Kursskript zum Modul - uni-tuebingen.de · Name Kurs A B C Matrikel-Nr Testat Kurstage 4 & 5 Betreuer (Name) Kursskript zum Modul Molekulare Biologie I Wintersemester 2017/2018

Name Kurs A B C Matrikel-Nr

Testat Kurstage 4 & 5 Betreuer (Name)

Kursskript zum Modul

Molekulare Biologie I

Wintersemester 2017/2018

Kurstag 4 Transformation / Transposition 1 (AG)

Kurstag 5 Transformation / Transposition 2 (AG)

Modul Molekulare Biologie I Kursskript WiSe17 Teil 4/5 Transformation/Transposition

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30 min 30°C

Transposonmutagenese ansetzen Infektion von E.coli CSH74 mit λ::Tn5

Transformation Arabidopsis: Inkubation mit Agrobakterien

4. Transformation / T-DNA / Transposons Allgemeine Genetik

Übersicht über die Versuche der Praktikumstage Kurseinheit 4 / 5

I) Transposonmutagenese bei E.coli (Versuch 1) II) Transformation mit Agrobakterium tumefaciens zur Erzeugung transgener Pflanzen

zur Genexpression (Versuch 2) III) T-DNA-Insertionsmutanten (Versuch 3)

¨ Kurseinheit 4: Durchführung Versuch 1 und Versuch 2

¨ Kurseinheit 5: Auswertung Versuch 1 und Versuch 2

Durchführung Versuch 3

Übersicht Kurseinheit 4 Einführung

45 min 30°C

Transposonmutagenese Mediumswechsel für die Transposition

Transposonmutagenese Überführen der Zellen in SM-Puffer, plattieren auf Selektionsmedium

Verdünnungsreihe vorbereiten Bestimmung des Phagentiters

Transformation Arabidopsis: Abspülen und Abtöten der Agrobakterien Überführen in GUS-Färbelösung


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CAT-Aktivität berechnen

30 min zentrifugieren Einführung

Übersicht Kurseinheit 5

Proteinrohextrakte herstellen WT, CAT2-‐KO, CAT2/3-‐KO

Proteinrohextrakte: Überstand abnehmen, auf Eis stellen

Proteingehalt bestimmen CAT-Aktivität photometrisch messen

1) Transposonmutagenese

auswerten 2) Transformation Arabidopsis

Auswerten, Zeichnung anfertigen


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4.I Transposon-Mutagenese in E. coli (Versuch I)

4.I.1 Theoretischer Hintergrund

Transponierbare Elemente sind genetische Elemente, die sich selbst aus dem Genom ausschneiden und an anderer Stelle wieder integrieren können. Sie werden auch als so genannte “springende Gene“ bezeichnet. Die Integration in die Ziel-DNA erfolgt dabei über illegitime Rekombination an beliebigen Stellen. Die einfachsten transponierbaren Elemente sind die IS-Elemente (Insertionselemente), die nur aus kurzen umgekehrten Sequenzwiederholungen an den Enden (inverted repeats) und einem offenen Leserahmen für die Transposase bestehen. Das Enzym Transposase setzt bei der Transposition einen versetzten Schnitt in die Ziel-DNA, so dass durch diesen Mechanismus an den Enden der IS-Elemente kurze direkte Sequenzwiederholungen (direct repeats) zu finden sind, die aber ursprünglich aus der Wirts-DNA stammen (Abb. 26). Abb. 26. Transposition eines IS-Elements

Transposons besitzen neben der Fähigkeit zur Transposition (inverted repeats und Transposasegen) noch mindestens eine weitere genetische Information, meist eine Antibiotikum-Resistenz (z.B. eine Kanamycin-Resistenz bei Tn5). Das im Kurs verwendete Transposon Tn5 (Abb. 27) gehört zu den zusammengesetzten Transposons, diese werden von IS-Elementen flankiert. Dabei ist eines der beiden IS-Elemente so mutiert, dass davon keine intakte Transposase mehr exprimiert werden kann. Abb. 27. Struktur des Transposons Tn5

IR

IS-Element

IR

Transposase IS-Element

DR IR IR DR

Transposase

Tn5

Kanr IS50 R

Stop-Codon

Transposase

IS50 L

DR IR IR DR Transposase

DR IR IR DR


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Durch die Transposition von Tn5 wird das Antibiotikum-Resistenzgen an einer beliebigen Stelle der bakteriellen DNA inseriert. Erfolgt die Insertion in ein Gen, so kann dieses Gen dadurch inaktiviert werden. Transposons werden deshalb häufig zur Mutagenese verwendet, da der Genort durch das Transposon markiert ist und somit durch molekulare Methoden (Hybridisierung oder Sequenzierung) leicht aufgefunden werden kann.

Es lassen sich prinzipiell zwei verschiedene Transpositionsmechanismen unterschieden. Durch eine replikative Verdopplung des Elementes (z.B. Tn3) kann es unter Beibehaltung der ursprünglichen Genomposition in eine zweite, neue Position eingefügt werden. Andere Elemente (z.B. Tn5) können ihre ursprüngliche Genomposition verlassen (Exzision) und in eine andere Stelle des Genoms integriert werden (Insertion).

In diesem Versuch wird das Transposon Tn5 verwendet. Dieses muss zunächst in die Bakterienzellen eingeschleust werden. Dazu wird ein Bakterienvirus, der Bakteriophage l, benützt, der die E. coli-Zelle infiziert und sein eigenes Genom in die Zelle einbringt. Unter energetisch günstigen Bedingungen wird nun das Phagengenom vermehrt, es werden Phagenhüllproteine gebildet, neue Phagen entstehen, die E. coli-Zelle wird lysiert und setzt neue Phagen frei. Der Phage l hat aber auch die Möglichkeit unter energetisch eher schlechten Bedingungen, sich an einer bestimmten Stelle (attachment site) in das Bakteriengenom zu integrieren und in stillgelegter Form diese ungünstigen Bedingungen zu überdauern (lysogener Phage oder Prophage). Er wird dann mit dem Bakteriengenom bei dessen Vermehrung mitrepliziert und so auf die Tochterzellen weitergegeben.

