Kloning Langsung dari Gen Xilanase dari Mata Air Panas PAWAN - RIAU

Sebuah gen fungsional yang mengandung Open Reading Frame (OR?) Encoding 0-1, 4-endoxylanase glycosyl keluarga hidrolase 11 dikloning langsung menggunakan metagenomic PCR-kloning metode dari sampel Musim Semi Pawan Hot di Riau. Gen terdiri dari 642 nukleotida, dikodekan untuk 213 asam amino. Urutan analisis asam amino menggunakan BLAST menunjukkan bahwa gen memiliki homologi yang tinggi (93%) dengan gen xilanase dari Bacillus subtilis. Gen menunjukkan fungsinya ketika subcloned menjadi vektor ekspresi dan diekspresikan pada E. coli. Ekstrak kasar enzim rekombinan memiliki aktivitas untuk 170 Ulml pada 50 "C. Hasil ini workshowed bahwa pendekatan metagenomic adalah metode cut kuat pendek untuk mendapatkan rekombinan biokatalis yang berguna untuk aplikasi industri.

PENDAHULUAN β-1, 4-Endoxylanases (Xylanases) (EC 3.2.1.8.) adalah enzim yang mengkatalisis

pembelahan tulang punggung xilan pada usia 1-4 tautan karbon secara teratur untuk menghasilkan xilosa dan xylooligosaccharides. Xilanase adalah enzim penting untuk bioteknologi, karena merupakan salah satu enzim xilanolitik yang dapat menurunkan xilan, menjadi zat yang berguna seperti xylose. Xilan adalah second major limbah dunia polimer berlimpah. Xilanase juga merupakan enzim yang menjanjikan untuk mengganti penggunaan lingkungan berbahaya kimia di industri kertas (Kulkarni et al. 1999).

Beberapa peneliti telah diisolasi, dimurnikan, dan ditandai xylanases mikroba dan juga kloning gen menggunakan pendekatan klasik dengan jenis mikroba murni (Tsujibo et al, 1997;. Chang et al 2004;.. Huang et al 2005). Sayangnya, metode konvensional, batas analisis mikroorganisme yang tumbuh di bawah kondisi laboratorium (Cowan et a /. 2005). Jumlah sel mikroorganisme prokariotik di bumi diperkirakan mencapai 1030, dan terdiri dari antara 106 dan 108 spesies terpisah (Cowan 2000). Dari keragaman ini, hanya 1% dapat dibudidayakan dan telah sudah dipelajari dengan menggunakan pendekatan budidaya klasik (Amann et al. 1995). Oleh karena itu, kami kehilangan mikroorganisme unculturable yang menempatkan 99% dari populasi mikroorganisme dalam biosfer. Mereka tetap sebagai sumber daya yang belum dimanfaatkan untuk gen baru yang berguna untuk industri (Cowan et a /. 2005). Ketika target akhir adalah untuk mendapatkan enzim arecombinant, standar metode mikrobiologi konvensional kadang-kadang menjadi rumit. Hal ini disebabkan para peneliti harus melakukan "penyaringan ganda" yaitu, penyaringan target isolat diikuti dengan penyaringan gen target, berurutan. Dalam tulisan ini, mengambil gen xilanase rekombinan fungsional menggunakan pendekatan metagenomic digambarkan. Dalam studi ini, saya langsung mencapai gen xilanase dari sampel DNA lingkungan dari mata air panas PAWAN (Riau, Indonesia), yang merupakan sumber daya potensial dari gen enzim termofilik. Gen itu diambil melalui suatu Polymerase Chain Reaction (PCR)-kloning, maka subcloned ke dalam vektor ekspresi pET101/D-TOPO dan atas disajikan dalam E.coli.

