau der mRNA Synthese des

klonierten Gens zusammen.

Diskussion

83

Nach BARIK (1997) können Transformanden mit einer hohen Basalexpression bereits an

ihrem Aussehen erkannt werden. Erscheinen Kolonien von transformierten BL21(DE3)

opak, ist die basale Expression von dem klonierten Gen hoch, sehen sie durchsichtig aus,

weisen sie nur eine sehr geringe Basalexpression auf. Diese durchsichtigen Kolonien sind

den opak wirkenden in den meisten Fällen für die Überexpression vorzuziehen.

Die Verwendung von Antibiotika zur Selektion von plasmidtragenden Bakterien bedarf

ebenfalls einiger Beachtung. So fordert der Gebrauch von Ampicillin besondere Vorsicht

bei instabilen Plasmiden, da die β-Lactamase in das Medium abgegeben und hier sehr

schnell das Ampicillin durch Spaltung inaktiviert wird. Bei einer Bakterienkultur, die ein

instabiles Plasmid trägt, können nach Zerstörung des Ampicillins Bakterien ohne Plasmid

die Kultur sehr schnell überwachsen. Dies ist um so bedeutender, da sämtliches Ampicillin

bereits gespalten ist, wenn die Bakteriensuspension erst leicht trübe ist. Eine Erhöhung der

Ampicillinkonzentration hilft in diesem Falle nicht, der Zeitpunkt der kompletten

Inaktivierung wird dadurch nur geringfügig hinausgezögert (pET System Handbuch,

Novagen).

Bei der Anzucht von ModA oder ModB in DE3-Stämmen kam es vor Induktion der

Expression gelegentlich zur spontanen Lyse der Bakterien. Eine ähnliche Beobachtung

machten auch MOSIG et al. (1998). Bakterien lysierten in Flüssigkulturen spontan, wenn

sie ein Plasmid mit dem klonierten T4 Gen srd („similar to rpoD“, ähnlich zu σ70) trugen.

Der Stamm C41(DE3) mit pET-Vektoren, die modA enthalten, wächst unter induzierten

Bedingungen nicht auf Agar-Platten, aber in Flüssigkultur mit einem Vollmedium. Auf den

Agar-Platten kommt es wahrscheinlich zu lokalen Unterversorgungen von einigen

essentiellen Substanzen, so daß die entsprechenden Gene für die Synthese dieser Stoffe

durch den CAP-Faktor aktiviert werden müssen. Dies gelingt aber durch eine ADP-

ribosylierte RNA-Polymerase nicht und es ist kein Wachstum zu verzeichnen. In

Flüssigkultur hingegen kommt es wahrscheinlich wegen der guten Durchmischung zu

keiner Limitierung dieser Substanzen und die Zellen können sich vermehren.

Aufgrund der hohen Transkriptionsrate von dem T7 Promotor aus und dem starken

Translationssignal der pET-Vektoren kam es während der Expression der Mod-Proteine

Diskussion

84

zur Bildung von Einschlußkörpern. Die Bildung von Einschlußkörpern kann von Vorteil

sein, wenn es eine effiziente Methode gibt, das Protein zu renaturieren. Isoliert man die

homogenen Einschlußkörper, kann das exprimierte Protein schon bis zu 90 % rein

vorliegen (LANGLEY et al., 1987).

4.3.1.1 Expression aus p32modA-His

Aus dem Vektor p32modA2 wurde der Vektor p32modA-His hergestellt, indem das trx

Gen eliminiert wurde. Somit sollte ein ModA Fusionsprotein gestaltet werden, das nur

einen C-terminalen „His-Tag“ trägt. Das trx wurde aus dem Vektor p32modA2 entfernt,

weil das denaturierte gpTrx-6His-ModA-6His besser an der Ni-NTA Matrix bindet als das

gp10His-ModA von p16modA7. Daraus wurde geschlossen, daß ein C-terminaler „His-

Tag“ eine bessere Bindung an der Matrix gewährleistet. Somit sollte eine bessere

Reinigung und Renaturierung über eine Ni-NTA Säule möglich sein. Um das Trx, das

nicht den gewünschten Einfluß auf die Löslichkeit hatte, nicht von dem Fusionsprotein

durch einen Proteinaseverdau nach der Reinigung zu entfernen, sollte das trx Gen aus dem

Vektor eliminiert werden. Später zeigte sich allerdings, daß das ModA-His mit dem C-

terminalen „His-Tag“ nicht besser an der Ni-NTA Matrix bindet als His-ModA. Der C-

terminale „His-Tag“ war anscheinend nicht alleine für die bessere Bindung an der Matrix

verantwortlich, sondern eher die gemeinsame Haftung des internen und C-terminalen „His-

Tags“.

Der generierte Vektor p32modA-His wies nach dem Entfernen des trx statt der 8

Nukleotide Spacer, optimal sollen 5 Nukleotide sein (GOLD, 1988; RINGQUIST et al., 1992;

CHEN et al., 1994), zwischen der SD-Region und dem Start-Codon AUG 11 Nukleotide

auf. Außerdem fehlen dem Exprimierten gpModA-His die ersten fünf Aminosäuren (Abb.

3.20), wie die entsprechende Nukleotidsequenz bei der Entfernung des trx verloren

gegangen sein könnte blieb ungeklärt. Bei dem Vorgängerplasmid (siehe auch 3.12), das

10 Nukleotide als Spacer enthielt, war keine Synthese von ModA-His nachzuweisen, da für

eine gute Translationseffizienz der Abstand zwischen der SD-Region und des Start-Codons

eine sehr wichtige Rolle spielt (CHEN et al., 1994). Die gute Expression aus dem Vektor

p32modA-His, mit den 11 Nukleotiden Spacer ist wahrscheinlich mit der guten

Übereinstimmung der sogenannten „Downstream Box“ mit der „Anti-Downstream Box“

der 16S rRNA zu erklären (SPRENGART et al., 1996). In Abb. 4.1 ist die Übereinstimmung

Diskussion

85

zwischen diesen beiden Sequenzen wiedergeben. Für eine gute Translation wird nicht

unbedingt eine SD-Region benötigt, eine gute Übereinstimmung, 7 – 8 komplementäre

Nukleotide, stromabwärts in der Nähe des Start-Codons mit der „Anti-Downstream Box“

der 16S rRNA ist für eine effiziente Proteinsynthese ausreichend (SPRENGART et al., 1996).

Position 1483 „Anti-Downstream Box“ 1469

16S rRNA A G U A C U U A G U G U U U C p32modA-His A G U A A U G C A A C U A A A A G A U U U U A A A A T A

Teil der mRNA von modA-His

oder

Position 1483 „Anti-Downstream Box“ 1469

16S rRNA A G U A C U U A G U G U U U C

p32modA-His A G U A A U G C A A C U A A A A G A U U U U A A A A T A

Teil der mRNA von modA-His

Abb. 4.1 Vergleich der „Anti-Downstream Box“ mit einem Teil der mRNA von modA-His.Die komplementären Nukleotide sind fett hervorgehoben und das Start-Codon istunterstrichen.

4.3.2 Expression von ModA aus dem pBAD-Vektor

Die Basalexpression der pBAD-Vektoren ist sehr gering und das Verhältnis von Induktion

zu Repression kann 1.200-fach sein, im Vergleich mit 50-fach bei Ptac-basierenden

Vektoren (GUZMAN et al., 1995). Da die Expression aus dem Vektor pBAD/HisB durch

die Induktormenge (Arabinose) reguliert werden kann, sollte eine Expression von ModA

aus diesem Vektor erfolgen, mit der Aussicht eine größere Menge lösliches und somit

natives ModA herzustellen.

Nach einer induzierten Überexpression von ModA und seinen Mutanten aus den Vektoren

pBADmodA2, pBADmodA2-R73K und pBADmodA2-E165D zeigte sich, daß die

rekombinanten Proteine zu keinem detektierbaren Anteil exprimiert wurden. Dies ist

wahrscheinlich darauf zurückzuführen, daß das Arg265 der α-Untereinheit der E. coli RNA-

Polymerase, welches ADP-ribosyliert wird, essentiell für die Erkennung von UP-Element

und CAP-abhängigen Promotoren ist (GAAL et al., 1996) (siehe auch 4.8.1). Da die

Transkription von dem Promotor PBAD CAP-abhängig ist, könnte dieser nach den ersten

gebildeten ModA Proteinen durch eine Ribosylierung der RNA-Polymerase nicht mehr

erkannt werden. Einen Hinweis auf die Richtigkeit dieser Vermutung liefert auch, daß eine

rpoA (Gen der α-Untereinheit) Mutante nicht auf Arabinose Medium wachsen kann. Die

Diskussion

86

verantwortliche Mutation befindet sich bei der Aminosäure Lys271 (GIFFARD & BOOTH,

1988), also in unmittelbarer Nähe des Arg265.