Tn5


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Man verwendet in diesem Versuch eine l-Mutante (l::Tn5), die zusätzlich ein Tn5-Transposons enthält als sogenanntes Trägerreplikon. Ein Replikon ist eine selbständig replizierende Einheit, die einen “origin of replication“ besitzt, z.B. das Bakteriengenom, ein Plasmid oder ein Phagengenom. Transponierbare Elemente sind keine unabhängigen Replikons; sie können aber von einem Replikon zum anderen "springen", in unserem Fall also vom Phagengenom ins Bakteriengenom. Eine Transposition kann dann dadurch nachgewiesen werden, dass das Resistenzgen mit dem Transposon von einem Replikon (Trägerreplikon) auf ein anderes (Zielreplikon) gesprungen ist. Wird nun eine Kanamycin-sensitive (Kms) Bakterienzelle von einem l::Tn5 infiziert, kann mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit Tn5 in das Bakteriengenom springen. Die Transposition lässt sich aber nur dann erkennen, wenn das Phagengenom nicht repliziert und damit eliminiert wird. Dies wird durch die Eigenschaften der l-Mutante gewährleistet. Die l-Mutante hat folgende genetische Konstitution: 1) Oam, Pam

(amber Mutationen in den Replikationsgenen O und P), dies bedeutet, dass der Phage sich nicht selbstständig replizieren kann, und 2) Δatt (Deletion der "attachment site"), d.h. der Phage kann nicht mehr ins Bakteriengenom als lysogener Phage integriert werden. Die Nachkommen der infizierten Zellen sind also nur dann kanamycinresistent, wenn eine Transposition von Tn5 ins Bakteriengenom erfolgt ist.

4.I.2 Ziel des Versuchs

Abschätzung der Transpositionshäufigkeit nach Infektion von kanamycinsensitiven E. coli-Zellen mit λ::Tn5 und anschließender Selektion auf kanamycinhaltigem Medium.

4.I.3 Durchführung

4.I.3.1 Infektion von E. coli CSH 74 mit λ::Tn5

¨ Der Stamm E. coli CSH 74 wird in LBMgMal-Medium bei 37 °C über Nacht angezogen.

¨ Die Zellen aus 1 ml der ÜN-Kultur werden im Eppendorf-Cup abzentrifugiert (5000 Upm, Biofuge, 5 min) und in 0,5 ml LBMgMal suspendiert (dies entspricht ca. 109 Zellen).

¨ 100 µl des λ::Tn5-Lysates werden zugegeben, mit einer moi (multiplicity of infection; Phagen/Bakterienzelle), die zwischen 1 und 50 liegt.

¨ Vorsichtig mischen; anschließend 30 min bei 30 °C inkubieren, in dieser Zeit soll die Infektion erfolgen

¨ Zellen erneut abzentrifugieren, in 1 ml LBPP3 aufnehmen und anschließend 1 h bei 30 °C inkubieren, in dieser Zeit soll nun die Transposition von Tn5 stattfinden.

¨ Zellen erneut abzentrifugieren, in 2,0 ml SM-Puffer aufnehmen und 0,2 ml auf eine LBKM-Platte ausplattieren.


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4.I.3.2 Kontrolle

¨ Gleiche Menge Bakterien statt mit Phagen, mit der entsprechenden Menge LBMgMal mischen und wie oben behandeln.

4.I.3.3 Bestimmung der Phagenzahl

¨ E. coli C600-Kultur in LBMgMal flüssig gewachsen (späte log-, beginnende Stationärphase) wird mit λ im Tropftest infiziert.

¨ Verdünnung des Lysates in SM Puffer vor dem Auftropfen bis 10-8 (siehe Pipettierschema unten)

¨ Herstellen der Titerplatte beginnt mit der Kennzeichnung. Die Beschriftung der Platte sollte, neben der Identifikation der Versuchsgruppe, 4 kleine Kreise auf der Bodenseite enthalten, die die Tropfmarkierung darstellen. Jeder Kreis ist noch mit der entsprechenden Verdünnungsstufe des λ-Lysates -2, -4, -6, -8 zu kennzeichnen

¨ Ausgießen von 0.1 ml E. coli-C600 Suspension mit 3 ml Weichagar (ca. 50 °C), auf eine LBMgMal-Platte. Dabei das Weichagarröhrchen direkt am Wasserbad sofort nach Bakterienzusatz unter Drehbewegung auf beschrifteter Platte ausgießen und rasch durch wippende/kreisende Bewegung der Platte gleichmäßig verteilen. Vorsicht, der WA erstarrt sehr schnell.