BAHAN DAN METODEStrain Bakteri, Plasmid, dan Menengah. Jenis bakteri yang digunakan sebagai host untuk

amplifikasi plasmid dan ekspresi adalah E. coli DH5 sebuah (Sony Suhandono, Departemen Biologi, Institut Teknologi Bandung) dan E. coli BL21 bintang (lnvitrogen), masing-masing. Plasmid yang digunakan dalam penelitian ini adalah pGEM-T mudah (Promega) dan pET101/D-TOPO vektor ekspresi (Invitrogen). Para agar-agar 1,5% LB medium yang mengandung

antibiotik dan X-gal/IPTG digunakan untuk seleksi E. coli menyimpan plasmid rekombinan. Agar LB medium yang mengandung antibiotik dan 0,5% Oat-spelt xilan digunakan untuk konfirmasi dari ekspresi gen pada E. coli.

Sampling dan Ekstraksi DNA Lingkungan. Sampel yang digunakan dalam pekerjaan ini adalah campuran lumpur dan air yang

dikumpulkan dari mata air panas Pawan di Riau dengan suhu sekitar 55 º C dan pH sekitar 8. Sampel diambil dimasukkan ke dalam botol steril. Sampel disimpan pada suhu 4ºC, atau - 80ºC untuk penyimpanan lama. DNA Metagenomic diekstraksi dari 5 (basah) metode sampel sayap yg diusulkan oleh Zhou (Zhou et al.1996) dengan beberapa modifikasi. Prosedur ini dimodifikasi oleh pembekuan dan pencairan sebelum ekstraksi. Sampel dicairkan dicampur dengan buffer ekstraksi DNA (mengandung 100 mM Tris-HCI, 100 mM natrium EDTA, dan 100 mM natrium fosfat, 1,5 M NaCl, dan CTAB 1%), panas, dan kemudian diekstraksi dengan SDS 10%.

Kontaminan protein dihapus oleh kloroform / isoamyl alkohol, maka DNA mentah diendapkan dengan isopropanol. DNA mentah diekstrak kemudian dimurnikan lebih lanjut menggunakan Gene Bersih Kit (Q-Biogene, USA), rendah leleh agarosa (Invitrogen), atau kolom cartridge (Promega). DNA diekstraksi dianalisis menggunakan elektroforesis gel agarosa 0,8%. Selain ekstraksi methd diusulkan oleh Zhou et al. (1996), ekstraksi DNA menggunakan Tanah persiapan Kit (Q-Biogene) juga dilakukan. Rekayasa Genetik Percobaan. Protokol dalam percobaan rekayasa genetika dilakukan berdasarkan protokol standar (Sarnbrook & Russel 2001). Sebelum analisis xilanase, amplifikasi rDNA-16 dilakukan untuk memeriksa kemampuan dari DNA diekstraksi sebagai template. DNA diekstraksi dan dimurnikan kemudian digunakan sebagai template untuk PCR menggunakan 5'-AATGCG GCC GCAATG TTTAAG TTTAAA AAGAATTTC T-3 'sebagai primer forward dan 5'-GC TCTAGA TTA CCA CAC TGT AC GTT AGAACT T -3' sebagai membalikkan primer. Primer dan Taqpolymerase yang dibeli dari Invitrogen dan primer yang spesifik untuk endoxylanase keluarga hidrolase glycosyl 11 sebagai hasil dari keselarasan keluarga xilanase dari Bacillus 11. Taq polimerase kondisi PCR adalah 94 ºC selama tiga menit untuk mulai panas, maka 45 detik, 52 º C 1 menit, 72 menit 2ºC selama 30 siklus menggunakan pengendara sepeda Termal (Eppendorf). DNA plasmid yang mengandung gen dikonfirmasi di family xilanase 11 dari Bacilluslicheniform tegang 15 di pBAD / g1II vektor terpilih sebagai kontrol positif. Penanda DNA yang digunakan adalah 1 kb DNA tangga dengan berbagai ukuran dari 100 bp - 12 kbp (Invitrogen). Dokumentasi elektroforesis agarosa dilakukan dengan menggunakan peralatan Geldoc (Kodak).

Produk PCR dengan ukuran diprediksi kemudian dipotong dan dimurnikan dengan Gene Bersih Kit, incubatedat 72 "C selama 30 menit untuk menambahkan adenines tambahan (A) pada akhir 3'-produk PCR, kemudian diligasi ke vektor pGEM-T mudah di 4 º C semalam. Campuran ligasi digunakan untuk mentransformasi E.coli DH5 α menggunakan ampisilin dan putih / biru penyaringan.

