Kémiai összekapcsolási stratégiák

4. Fotoaffinitás5. Enzimek7. Nem-kovalens

-COOH-CHO

4. Oxidálószerek-SH + HS-

6.

-SH5. -NH-NH2 H2N-NH-

-NH23. Diimidazol4. -CHO OHC-

3. Fotoreaktív3. -COOH HOOC-

2. HS-2. Woodward’ reagens2. -SH HS-

1. –NH2 HS-1. -NH2 H2N-

1. Karbodiimid

Különböző funkciós csoportokNincs beépülés a két

komponens közéAzonos funkciós csoportok

Heterobifunkciós„Zero-length”Homobifunkciós

TRI

N C N

CH C N

N N

O

C

O

Kapcsoló reagens megválasztása1. A reakció specificitása: acilezés, alkilezés

� Acilezés

� Alkilezés

P NH2 + N

O

O

O

R

O

P NH

R

O

+ N

O

O

OH

észter

P SH + N

O

O

CH3

P S

N

O

O

CH3

N-etil-maleimid (NEM)

� Nukleofilitása) Egy perióduson belül

-NH2 > -OR > -OH > -OAr > R-NH2 > NH3 > H2O

Tyr Lys, α Ser, Thra) Egy oszlopon belül

-SH > -OH; F > Cl > Br > Ia) -NH2 > NH3; -OAr > HOAr; -OH > H2O

Edwards Jo, Pearson RG JACS 84 26 (1962)-SR > -SAr > -I > -CN > -OH > -N3 > -Br > -OAr > > -Cl > piridin > -OAc > H2O

Σ -SH > -NH2 > -OH

� pH hatás protonálás csökkenti a nukleofilitást-SH pKa = 8.3

-εNH2 10.810.9

-OH > 13

2. A reagens hidrofil/hidrofób jellege� pl. membrán

3. A reagens hasíthatósága� pl. –S–S– ,

pH = pKa + log[A-][AH]

OH

CH CH

OH OH

C O CH2

O

CH2 O C

O

4. A reagens méretepl. n = 0,1,2…

5. A reagens „riporter” sajátságapl. UV, F kromofór, spin-jelző

(CH2)n

1. „Zero-length” kapcsoló reagensek

A) Savamid kötés B) Shiff bázis C) Diszulfid kötés(szekunder amin)

NH2 HOOC

P-

O

OH

O NH2 HOC SH SH

I. Kumulált kettős kötésa) Karbodiimidb) Woodward

II. Aktív karbonila) CDIb) Szénsav

származékok

Spontán

Redukálószerek(lásd ott)

pl. HPO-IgGFerritin – avidin

levegő H2O2

I2pl. membrán

N

N

N

N

Cu2+

CuP [di(1,10-fenantrolin)]

A) Savamid kötés Kumulált kettős kötésű reagensek

I. Karbodiimidek

R C

OH

O

+ N C N NH C N

O

R C

O

R C

NH

O

R1

+ NH C NH

O

N

O

O

O

O

R SO3-Na+

N

O

O

OH

SO3-Na+

+NH2 R1+N-hidroxiszulfoszukcinimid

"aktív észter"NH2 R1+

Staros JV Anal Biochem 156 220 (1986)

A. Nem-vízoldékony karbodiimidek

B. Vízoldékony karbodiimidek

Sheehan JC J Am Chem Soc 77 1067 (1955)

N C N

N,N' - diciklohexil-karbodiimid, DCC

N C N

CH3

CH3

CH3

CH3

N,N' - diizopropil-karbodiimid, DIC

Sheehan JC et al. J Org Chem 26 2525 (1961)

Sheehan JC J Org Chem 21 439 (1956)

N C N

CH3

NH+CH3

CH3

1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid HCl

EDC [EDAC]

pH 4.7 - 6 (7.5) puffer

Mellékreakció: hidrolízis, tiolízis (tioészter)N C N

N+

O

CH3

1-ciklohexil-3-(2-morfolinoetil)karbodiimid, CMC

C. Woodward reagens

C3

O

N+

CH5

CH3

SO3-

3'

-OHC3

O

SO3-

C5 N

CH3

N-etil-3-fenil-izoxazolium-3'-szulfonát ketoketénimin

SO3-

C3

C5

NH CH3

O O

1. R-COOH

2. Q-NH2

-H2O

+ R

NH

O

Q

Woodward RB J Am Chem Soc 83 1010 (1961)