¨ auf den Rasen (in die markierten Kreise) aus der jeweiligen Verdünnungslösung 10 µl (= 0,01 ml) pipettieren, gut einziehen lassen, Inkubation über Nacht bei 37 °C

10 µl

990 µl SM

10 µl

990 µl SM

10 µl

990 µl SM

990 µl SM

10 µl

λ-Lysat

10-2 10-4 10-6 10-8

jeweils 10 µl auftropfen


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4.I.4 Material und Geräte

• - Pipetten • - 0,5 ml LBMgMal • - 2 ml LBPP3

• - 1 Röhrchen mit 10 ml SM-Puffer • - 2 Platte LBKm • - 1 LBMgMal-Platte • - 1 Röhrchen Weichagar (3 ml) • - 1 Trigalskispatel • - 6 Eppendorfcups • - Pipettenspitzen weiß/gelb

Medien

• SM-Puffer: • 100 mM NaCl • 10 mM MgSO4 • 20 mM Tris/HCl pH 7,5

LB - Medium:

• 10 g Bactotryptone • 5 g Hefeextrakt • 10 g NaCl mit NaOH auf

pH7,4 LBMgMal:

• LB-Medium mit 10 mM MgCl2 und 0,4 % Maltose

LBPP3-Medium:

• LB-Medium mit 3 mM Na4P2O7.10

Medienzusätze

• Thiamin: 1 µg/ml • Agar: 15 g/l für Festmedien • 6,5 g/l für WA

Stämme

• E. coli CSH74, E. coli C600 • Lysat • 110 µl l::Tn5-Lysat


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4.I.5 Pipetierplan Transposonmutagenese mit Tn5 Tn5 Mutagenese Kontrolle Bemerkung

Zellen (E. coli Csh74 ÜN-Kultur)

1 ml 1 ml

3 min bei 5000 rpm in der Mikrofuge abzentrifugieren

Zellen in LBMgMal-

Medium resuspendieren 0,5 ml LBMgMal 0,5 ml LBMgMal Vortexer benutzen

Zugabe von l::Tn5 100 µl -

Zugabe von LBMgMal - 100 µl

¨ Beide Ansätze vorsichtig mischen (kein Vortexen)

¨ 30 min bei 30 °C inkubieren (Adsorbtion und Infektion)

¨ Zellen 3 min bei 5000 rpm in der Mikrofuge abzentrifugieren

Zellen in LBPP3-Medium resuspendieren 1 ml 1 ml

¨ 60 min bei 30 °C inkubieren (Transposition)

¨ Zellen 3 min bei 5000 rpm in der Mikrofuge abzentrifugieren

Zellen in SM-Puffer resuspendieren 0,2 ml 0,2 ml

Auf LBKm-Platten ausplattieren 0,2 ml 0,2 ml

Inkubation der Platten bei 37°C ÜN (hängend)


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4.I.6 Auswertung

Tn5 Mutagenese Kontrolle Bemerkungen

Anzahl resistenter Kolonien auf LBKm-Platten

Falls auf der Kontrollplatte resistente Kolonien zu sehen sind, müssen diese von den Transpositionsplatten abgezogen werden

Anzahl resistenter Kolonien pro ml Phagenlysat

Es wurde nicht 1 ml des Phagenlysats für dieses Experiment eingesetzt, sondern nur 100 µl, außerdem wurde nicht der gesamte Versuchsansatz ausplattiert

Anzahl der Phagen-plaques im Verdünnungstropfen

Die Einzelplaques können entweder in der 10-6 oder der 10-8 Verdünnung ausgezählt werden

Anzahl der Phagen-pro ml Lysat

Es wurde nicht 1 ml des Phagenlysats auf die Platte sondern nur 10 µl aufgetropft, außerdem muss die Verdünnung berücksichtigt werden.

Bestimmen sie nun die Transpositionsfrequenz in Bezug auf die eingesetzte Phagenzahl. Transpositionsfrequenz = Zahl der resistenten Bakterien pro ml Phagenlysat Zahl der eingesetzten Phagen pro ml Phagenlysat Transpositionsfrequenz:


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Weshalb kann sich der Phage l::Tn5 in dem E. coli-Stamm C600 vermehren, wohingegen in CSH74 keine Phagenvermehrung stattfindet? Wie würde die Phagentiterplatte aussehen, wenn Sie die beiden Stämme verwechselt hätten? Wie würden die LBkan-Platten aussehen? Kurze Begründung Warum wird die mit diesem Experiment bestimmte Transpositionsfrequenz etwas unter dem eigentlichen Wert für die Transpositionsrate von TN5 liegen?


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4.II. Pflanzentransformation durch Agrobacterium tumefaciens zur Erzeugung von transgenen Pflanzen zur Genexpression (Versuch 2)

4.II.1 Theoretischer Hintergrund

Als Transformation bezeichnet man die Aufnahme von freier DNA in lebende Zellen. Die Expression der auf dieser DNA codierten Proteine kann zu einer Veränderung des Phänotyps (morphologische/physiologische Eigenschaften) führen. Für die Aufnahme von "nackter" DNA sind manche Zellen (wie z.B. einige Bakterienspezies) von Natur aus befähigt, oder sie können die Kompetenz dazu durch geeignete Vorbehandlung erlangen (wie z. B. Transformation bei E. coli). Auch bei Pflanzen ist ein direkter DNA-Transfer möglich. Allerdings gibt es kein natürliches Kompetenzstadium wie bei einigen Bakterien. Die DNA kann über verschiedene Techniken in die Pflanzenzellen eingeschleust werden.