Da die beiden Mutanten immer noch eine schwache Ribosylierungsaktivität aufweisen,

schalten auch diese evtl. den Promotor durch eine ADP-Ribosylierung der RNA-

Polymerase aus. Wahrscheinlich könnte eine ModA Doppelmutante R73A, E165A, die

vollständig inaktiv sein sollte, von diesem Plasmid aus in einer löslichen Form exprimiert

werden.

Die Wuchskurven in Abb. 3.15 zeigen einen deutlichen Einfluß des Gens modA unter

induzierten Wuchsbedingungen. Die entsprechende Wuchskurve weist einen deutlich

flacheren Verlauf im Vergleich zum leeren Vektor auf. Dies könnte bedeuten, daß ModA

exprimiert wurde, die Mengen aber zu gering waren, um eine Expression erkennen zu

können.

4.4 Vermeidung von Einschlußkörpern

ModA lag nach der Expression aus den pET-Vektoren durchweg in Form von

Einschlußkörpern vor. Da es zu dieser Zeit noch keine effizienten Protokolle für die

Renaturierung von ModA gab und die ersten Versuche, die mit 7 M GuHCl denaturierten

Proteine zu renaturieren, nicht sehr effektiv waren, wurde versucht die Bildung der

Einschlußkörper zu vermeiden.

Die Hauptparameter, die zur Bildung von Einschlußkörpern führen sind in abnehmender

Reihenfolge die mittlere Ladung der Aminosäuren (Nettoladung/Anzahl der

Aminosäuren), die „Turn“ bildenden Aminosäurereste, der Cysteingehalt, der Prolingehalt,

die Hydrophilizität und die Gesamtanzahl der Aminosäuren (WILKINSON & HARRISON,

1991). Die Ergebnisse der Auswertung nach diesen Kriterien zur Löslichkeit bzw.

Unlöslichkeit von Proteinen sind jedoch nicht immer ganz eindeutig. Nach SCHEIN &

NOTEBORN (1988) gibt es auch keinen Zusammenhang zwischen der Bildung von

Einschlußkörpern und der Proteinkonzentration oder der Produktionsrate. Faktoren, die die

Löslichkeit direkt beeinflussen sind möglicherweise mehr mit der Sekundärstruktur

verbunden als mit der Aminosäurezusammensetzung des Proteins (SCHEIN, 1989). Die cis-

trans Isomerisierung der Prolinreste könnte der limitierende Schritt während der Faltung

verschiedener Proteine sein (SCHEIN, 1989). Die Faltung zum nativen Protein kann somit

mehrere Minuten dauern (GUISE et al., 1996). Für ModA sollte die Faltung des Proteins

allerdings schnell vonstatten gehen, da zwei Minuten nach der T4 Infektion bereits aktives

Diskussion

87

ModA nachzuweisen ist. Durch eine hohe Translationsrate kommt es aber zu vielen

Faltungsintermediaten, die hydrophobe Oberflächen exponieren, wodurch die Proteine

aggregieren könnten (MITRAKI et al., 1987; MITRAKI & KING, 1989).

Rekombinante Proteine aggregieren oft, wenn E. coli bei 37° C kultiviert wird. Eine

Reduktion der Temperatur auf 30° C kann häufig eine Zunahme der nativen Proteine

bewirken, da die Rate der Proteinsynthese herabgesetzt ist (SCHEIN & NOTEBORN, 1988).

Im Falle von ModA brachte auch eine Kultivierung bei 16° C keine Verbesserung der

Expression von löslichem ModA.

Sollten die zu exprimierenden Proteine Faltungshelfer in Form von Chaperonen benötigen,

werden diese während der Expression ausgedünnt und können nicht mehr alle

neusynthetisierten Proteine bei ihrer Faltung in die native Form unterstützen. Die Co-

Überexpression von Chaperonen kann somit zu einer Erhöhung des nativen Proteins

beitragen (GOLOUBINOFF et al., 1989; BUCHNER et al., 1991; BLUM et al., 1992). Der

nützliche Effekt der Chaperone ist allerdings nicht vorhersagbar, so daß die passende

Substrat-Chaperon Kombination erst herausgefunden werden muß (YASUKAWA et al.,

1995). So konnten BLUM et al. (1992) mit der Coexpression von DnaK die Löslichkeit des

menschlichen Wachstumshormons steigern und die Bildung von Einschlußkörpern

verringern. Die Coexpression von GroEL und GroES hingegen hatte keinen Einfluß auf die

Löslichkeit dieses Proteins. Mit der Coexpression der Hitzeschockproteine GroEL und

GroES war es aber möglich, die Ribulose-bisphosphat Carboxylase Oxigenase (Rubisco)

in ihrer nativen Form zu exprimieren. Diese Chaperone scheinen notwendig für den

Zusammenbau der Untereinheiten zu sein (GOLOUBINOFF et al., 1989).

Da die Chaperone in einer aufeinanderfolgenden Art und Weise zusammenarbeiten

(LANGER et al., 1992), könnte die Coexpression nur eines Chaperons nicht ausreichen, um

die Faltung in den nativen Zustand zu gewährleisten. So zeigte die Coexpression von

DnaK mit His-ModA oder Trx-ModA keinen erkennbaren Anstieg an löslichen

rekombinanten Protein. ModA scheint für die Faltung in den nativen Zustand nicht an das

Vorhandensein von DnaK angewiesen zu sein. Bei der Coexpression von GroEL und

GroES wurde kein ModA mehr exprimiert. Worauf dieses Phänomen zurückzuführen sein

könnte ist nicht bekannt. Es könnten Inkompatibilitäten zwischen den beiden Plasmiden

gewesen sein, oder durch die Anwesenheit des Vektors pGroESL waren die Vektoren mit

modA noch instabiler und wurden schneller von den Bakterien verloren.

Diskussion

88

Die Fusion mit einem hydrophilen Protein wie Thioredoxin (Trx) kann auch die

Löslichkeit erhöhen. So konnten mehrere Proteine, die vorher als Einschlußkörper

vorlagen, als Trx-Fusionsprotein löslich und in aktiver Form exprimiert werden (LAVALLIE

et al., 1993; HLAVAC & ROUER, 1997). Dabei weist das Trx noch andere nützliche

Eigenschaften auf. Es ist sehr hitzestabil und so kann eine Vorreinigung durch

Denaturierung bei 80° C von kontaminierenden E. coli Proteinen erfolgen. Durch einen

schnellen osmotischen Schock werden die Proteine Trx und EF-Tu aus der Zelle freigesetzt

und liegen somit nur mit wenigen Verunreinigungen vor. Im vorliegenden Fall ist die

Aggregationsfähigkeit des rekombinanten Proteins Trx-ModA anscheinend größer als die

Löslichkeit des Trx, da bei der Überexpression wieder nur Einschlußkörper gebildet

wurden. Warum ModA so stark zur Aggregation neigt ist unbekannt, zumal es keinen

ausgesprochen hydrophoben Charakter aufweist (Abb. 3.2).

Manche Proteine werden erst durch die Bildung von Disulfidbrücken stabilisiert, deren

Bildung im reduzierend wirkenden Cytoplasma von E. coli allerdings unterbunden ist.

ModA weist drei Cysteine in der Aminosäuresequenz auf, womit eine Disulfidbrücke

gebildet werden könnte. ModA sollte aber keine Disulfidbrücke aufweisen, da das

Cytoplasma von E. coli der Bereich ist, in dem ModA nach einer T4 Infektion gebildet

wird. Somit sollte auch ohne diese kovalente Bindung eine stabile, lösliche Struktur

gebildet werden können.

Die Sekretion von Proteinen in das Kulturmedium verhindert in manchen Fällen ebenfalls

die Bildung von Einschlußkörpern. Verwendet man ein porenbildendes Protein wie das

Bakteriocinfreisetzungsprotein (BRP), werden auch keine Signalsequenzen für den

Durchtritt durch die Zellwand benötigt. Dabei können die Proteine nicht nur aus dem

periplasmatischen Raum, sondern auch aus dem Cytoplasma freigesetzt werden (VAN DER

WAL et al.,1995). Während der Überexpression von ModA in Gegenwart des BRP konnte

keine Freisetzung von ModA in das Medium beobachtet werden, obwohl die Expression in

diesem System gut funktioniert hat, was man an der Menge des gebildeten ModA, das als

Einschlußkörper vorlag, sehen konnte. Es wurden jedoch eine Anzahl anderer Proteine im

Kulturüberstand gefunden. Ob diese freigesetzten Proteine nur aus dem Periplasma oder

auch aus dem Cytoplasma stammen ist unbekannt. Wenn auch aus dem Cytoplasma die

Proteine ausgeschleust wurden, was nach VAN DER WAL et al. (1995) geschieht, scheint

ModA schneller zu aggregieren, evtl. schon bei der Synthese an den Ribosomen, als daß es

aus der Zelle ausgeschleust werden könnte.