1) Polimer α-kimotripszin2) Hemin – IgG konjugátum3) Enzim – bilirubin konjugátum

O

NN

N

N

N,N' - karbidiimidazol, CDI

O

NN

OR

O

+NH

N

Acil-imidazol

R

NH

O

Q+ CO2 +

NHN

R

OH

O

NH2 Q+

+

O

OCl

CH3

klórszénsavetilészter

O

OO

CH3

R

O

R

NH

O

Q+ CO2 + CH3CH2OH

II. Aktív karbonil csoportot tartalmazó reagensek

A B

Anderson GW J Am Chem Soc80 4323 (1958)

Enzim – ellenanyag →hisztokémia

Ganglionid – flourofor

2. Homobifunkciós kapcsoló reagensek

2.1. Funkciós csoportok2.1.1. Amino csoport

NH2+

CO

CH3 + NH2 R

NH2+

CNH

R

Cl-

Cl-

imidoészter imidoamid

N O

O

O

O

+ NH2 R

O

CNH

R

N-hidroxi szukcinimid észter

amid

a

b

cF

NO2

F

NO2

+ NH2 R

F

NO2

NH

NO2

R

aril halogenidaril amin

d

O C N+ NH2 R

NH

O

NHR

S C N+ NH2 R

NH

S

NHR

e

HC

O

+ NH2 R1. Schiff bázis

2. RedukcióR

NHCH2

dialdehid

2.1.2. Tiol csoportoka

b

Hg2+ 1947-től

O

O

Hg+

Hg+

X-

X-+ SH R

O

O

Hg

Hg+

R

S

X-

3,6-bis(merkurimetil)dioxán X = Cl-, NO2-

c

d

S S

O

CH3

O

(CH2)n S S CH3

O

O

+ SH R S SR (CH2)n S S CH3

O

O

polimetilén bis(metántioszulfonát) diszulfid + metánszulfonsav

n = 5, 6, 8, 10, 12

N

S S

(CH2)2

NH

O

(CH2)4

NH

(CH2)2

O

S

S

N

+ SH R

1,4-di-[3'-(2'-piridiltio)propionamido]bután

(DPDPB)

R

S S

(CH2)2

NH

O

(CH2)4

NH

(CH2)2

O

S

S

N

diszulfid

e

f

g

N

O

O

(CH2)n N

O

O

+ SH R N

O

O

(CH2)n

SR

tioéter n = 1, 3, 6, 8, 12N,N'-metilén-bis-maleimid

Br Br

O

+ SH R S S

O

R R

tioéter 1,3-dibrómaceton

N

N

N

OCH3

Cl Cl

+ SH R N

N

N

OCH3

S SR

R

tioéter 2,4-diklór-6-metoxi-S-triazin

2.1.3. Karboxil csoportok

2.1.4. Aldehid csoportok

N2

(CH2)4

N2

+ HOOC RO

(CH2)4

N2

R

O

bis-diazo-hexán észter

NH2NH (CH2)4 NH

NH2

O O

+ OHC R NNH (CH2)4 NH

NH2

O O

R

Adipinsav hididrazid hidrazon

EDC

imid

2.1.5. Bis-benzidin származékok – vegyes célcsoport (karcinogén 1985)

NH3+

NH3+

N+

N+

N

N

N

N

OH

NH3+

O-

N

N

N

NH

NH3+

O

O-

Benzidin

N

N NH

NH3+

O

O-

Tirozin

Histidin

Lizin

bis-Diazotált Benzidin

2.2. Összekötők (spacer)2.2.1. Nem hasítható

R NH2

CH3O (CH2)n O

CH3

NH2+

NH2+

Cl-

Cl-

R1NH2

RNH (CH2)n NH

R1

NH2+

NH2+

HIDROFÓB

n = 1 dimetil malonimidát (DMM)

n = 2 - 10 (n = 4, DMA n = 5, DMP n = 6, DMS

Amidin kötés

a

Alkalmazás: pH 8 – 9, TÖLTÉS, vízoldékonyfixálás elektronmikroszkópiamultienzim komplexekimmunkomplexek szerkezeteprotein – A – immobilizáció

