Kobe University Repository : Kernel

タイトルTit le

東南アジア、特にインドネシアにおけるデング出血熱ウイルスの生態学的・疫学的研究 : 免疫電子顕微鏡法による感染オオカからのアルボウイルス検出法の試み (国際交流研究中間報告(予報))(国際交流研究中間報告(予報))

著者Author(s)

松村, 武男 / 山西, 浩 / Bernardus / E, F, da, Silva / 小西, 英二 / S, Diakaria/ 藤田, 宣哉 / Hoedojo / S, Cornain / S, Soedarto / Machfudz / D,Rukmono / Sujudi / 堀田, 進

掲載誌・巻号・ページCitat ion 神戸大学医学部神緑会学術誌,5:139-142

刊行日Issue date 1989-06

資源タイプResource Type Departmental Bullet in Paper / 紀要論文

版区分Resource Version publisher

権利Rights

DOI

JaLCDOI 10.24546/81007124

URL http://www.lib.kobe-u.ac.jp/handle_kernel/81007124

Create Date: 2018-07-01

神緑会学術誌 第5巻1989年

国際交流研究中間報告(予 報)

東 南 ア ジア、特 に イ ン ドネ シア にお け るデ ング出血熱

ウイル スの生態学的 ・疫学的研究

一免疫電子顕微鏡法 による感染 オオカか らの

アルボウイルス検出法の試み一

*1松 村 武 男

E.F.daSilva

*5藤 田 宣 哉

*7S.Soedarto

*2山 西 浩

*1小 西 英 二

*4Hoedojo

*7MachfudZ

*3Sujudi

*3Bernardus

*4S.Diakaria

*6S.Cornain

*aD.Rukmono

*8堀 田 進

は じめ に

デ ング出血熱は、発熱 ・嘔気 ・嘔吐 ・咳噺で もって

突然に発症する急性の熱性疾患である。その1・2日

後 には溢血点で知 まって、紫斑や消化器出血 を伴 う出

血症状が現われ、ヘマ トクリット値が上昇 し、低蛋白

血症や血小板減少を伴 う血液異常状態 をきた し、次の

日に死亡す るか、完全に治療するかどち らかの運命 を

たどる。致命率 は50%で あ り、診断は、血中抗体の上

昇を検査す るか、血液からの ウイルス分離によって確

定されて きた。

このデ ング出血熱 は、1950年 代に先づフィリピンと

東南 アジアに、続いてイ ンドやオセアニアに認め られ

て きた。何故 この ような重症の出血熱が、ある限 られ

た地域の、主 として子供 に出現 して きたのかについて

は、一説 には、Hypersensitivityが 関係がある と考 え

られているが、現在 なお、未解決の問題である。ベ ク

ター(ウ イルス媒介者)は 、Aedesaegypti(ネ ッタイ

シマ カ)かAdesalbopictus(ヒ トスジシマ カ)で ある

が、この蚊の発生や増殖は気象や ヒ トの生活環境の条

件に影響 される。ベクター ・コン トロールすることが、

この感染症 を減 らす主要対策であるが、熱帯環境下で、

この対策 の具体化 は生易 しいことではない。予防接種

は、現在 なされていないが、良質のワクチ ンが待望 さ

れている。デ ングウイルスが疫学的に4型 に分類 され

ていることも、この ウイルスの生態 ・疫学上の問題 を

複雑 に している(Hotta,1984)。

さて、本研究は、以上の諸点をふまえて、本 ウイル

ス浸淫地であるインドネシアを中心 に、患者の迅速診

断法を確立 し、現地研究者 と協力 しなが ら、本 ウイル

スの生態学的 ・疫学的調査研究に資することを目的 と

して行われた。

材 料 と 方 法

供 試 蚊 の 雄 成 虫:神 戸 大 学 医 学 部 医 動 物 学 教 室 で は 、

温 度27±1℃ 、 相 対 湿 度70--gay、 照 明 サ イ ク ル 明:

暗=16:8時 間 と い う条 件 に 制 御 した 飼 育 室 で 、 江

下 ・栗 原 の 方 法(1982)に 従 っ て 発 育 させ た 。 イ ン ド

ネ シ ア 大 学 医 学 部 寄 生 虫 学 教 室 で は 、 室 温 で 飼 育 さ れ

た 。

Tvxorhynehtites蚊 の 飼 育 法:?'oxorhychitesω 肋 痂6η 廊

(Doleschall>(以 後 、 オ オ カ と略 す) .(図1)は 、 日

本 で は 当 教 室 で 継 代 飼 育 した も の 、 イ ン ドネ シ ア大 学

で は 、NAMRUか ら1987年 に導 入 した 後 、 同 大 学 寄 生

虫 学 教 室 で 継 代 飼 育 した もの で あ る 。 本 種 の幼 虫 は 、

飼 育 温 度27℃ あ る い は室 温(イ ン ドネ シ ア)の 下 で 、

50-一一一70meの くみ お き水 道 水 を入 れ た 容 量 約9flm2の デ ィ

ス ポ ーザ ブ ル カ ップ(底4cm、 高 さ8cm)を 用 い て 、

個 別 飼 育 を行 っ た 。 餌 の 投 与 方 法 は 、 若 令 幼 虫 に は 、

*1神 戸大学医学部医動物学教室

*2神 戸学院女子短期大学

*3イ ン ドネシア大学

*4イ ン ドネシア大学医学部寄生虫学教室

*5

*6

*7

*8

京都府衛生公害研究所インドネシア大学医学部病理学教室アイルランガ大学医学部寄生虫学教室

金沢医科大学附属熱帯医学研究所

一139一

ア ル テ ミ ア 、4γ'θ祝fαSalinaを1日 お き に4回 、3・4

令 幼 虫 に は 、イ ト ミ ミズ 類 を'1週 間 お きに2回 と した 。

こ の 方 法 に よ っ て 羽 化 した オ オ カ成 虫 を実 験 宿 主 と し

て 用 い た 。

接 種 ウ イ ル ス:Chikungunyaウ イ ル ス(以 下CHIK

と略)(BHK-21細 胞6代 継 代 株)は 、 神 戸 に て 継

代 培 養 され た も の を使 用 した 。Dengue1型 ウ イ ル ス

(以 下DEN-1と 略)は 、 哺 乳 マ ウ ス 脳 内 接 種 で214

代 継 代 さ れ た 望 月 株 を使 用 した 。

感 染 蚊 の 作 成:蚊 胸 部 注 入 法 を用 い た 。 こ の 方 法 は 、

Rosen&Gublerの 方 法(1974)に 準 じ て 微 量 毛 細 管

注 射 装 置(図2)を 用 い 、0.5,u1ま た は1μ'の ウ イ

ル ス 液 を蚊 胸 部 内 に 注 入 した 。

清 を炉 過 滅 菌(0.45,umフ ィ ル ター を使 用)し 、 稀 釈

後BHK-21培 養 細 胞 に て プ ラ ク定 量 を 行 っ た(山 西

ら 、1983)。 同 様 に 感 染 蚊 のhemolymphを 採 取

(Kambysellis,1978:後 述)し 、5%仔 牛 血 清 加

MEM添 加 後 、7戸過 滅 菌 を行 い 、 プ ラ ク定 量 に供 した 。

感 染 オ オ カ のhemolymphの 採 取:図3に 示 す ご と く、

洗 浄 さ れ た パ ス ツ ー ル ピペ ッ トの 両 端 を カ ッ タ ー で 切

断 し、 遠 心 チ ュ ー ブ の 長 さ よ り短 小 に す る。 そ して 、

Glasswoo1の 適 当 量 を ピペ ッ トで つ め 込 み 、 そ の 上 に

オ オ カ3匹 をつ め る 。遠 心 チ ュ ー ブ の 底 に真 綿 をつ め 、

パ ス ツ ー ル ピペ ッ トの 尖 端 が 破 損 しな い よ う に して 、

3000rpm、15分 間 遠 心 を行 っ た 。 遠 心 後 は 、 同 図 に 示

す ご と く、hemolymphを 回 収 す る こ とが で き た 。 チ ッ

プ を カ ッ タ ー で 切 断 して 、 陰 性 電 子 染 色 法 に よ る 電 子

顕 微 鏡 観 察 や ウ イ ル ス 定 量 用 サ ン プ ル に 供 し た

(Matsumura&Shiraki-lnoue,1983)o

,＼ 倉

♂"