Diskussion

89

MOORE et al. (1993) konnten die Bildung von Einschlußkörpern verhindern, indem sie ein

angereichertes Vollmedium (Trypton-Phosphat-Medium (2.5.1)) verwendeten.

Verschiedene T4-Proteine, wie die dCMP Deaminase, eine Endonuklease und andere

Proteine, konnten mit diesem Medium in löslicher und aktiver Form aus pET-Vektoren

exprimiert werden, was mit anderen Vollmedien nicht gelang. Dieses Medium ist

zusätzlich mit Phosphat gepuffert, da die Kontrolle des pH Wertes auch einen

entscheidenden Einfluß auf die Bildung von Einschlußkörpern hat. Die Bildung von

Einschlußkörpern nimmt zu, wenn der pH Wert sinkt, da der intrazelluläre pH den

Faltungsprozeß und die Konformation von Proteinen beeinflußt (STRANDBERG & ENFORS,

1991). Aber auch mit diesem Medium gelang es nicht, ModA in löslicher Form zu

exprimieren, selbst wenn man alle Parameter, die die Bildung von nativem Protein fördern,

wie niedrige Anzuchttemperatur, geringe Induktormenge und kurze Expressionszeit

zusammen anwendete.

4.5 Renaturierung von denaturierten Proteinen

Da die Bildung der Einschlußkörper durch keine der verwendeten Maßnahmen

unterbunden werden konnte, mußte versucht werden, die denaturierten Proteine in vitro zu

renaturieren. Das Auflösen und Renaturieren der Einschlußkörper kann ein limitierender

Faktor für die effiziente Herstellung von aktiven Proteinen aus E. coli sein. Da es keine

allgemeingültigen Regeln für eine effiziente Renaturierung gibt, muß für jedes Protein eine

neue Strategie gefunden werden. Dabei wird die Effizienz der Rückfaltung durch die

Proteinsequenz, dem Redoxpotential, dem Lösungsmittel, dem pH-Wert, der Ionenstärke

und der Konzentration des denaturierten Proteins beeinflußt (KOPETZKI et al., 1989).

Normalerweise werden Einschlußkörper in hohen Konzentrationen von chaotropen

Agenzien wie Harnstoff oder Guanidinium Hydrochlorid (GuHCl) aufgelöst. Dabei

stabilisiert Harnstoff den ungefalteten Zustand der Proteine, während GuHCl die

Wasserstoffbindungen stört und dadurch die Proteinstruktur auflöst (SCHEIN, 1990). Die

Verwendung von GuHCl ist dem Harnstoff jedoch vorzuziehen, da Harnstoff bei der

Zersetzung Isocyanate bilden kann und freie Amino- oder Thiolgruppen der Proteine

dadurch irreversibel geschädigt werden (HAGEL et al., 1971).

Wie oben dargelegt, spielt die Konzentration des denaturierten Proteins eine Rolle bei der

Renaturierung. Bei der Renaturierung entstehen Faltungsintermediate, bei denen

Diskussion

90

hydrophobe Bereiche noch an der Oberfläche liegen. Ist die Konzentration der Proteine zu

hoch, können diese Faltungsintermediate über diese hydrophoben Bereiche interagieren

und fallen dabei häufig aus. Diverse Versuche mit GuHCl denaturiertes ModA über

Dialyse oder Verdünnung zu renaturieren, brachten nur minimale Ausbeuten an löslichem

Protein (3.9). Wurden die verdünnten Proteinlösungen zentrifugiert, fand man einen

Proteinniederschlag. Wurde der Überstand danach eingeengt, viel noch einmal ein Teil des

Proteins aus.

Durch die Immobilisierung der „His-Tag“-Proteine an eine Ni-NTA Matrix können diese

effizient renaturiert werden, indem man das denaturierende Agens im Waschpuffer immer

weiter verdünnt (HOLZINGER et al., 1996; SHI et al., 1997). Der Erfolg beruht

wahrscheinlich darauf, daß die Proteine voneinander getrennt sind und es somit kaum zu

Protein-Protein Interaktionen kommen kann, die zu einer Aggregation der Proteine führen.

Für die Proteine ModA und ModB war diese Art der Renaturierung allerdings nur sehr

bedingt anwendbar, da trotz „His-Tag“ die denaturierten Proteine aus unbekannten

Gründen nur sehr schlecht an dem Säulenmaterial banden, und somit die Ausbeute an

renaturiertem Protein sehr gering war.

Eine weitere Methode, die die Rückfaltung von in GuHCl denaturierten Proteinen über

eine Gelfiltrations Chromatographie beschreitet (WERNER et al., 1994; CHAUDHURI et al.,

1996) wurde hier nicht angewendet, da die Mod Proteine selbst stark verdünnt noch zur

Aggregation neigen, und die Gefahr bestand, daß die Säule verstopft.

Es ist nur wenig über die strukturellen Eigenschaften der Einschlußkörper bekannt. OBERG

et al. (1994) konnten aber zeigen, daß die Einschlußkörper einen gewissen Anteil an

Sekundärstrukturen aufweisen. Durch die Denaturierung mit GuHCl oder Harnstoff

verlieren die Proteine ihre Sekundärstruktur (DILL & SHORTLE, 1991), die sie während der

Synthese an den Ribosomen bereits gebildet haben (PRZYBYCIEN et al., 1994; OBERG et al.,

1994). Dies ist einer der Hauptgründe für die schlechte Ausbeute der Wiederherstellung

des nativen Proteins aus Einschlußkörpern. MITRAKI et al. (1987) zeigten für die

3-Phosphoglycerat Kinase, daß schon bei einer Konzentration von 0,7 M GuHCl im Puffer,

eine Rückfaltung des Proteins zur nativen Form nur noch bedingt möglich ist. Sie konnten

ebenfalls zeigen, daß nach einer Renaturierung zwar sämtliche β-Strukturen wieder

vorhanden waren, aber 29 % der α-Helices ungefaltet blieben.

Diskussion

91

KHAN et al. (1998) nahmen an, daß die Renaturierung effektiver sein sollte, wenn man die

Sekundärstrukturen während der Lösung der Einschlußkörper nicht auflöst. Sie konnten

zeigen, daß man die Einschlußkörper bei einem pH von 12,0 und 2 M Harnstoff auflösen

kann, ohne die nativ-ähnliche Sekundärstruktur zu zerstören und die Rückfaltung zum

nativen Protein eine höhere Ausbeute erreicht, als es mit den herkömmlichen Methoden

mit hohen Konzentrationen von Harnstoff oder GuHCl möglich war.

So konnten selbst bei hohen Proteinkonzentrationen von bis zu 1 mg/ml für His-ModA

bzw. 3 mg/ml für Trx-ModA die Proteine mit hoher Ausbeute renaturiert werden (3.9.2).

ModA scheint allerdings nicht sehr stabil zu sein, da nach einigen Tagen Lagerung bei

-20° C ein Teil der Proteine ausfällt. Nach früheren Beobachtungen wußte man bereits, daß

ModA in vivo ebenfalls sehr instabil ist (GOFF, 1974; HORVITZ, 1974b). Nichts desto trotz

hat man mit diesem Verfahren der Renaturierung nun eine Methode in der Hand größere

Mengen ModA in aktiver Form zu gewinnen. So liegt die Ausbeute von angereicherten

ModA (isolierte Einschlußkörper mit ca. 90 % ModA) bei etwa 70 mg aus einer 500 ml

Expressionskultur.

4.6 Reinigung von ModA

Zur Reinigung der „His-Tag“ Proteine wurde die von PORATH et al. (1975; PORATH, 1992)

eingeführte immobilisierte Metallchelat-Affinitätschromatographie (IMAC) verwendet.

Diese Methode nutzt die starke Affinität von zweiwertigen Ionen wie Ni2+ zu

aufeinanderfolgenden Histidinresten (6 – 10 Stück) aus. Die gebundenen Proteine können

anschließend mit Imidazol oder bei pH 6,0 eluiert werden. Hierbei ist es möglich, ein

Protein in einem Schritt von weniger als 1 % Gesamtprotein auf über 95 % Homogenität

aufzureinigen (JANKNECHT et al., 1991). Die Aufreinigung unter denaturierenden

Bedingungen vermindert den Anteil an Fremdproteinen, da es zu keinen Protein-Protein

Interaktionen kommen kann, wie es unter nativen Bedingungen möglich ist (LEGRICE &

GRÜNINGER-LEITCH, 1990). Für die effiziente Reinigung des rekombinanten Proteins

ModA wurde eine N-terminale Fusion mit einer 10-Histidin-Sequenz („His-Tag“) oder

eine C-terminale Fusion mit einer 6-Histidin-Sequenz generiert. Die Reinigung unter

denaturierenden Bedingungen über eine Ni-NTA Säule war wie schon dargelegt nicht sehr

effektiv. Es wurde vermutet, daß evtl. der „His-Tag“ nicht mit exprimiert wurde. Das

Vorhandensein des „His-Tags“ wurde mit einem Ni-NTA Konjugat überprüft. Wie Abb.