Klon positif maka dianalisis dengan menggunakan enzim restriksi EcoRI dibeli dari Invitrogen. Klon positif menyembunyikan ukuran diprediksi disekuensing dan dianalisis. Satu sequencing gen kemudian, subcloned ke vektor juara pET101/D-TOPO menggunakan bukti membaca amplifikasi PCR dengan polimerase PFU (Promega) di bawah kondisi PCR yang sama tapi tanpa langkah mulai panas. Primer maju digunakan dalam membaca bukti PCR 5'-CACC ATG TTTAAG TTTAAAAAGAAT-3 ', sedangkan primer sebaliknya adalah sama dengan amplifikasi Taq-PCR pertama. Ligasi kemudian ditransformasikan ke E. coli DH5 α, dan gen xilanase penampungan positif plasmid dipilih. Plasmid ini kemudian berubah lagi ke E. coli BL2

saya bintang menggunakan elektroporasi (Gene pulser, Biorad). Koloni positif dengan zona bening diperiksa di LB Spelt mengandung Oat xilan (0,5%) untuk mengamati aktivitas xilanase.

Bioinformatika Analisis Gene Xilanase. DNA plasmid disekuensing di Pusat Pengkajian Bioteknologi, BPPT. Urutan DNA

xilanase pengkodean dianalisis menggunakan kroma dan Genetyx soilware. Pencarian untuk kesamaan dalam nuclebtides dan asam amino dilakukan menggunakan program BLAST di http://lwww.ncbi.nlm.nih.gov. Gen kemudian diserahkan ke GenBank, Amerika Serikat. Analisis beberapa urutan dilakukan melalui http://www.genome.ad.jp server. Gen-gen xilanase yang digunakan dalam analisis keselarasan beberapa adalah: B.lichenformis (AccessionNumber AAZI 7387), Paenibacillus macerans (menurut Bil AAZ17386.), Bacillus amyloliquefaciens (menurut Bil AAZI 7388.), 5. circulans (menurut Bil. AAM08360), B. subtilis (menurut Num.CAA84276), dan Thermobacillusxylanilyticus (menurut Bil CAJ87325.). Peptida sinyal seperti yang diperkirakan menggunakan http://www.cbs.dtu.dkserver

Rekombinan Persiapan Enzim dan Enzyme Assay.Koloni E. coli BL21 bintang yang berisi xilanase rekombinan positif dibudidayakan pada

50 LB ml mengandung ampisilin, dan pada OD600 = 0,6, IPTG ditambahkan dan budidaya dilanjutkan selama empat jam. Sel adalah pellet dengan sentrifugasi dan disuspensikan dalam 5 20 mM pH fosfat ml penyangga 7 mengandung 1 mercaptoethanol mM, dan terganggu dengan sonikasi on-off selama lima menit. Ekstrak kasar yang mengandung enzim rekombinan diperoleh kembali dengan sentrifugasi (13.000 rpm). Xilanase aktivitas diukur (sampel dalam rangkap dua) berdasarkan metode Miller menggunakan asam diiitrosalicilic untuk mendeteksi gula pereduksi (Miller 1959;. Bailey et al 1992) pada kisaran suhu antara 30 dan 70 ° C. Satu unit aktivitas xilanase didefinisikan sebagai jumlah enzim untuk menghasilkan 1 umol dari xilosa per menit di bawah kondisi percobaan.