4.II.1.1 Protoplastentransformation

Da Zellen in Gewebeverbänden oft schwieriger zu transformieren sind, werden häufig zunächst Einzelzellen in Form von Protoplasten hergestellt. Hier werden, mit Hilfe der Enzyme Cellulase und Mazerozym, die Zellen aus dem Gewebeverband herausgelöst und von ihrer Zellwand befreit, wodurch sie eine runde Form annehmen. Diese Einzelzellen können nun durch verschiedene Behandlungen dazu gebracht werden, DNA aufzunehmen. PEG: Die erfolgreiche Aufnahme von Nukleinsäuren in Protoplasten setzt zunächst einmal einen möglichst engen Kontakt voraus. Da sowohl die Nukleinsäuren als auch das Plasmalemma negative Ladung tragen, benutzt man als Vermittler positiv geladene bivalente Kationen wie Ca2+ oder Mg2+. Mit Hilfe von Polyethylenglykol wird die Zelle dazu veranlasst, die an der Oberfläche angelagerten Nukleinsäuren durch Einstülpungen und Vesikelbildung in den Protoplasten aufzunehmen (Endocytose). Elektroporation: Man kann die Durchlässigkeit von Biomembranen kurzfristig durch elektrische Pulse erhöhen ohne die Membranstruktur nachhaltig zu zerstören. Ursprünglich nahm man an, dass durch diese Behandlung kurzfristig offene Poren entstehen, durch die Moleküle frei diffundieren können. Heute nimmt man aber an, dass die elektrophoretische Beweglichkeit der DNA ebenfalls eine wichtige Rolle spielt. Die elektrische Pulslänge bzw. -stärke ist dabei abhängig vom Objekt und muss zunächst erstmal ermittelt werden. Mikroinjektion: Die Mikroinjektion mit Glaskapillaren hat sich vor allem in der medizinischen/tierischen Forschung durchgesetzt. Die freie Beweglichkeit der Protoplasten und die großen Vakuolen sind bei Pflanzenzellen Hindernisse für die Anwendung dieser Methode. Silkonfasern: Silkoncarbidfasern können wie Mikroinjektionsnadeln wirken, wenn man sie zusammen mit DNA zu Protoplasten gibt.


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Liposomen: Hier wird die DNA zusammen mit Phospholipiden unter bestimmten Bedingungen inkubiert, was dazu führt, dass die Nukleinsäuren in Liposomen eingeschlossen werden. Die Liposomen können dann mit den Protoplasten fusionieren. Eine der großen Schwierigkeiten bei all diesen Methoden stellt die Regeneration von ganzen Pflanzen aus den transformierten Protoplasten dar, die bei manchen Spezies bisher auch noch nicht gelungen ist. Über verschiedene Regenerationsmedien mit unterschiedlichen Hormonkonzentrationen und -zusammensetzungen wird erreicht, dass sich die Protoplasten teilen und sich dann aus einem zunächst undifferenziert wachsendem Zellhaufen (Kallus) Spross- und Wurzelgewebe entwickelt und eine ganze Pflanze regeneriert werden kann.

4.II.1.2 Gewebetransformation

Partikelbombardment: Bei dieser Technik werden die zu transformierenden Nukleinsäuren an Gold- oder Wolframpartikel adsorbiert und dann mit hoher Geschwindigkeit in Pflanzenzellen eingeschossen. Der Partikeldurchmesser beträgt 2 µm. Damit können Zellen, aber auch intaktes Gewebe transformiert werden. Hier stellt sich das Problem, dass nicht alle Zellen einer Pflanze transformiert, werden. Will man vollständig transgene Pflanzen erzeugen, muss man auch hier über Gewebekultur und Regeneration gehen. Einfacher ist es, wenn man Meristemzellen transformiert aus denen sich dann mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit transformierte Pollen und/oder Eizellen entwickeln können. Agrobakterienvermittelter Gentransfer: Es gibt aber auch ein sehr effizientes biologisches Transformationssystem, bei dem Pflanzenzellen im Gewebeverbund mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens transformiert werden. Es handelt sich hier um eine natürliche Übertragung von Genmaterial von Pro- auf Eukaryoten. Der Mechanismus der Genübertragung, soweit man ihn bisher kennt, ist dem Konjugationstransfer zwischen Bakterien sehr ähnlich. Die T-DNA, ein ca. 20 - 25 kb langes Stück DNA des mehr als 150 kb großen Ti-Plasmids, wird als DNA-Einzelstrang im Agrobakterium erzeugt. Dabei spielen die an anderer Stelle im Plasmid lokalisierten vir- (Virulenz) Gene eine entscheidende Rolle. Sie werden durch Signalstoffe der Pflanze induziert und die Genprodukte der vir-Gene wirken in trans auf die Enden der T-DNA und führen so zur Excision eines Einzelstrangs der T-DNA, zur Übertragung in die Pflanzenzelle, zum Einschleusen in den Zellkern und vermutlich dort auch zur Integration ins Pflanzengenom. Die Voraussetzungen für diese Transformation sind:

Ø eine Verletzung des Pflanzengewebes Ø die Freisetzung der Signalstoffe Ø eine Infektion mit Ti-Plasmid-tragenden Agrobakterien an dieser Stelle.

Die Transformation mit natürlichen Agrobacterium tumefaciens (pTi) Stämmen lässt sich anhand der Tumorgenese (Ausbildung so genannter Wurzelhalsgallen) an der Infektionsstelle erkennen. Die Tumorbildung tritt ein, weil auf der übertragenen T-DNA Gene liegen, deren Genprodukte die Synthese von Auxin und Cytokinin im transformierten Gewebe anregen und somit Dedifferenzierung und Gewebeproliferation (Tumorbildung) auslösen (siehe Abb. 28).


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Abb. 28. Prinzip der Tumorbildung

Der biologische Sinn dieser morphologischen Veränderung wird dadurch verständlich, dass noch weitere Gene mit der T-DNA eingeschleust werden, deren Genprodukte zur Herstellung so genannter Opine (Aminosäurederivate) im Tumorgewebe führen. Interessanterweise können Opine nicht von der Wirtspflanze weiterverwertet werden, wohl aber von Agrobacterium tumefaciens Stämmen, die das Ti-Plasmid tragen (siehe Abb. 29/ Abb. 30). Die Gene, die für die Enzyme des Opin-Abbaus kodieren (Opine können als C- und N-Quelle dienen), liegen nämlich auch auf dem Ti-Plasmid, aber außerhalb der T-DNA. Sind diese Gene aktiv (die Expression wird durch das Substrat induziert) dann wird auch gleichzeitig der Konjugationstransfer von pTi auf Ti-freie Agrobakterien induziert.

Abb. 29. Struktur des Ti-Plasmids

Cytokinine

Auxine

T-DNA right border left border

aux

opiK vir A-G

Ti-Plasmid

Transfergene: Die Genprodukte sind für die Übertragung des Ti-Plasmids auf Agrobakterien mittels Konjugation verantwortlich.