3.16 zeigt, konnte der „His-Tag“ eindeutig nachgewiesen werden. Da ein Ni-NTA

Diskussion

92

Konjugat, also praktisch die gleiche Erkennung des „His-Tags“, wie an einer Ni-NTA

Matrix verwendet wurde, ist es nicht einsichtig, warum die Proteine nicht ebenfalls an der

Matrix binden.

Es sind zur Zeit mit ModA und ModB vier Proteine bekannt, die unter denaturierenden

Bedingungen nicht an Ni-NTA binden. Es bestand aber die Möglichkeit, daß ModA bzw.

ModB, wie die anderen beiden Proteine, unter nativen Bedingungen gereinigt werden

können (STEINERT persönliche Mitteilung (Firma Qiagen)). Mit der effizienten

Renaturierungsmethode (3.9.2) lag ausreichend natives His-ModA für eine Reinigung

unter nativen Bedingungen vor. Das renaturierte His-ModA bindet allerdings nicht mit den

Kapazitäten (5 – 10 mg Protein pro ml Säulenmaterial) wie der Hersteller sie angibt,

jedoch sehr viel besser als das denaturierte Protein an der Ni-NTA Matrix. Nach erfolgter

Elution von der Säule kann man eine Reinheit von 95 % und darüber erzielen (Abb. 3.17).

4.7 Mutanten von ModA und ModB

Nicht alle Aminosäuren eines Proteins sind für die katalytische Aktivität notwendig. Durch

ortsspezifische Mutagenese können die funktionellen und somit für die Katalyse

essentiellen Aminosäuren ermittelt werden. Das Alignment einiger ADP-

Ribosyltransferasen (Abb. 1.9) zeigt konservierte Aminosäuren auf, die für die Funktion

des Enzyms relevant sein sollen. Wie in der Einleitung erläutert, zeigen alle bekannten

Strukturen der ADP-ribosylierenden Toxine eine Aushöhlung, in der die NAD+-Bindestelle

lokalisiert ist. Diese Mulde besteht aus 18 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, die eine α-

Helix über ein β-Faltblatt bildet (Abb. 4.2). Diese Struktur wird von anderen β-Strängen

flankiert, die die katalytischen Seitenketten tragen. Dabei geht diese konservierte

dreidimensionale Struktur aber nicht auf konservierte Aminosäuren zurück. Für die

Cholera Toxin Gruppe ist ein Arginin in β1 hoch konserviert (Abb. 1.9). Ein konservativer

Austausch des nukleophilen Arginins gegen Lysin eliminiert die enzymatische Aktivität,

da das Lysin bei einem physiologischen pH protoniert vorliegt und somit keine Interaktion

mit der Amidgruppe des Nicotinamid vom NAD+ eingehen kann (LOBET et al., 1991;

BURNETTE et al., 1991). Eine weitere vollständig konservierte Aminosäure, die bei allen

ADP-Ribosyltransferasen zu finden ist, ist das Glutamat in β5 (Abb. 1.9). In vielen

Proteinen ist dieser Rest so wichtig, daß nicht einmal ein konservierter Austausch zu

Aspartat für die Enzymaktivität toleriert werden kann (TWETEN et al., 1985; PIZZA et al.,

1988).

Diskussion

93

Abb. 4.2 Schemazeichnung der NAD+-Bindetasche, die in allen ADP-Ribosyltransferasen vorhanden sein soll. Gezeigt wird die Interaktion desNicotinamidringes mit dem konservierten Arg/His Rest. Das katalytischessentielle Glu ist ebenfalls angegeben. (nach DOMENIGHINI et al., 1994)

In Tabelle 4.1 sind einige Untersuchungen aufgelistet, in denen die oben beschriebenen

katalytisch essentiellen Aminosäurereste durch ortsspezifische Mutagenese verifiziert

wurden. Nach diesen Ergebnissen und dem Alignment (Abb. 1.9) sollten für ModA die

Aminosäuren Arg72 und Glu165 an der Katalyse beteiligt sein, für ModB entsprechend

Arg73 und Glu173. In beiden Fällen wurden konservative Austausche der Aminosäuren

vorgenommen, d.h. Arg wurde gegen Lys und Glu gegen Asp ausgetauscht (3.11). Der

Austausch erfolgte über eine PCR, in der komplementäre Primer eingesetzt wurden, die die

Mutation tragen (2.6.4). Der Elternstrang wurde mit dem Restriktionsenzym DpnI, das

methylierte und hemimethylierte DNA erkennt, verdaut, so daß hauptsächlich der

neusynthetisierte und mutagenisierte Vektor für eine Amplifikation in E. coli transformiert

wurde. Eine Sequenzierung der Plasmide bestätigte die erfolgreiche Mutagenese.

Diskussion

94

Tabelle 4.1 Katalytisch aktive Aminosäuren einiger ADP-Ribosyltransferasen, die durchMutageneseexperimente identifiziert wurden.

Enzym(Organismus)

katalytischaktive

Aminosäure

Referenz

Diphtherie Toxin(Corynebacterium diphtherie)

His-21 PAPINI et al., 1989

Diphtherie Toxin(Corynebacterium diphtherie)

Glu-148 CARROLL & COLLIER, 1984;TWETEN et al., 1985

Exotoxin A(Pseudomonas aeruginosa)

His-440 CARROLL & COLLIER, 1988

Exotoxin A(Pseudomonas aeruginosa)

Glu-553 CARROLL & COLLIER, 1987;DOUGLAS & COLLIER, 1987

Pertussis Toxin(Bordetella pertussis)

Arg-9 BURNETTE et al., 1988

Pertussis Toxin(Bordetella pertussis)

Glu-129 BARBIERI et al., 1989ANTOINE et al., 1993

hitzelabiles Enterotoxin(Escherichia coli)

Arg-7 LOBET et al., 1991

hitzelabiles Enterotoxin(Escherichia coli)

Glu-112 TSUJI et al., 1991CIEPLAK et al., 1995

C2 Toxin(Clostridium botulinum)

Arg-299 BARTH et al., 1998

C2 Toxin(Clostridium botulinum)

Glu-389 BARTH et al., 1998

Iota Toxin(Clostridium perfringens)

Arg-295 PERELLE et al., 1996

Iota Toxin(Clostridium perfringens)

Glu-378Glu-380

PERELLE et al., 1996

C3-ähnliches Toxin(Clostridium botulinum)

Glu-174 AKTORIES et al., 1995

Cholera Toxin(Vibrio cholerae)

Arg-7 BURNETTE et al., 1991

Cholera Toxin(Vibrio cholerae)

Glu-112 TSUJI et al., 1991

Mono-ADP-Ribosyltransferase(Kaninchen)

Glu-240 TAKADA et al., 1995

Poly-ADP-Ribosyltransferase(Mensch)

Glu-988 MARSISCHKY et al., 1995

ModA(Bakteriophage T4)

Arg-72 diese Arbeit

ModA(Bakteriophage T4)

Glu-165 diese Arbeit

ModB(Bakteriophage T4)

Arg-73 diese Arbeit

ModB(Bakteriophage T4)

Glu-173 diese Arbeit

Diskussion

95

Für eine schnelle und einfache Überprüfung der Aktivität der Mutanten von ModA und

ModB wurde der Plasmidstabilitätstest (STUDIER & MOFFATT, 1986; STUDIER et al., 1990)

modifiziert (2.5.4.3). In diesem Test macht man sich die Toxizität von ModA bzw. ModB

zu Nutze. Sind die entsprechenden Plasmide in den Stamm C41(DE3) transformiert, findet

man keine Koloniebildung auf IPTG-haltigen Agar-Platten. Die Bakterien bilden erst

Kolonien, wenn durch eine Mutation die toxischen Proteine nicht mehr gebildet werden

oder die Proteine selbst durch eine Mutation in ihrer Aktivität eingeschränkt sind.

