Slide 1
Analisis profil as. Amino gelatin sapi dan babiKelompok 6Citra
Reza APP1110102000028Hadi Qudsi1110102000066Khalida
Handayani1110102000008Liana Puspita
Cahyaningrum1110102000072Nirmala Kasih1110102000042Asam aminoAsam
amino adalah senyawa organik yang memiliki gugus fungsional
karboksil (-COOH) dan amina (NH2). Dalam biokimia seringkali
pengertiannya dipersempit: keduanya terikat pada satu atom karbon
(C) yang sama (disebut atom C "alfa" atau ). Asam amino merupakan
monomer yang menyusun polimer-polimer pada protein. Asam amino
dapat mengalami proses hidrilisis yang menghasilkan hidrolisat
protein. Gugus karboksil memberikan sifat asam dan gugus amina
memberikan sifat basa. Dalam bentuk larutan, asam amino bersifat
amfoterik: cenderung menjadi asam pada larutan basa dan menjadi
basa pada larutan asam. Perilaku ini terjadi karena asam amino
mampu menjadi zwitter-ion. Asam amino termasuk golongan senyawa
yang paling banyak dipelajari karena salah satu fungsinya sangat
penting dalam organisme, yaitu sebagai penyusun protein. Asam amino
adalah komponen utama protein, yang ditemukan dalam semua organisme
hidup dan memainkan peranan dalam sel hidup
GelatinGelatin merupakan campuran heterogen dari polipeptida
yang diperoleh melalui hidrolisis kolagen dari jaringan ikat
hewan.Di eropa sumber utama gelatin diekstrak dari kulit babi 80%,
kulit sapi 15%, dan 5% sisanya berasal dari tulang babi dan sapi,
unggas dan ikan berdasarkan cara pembuatannya, gelatin dibedakan
atas dua jenis, yaitu gelatin tipe A dan tipe B Gelatin yang
berasal dari kulit babi diperlakukan dengan metode asam (tipe A)
untuk menghindari saponifikasi karena kandungan lemak yang tinggi
di kulit. Umumnya, perlakuan asam terbatas pada jaringan hewan muda
yang memiliki ikatan kovalen dalam kolagen yang lebih rendah yang
menjamin kualitas gelatin yang baik.Perlakuan alkali (tipe B)
digunakan untuk gelatin yang bersumber dari tulang
Gelatin merupakan salah satu bahan baku yang banyak digunakan
dalam industri pangan seperti permen, es krim, produk susu, roti,
kue, keju, yogurt, dan marshmallow. Gelatin digunakan sebagai
stabilizer atau emulsifier, memperbaiki dan mempertahankan sistem
emulsi produk pangan. Disamping itu, gelatin juga dimanfaatkan
dalam industri kosmetik, farmasi,dan lain-lain Analisi As.Amino
Gelatin Babi dan SapiKCKT/ HPLCPCA
7HPLC
IDENTIFIKASI ASAM AMINO DENGAN HPLCUntuk identifikasi senyawa
organikTahap2 :Pembuatan hidrolisat protein(asam
/basa),Derivatisasi InjeksiHIDROLISIS METODE ASAMSampel halus
dicampur dgn 6 N HCL dan dimasukkan dalam gelas ampul, dialiri gas
nitrogen, ampul gelas di sealed dgn api bunsen. Ampul gelas
dimasukkan oven 110 oC selama 20 jam.(-) asam amino tryptophan
rusak, sebagian cystein dan methionine juga rusak.
HIDROLISIS BASASampel halus di ekstrak dengan 4,2 N NaOH
dimasukkan dalam ampul gelas, di sealed, dibekukan dalam es kering.