Opinsynthese: Die Genprodukte sind an der Synthese von Opinen als C-und N-Quelle beteiligt.

Opinkatabolismus: Die Genprodukte sind für den Abbau von Opinen als C-und N-Quelle verantwortlich.

Virulenzgene: Die Genprodukte sind für die Übertragung einer einzelsträngigen T-DNA in die Pflanzenzelle verantwortlich.

Bordersequenzen: Diese Sequenzen werden von den Vir-Genprodukten erkannt.

Die Genprodukte sind für eine erhöhte Produktion von Auxinen und Cytokininen verantwortlich.

cyt opiS

tra


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Daraus ergibt sich folgende pTi abhängige Signalkette:

Abb. 30. Ti-Plasmid-abhängige Signalkette

Opinverwertung: Opine werden von Agrobacterium (pTi) aufgenommen, sie induzieren da Gene für ihren eigenen Abbau und die Weiterverwertung, gleichzeitig wird der Konjugationstransfer des Ti-Plasmids auf plasmidfreie Rezipienten stimuliert (5)

T-DNA

vir tra

opiK

T-DNA

Acetosyringone: verletzte Pflanzen scheiden Signalstoffe aus, die auf die Virulenzgene, die auf dem Agrobacterium Ti-Plasmid lokalisiert sind, induzierend wirken (1)

Auxin, Cytokinin: transformierte Pflanzenzellen produzieren Pflanzenwuchs-stoffe, die Tumorgenese bewirken (3)

T-DNA

vir tra

opiK

T-DNA: Transfer der T-DNA mittels aktivierter vir-Gene von Agrobacterium (pTi) in die Pflanzenzelle (2)

Pflanzenzelle

Opine: transformierte Zellen produzieren Opine, die an die Umgebung abgegeben werden können (4)

Agrobacterium tumefaciens

Pflanze

tra T-DNA


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Somit kann die Ausbreitung des pTi den Anteil substratverwertender, pflanzenvirulenter Agrobakterienzellen in der natürlichen Population erhöhen, um über die Infektion von Pflanzen neue Nahrungsquellen zu erschließen.

Praktische Anwendung in der Gentechnik: Der molekulare Mechanismus der Agrobakterien-vermittelten Transformation kann auch zur Übertragung fremden Genmaterials ausgenutzt werden. Essentiell für den T-DNA-Transfer und die Integration ins Pflanzengenom sind nur die kurzen repetitiven Enden der T-DNA (ca. 25 bp), die sogenannten Bordersequenzen. Das gesamte dazwischenliegende Genmaterial (Gene für Opinsynthese, Pflanzenwuchsstoffe usw.) kann deletiert werden, ohne dass der Mechanismus, der über die trans-aktiven vir-Gene wirkt, beeinträchtigt wird. Anstelle der deletierten Regionen können beliebige Gene eingebaut werden, diese werden dann anstatt der natürlichen T-DNA transferiert. Allerdings bleibt bei solchen Transformationen aufgrund des Fehlens der Hormongene (Auxin, Cytokinin) die Tumorgenese aus und die Transformation kann nicht erkannt werden. Durch gleichzeitige Übertragung anderer selektierbarer Markergene (z.B. Antibiotikaresistenzgene) als Teil künstlicher T-DNA-Konstrukte kann jedoch eine Identifizierung der transformierten Zellen sichergestellt werden. Dazu haben sich Transformationsmethoden bewährt, die von Gewebestücken oder Organen (Blattstücke bei Tabak, Wurzeln oder Wurzelstücke oder Blüten bei Arabidopsis) ausgehen, die mit geeigneten Agrobakterien-Stämmen, die die manipulierten T-DNA-Konstrukte enthalten, infiziert werden. Die infizierten Gewebeteile oder Organe werden dann auf antibiotikahaltigen Selektionsmedien kultiviert, bzw. bei der Blütentransformation werden die Samen auf ein entsprechendes Medium ausgelegt. Darauf können nur transformierte Zellen überleben, die dann proliferieren und unter geeigneten Bedingungen (Hormonzusammensetzung des Mediums) zu transgenen Pflanzen regenerieren. Transgene Pflanzen enthalten in allen Zellen das ursprünglich über Agrobakterium-Transformation eingeführte Genmaterial, dessen Ausprägung nun untersucht werden kann. Eine Regeneration von Pflanzen aus Tumorgewebe ist in der Regel nicht möglich, da die Gene der natürlichen T-DNA eine zu starke Veränderung der Hormonspiegel erzeugen (siehe Abb. 30, S. 42). Daher werden die Gengruppen, die für die Produktion der Hormone zuständig sind, deletiert. Lediglich bei Verwendung von Agrobacterium rhizogenes (pTi) zur Transformation kann anschließend aus dem proliferierenden wurzelartigen Gewebe die Regenerierung von Pflanzen eingeleitet werden. Für diese Art der Transformation gibt es verschiedene Anwendungsmöglichkeit, z. B. kann untersucht werden, welche Auswirkung eine starke andauernde Expression eines Genes auf das Wachstum und die Entwicklung einer Pflanze hat. Mit Hilfe von sogenannten Reportergenen, das sind Gene deren Genprodukte mit einfachen Verfahren nachweisbar sind wie z.B. Beobachtung von Fluoreszenzlicht oder auch einer Farbreaktion, kann man Promotorregionen von bestimmten Genen testen und sichtbar machen in welchem Gewebe oder zu welchem Zeitpunkt das Gen, das sie normalerweise kontrollieren, exprimiert wird.