O (CH2)2

NH2+

O(CH2)2 O

CH3

NH2+

CH3

Cl-

Cl-

O (CH2)2

NH2+

OCH3(CH2)n

O(CH2)2 O

CH3

NH2+Cl

-Cl

-

b

DODP

n = 1, 2, 4 n = 1 DMDP

R NH2 R1NH2

NH (CH2)2

NH2+

OR(CH2)n

O(CH2)2 NH

R1

NH2+Cl

-Cl

-

HIDROFIL

2.2.2. HasíthatóAlkalmazás: elektroforézis � hasítás

molekuláris mozgás a membránbanIA ag asszociációShivdagani RA J Immunol 141 1252 (1988)

DISZULFID / HIDROFÓBaCH3

O (CH2)nS

S(CH2)n O

CH3

NH2+

NH2+

Cl-

Cl-

n = 2 Dimetil 3,3'-ditiobis propionimidát (DTBP)

n = 3 DTBB, 4 DTBV, 6 DTBE

R NH2 R1NH2

RNH (CH2)n

SS

(CH2)n NHR1

NH2+

NH2+

Cl-

Cl-

RNH (CH2)n

SH

NH2+

Cl-

SH(CH2)n NH

R1

NH2+

Cl-

Wang K; Richards F: J Biol Chem249 8005 (1974) (YALE)

DISZULFID / HIDROFIL

Dimetil 3,3'-(ditio-dimetil-dioxi)bisimidát . 2HCl

CH3O (CH2)2

O(CH2)2

SS

(CH2)2O

(CH2)2 OCH3

NH2+

NH2+

Cl-

Cl-

CH3O (CH2)2

NH

NH2+

(CH2)2

O

SS

(CH2)2 CH3

O(CH2)2NH

NH2+

OCl-

Cl-

Dimetil 3,3'-(ditio-dimetilén-diamido)bispropionimidát . 2HCl

SS

(CH2)2 NH(CH2)4

NH (CH2)2S

S

O O NN

1 2

3

1,4-di-[3'-(2'-piridilditio)propionamido]bután DPDPB

RS

S(CH2)2 NH

(CH2)4

NH (CH2)2S

SR1

O O

R SH R1SH

16 Ao

RSH SH

(CH2)2 NH(CH2)4

NH (CH2)2SH

O O

SHR1

DTT

+ +

Vicinális diolb

NO

ON

O

OOH

OH

O

O

O

O

Diszukcinimit tartarát (DST)

R NH2 R1NH2

NHNH

R1

O

OOH

OH

R

NHH

O

O

RH

NHR1

O

O

NaIO4

AMID

Smith RJ, Biochemistry 17 3719 (1978)

Bázisérzékeny kötésc

Bis[2-(szukcinimido-oxikarbonil)etil]szulfon (BSES) nem vízoldékony

N

O

(CH2)2

OO

O

S

O

(CH2)2

O

N

O

OO

O

C1

R NH2 R1NH2

R

NH

(CH2)2

O

S

O

(CH2)2

O

R1

NH

O

AMID

pH 11.6

2 óra, 37 oC

R

NH

(CH2)2

O

S

O

O-

O

OH (CH2)2

R1

NH

O

+

Etilén-glikol-bis(szukcinimidil szukcinát) (EGS) nem vízoldélony

C2

OO

OO

N

N

OO

O

O

O

O

O

O

R NH2 R1NH2

NHO

ONH

R

R1

O

O

O

OpH 8.5

1M H2N-OH

3-6 óra, 37 oC

NHNH

OH

R

O

O

OHOH

OHNH

NHR1

O

O

+ +etilén glikol

P1,P2-bis(5'-piridoxál)difoszfát (Bis-PLP)

C3

N

CHO

OH

CH3

O

N

CHO

OH

CH3

O P R

O

OH

P

O

OH

R NH2 R1NH2

N

OH

CH3

O

N

OH

CH3

O P R

O

OH

P

O

OH

N

R1

N

R

H+/OH-

N

OH

CH3

O P OH

O

OH

N

R

N

OH

CH3

OOH P

O

OH

N

R1

+

homobifunkcionáliskeresztkötő1. fehérje

aktiváltoligomer

2. fehérje

aktiváltmonomer

nagy polimerkonjugátum

idealizált, kis molekulatömegű konjugátum