Kemudian dipindahkan ke tabung gelas (Oehlhlegel glass), agar
hidrolisat bisa divakumkan (0,18 mm Hg). Gelas ini pindahkan kesuhu
kamar dimasukkan oven 110 OC selama 16jam. Note : khusus di gunakan
untuk recovery tryptophan, dimana dgn methode asam 100% asam amino
tryptophan rusak.Derivatisasi Tujuan :Meningkatkan deteksiMerubah
struktur molekul(polaritas analit)m-> mhslkan puncak
kromatografi yg lbh baikMubah matriks -> pemisahan lbh
baikMstabilkan analit yg sensitif
Syarat rx derivatisasi :Produk yg dihslkan hrs mampu menyerap
sinar uv/ s.tampak/ membentuk senyawa berfluoresen.Proses
derivatisasi cepat dan hrs menghasilkan produk yg sebesar mungkin
(100%)Produk harus stabil selama proses derivitasi dan deteksiSisa
pereaksi u/ derivatisasi harus tdk menggangu pemisahan
kromatografiNote:Derivatisasi dilakukan sebelum analit masuk kolom
(pre-column derivatization) atau setelah analit keluar dari kolom
(post-column derivatization)Kelebihan dari derivatisasi pra kolom
yaitu waktu analisa cepat, dan cocok untuk analisa dengan jumlah
residu yang lebih sedikit atau sekitar 20 residu.REAGEN
DERIVATISASIGUGUS FUNGSIONALREAGEN U/ DIDETEKSI UV/VISREAGEN U/
DIDETEKSI FLUORESENAs.karboksilat; as.lemak;
as.folat>P-nitrobenzil N,N-diisopropiliso urea
(PNBDI)>3,5-dinitrobenzil N,N-diisopropiliso urea
(DNBDI)>P-bromofenasil bromida (PBPB)
>4- bromometil-7-asetoksikumarin>4-bromometil-7-
metoksikumarinalkohol>3,5-dinitrobenzil klorida
(DNBC)>4-dimetilaminiazobenzen-4-sulfinil
(Dabsyl-Cl)>1-naftilisosianat (NIC-1)Aldehid;
keton>P-nitrobenziloksiamin hidroklorida
(PNBA)>3,5-dinitrobenziloksiamin hidroklorida (DNBA)Dansil
HidrazinAmin primerFluoresamin 0- ftalaldehid (OPA)Amin primer
& sekunder> 3,5-dinitrobenzil klorida (DNBC)>
N-Suksinimidil-p-nitrofenilasetat(SNPA)> N-Suksinimidil-3,5
dinitrofenilasetat(SDNPA)Dimetilaminiazobenzen-4-sulfinil
(Dabsyl-Cl)Naftilisosianat (NIC-1)
7-kloro-4-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazol
(NBD-Cl)7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazol(NBD-F)Dansil
kloridaAs.amino4-dimetilaminiazobenzen 4-sulfinil
(Dabsil-Cl)Flioresamin o- ftalaldehid
(OPA)7-kloro-4-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazol
(NBD-Cl)7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazol (NBD-F) Tingginya
peak dari as.amino dpt digunakan untuk perbedaan yg sederhana dari
gelatin babi dan sapiefektivitas pemisahan, kecepatan analisis dan
sensitivitas deteks. karena dengan HPLC campuran analit dapat
dipisahkan secara langsung dalam kolom yang sesuai, seperti dalam
metoda analisis asam amino
Penggunaannya hanya untuk profil as.amino Untuk perbedaan antara
analisa gelatin babi dan sapi mungkin tidak cukup dipercaya
(memerlukan bantuan analisa lain)KeuntunganKerugianPERBEDAAN AA
BABI DAN SAPI MENGGUNAKAN HPLCKonsentrasi dari aa. Yang lebih
tinggi antara aa keduanyaBabi : as. Glutamat, trypthophan,
phenylalanine, glutamine, tyrosine,methioninSapi : as.aspartat,
asparagin, histidine, alanin, arginin, isoleusine, leusin,
lysine
Bahan dan Larutan StandarBahan:Standar asam
aminoortho-phtalaldehyde (OPA)2-mercaptoethanol (MCE)gelatin babi
dan sapimethanol, tetrahydrofuran, NaOH, HCL, Pb(II)asetat, asam
oksalatAir bidistilled steril Sampel permen (soft candy)
Larutan standar dan reagen:Larutan standar asam amino disiapkan
dengan melarutkan 10 mg dari asam amino dengan air bidistilled
sampai 10 ml dalam labu volumetri standarReagen derivatisasi
OPA-MCE disiapkan dengan melarutkan 100 mg orto-phtalaldehid (OPA)
dan 100 l 2-mercaptoethanol (MCE) dalam labu volumetri 50 ml.
Tambahkan dengan 10 m metanol dan dibuat dalam volume menggunakan
bufer borat (pH 9,1 0,05)
Preparasi sampel (soft candy)Cara kerjaKolom yang digunakan
adalah EurospherSistem eluen terdiri dari dua komponen (sistem
gradien) Eluen A adalah buffer asetat 0,01 M (pH: 5,9), sedangkan
eluen B adalah metanol: buffer asetat 0,01 M (pH: 5,9):
tetrahidrofuran (400: 75: 25 v / v / v).Laju alir eluen adalah 1,5
ml / menit. Detektor fluoresensi di set pada panjang gelombang
eksitasi dan emisi di 340 dan 450 nm
profil asam amino ditentukan dengan menggunakan RP-HPLC dengan
detektor fluorosensi, dan Langkah-langkah analisis meliputi
hidrolisis gelatin untuk melepaskan residu asam amino dan
derivatisasi asam amino dengan OPA-MCE.KEGUNAAN REAGENHCl 6N :
mendestruksi sampel mnjd unsur2nya karena HCl bersifat oksidatir
kuatNaOH 1M : menetralkanPengenceran dengan air steril dan di
guncang pelan : membilas hidrolisatOPA-MCE: reagen derivatisasi
gugus amine primer agar dapat terdeteksi dgn spektrofloromtr
5 ml Pb asetat (II) 40% : penjernih dan mengendapkan asam-asam
organik.2 ml asam oksalat 15 % : mengendapkan Pb
Kegunaan menggunakan HPLC dengan fluorosensi dalam analisis ini
adalah untuk memisahkan kadar asam amino yang terkandung dalam
gelatin sapi dan babi. Kadar asam amino yang didapat kemudian
diproses menggunakan PCAPenggunaan HPLC dalam determinasi asam
amino banyak digunakan terutama dari segi efektivitas pemisahan,
kecepatan analisis dan sensitivitas deteks. karena dengan HPLC
campuran analit dapat dipisahkan secara langsung dalam kolom yang
sesuai, seperti dalam metoda analisis asam aminoDerivatisasi dengan
HPLC bertujuan untuk mengubah analit menjadi bentuk yang dapat
terdeteksi oleh sistem detektor yang digunakan, sesuai dengan
sensitivitas yang diperlukan. Untuk mendapatkan sensitivitas dan
selektivitas yang tinggi digunakan detektor spektrofluorometer.