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Eine zweite sehr wichtige Anwendung der Agrobakterien-vermittelten Transformation von T-DNA ist das Erzeugen von mutanten Linien (T-DNA-Insertionslinien) durch T-DNA-Mutagenese. Dabei wird die T-DNA nicht zur Übertragung von bestimmten Genen verwendet, sondern ihre Eigenschaft ausgenutzt, zufällig ins pflanzliche Genom zu integrieren. Diese zufällige Integration kann in kodierenden Regionen passieren, so dass dadurch ein bestimmtes Gen mutiert wird (knock-out). Da man die Sequenz der verwendeten T-DNA kennt, hat man nun die Möglichkeit, die Sequenzen, die den Integrationsort flankieren, leicht zu bestimmen und somit das defekte Gen zu identifizieren und zu charakterisieren. Für Arabidopsis gibt es mittlerweile einige große Kollektionen solcher T-DNA-Insertionslinien, die es ermöglichen, relativ schnell eine Knock-out Mutante für ein bestimmtes Gen zu finden. Mit Hilfe dieser Knock-out-Mutanten kann man versuchen, die Funktion eines Gens näher zu charakterisieren.

Die Erzeugung von transgenen Pflanzen mit Hilfe von Agrobakterien-vermitteltem Gentransfer kann allerdings nicht bei allen Pflanzen eingesetzt werden.

4.II.2 Ziel des Versuches

Die Agrobakterien-vermittelte Transformation soll bei Arabidopsiskeimlingen durchgeführt werden. Mit Hilfe der T-DNA soll ein sogenanntes Reportergen in die Pflanzenzellen eingeschleust werden, das für ein Enzym, die β-Glucoronidase, kodiert. Dieses ist in der Lage, ein farbloses Substrat in eine blaue Substanz umzuwandeln. Die erfolgreiche Transformation kann also anhand einer Gewebefärbung nachgewiesen werden, wenn das Reportergen durch einen starken Promotor getrieben wird.

Agrobakterien-Stämme:

GV 3101: Agrobakterienstamm, der ein Ti-Plasmid trägt, das zwischen den Bordersequenzen der T-DNA das Gen für die β-Glucoronidase (uid A) trägt, allerdings ohne Promotor.

GV 3101+: Agrobakterienstamm, der ein Ti-Plasmid trägt, das zwischen den Border-sequenzen der T-DNA das Gen für die β-Glucoronidase (uid A) mit einem starken vorgeschaltenen Promotor trägt.

Pflanzenmaterial:

Arabidopsis-Keimlinge (Ökotyp Col-0), die ca. 4 Wochen auf MS-Medium angezogen wurden.


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4.II.3 Durchführung

Die Zellen einer Übernachtkultur der beiden Agrobakterienstämme werden zunächst abzentrifugiert und in Infiltrationsmedium resuspendiert, so dass sie eine OD600nm von 1,0 aufweisen.

¨ Sie erhalten jeweils 2 ml der Bakteriensuspension, die bereits auf die richtige OD eingestellt wurde.

¨ Die Pflanzen werden nun vorsichtig mit der Pinzette aus dem MS-Medium gezogen und möglichst mit der intakten Wurzel in eine 2 ml Eppendorf-Gefäß überführt und kurz mit Wassere abgespült.

¨ Die Pflanzen werden dann jeweils mit einer der beiden Agrobakterien gut bedeckt und auf einem Schüttler niedertourig geschüttelt.

¨ Nach 20-40 min wird die Agrobakterien-Suspension wieder entfernt.

¨ Die Pflanzen werden nun 2 x mit H2O, das Cefatoxim enthält, gewaschen, um die restlichen Bakterien abzutöten.

¨ Die Pflanzen werden dann anschließend in 3-5 ml eine Färbelösung gebracht, die das Substrat X-GlcA (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-b-D-Glucuronid) enthält, um die Expression des Reportergens anhand der Blaufärbung in den transformierten Zellen nachzuweisen.

¨ Für den Substratumsatz werden die Pflanzen in der Färbelösung über Nacht bei 37 °C inkubiert.

¨ Anschließend wird die Färbelösung entfernt und die Pflanzen werden in 70% Ethanol fixiert, das gleichzeitig das Chlorophyll auswäscht und eine Entfärbung der Blätter herbeiführt.

4.II.4 Medien und Puffer:

Infiltrationsmedium:

• ½ x MS Salze (micro and macro elements; 2,151 g/l) • 1x Vitamine (1000x 0 1,031 g/10ml) • 5% (w/v) Saccharose • pH 5,7 mit KOH einstellen • nach dem Autoklavieren und direkt vor Benutzung 0,05% (v/v) SILWET L-77

zugeben.


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MS-Medium:

• 1x MS Salze (4,302 g/l) • 1x MS Vitamine (s.o.) • 0,8% Agar • pH 5,7

Färbelösung:

• 0,5 M EDTA pH 8,0 • 0,2 M Natriumphosphat pH 7,5 • 0,1 M Kaliumferrocyanid • 0,5 M Kaliumhexacyanoferrat • 0,1% Triton X • X GlcA in DMSO (0,3 mg/ml) • H20

Wasser zum Waschen:

• mit 250 mg/l Cefatoxim

4.II.5 Auswertung

Betrachten Sie Ihre transformierten Keimlinge zunächst mit dem Auge, später mit dem Binokular. Gibt es einen Unterschied zwischen den beiden transformierten Keimlingen? Worauf beruht dieser?


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Fertigen sie eine Skizze des angefärbten Keimlings an und zeichnen Sie die gefärbten Stellen ein. Wie unterscheidet sich die von Ihnen transformierte T-DNA von der unten gezeigten T-DNA eines Wildtyp-Agrobakteriums? Welchen Vorteil bietet die T-DNA Mutagenese gegenüber einer chemischen Mutagenese?