Vergleicht man dann noch die Größe der Kolonien auf induzierenden und nicht

induzierenden Agar-Platten hat man einen guten Anhaltspunkt auf die Aktivität der

einzelnen Mutanten (Tabelle 3.3). So lag die Koloniegröße der generierten Mutanten unter

induzierten Bedingungen bei ca. 50 % von der unter nicht induzierten Bedingungen. Dies

bedeutet, daß die konservativen Austausche in ModA bzw. ModB zu keiner totalen

Inaktivierung der Proteine geführt haben, deren Aktivität aber so stark abgenommen hat,

daß sich Kolonien bilden konnten. Erst bei einem nicht konservativen Austausch des Arg72

zu Ala bei ModA findet man Kolonien gleicher Größe (NIVINSKAS persönliche

Mitteilung). Dies bedeutet, daß in diesem Fall wahrscheinlich keine Restaktivität von

ModA mehr zu verzeichnen ist. Beim Austausch des Glu165 gegen Ala bei ModA findet

sich keine vollständige Inaktivierung des Enzyms. Mit einer Koloniegröße von 70-80 %

liegt diese aber über der von der Mutante E165D. Also scheint hier die Aktivität durch

diesen nicht konservativen Austausch weiter gesunken zu sein. Einen größeren Einfluß auf

die Katalyse scheint das in unmittelbarer Nähe liegende Glu163 zu haben. Bei der Mutation

E163A wird ModA anscheinend vollständig inaktiviert. Aminosäureaustausche gegen

Alanin an den ebenfalls konservierten Aminosäuren Ser109, Phe127 und Phe129 in β2 bzw.

β3 (Abb. 1.9) scheinen ModA ebenfalls vollständig zu inaktivieren (Tabelle 3.3).

Bei Mutageneseuntersuchungen sollte man aber immer bedenken, daß ein einzelner

Aminosäureaustausch auch dazu führen könnte, daß ein Protein seine Tertiärstruktur

verliert und eine andere Konformation einnimmt. Dies würde wahrscheinlich ebenso eine

Inaktivierung des Proteins anzeigen, obwohl die entsprechende Aminosäure nicht an der

Katalyse beteiligt ist, sondern lediglich die Struktur des Proteins verändert wurde.

So zeigt die Sekundärstruktur Vorhersage der Mutanten ModA_E165D und ModA_E165A

in der Nähe der Mutation einen gravierenden Wechsel von einer α-Helix zu einem

β-Faltblatt (Abb. 4.3). Da die Mutante ModA_E165D in dem Plattentest aber noch eine

Restaktivität aufweist, scheint die Tertiärstruktur nicht wesentlich anders zu sein als beim

Diskussion

96

Wildtyp ModA. Somit scheint die Sekundärstruktur Vorhersage an dieser Stelle nicht ganz

zu stimmen. Bei der Mutante ModA_E165A liegt fast die gleiche Sekundärstruktur

Vorhersage vor wie beim Wildtyp, also wahrscheinlich auch die gleiche Tertiärstruktur.

Der Ausfall der Aktivität deutet darauf hin, daß Glu165 an der Katalyse beteiligt ist. Eine

letzte Sicherheit, daß diese oben genannten Aminosäuren an der Reaktion involviert sind,

könnte eine Kristallisation von ModA liefern. Aber auch die Cirkulardichroismus (CD)

Spektroskopie kann Anhaltspunkte darüber liefern, ob durch eine eingefügte Mutation sich

der Anteil an Helices oder Faltblättern verändert hat (FLANDERS et al., 1984; STRZELECKA-

GOLASZEWSKA et al., 1985).

ModA_Wildtyp141EYNPNFKFPDSHRYRNMELVSDEQEVMIPAGSVFRIADRYEYKKCSTYTIYTLDFEGFNL

ccccccccccccchhhhhhhcchhhhccccccceeeeceeccccccceeeeeecccceec

ModA_E165D141EYNPNFKFPDSHRYRNMELVSDEQDVMIPAGSVFRIADRYEYKKCSTYTIYTLDFEGFNL

ccccccccccccceeeeeeeecchhhhhccccceeeeceeccccccceeeeeecccceec

ModA_E165A141EYNPNFKFPDSHRYRNMELVSDEQAVMIPAGSVFRIADRYEYKKCSTYTIYTLDFEGFNL

ccccccccccccchhhhhhhhhhhhhhhccccceeeeceeccccccceeeeeecccceec

Abb. 4.3 Unterschiede in den Sekundärstruktur Vorhersagen von ModA_E165D undModA_E165A zum Wildtyp ModA. Die mutierte Aminosäure ist in Fettdruckhervorgehoben. Die Vorhersage erfolgte nach dem Algorithmus von GARNIER et al.

(1996).h: α-Helix; e: β-Faltblatt; c: ungeordnete Struktur

4.8 ADP-Ribosylierung durch ModA und ModB

Der erste Aktivitätstest nach ROHRER et al. (1975) mit löslichen Proteinrohextrakten einer

Überexpression zeigte, daß beide Proteine ADP-Ribosyltransferasen sind und nur das

Protein des zweiten Leserahmens die RNA-Polymerase markierte (Abb. 3.10). Somit

besitzt der Bakteriophage T4 nicht zwei, sondern drei ADP-Ribosyltransferasen, das Alt-,

das ModA- und das ModB-Protein. In diesem ersten Test wurden sehr wenige Proteine

radioaktiv markiert, was wahrscheinlich an der geringen Menge an löslichem Mod, einer

für so wenig Protein kurzen Reaktionszeit und an einer kurzen Exposition liegen könnte.

Bei nachfolgenden Aktivitätstests mit gereinigtem Enzym zeigten sich im

Autoradiogramm mehrere markierte Banden (Abb. 3.21). Diese Vielfalt der Markierungen

konnte in weiteren Versuchen mit löslichen Proteinüberständen ebenfalls nachvollzogen

Diskussion

97

werden. Die Generierung der zusätzlich markierten Banden liegt also nicht an einer

veränderten Faltung der Proteine nach der Renaturierung der Einschlußkörper, sondern

sind vielmehr eine Auswirkung der Konzentration an aktivem Protein.

Von den Proteinen, die durch ModA modifiziert werden, ist zur Zeit nur eines bekannt, die

α-Untereinheit der E. coli RNA-Polymerase und für ModB ist im Moment nur das S1

Protein der Ribosomen identifiziert. Inwiefern die anderen Markierungen auf die

Unspezifität der ADP-Ribosyltransferasen zurückzuführen sind (siehe auch 4.9), oder ob

sie einen Einfluß auf den Wirt oder die T4 Entwicklung haben, muß noch geklärt werden.

Bei der Verwendung von zwei oder allen drei ADP-Ribosyltransferasen in einem

Reaktionsansatz tritt kein erkennbarer synergetischer Effekt auf (Abb. 3.22). Es findet sich

lediglich eine Summierung der radioaktiven Markierungen. Somit scheint jede ADP-

Ribosyltransferase des T4 unabhängig zu arbeiten, ohne einen Einfluß auf die anderen

beiden Transferasen auszuüben oder von ihnen beeinflußt zu werden.

Nicht infizierte E. coli zeigen ebenfalls eine ADP-Ribosylierung, die mit dem Alter der

Kultur zunimmt und evtl. eine signifikante Rolle im Übergang von der logarithmischen in

die stationäre Phase spielt (SKORKO et al., 1977; SKORKO & KUR, 1981). Dabei wird

jedoch nur ein Protein mit ca. 20 kDa in vivo markiert. Diese Markierung bei 20 kDa wird

in den in dieser Arbeit beschriebenen Kontrollansätzen nicht gefunden. Dies liegt

wahrscheinlich daran, daß bei SKORKO & KUR Gesamtprotein verwendet wurde und in den

erwähnten Kontrollen der vorliegenden Arbeit nur lösliches Protein verwendet wurde. Dies

würde bedeuten, daß das besagte 20 kDa Protein mit der unlöslichen Zellfraktion

sedimentierte. Die Markierung bei ca. 70 kDa wurde von SKORKO & KUR allerdings nicht

gefunden.

Unter in vitro Bedingungen wurden mit verschiedenen Proteinfraktionen von E. coli auch

noch diverse andere, nicht näher beschriebene Proteine markiert, dieses ADP-

ribosylierende E. coli Enzym ist allerdings sehr instabil, es fällt aus und ließ sich nicht

weiter reinigen (SKORKO et al., 1977; SKORKO & KUR, 1981).

4.8.1 ADP-Ribosylierung der αααα-Untereinheit durch ModA

ModA ADP-ribosyliert die α-Untereinheit der E. coli RNA-Polymerase. Diese

Modifikation sollte mit einigen Auswirkungen auf die Transkription verbunden sein. So

Diskussion

98

wird die α-Carboxiterminale Domäne (αCTD) für die Interaktion mit stromaufwärts

liegenden Promotorelementen (UP-Elemente) benötigt, wie bei dem ribosomalen E. coli

Promotor rrnB P1 (ROSS et al., 1993; 1998). Die αCTD ist ebenfalls das Ziel für viele

Transkriptionsaktivatoren (ISHIHAMA, 1993), wie z.B. den Klasse I Aktivatoren (ZOU et

al., 1992; TANG et al., 1994). Von CAP (Katabolit Aktivator Protein) werden immerhin ca.