Dalam hal ini derivatisasi dilakukan supaya didapat senyawa yang
berfluoressensi kuat.
HASILHASILBabi : as. Glutamat, trypthophan, phenylalanine,
glutamine, tyrosine,methioninSapi : as.aspartat, asparagin,
histidine, alanin, arginin, isoleusine, leusin, lysine
PCAPrincypal Component AnalysisPCA adalah suatu alat yang
digunakan untuk menganalisis data atau mengklasifikasi suatu data
mislanya gelatin sapi atau babi dengan sistem mengurangi dimensi
dari satu set data tapi bisa memberikan terhadap suatu variabel
asli.Atau alat yang mampu meganalisa suatu senyawa berdasarkan asam
amino pada proteinnyaLanjutan..Berdasarkan Kaiser criterionKomponen
utama (PC) yang digunakan adalah PC dengan eigen Value (nilai ciri
atau varians setiap komponen utama ) lebih dari 1 sedangkan
proporsi keragaman yang dianggap cukup mewakili data jika keragaman
kumulatif mencapai 70-80%PC diurutkan dari variasn terbesar hingga
terkecilPC1 kombinasi linier dari suatu variabel yang diamali dan
memiliki varians terbesarPC2 komponen dari suatu variable yang
diamati yangberdifat ortogonal terhadap PC1 dan memiliki variasn
kedua terbesar
Kurva score plot digunakan jk ada 2 komponen pertama yang
merupakan nilai terbanyak dalam variabilitas di dalam dataKomponen
utama pertama (PC1) sbg absisKomponen utama kedua (PC2) sbg
ordinatKurva score plot digunakan untuk menaksir data yaitu sebagai
dasar perbedaan gelatin sapi dan babii semakin dekat letak antara
sampel pada score plot, maka semakin besar pula kemiripannya atau
sampel merupakan kelompok yang samaPCA ( Principal Component
Analysis)PCA merupakan suatu teknik untuk mengurangi banyaknya data
ketika adanya korelasi, namun PCA tidak akan membantu saat
variabel-variabel tidak memiliki korelasi. PCA digunakan untuk
memilih variabel yang signifikan dari parameter persentase peak
yang tinggi untuk tiap asam amino. Hasil PCA adalah komponen utama,
dimana mengandung informasi untuk sebuah data yang pasti dari
variabel data. PC1 memberikan variabel terbesar dari data,
sementara PC2 menjelaskan variasi data terbesar selanjutnya, begitu
seterusnya.Hasilnya adalah :
1 = PC1 (-) dan PC2 (-)2 = PC1 (+) dan PC2 (-)3 = PC1 (-) dan
PC2 (-)4 dan 5 = PC1 (+) dan PC2 (+)6 dan 7 = PC1 (-) dan PC2
(+)
Kesimpulan Penggunaan kombinasi HPLC dan PCA dalam menentukan
profil asam amino dari gelatin sapi atau babi dapat dilakukan hanya
dalam skala laboratorium karena metode pembuatan gelatin yang masih
sederhana. Penggunaan kombinasi HPLC dan PCA dalam menentukan
profil asam amino dari gelatin sapi atau babi tidak dapat dilakukan
dalam skala industri karena proses pembuatan gelatin dalam industri
yang kompleks dapat mempengaruhi profil asam amino sehingga data
yang dihasilkan tidak dapat dijadikan acuan.
pertanyaanTidak ada penanya.Dapus Analisis Komposisi Asam Amino
Gelatin Sapi dan Gelatin babi Pada Produk Kapsul Lunak Simulasi
Menggunakan Teknik Kombinasi High Performance Liquid Chromatography
(HPLC) dan Principal Component Analysis (PCA)
Differentiation of Bovine and Porcine Gelatins in Soft Candy
Based on Amino Acid Profiles and Chemometrics
% susut pengeringan = = = 88,44%