T-DNA right border left border opiS aux cyt


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5. T-DNA Insertionsmutanten (Versuch 3)

5.I Theoretische Einführung

Eine zweite sehr wichtige Anwendung der Agrobakterien-vermittelten Transformation von T-DNA ist das Erzeugen von mutanten Linien (T-DNA-Insertionslinien) durch T-DNA-Insertionsmutagenese. Dabei wird die T-DNA nicht zur Übertragung von bestimmten Genen verwendet, sondern ihre Eigenschaft, zufällig ins pflanzliche Genom zu integrieren, ausgenutzt. Diese zufällige Integration kann in kodierenden Regionen passieren, so dass dadurch ein bestimmtes Gen mutiert wird (knock-out). Da man die Sequenz der verwendeten T-DNA kennt, hat man nun die Möglichkeit die Sequenzen, die den Integrationsort flankieren, leicht durch Sequenzierung zu bestimmen und somit das defekte Gen zu identifizieren und zu charakterisieren. Für Arabidopsis gibt es mittlerweile einige große Kollektionen solcher T-DNA-Insertionslinien, die es ermöglichen relative schnell eine Knock-out-Mutante für ein bestimmtes Gen zu finden. Mit Hilfe dieser Knock-out-Mutanten kann man versuchen, die Funktion eines Gens näher zu charakterisieren.

Im Praktikum stehen verschiedene Pflanzenlinien zur Verfügung, die eine T-DNA Insertion in einem der Catalasegene bzw. in zwei der drei Arabidopsis Catalasegene tragen. Die T-DNA, die für diese Mutagenese eingesetzt wurde, leitet sich ebenfalls von der T-DNA des Ti-Plasmids von Agrobakterium tumefaciens ab, trägt aber auch nicht mehr die “Hormongene“ (für Auxin-, Cytokininsynthese) und die „Opinsynthesegene“. Diese wurden durch ein Hygromycinresistenzgen ersetzt. Die Catalase-Knock-out-Linien stammen vom Salk-Institut, das eine sehr große Kollektion von T-DNA Insertionslinien für Forschungszwecke zur Verfügung stellt. In den Salk-Linien wurde für eine Vielzahl von zufällig ins Genom integrierten T-DNAs durch Sequenzierung und Abgleich mit der Arabidopsis-Genomsequenz die Insertionsorte der T-DNAs bestimmt. Das Salk -Institut stellt aber nicht notwendigerweise homozygote Linien für die jeweiligen T-DNA Insertionsstellen zur Verfügung, d.h. man kann zwar Samen für einzelne Linien bestellen, muss aber zuerst mit Hilfe einer PCR herausfinden, ob diese Linien für die T-DNA Insertion im gewünschten Gen homozygot, heterozygot oder wildtypisch sind d.h. die T-DNA Insertion in einem Allel, in beiden Allelen oder im schlechtesten Fall in keinem Allel trägt. Dazu werden Primer benützt, die jeweils spezifisch die Sequenzen der Catalasegene erkennen. Diese werden jeweils miteinander und mit einem Primer, der die T-DNA Left-Border Sequenz erkennt, kombiniert (Abb. 31).


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Abb. 31. Prinzip des Nachweises einer T-DNA-Insertion mittels PCR

T-DNA Insertionen in Exonbereichen von Genen sorgen häufig dafür, dass das Gen, in das die T-DNA eingebaut wurde, nicht mehr korrekt, sondern nur unvollständig abgelesen wird und die verkürzte mRNA dann schnell wieder abgebaut wird. Bei einer Insertion in einen Intronbereich bzw. auch in den Promotorbereich eines Gens kann ebenfalls die Expression des Gens gestört sein, hier ist es allerdings auch möglich, dass die mRNA nach wie vor korrekt gebildet wird. Dies muss auf jeden Fall zunächst überprüft werden, bevor man hier von einem funktionellen Knock-out des Genes sprechen kann. Hier wird häufig über eine PCR nachgeschaut, ob der Bereich der mRNA, downstream der T-DNA liegt, in der Zelle gebildet wird und stabil ist. Dazu wird die gesamte mRNA, die sich aus einer Zelle isolieren lässt mit Hilfe einer reversen Transkriptase in cDNA umgeschrieben und mit spezifischen Primern aus dem 3´-Bereich des entsprechenden Genes wird überprüft, ob diese mRNA in der Gesamt-RNA-Population vertreten ist. Hier muss man aber beachten, dass dieser Bereich auch über einen Promotor, der in T-DNA lokalisiert ist, transkribiert werden könnte und auch nur eine unvollständige mRNA für das entsprechende Gen darstellt. Daher ist es aussagekräftiger die Proteine bzw. besser noch die Funktion der Proteine nachzuweisen.

5.II Ziel des Versuches:

Im Praktikum soll nun versucht werden, die Aktivität der Catalase in verschiedenen Catalase-Knock-out-Linien quantitativ zu bestimmen, um festzustellen, ob das Genprodukt durch die Insertion der T-DNA tatsächlich ausfällt und die Enzymaktivität verschwindet. Die Gesamtenzymaktivität der Catalasen kann in einem einfachen Test photometrisch bestimmt werden, dabei kann aber nicht zwischen den drei verschiedenen Isoformen von Arabidopsis, CAT1, CAT2 oder CAT3, unterschieden werden.

CATALASE2

CATA-

Keine Insertion: Produkt mit 2 genspezifischen Primern kein Produkt mit genspezifischem und T-DNA Primer

T-DNA Insertion: kein Produkt mit 2 genspezifischen Primern (zu groß) Produkt mit genspezifischem und T-DNA Primer LB

LB

A

B

(LB findet keine Anheftungs-sequenz)

LASE2 T-DNA


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Die Catalaseaktivität kann in einem Pflanzenrohextrakt nach Zugabe ihres Substrats Wasserstoffperoxid gemessen werden. Die Abnahme von Wasserstoffperoxid kann im Photometer direkt bei einer OD von 240 nm über die Zeit verfolgt werden. Die Abnahme ΔA/min ist dabei ein Maß für die Catalasegesamtaktivität. Um nun die Gesamtaktivtät der verschiedenen Extrakte miteinander vergleichen zu können, muss die bestimmte Aktivität auf die Menge an isolierten Proteinen in den Rohextrakten bezogen werden. Diese kann wiederum mit einem photometrischen Test nach Bradford (1976) bestimmt werden.