HASILKeberhasilan pendekatan metagenomic tergantung pada kemurnian DNA diekstraksi dari

lingkungan. DNA diekstraksi dari Pawan-Riau air panas tanpa pemurnian lebih lanjut tidak bisa memberikan produk amplifikasi PCR. Beberapa protokol pemurnian seperti menggunakan kartrid kolom atau agar-agar pencairan dilakukan, namun pemurnian hanya dengan Gene Bersih Kit memberikan hasil yang konsisten. Ekstraksi DNA dari sampel lingkungan yang sama dengan menggunakan Tanah Kit DNA Ekstraksi, tanpa peralatan lisis direkomendasikan, memberi bersih DNA (Gambar 1a). Namun, tanpa menghasilkan DNA ukuran besar dan memberikan amplifikasi negatif dalam percobaan 16S rDNA amplifikasi karena ukuran terfragmentasi. Ekstraksi DNA dari lingkungan b sampel) menggunakan metode yang diusulkan oleh DNA Zhou gavegenomic baik dalam berat molekul tinggi dan dalam ukuran terfragmentasi (Gambar 1b). Namun, diberikan pita amplifikasi PCR produk terutama pada ukuran yang sama dengan prediksi satu (sekitar 650 bp) (Id Gambar). Jadi, untuk contoh ini, Zhou et al. (1996) metode memberikan hasil yang lebih baik dibandingkan dengan kit DNA tanah ekstraksi. Sebuah gen yang disebut xyn PW8 dikloning langsung dari sampel ini kemudian berhasil subcloned ke dalam vektor ekspresi pET101/D-TOPO. Ini telah dikonfirmasi sebagai gen fungsional, yang memberikan rekombinan positif E. coli BL21star dengan aktivitas xilanase (Gambar 2). Aktivitas xilanase rekombinan dalam ekstrak kasar setelah gangguan sel adalah 170 U / ml pada suhu 50 ° C (Gambar 3). Gen ini PW8 xilanase memiliki OW mengandung 642 bp nukleotida yang dikodekan 21 3 asam amino (Gambar 4). Gen yang diperoleh dalam pekerjaan ini telah

disampaikan ke GenBank dengan Acc. Bil. DQ888232. Para ofthegene konten GC adalah 41 sedangkan massa molekul dihitung dan titik isoelektrik (PI) dari produk gen adalah 23.323 Da dan 9,85 (termasuk peptida sinyal), masing-masing. Homologi asam amino ini xilanase rekombinan dengan otherxylanases dianalisis sebagai shownin Gambar 5. Ini gen xilanase PW8 memiliki perbedaan dalam 13 asam amino dari yang xilanase B. subtilis atau memiliki homologi identitas 93%. Acidnumber amino 1 sampai dengan 30 orang seperti yang diperkirakan sebagai peptida sinyal didasarkan pada server prediksi sinyal peptida (http://www.cbs.dtu.dk.)

PEMBAHASAN Ekstraksi DNA lingkungan dan kloning gen xilanase langsung fungsional dilaksanakan.

Dua metode pendekatan metagenomic dilakukan, yang pertama adalah pendekatan urutan-based (PCR-kloning) dengan hasil sekuens DNA, dan yang kedua adalah pendekatan berbasis fungsional (metagenome perpustakaan) dengan hasil klon fungsional (Cowan et al 2004).. Dalam karya ini, kami memilih pendekatan pertama untuk menemukan gen xilanase dari sampel pegas Riau panas, karena memiliki beberapa keunggulan. Percobaan PCR-kloning pendekatan tidak terlalu rumit dibandingkan dengan perpustakaan metagenome. Itu nyaman dan relatif bukan metode memakan waktu. Namun, hanya mendapatkan gen parsial dan banyak putatif gen enzim tanpa aktivitas enzim terbukti, menjadi kerugian dari pendekatan kloning PCR. Bahkan, ada kurang metagenomic DNA jumlah di habitat yang lebih ekstrim. Oleh karena itu, saya sarankan bahwa kloning PCR adalah pilihan terbaik untuk pemanfaatan genetik lingkungan dari sumber air panas. Pendekatan metagenomics dapat digunakan untuk mengeksplorasi menemukan enzim dan metabolit sekunder seperti amilase, esterase, dan antibiotik (Gillespie et al 2002;. Yun et al 2004;. Rhee dkk 2005.). Dalam penelitian, sampel berlimpah digunakan untuk ekstraksi DNA metagenomic. Dalam karya ini, Saya melakukan PCR-kloning gen xyIanase langsung dari Pawan-Riau sampel air panas lingkungan.