10 % aller E. coli Gene reguliert (ISHIHAMA, 1993). Das Arg265 scheint in diesen Fällen

eine besonders wichtige Rolle einzunehmen (ZOU et al., 1992). GAAL et al. (1996) konnten

zeigen, daß eine Mutation R265A in der αCTD für die Transkription von UP-Element

abhängigen Promotoren beinahe den gleichen Effekt hat, als würde der gesamte

Carboxyterminus fehlen. Wie Abb. 4.4 zeigt, kann der ADP-Ribosylrest den gesamten

Carboxyterminus überspannen und der große, negativ geladene Rest so die Interaktion mit

UP-Elementen oder Aktivatorproteinen unterbinden, aber auch neue Interaktionsflächen

für z.B. vom T4 neusynthetisierte Proteine liefern. Es ist möglich, daß die ADP-

Ribosylierung am Arg265 die Aktivatoren und die stromaufwärts liegenden Bereiche der

ribosomalen Wirtspromotoren daran hindert die Transkription zu stimulieren und somit der

beobachtete schnelle Abfall der Wirtstranskription bei einer T4 Infektion verursacht wird

(ROSS et al., 1993). Außerdem könnte die ADP-Ribosylierung der α-Untereinheit eine

Rolle in der Verminderung der RNAP-Promotor Interaktion spielen, was die

Transkriptelongation beeinflußt (ADELMAN et al., 1998).

Für die Transkriptionsinitiation an Promotoren ohne UP-Elemente wird die αCTD nicht

unbedingt benötigt (IGARASHI & ISHIHAMA, 1991). Sie hat hier aber trotzdem eine

funktionelle Rolle, indem sie die Bildung des offenen Transkriptionskomplexes fördert

(BURNS et al., 1999).

Die Roh-abhängige Transkriptionstermination ist für die Genexpression und deren

Regulation sehr wichtig. Hier spielt die αCTD ebenfalls eine sehr wichtige Rolle.

Besonders die Aminosäuren Arg265, Gly296, Leu300, Ile303, Lys304, Asp305 und Leu307 werden

für eine effiziente Roh-abhängige Termination in vivo benötigt. Ihr Austausch gegen

Alanin hat teilweise den gleichen Effekt als würde der gesamte Carboxyterminus fehlen

(KAINZ & GOURSE, 1998).

Diskussion

99

Glu 329Phe 249

Lys 271Arg 284

Lys 304

Arg 255Arg 310

Arg 317

Lys 297

Lys 291 Lys 298Arg 265

ADP-Ribosylrest

Abb. 4.4 α-Carboxyterminus der E. coli RNA-Polymerase mit ADP-Ribosylrest am Arg265.Die genaue Lage des ADP-Ribosylrestes ist nicht bekannt, die angegebene Positionberuht auf Vermutungen. Es sind das Ende und der Anfang der αCTD sowiesämtliche Arginine und Lysine angegeben.

Es wurde gezeigt, daß die ADP-ribosylierte RNA-Polymerase von den mittleren T4

Promotoren aus nicht sehr gut transkribiert. Hier wird die Transkription durch MotA

(„modifier of transcription“ von T4) aber aktiviert, da erst durch MotA die Bildung des

offenen Transkriptionskomplexes erreicht werden kann (HINTON et al., 1996). Die

unmodifizierte E. coli RNA-Polymerase kann von den mittleren T4 Promotoren

transkribieren, es wird hier die erweiterte –10 Sequenz (TGNTATAAT) erkannt, aber die

Transkription kann nicht mehr durch MotA stimuliert werden (HINTON, 1991; SCHMIDT &

KREUZER, 1992). In Gegenwart von AsiA (Antisigmafaktor von T4) wird die

unmodifizierte RNA-Polymerase wieder durch MotA aktiviert und die Transkription von

den mittleren Promotoren gesteigert (OUHAMMOUCH et al., 1995; HINTON et al., 1996).

Des weiteren wird die Transkription an den frühen Promotoren durch AsiA vermindert,

wodurch von der frühen auf die mittlere Transkription umgeschaltet wird (OUHAMMOUCH

et al., 1994; 1995).

Diskussion

100

Die ADP-ribosylierte RNA-Polymerase erkennt also keine Promotoren mit erweiterter

-10 Region, und die Kontakte der α-Untereinheit mit der DNA und Aktivatoren geht

verloren, was einmal die Erkennung der entsprechen Wirtspromotoren unterdrückt, aber

auch die Transkription von mittleren T4 Promotoren während der frühen Infektionsphase

verhindert. Diese Einschränkungen in der Promotorerkennung der Wirts DNA verursachen

womöglich die Toxizität von ModA.

Für die Erkennung und erhöhte Transkription von späten T4 Promotoren wird die

carboxyterminale Domäne der α-Untereinheit nicht benötigt (TINKER et al., 1995), somit

hat die ADP-Ribosylierung des Arg265 keinen Einfluß auf die Transkription dieser späten

Promotoren. RABUSSAY & GEIDUSCHEK (1977b) haben allerdings gezeigt, daß T4

modifizierte RNA-Polymerase für eine solide Stimulation der späten T4 Promotoren

benötigt wird. Diese beiden Aussagen stehen nicht unbedingt im Widerspruch zu einander,

da RABUSSAY & GEIDUSCHEK (1977b) T4 DNA, die 5-Hydroxymethylcytosin anstelle von

Cytosin besitzt verwendet haben und diese modifizierte DNA normalerweise notwendig

für die Synthese von späten Proteinen sein soll (zusammengefaßt bei RABUSSAY &

GEIDUSCHEK, 1977a). TINKER et al. (1995) haben jedoch für ihre Untersuchungen späte

Promotoren verwendet, die auf Plasmiden liegen und somit Cytosin enthalten. Der

gefundene Unterschied mag also bei den verschiedenen DNA Typen liegen.

4.9 ADP-Ribosyltransferase Aktivität von ModA

Da den ADP-Ribosyltransferasen offensichtlich eine Spezifität für die Seitenkette der

Guanidinderivate fehlt (MOSS & VAUGHAN, 1977; 1978; MOSS et al., 1979; MEKALANOS et

al., 1979), können künstliche Substrate für Aktivitätstests eingesetzt werden (SOMAN et al.,

1983; 1984).

Im Gegensatz zu vielen bakteriellen ADP-Ribosyltransferasen, die für in vitro

Untersuchungen erst aktiviert werden müssen (PASSADOR & IGLEWSKI, 1994), sind die

Transferasen des T4 von Anfang an aktiv.

Die Aktivität von ModA wurde mit einem photometrischen Test ermittelt, wobei das

artifizielle Substrat p-Nitrobenzylidin-aminoguanidin (NBAG) eingesetzt wurde. Das

Substrat NBAG mußte für diesen Versuch erst hergestellt werden (2.8.2.1). Zur

Überprüfung, ob die richtige Substanz synthetisiert wurde, wurde ein Wellenlängenscan

von 230 – 550 nm durchgeführt und mit den Scans der Ausgangsmaterialien und dem Scan

für NBAG von SOMAN et al. (1983) verglichen. Es zeigte sich, daß NBAG synthetisiert

Diskussion

101

wurde und keine erkennbaren Verunreinigungen zu finden waren. In dem entsprechenden

Test wird das NBAG nur mono-ADP-ribosyliert (SOMAN et al., 1983; 1984). Dieser

Hinweis muß bedacht werden, damit die Reaktionsgeschwindigkeit richtig bestimmt

werden kann.

Bei diesem Versuch ist es sehr wichtig, daß während der Durchführung der pH-Wert

konstant gehalten wird, da die Methode auf der Änderung des pKa von NBAG basiert

(Erniedrigung von 0,7 – 0,8 pH Einheiten) (SOMAN et al., 1983). Deshalb kann diese

Methode auch nicht über einen weiten pH-Bereich angewendet werden. Nach SKORKO et

al. (1977) liegt das pH-Optimum für ModA bei 7,5 und das Temperaturoptimum zwischen

15° C und 20° C. Also sollte bei diesem Test (pH 7,4) keine große Aktivitätseinbuße von

ModA zu befürchten sein. Außerdem war schon bekannt, daß ModA kein Mg2+ benötigt

und nicht durch EDTA inhibiert wird, des weiteren wird es durch Sulfhydryl-Reagenzien

geschützt und Nicotinamid ist ein Inhibitor für die Reaktion (SKORKO et al., 1977).

Bei der Aktivitäts-Untersuchung von ModA unterliegt man jedoch einer gewissen

Gradwanderung, da ModA bei einer niedrigen Ionenstärke instabil ist, die Aktivität aber

durch eine hohe Ionenstärke inhibiert wird (SKORKO et al., 1977).