5.III Durchführung

Von den folgenden Pflanzenlinien soll die Catalaseaktivität bestimmt werden. Dazu werden Proteinrohextrakte hergestellt und sowohl die Catalasesaktivität als auch die Gesamtproteinmenge bestimmt.

Pflanzenmaterial:

Arabidopsis thaliana Col-0 (Wildtyp) CAT2-knock-out-Mutante CAT2/3-double-knock-out-Mutante

Isolierung von Gesamtprotein aus Pflanzenmaterial (nativ)

Je 0,1 g Blattmaterial (1 mittelgroßes Blatt) wird mit 200 µl Extraktionspuffer in einem Eppendorfgefäß mit einem Handmörser homogenisiert. Die Proben werden für 30 min bei 13000 rpm zentrifugiert und der klare Überstand in ein neues Eppendorfgefäß überführt und auf Eis gehalten.

Proteinkonzentrationsbestimmung (nach Bradford 1976)

Zur Bestimmung des Gesamtproteingehalts muss zunächst eine Eichkurve für die Bradfordlösung mit einem Protein bekannter Konzentration, in diesem Fall BSA (Rinder-Serumalbumin), gemacht werden. Für die Eichkurve sollten BSA-Konzentrationen von 1 µg bis 20 µg eingesetzt werden. Jeweils 10 µl der entsprechenden BSA-Lösung werden mit 1mL Bradford-Lösung (1:5 Verdünnung des Biorad Protein-Assay Konzentrates) gemischt und 5 min inkubiert und danach bei 595 nm in Einmalplastikküvetten gegen Bradford.-Lösung als Nullwert gemessen. BSA (in µg) 1 2 5 10 12 15 20

Absorbtion 595 nm


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Für die Proteinbestimmung der Rohextraktlösung werden 10 µl des Proteinextraktes mit 1 ml Bradford-Lösung gemischt. Nach 5 Minuten Inkubation bei RT wird entsprechend der Eichkurve die Absorption bei 595 nm photometrisch in Einmalplastikküvetten gegen Bradford-Lösung als Nullwert gemessen. Die Proteinkonzentration kann nun mit Hilfe der vorher erstellten Eichkurve bestimmt werden.

Catalaseaktivität

Zur Messung der Catalaseaktivität werden 50 µl des Rohextraktes eingesetzt. 850 µl Phosphatpuffer gemischt werden mit 100 µl 10 mM H2O2 gemischt und in eine Quarzküvette überführt (Keine Einmalküvetten!), da hier im UV-Wellenlängenbereich gemessen wird. Damit wird das Photometer dann auch auf null gesetzt. Durch die Zugabe von 50 µl Rohextrakt in die Küvette wird die Reaktion gestartet. Dabei sollte die Küvette bereits im Messgerät stehen und der Rohextrakt sollte durch mehrmaliges Hoch- und Runterpipettieren mit der 200µl-Pipette mit dem Rohextrakt und dem Puffer vermischt werden. Dann wird sofort mit der Messung begonnen und die Abnahme des H2O2-Gehalts wird der Wellenlänge 240 nm über 2 min gemessen, wobei alle 30 sec ein Messwert notiert wird. Aus den fünf Messpunkten kann dann eine Gerade erstellt werden und die Abnahme der Absorption pro min kann bestimmt werden.

Zeit Col-0 (Wildtyp) CAT2-KO CAT2/3-KO

0 sec

30 sec

60 sec

90 sec

120 sec

Die Catalaseaktivität wird für die verschiedenen Proben wie folgt berechnet. 0,04 x µg Protein (in 50 µl Rohextrakt)

ΔA/min Units / µg Protein =


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5.IV Puffer und Lösungen

Proteinextraktionspuffer (CAT):

• 100 mM Tris-HCl, pH 8,0 • 20% (v/v) Glycerin • 30 mM DTT (frisch zugeben)

Phosphatpuffer für die Messung:

• 25 mM Kaliumdihydrogenphosphat • 25 mM di-Kaliumhydrogenphophat • gegeneinander titrieren bis pH 7,0 erreicht ist, danach Zugabe von 2 mM EDTA

5.V Auswertung

Bestimmen Sie die Gesamtaktivitäten der drei Pflanzenlinien mit der angegebenen Formel und vergleichen Sie diese.

Linie Gesamtaktivität in u/µg

Col-0

CAT2-KO

CAT2/3-KO

Ordnen Sie die drei Linien nach ihrer Aktivität

_______________ < _______________ < _______________

Kurze Interpretation:


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Wenn man auf DNA-Ebene die Insertion der T-DNA im CAT2-Gen mit Hilfe von PCR nachweisen will, werden 3 Primerkombinationen eingesetzt: LB T-DNA und CAT2-left LB T-DNA und CAT2-right CAT2-left und CAT2-right

Welche Produkte erwarten sie jeweils für die 3 Primerkombinationen a) im Wildtyp, b) wenn die T-DNA in einer Kopie des CAT2 vorliegt (heterozygot) oder c) in beiden Kopien (homozygot) vorliegt? (Skizze) Wie viele und welche Primerkombinationen müssen Sie testen, wenn Sie herausfinden wollen, ob die Doppelmutante CAT2/3-KO für beide T-DNA-Insertionen homozygot ist?

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