Saya terfokus pada gen xilanase karena memiliki aplikasi bioteknologi banyak dengan relative tinggi nilai-nilai ekonomis (Kulkami et al. 1999). Langsung kloning gen xilanase dari nyali manusia dilakukan oleh Hayashi et al. (2005) dan dari usus rumen oleh Liu eral. (2005). Sunnah andBergquist (2003) menggambarkan PCR-kloning dari DNA lingkungan dari kolam panas di Selandia Baru. Penelitian mereka dilaporkan langsung kloning gen xilanase dari sampel metagenomic menggunakan PCR-mirip kloning pendekatan. Namun, dalam makalah mereka, mereka melaporkan berbagai jenis xilanase. Sunnah dan Bergquist (20031, dan alsoLiu et al (2005) gen xilanase terpencil milik keluarga hidrolase glycosyl 10 menggunakan primer degenerate., Sedangkan Hayashi et al. (2005) gen terisolasi dari keluarga xilanase 8 yang mereka dinyatakan sebagai xilanase baru. Saya primer spesifik yang dirancang dan digunakan untuk keluarga xilanase 11. Ini primer spesifik gen menutupi keseluruhan (OW) dari gen xilanase Sebenarnya, yang lain merosot primer untuk gen xilanase lain juga dirancang dan diterapkan ke dalam amplifikasi PCR.. Namun, hanya primer spesifik xilanase keluarga 11 (xyn 11) memberikan hasil positif dalam percobaan. Contoh penggunaan set primer spesifik yang khusus untuk lipase bakteri dan nitril hydratase subunit-urutan dalam memperkuat ekstrak DNA metagenomic dan mendapatkan fragmen gen putatif digambarkan oleh Cowan kelompok sebelumnya (Cowan et al. 2005). Namun, mereka hanya berhasil sampai dengan gen putatif tetapi tidak melakukan gen fungsional eksperimen. urutan DNA dari studi ini memberikan ORF penuh tanpa pergeseran frame dan memiliki inisiasi serta stop kodon Oleh karena itu,. dari urutan DNA dapat diprediksi bahwa DNA adalah gen fungsional. Prediksi ini terbukti bahwa ekstrak kasar enzim rekombinan menunjukkan aktivitasnya pada kisaran suhu antara 30-70 º C dan

aktivitas tertinggi pada 55 º C (Gambar 3). suhu optimum adalah sama dengan suhu habitat Pemurnian dan karakterisasi lebih lanjut dari xilanase rekombinan seperti themostability dan profil pH adalah masih. Hasil penelitian menunjukkan bahwa keluarga endoxylanase 11 mungkin enzim mana-mana. dan disebarkan secara luas di antara mikroorganisme dihuni mata air panas. Sejak homologi ini xylanases metagenomic sangat tinggi untuk xilanase dari B. subfilis (sekitar identitas asam amino 93%), itu meramalkan bahwa di mana-mana itu setidaknya di antara spesies Bacillus. mana-mana gen encoding lipaseA antara spesies Bacillus yang hidup di habitat tanah digambarkan oleh Ruiz et al. (2003) Dengan demikian, fenomena yang sama dapat ditemukan dalam keluarga xilanase 11 spesies BaciNus.. Hipotesis ini juga didukung oleh hasil BLAST yang menunjukkan ini gen xilanase keluarga 11 sudah sangat sangat dilestarikan di daerah N-terminal (atau wilayah peptida sinyal) dan C-terminal maupun di urutan asam amino internal yang antara spesies BaciNus (Gambar 5). Studi kloning langsung xilanase gen dari sampel lingkungan masih terbatas, dan ini studi saat ini mungkin menjadi contoh pertama dari kloning langsung gen xilanase dari habitat termal bahasa Indonesia. Dengan menggunakan pendekatan kloning langsung dari sampel lingkungan af, saya berhasil mendapatkan xilanase rekombinan cepat dari itu dari pendekatan konvensional karena itu,. terbukti bahwa pendekatan metagenomic adalah cara yang sangat potensial dan lebih cepat untuk mendapatkan gen baru keduanya dan produk mereka.