Vor der Bestimmung von Vmax und KM wurde überprüft, ob unter den gegebenen

Bedingungen ein linearer Zusammenhang in Abhängigkeit der Proteinkonzentration

besteht. Die Linearität wurde bestätigt, was bedeutet, daß es unter der gegebenen

Versuchsanordnung zu keiner Limitierung der Substrate kam. Im Anschluß wurden die

Werte für Vmax und KM in Abhängigkeit beider Substrate (NAD+, NBAG) bestimmt. Dabei

gibt der KM Wert die Substratkonzentration an, bei der die Hälfte der aktiven Zentren

besetzt sind. Es wurde ein KM für NAD+ von 258 µM und für NBAG von 219 µM, also ein

fast identischer Wert ermittelt. In Tabelle 4.2 sind zum Vergleich KM-Werte einiger ADP-

Ribosyltransferasen aufgeführt. Der Wert, der von SKORKO et al. (1977) für ModA

ermittelt wurde liegt um den Faktor 18 niedriger als der in dieser Arbeit ermittelte Wert.

Diese Abweichung kann nur durch die unterschiedlichen Versuchsbedingungen erklärt

werden.

Die Werte für Vmax variieren stärker. Der Wert für Vmax(NAD+) liegt bei 20 mol Produkt .

h-1 . mol ModA-1 und Vmax(NBAG) bei nur 5,3 mol Produkt . h-1 . mol ModA-1. Die

Reaktionsgeschwindigkeit in Abhängigkeit von NBAG liegt wahrscheinlich höher, da

Diskussion

102

ModA sich selbst ribosyliert und diese Ribosylierung bei wenig vorhandenem NBAG

stärker zu tragen kommt und mit diesem Testverfahren nicht registriert werden kann.

Man hat es hier mit einer enzymatischen Reaktion mit zwei Substraten zu tun (wenn man

ModA, das sich autoribosyliert mitzählt, sind es sogar drei Substrate). Da in den

Reaktionsansätzen ein Substrat (entweder NAD+ oder NBAG) aber immer konstant im

Sättigungsbereich gehalten wurde, kann man sie wie eine Reaktion mit einem Substrat

behandeln. Eine enzymatische Reaktion mit einem Substrat folgt nach Michaelis und

Menten folgender Gleichung:

E n zy m + S u b stra t E n zy m -S u b s tra t-K o m p lex E n zy m + P ro d u k tk 1

k 2

k 3

E S E S E P

Für KM gilt: KM = (k2 + k3)

k1

Für k3 « k2 gilt: KM = k2

k1

Für die Reaktionsgeschwindigkeit gilt nach Michaelis und Menten folgende Gleichung:

V = Vmax [S]

[S] + KM

Wenn k2 wesentlich größer als k3 ist zeigt ein hoher KM-Wert eine schwache und ein

niedriger KM-Wert eine feste Bindung des Substrates zum Enzym an.

Tabelle 4.2 KM-Werte verschiedener ADP-Ribosyltransferasen.Protein Substrat KM (µM) Referenz

ADP-Ribosyltransferase

aus Vogelerythrocyten

NAD+

NADP+

30

30

MOSS et al., 1979

Cholera Toxin NAD+ 4000 MOSS et al., 1976

E. coli Enterotoxin NAD+ 8000 MOSS & RICHARDSON, 1978

Pertussis Toxin NAD+ 2 FINCK-BARBANCON & BARBIERI, 1995

ModA NAD+ 14,3 SKORKO et al., 1977

ModA NAD+ 258 diese Arbeit

Diskussion

103

Die katalytische Konstante kkat von ModA wurde für NAD+ mit 0,334 Umsätzen pro

Minute bestimmt. In Tabelle 4.3 sind die kkat-Werte einiger ADP-Ribosyltransferasen

angegeben. ModA hat eine relativ geringe Aktivität. Sie liegt um einen Faktor von ca. 180

unter der des Diphtherie Toxins, aber auch um einen Faktor 1000 höher als bei dem C3-

ähnlichem Toxin von Clostridium limosum.

Tabelle 4.3 Katalytische Konstanten (kkat) einiger ADP-Ribosyltransferasen.Protein kkat (min-1) Referenz

C2 Toxin 1,77 BARTH et al., 1998

C3-ähnliches Toxin 0,00033 BÖHMER et al., 1996

Diphtherie Toxin 58,8 WILSON et al., 1990

E. coli Enterotoxin 0,65 CIEPLAK et al., 1995

Alt-Protein vom T4 0,028 KOCH, 1999

ModA 0,334 diese Arbeit

4.10 Transkriptionsversuche mit alterierter und modifizierter E. coli RNA-Polymerase

Die ADP-Ribosylierung der E. coli RNA-Polymerase hat einen Einfluß auf die

Transkription. MAILHAMMER et al. (1975) konnten zeigen, daß modifizierte RNA-

Polymerase unter in vitro Bedingungen von E. coli DNA weniger mRNA synthetisiert als

normale RNA-Polymerase. Unter den gleichen Bedingungen wurde die mRNA Bildung

von T4 DNA durch modifizierte RNA-Polymerase jedoch nicht beeinträchtigt, was darauf

hindeutet, daß die Genexpression der Wirtszelle durch die ADP-Ribosylierung zum Teil

ausgeschaltet wird. Dabei zeigte sich die normale RNA-Polymerase 4 bis 15 mal effektiver

an bestimmten E. coli Promotoren als die modifizierte RNA-Polymerase. Sie konnten

zeigen, daß die unmodifizierte α-Untereinheit essentiell für die effiziente Transkription des

lac Promotors ist.

In einem in vivo System konnte man zeigen, daß alterierte RNA-Polymerase die

Transkription von vielen frühen T4 Promotoren steigert (WILKENS & RÜGER, 1996). Jetzt

sollte im Vergleich die Auswirkung von modifizierter RNA-Polymerase (RNAP)

untersucht werden. Experimente mit gereinigter RNAP, die während des laufenden

Versuchs durch Alt oder ModA ADP-ribosyliert werden sollte, zeigten keine Veränderung

in der Transkriptionsrate. Entweder fehlten zusätzliche Komponenten in dem

Diskussion

104

Reaktionsansatz, die mit der ADP-ribosylierten RNAP interagieren, oder die Ribosylierung

durch Alt bzw. ModA lief in dem Versuchsansatz zu langsam ab, so daß während der

Versuchsdauer kein Einfluß auf die Transkription festzustellen war. Deshalb wurde ein

„halb in vivo“ System, bei dem die löslichen Proteine einer überexprimierenden Kultur

eingesetzt wurden, verwendet. Es wurde die Transkription von genomischer DNA von T4

bzw. E. coli untersucht. Von der T4 DNA wird in diesem System nur von den frühen

Promotoren transkribiert, da die Proteine AsiA und MotA, die für die Transkription der

mittleren Promotoren notwendig sind, fehlen. Eine Transkription von den späten

Promotoren erfolgt ebenfalls nicht, da gp55, gp33 und der gp44-gp62 Komplex fehlen.

Von T4 DNA läßt sich mit alterierter RNA-Polymerase durch Zugabe von mehr löslichem

Proteinextrakt die Transkriptmenge steigern (Abb. 3.29). Bei unveränderter oder

modifizierter RNAP ist eine solche Steigerung nicht festzustellen. Mit modifizierter RNAP

erzielt man außerdem nur zwischen 30% und 50% der Transkriptmenge wie von der

normalen RNAP. Dies bedeutet, daß modifizierte RNAP von T4 DNA schlechter

transkribiert als normale RNAP. Der Unterschied kommt wahrscheinlich daher, daß

normale RNAP auch von den mittleren Promotoren transkribiert, was die modifizierte

RNAP nicht kann (siehe auch 4.8.1). Die ADP-Ribosylierung der zweiten α-Untereinheit

durch ModA bewirkt anscheinend, daß die gute Transkription der frühen T4 Promotoren

durch die alterierte RNAP stark eingeschränkt und somit die frühe Transkription fast

eingestellt wird.

Bei der Transkription von E. coli DNA zeigen alterierte und normale RNAP ein fast

identisches Verhalten. Durch Zugabe von mehr löslichem Proteinextrakt konnte in beiden

Fällen nicht mehr Transkript gebildet werden. Für die normale RNAP wäre zu erwarten

gewesen, daß mit mehr Protein auch mehr Transkript gebildet wird. Es sei denn, daß mit

der eingesetzten Proteinmenge am Anfang des Versuchs schon so viel RNAP im Ansatz

ist, daß sämtliche Promotoren auf der vorhandenen DNA bereits „ausgelastet“ sind.

Übereinstimmend mit der T4 DNA zeigt die modifizierte RNAP bei der E. coli DNA

wieder eine nur geringe Transkriptbildung. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, daß durch

die modifizierte RNAP ein Teil der E. coli Promotoren abgeschaltet wird, was wohl zu

dem beobachteten Zusammenbruch der E. coli Transkription beitragen könnte (GOLDFARB

& PALM, 1981). Der Zusammenbruch der bakteriellen RNA-Synthese findet in alt -, mod

-

Mutanten aber immer noch statt (GOFF & SETZER, 1980), so ist ModA nicht alleine dafür

Verantwortlich, könnte aber einen Teil dazu beitragen.