聯鰻

図1オ オ カ(Toxorhynchites属)成 虫

図2微 量毛細管注射装置 、注射筒 、三方コ ック、ヘマ トクリッ ト管よりなる。

ウイルスの定量;-135℃ に保存 しておいた感染後2

週 間の オオカに5%仔 牛血清加MEMを 加えて乳剤 を

つ くり、 さらに3000回 転 ・5分 間冷却遠心後、その上

図3パ ス ツ ー ル ピ ペ ッ ト に よ る オ オ カ の

hemolymphの 分 離 、 オ オ カ は破 砕 さ れ て 黒

く塊 状 と な っ て い る。

図4プ ロテインA一 金法によるウイルス同定法の

原理(7)

一140一

神緑会学術誌 第5巻1989年

免 疫 電 子 顕 微 鏡 法:本 法 はRothら に よ っ て 初 め て

Postembedding法 に よ る細 胞 内 抗 原 の 同 定 に 導 入 さ れ

た 。 こ の 原 理 は 、 プ ロ テ イ ンA(Staphylococcusaureus

の 細 胞 壁 か ら単 離 さ れ た 分 子 量 約41,000の1本 鎖 ポ リ

ペ プ チ ド)が 免 疫 グ ロ ブ リ ン(主 にIgG)Fc鎖 と強

い 親 和 性 を 有 す る こ と に 基 く(Bendayan.&

Stephens,1984:図4)。

こ こ で は 、 ① オ オ カ のhemolymphを フ ォ ル ム バ ー

ル メ ン ブ ラ ン をcoatし た グ リ ッ ドに 滴 下 す る。 ② 余

分 のhemolymphを 消 紙 で 除 き、 直 ち に0.5%オ ブ ア ル

ブ ミン ーPBS上 に 浮 べ る(20～30分)。 ③PBSま た は

蒸 溜 水 上 に 浮 べ て3回 洗 浄 す る 。 ④ 適 当 にPBSで 希

釈 した 抗 血 清(CHIKに つ い て は 、 ウ サ ギ 高 度 免 疫 血

清 、DEN-1は マ ウ ス の 腹 腔 内 接 種 に よ っ て 得 ら れ た

抗 血 清 を用 い た)の 一 滴 に 浮 べ る(5～15分)。 ⑤ 適

当 にPBSま た は 蒸 溜 水 上 に 浮 か せ て7回 以 上 洗 浄 す

る 。 ⑥ プ ロ テ イ ンA一 金 粒 子 コ ロ イ ド液 上 に 浮 か べ る

(5～15分)。 ⑦PBSま た は 蒸 溜 水 上 で3回 洗 浄 す る。

⑧ 燐 タ ン グ ス テ ィ ン酸 ナ ト リ ウ ム 液(2%)で 電 子 染

色 を行 い 、JEM-1200EX電 子 顕 微 鏡(イ ン ドネ シ ア

大 学 〉 に て観 察 した 。

結 果

1.胸 腔 内接 種 され た オ オ カ に お け る ウ イ ル ス の 増 殖:

CHIK接 種 材 料 と して5×10'PFU/mlの0.5,ulお よ

び 、5×107PFU/mlの1.0,ulの2週 間 後 の プ ラ ク 値

は 表1に 示 した とお りで あ る。

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図5(a)デ ン グ1型(望 月 株)、(b)チ ク ン グ ニ ア(ア

フ リ カ 株)ウ イ ル ス の プ ロ テ イ ンA一 金 法 に

よ る 同 定 、主 と して ウ イ ル ス ・エ ン ベ ロ ー プ

(外 被)周 辺 に金 粒 子 が認 め ら れ る(倍 率:

200,000)o

表1.オ オ カ に お け るCHIKの 増 殖

接種材料C田K(PFU/m'),

接種 量PFU

オ オ カ個 体

No.PFU/オ オカ 増殖率

5×1q4:2.5×10

1*

2

3

<10

8.0×106

1.7×105

<0.4320,000

6.800

5×107・5×104,

1

23

2.6×10

6.1x106

1.6×107

520

122

320

*印 のオオ カの個体 は、CHIK接 種の不備 に よる もので、 オオカの非感

受性 を示す ものではない と考 えられる。

接 種CHIK量 が 少 な い 程(25PFU)、 オ オ カ 個 体 に

お け る ウ イ ル ス増 殖 率 は 高 く(・:11～320,000)、 接

種CHIK量 が 多 い 程(5.0×104PFU)、 各 個 体 の ウ イ

ル ス 増 殖 率 は 小 さか っ た(122～520)。

2.免 疫 電 子 顕 微 鏡 法 に よ る デ ン グ お よ び チ ク ン グ ニ

ア ウ イ ル ス の 同 定:今 回 の 予 備 実 験 で は 、 感 染 オ オ カ

よ り、 プ ロ テ イ ンA一 金 免 疫 電 顕 法 に て 、 直 接 的 に ウ

イ ル ス 同 定 す る こ とに 成 功 して い な い が 、 感 染 マ ウ ス

脳 よ りDEN-1(図5a)、 ま た 精 製CHIK(図5b)を

陰 性 電 子 染 色 法 に よ っ て 同 定 し得 る こ と を示 し て い

る。特に前者のDEN-1の 同定 は、脳乳剤の100倍 希

釈液からの直接的なウイルス検出の試みによる もので

ある。

考 察

デ ング出血熱は、高率に重症化 ・悪性化 をきたす と

ころか ら、診断の迅速性 ・簡易性 ・経済性 ・確実性が

期待 され、それに基 く治療の対応が緊急の課題である。

その上、ウイルスの生態学 ・疫学上の側面から、本疾

患の流行予測が確実にな され得 ることが、公衆衛生上

重要な課題で もある。

デングウイルスの診断のための迅速ウイルス同定法

については、蛍光抗体法 ・Peroxydase標 識抗体法 な

どの報告がなされているが、ウイルスの分離 ・同定法

となると、単なる同定法に比べて、長時間を要する。

従来、哺乳マ ウス接種法 ・感受性培養細胞接種法 ・ヤ

ブカ属(Aedes)や オオ カ属(Toxorhynchites)接 種法

一141一

などの報告があるが、オオカ法は、蚊の飼育法に梢 々

困難な条件 はある ものの、大型力で扱 い易 く、 しか も

吸血性がな く、安全 である(山 本 ・大山、1985)。

それ故、本研究では、オオカによるデ ング出血熱 ウ

,イルスの同定 ・分離法を検討す ることになった。その

結果、 オ オカ体内(主 と してhemolymph>で2週 間

以内にGHIKの 著 しい増殖が確認 され、条件が整 えば、

後 は免疫電顕法によるウイルスの同定が、お よそ2時

間以 内 で 可 能 で あ る こ とが 示 され た(Konishi&

Yamanishi,198:Soekimanetal,1986}o

今後、以下の問題点 をさらに検討する必要があろう。

① プ ロテ インm金 法 による1、2、3、4型DEN

の型別は、モノクローナル抗体 を使用 して も、不可能

であろ う。そのために、蛍光抗体法 をは じめ、他の免

疫学的方法 による型別同定法 を併用する必要がある。

②電子顕微鏡によるデ ング出血熱ウイルスの形態学的

特徴 を把握するためには、熟練が必要 とされる。③プ

ロテインA一 金法の2種 以上のウイルス粒子抗体(た

とえば外被蛋白と芯部蛋 白)に よる二重ラベル法を応

用 し、 ウイルスの同定 を二元化する。④ オオカの脳内

接種法が胸腔内接種法 よりウイルス増殖が2倍 迅速で

あるとの報告 があ り(大 山 ら、1981)、 被検材料の オ

オカ接種法の検討が必要である。

以上 の諸点が さらに検討 されなければな らないが、

本法のルーチ ン化が準備 されれば、デ ング出血熱診断

のス ク リーニ ング ・テス トとして有意義 な方法で あ

り、実用化 されることが期待 される。

謝 辞

本研 究 を行 うにあたって、Protein-A金 を恵与 さ

れた兵庫県衛生研究所微生物部主任研究員 増田邦義

博士 、また、現地 にあって本研究 を支援 して頂いたイ

ン ドネ シ ア大 学 医 学 部 長AsriRasad教 授、Sri

Oemijati教 授、お よび、PinardiHadidjaja博 士に対 し

て深謝す る。最後 に、本研究は昭和63年 度社団法人神

緑会研 究助成および文部省科学研究費海外学術研究補

助金(1987--1988年 度)の 補助 によって行われた。 こ

こに改めてお礼 を申し上げる次第である。

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一142一