Diskussion

105

Man sollte bei diesen in vitro Versuchen aber bedenken, daß die RNA-Polymerase von

vielen zusätzlichen Stellen, wie Einzelstrangbrüchen in der DNA, transkribieren kann, die

keine Promotoren darstellen und es somit zu einer falschen Aussage kommen kann.

Es bleibt noch viel zu tun, um die Auswirkungen der drei ADP-Ribosyltransferasen des

Bakteriophagen T4 auf seinen Wirt E. coli, aber auch auf seine eigene Entwicklung

vollständig zu verstehen.

Zusammenfassung

106

5 ZusammenfassungDie ADP-Ribosylierung ist eine weit verbreitete posttranslationale Modifikation von

Proteinen, die bei Viren, Prokaryonten und Eukaryonten auftritt und zur Regulation

diverser Stoffwechselprozesse eingesetzt wird. Obwohl die Familie der ADP-

Ribosyltransferasen kaum Homologien in der Aminosäuresequenz aufweisen, zeigen sie

doch eine gemeinsame Struktur, die das katalytische Zentrum bildet. Anhand der

Sekundärstruktur kann ein Alignment der bekannten ADP-Ribosyltransferasen angefertigt

werden. Das Alignment zeigt einige hoch konservierte Aminosäuren, die wahrscheinlich

für die Katalyse notwendig sind.

Vom Bakteriophagen T4 waren zwei, für ihn nicht essentielle, ADP-Ribosyltransferasen

bekannt, das gpAlt und das gpMod. Die Auswirkungen von Alt auf die frühen T4

Promotoren sind bereits bekannt, nun sollte die Auswirkung von Mod auf die

Transkription untersucht werden. Dazu mußte zuerst das Gen für Mod kloniert werden. Es

gab zwei potentielle Kandidaten, die das Gen mod sein konnten. Die Gene liegen in einem

Operon hinter dem frühen T4 Promotor P13.149. Bei den Klonierungsarbeiten stellte sich

heraus, daß beide Genprodukte toxisch für E. coli sind. Eine Klonierung konnte somit erst

in stringent kontrollierten Vektoren wie den pET-Vektoren oder dem Vektor pBAD

erfolgen.

Aktivitätstests mit beiden Genprodukten zeigten, daß es sich bei beiden Proteinen um

ADP-Ribosyltransferasen handelt. Somit besitzt der Bakteriophage T4 drei ADP-

Ribosyltransferasen, das gpAlt, das gpModA und das gpModB. Die drei Proteine zeigen

unterschiedliche Ribosylierungsmuster in SDS-Polyacrylamidgelen, wobei einige Proteine

von zwei der drei Transferasen ribosyliert werden. So z.B. die α-Untereinheit der E. coli

RNA-Polymerase. Sie wird durch Alt und ModA ADP-ribosyliert.

Die Proteine ModA und ModB werden als Einschlußkörper exprimiert. Es wurden keine

Anzuchtbedingungen gefunden, die lösliches Protein lieferten. Auch die Coexpression von

Chaperonen, der Versuch die exprimierten Proteine in das Kulturmedium zu bringen oder

die Fusion mit Thioredoxin änderten nichts an der Bildung der Einschlußkörper. Aber

durch die Isolierung der Einschlußkörper kann ModA bereits zu > 90 % sauber vorliegen.

Zu diesem Zeitpunkt ist es allerdings inaktiv und muß noch renaturiert werden.

Zusammenfassung

107

Die Renaturierung der mit 7 M GuHCl oder 8 M Harnstoff behandelten Einschlußkörper

von ModA ist nicht sehr effektiv. Werden diese Einschlußkörper aber bei einem pH 12 und

2 M Harnstoff aufgelöst, können sie leicht durch Dialyse renaturiert werden. Jedoch ist

ModA nicht sehr stabil und es fällt mit der Zeit aus.

Eine Reinigung von rekombinanten ModA bzw. ModB, die mit einem „His-Tag“ versehen

sind, ist unter denaturierenden Bedingungen nur bedingt möglich. Aus unbekannten

Gründen hat der „His-Tag“ unter denaturierenden Bedingungen eine schlechte Affinität zur

Ni-NTA Matrix. Ein „His-Tag“ am nativen Protein bindet besser an Ni-NTA, wodurch

ModA bzw. ModB weiter gereinigt werden können. Für das gereinigte ModA wurde ein

KM-Wert für NAD von 258 µM und für NBAG von 219 µM ermittelt. Die kkat-Werte

liegen für NAD bei 0,334 min-1 und für NBAG bei 0,089 min-1.

Der Austausch bestimmter Aminosäuren gibt Aufschluß über die Notwendigkeit dieser

Aminosäuren für die Katalyse. Als katalytisch wirksame Aminosäuren wurden die für

ModA postulierten Aminosäuren Arg72 und Glu165 und für ModB die Aminosäuren Arg73

und Glu173 durch ortsspezifische Mutagenese verifiziert. Der homologe Austausch je einer

der genannten Aminosäuren zeigte eine verminderte Aktivität der toxischen Proteine, was

für eine Beteiligung an der Reaktion oder für eine Beteiligung an der Bindung des

Substrats spricht. Für die erzeugten Mutanten müssen die Werte für KM und Vmax noch

bestimmt werden, um Anhaltspunkte zu erlangen ob die mutierten Aminosäuren an der

Katalyse oder der Substratbindung beteiligt sind.

Da ModA die α-Untereinheit der E. coli RNA-Polymerase modifiziert, liegt es nahe, eine

Auswirkung auf die Transkription zu vermuten. Untersuchungen zur Transkription mit

modifizierter RNA-Polymerase von genomischer T4 bzw. E. coli DNA zeigen, daß die

Transkription im Vergleich zu alterierter oder unveränderter RNAP, deutlich geringer ist.

Es ist somit zu vermuten, daß durch die modifizierte RNAP einige Promotoren nicht mehr

erkannt werden können. Während einer T4 Infektion liegt erst eine alterierte RNAP vor,

die gut von den frühen T4 Promotoren transkribieren kann. Durch eine Modifikation der

RNAP wird die Transkription von diesen frühen Promotoren teilweise unterbunden und

durch die Synthese von AsiA und MotA auf die mittleren Promotoren umgeschaltet.

Literaturverzeichnis

108

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Lebenslauf

124

Lebenslauf:

Persönliche Daten: Bernd TiemannHermannstraße 1A58239 Schwerte

geboren am 19. Januar 1965 in Dortmund

ledig

Schulbildung:

08/71 – 08/75 Grundschule in Dormund-Aplerbeck

08/85 – 08/81 Realschule am Bohlgarten in Schwerte

08/81 – 08/84 Ruhrtal Gymnasium in Schwerte

Berufsausbildung, Berufstätigkeit:

10/84 – 07/85 Auslieferfahrer und Hilfskraft im Dental-Labor Otto Kozmacs

GmbH & Co KG in Dortmund-Aplerbeck

08/85 – 07/88 Ausbildung zum Zahntechniker im Dental-Labor Otto Kozmacs

GmbH & Co KG in Dormund-Aplerbeck

07/88 – 09/89 Geselle im Dental-Labor Otto Kozmacs GmbH & Co KG

10/89 – 11/89 Geselle bei Hartmann-Dental GmbH in Datteln

12/89 – 10/90 Geselle im Dental-Labor Otto Kozmacs GmbH & Co KG

Hochschulausbildung:

10/90 – 11/95 Studium der Biologie an der Ruhr-Universität Bochum,

Diplomarbeit: Untersuchungen zur Molekularbiologie

pflanzlicher Nitrilasen

seit 04/96 wissenschaftlicher Mitarbeiter am Lehrstuhl für Biologie der

Mikroorganismen der Ruhr-Universität Bochum und Promotion

Veröffentlichungen:

Hillebrand, H.; Tiemann, B.; Hell, R.; Bartling, D. und Weiler,

E.W. (1996). Structure of the gene encoding nitrilase 1 from

arabidopsis thaliana. Gene 170, 197-200

Lebenslauf

125

Wilkens, K.; Tiemann, B.; Bazan, F. und Rüger W. (1997).

ADP-ribosylation and early transcription regulation by

bacteriophage T4. Adv.Exp.Med.Biol. 419, 71-82

Tiemann, B.; Depping, R. und Rüger W. (1999).

Overexpression, purification, and partial characterization of

ADP-ribosyltransferases ModA and ModB of bacteriophage

T4. Gene Expression (zur Publikation angenommen)

Documents

Klonierung, Überexpression, Reinigung und teilweise ... · EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ( ethylen d iamin tetra acetic acid et al. und andere ( et alius ) G G uanin gp G en