La biopsia di nervo

Vittorio Cavallari

Sezione di Diagnostica Ultrastrutturale e Metodologie Quantitative Dipartimento di Patologia Umana, Università di Messina. www.geocities.com/diagnostica_morfo_integrata

Generalità

La biopsia di nervo non è più un procedimento diagnostico elettivo:

• Metodo invasivo che può provocare sintomatologie dolorose indesiderate

• Metodo oneroso in termini di risorse e tempi di esecuzione dell’indagine

• Informazioni aggiuntive relativamente poco rilevanti rispetto al pannello degli studi neurofisiologici

Effetti indesiderati

• Dolore da neuroma

• Iperestesia e disestesia nell’area cutanea innervata dal tronco nervoso sezionato

• Inestetismi da esiti dell’intervento chirurgico

Indicazioni diagnostiche

• Limitate alle situazioni in cui si rilevano discrepanze fra il quadro clinico e i dati strumentali.

• Il contributo delle informazioni ottenute mediante lo studio delle fibre amieliniche, non accessibili alle indagini strumentali, non è unanimemente riconosciuto

• Il significato prognostico dell’esame, che può essere accuratamente quantificato, non giustifica in molti casi i disagi per il paziente.

Metodologie

• Biopsia fascicolare• Biopsia dell’intero tronco nervoso• Nervi utilizzati: Surale, peroneo

superficiale, radiale cutaneo.La sede della biopsia dipende dal tipo di patologia presente nel soggetto. Per lo studio della neuropatia diabetica è spessoutilizzato il nervo surale.

Trattamento del materiale

• L’esame istologico e immunoistochimico tradizionali non forniscono di solito informazioni utili.

• L’inclusione in paraffina determina estese alterazioni strutturali delle fibre nevose.

• La metodica d’elezione è l’inclusione in resina, che consente l’esame in microscopia ottica ed elettronica di materiale strutturalmente preservato in maniera soddisfacente.

• Metodiche aggiuntive, quali la dissociazione di fibre osmicate (teasing) forniscono informazioni addizionali sulla mielina.

Nervo incluso in paraffina

Nervo incluso in paraffina

Nervo incluso in resina

Trattamento del materiale

• È bene ottenere sezioni dell’intero tronco nervoso, che verranno utilizzate per la valutazione generale della superficie fascicolare. Le sezioni, di spessore inferiore a 0.5 mm, vengono tagliate con una lama da rasoio da porzioni non traumatizzate del nervo e poi incluse orientate in trasversa.

• I fascicoli vengono poi delicatamente dissociati nel nervo residuo, e inclusi orientati in longitudinale e in trasversa.

• Il nervo è estremamente delicato e suscettibile agli artefatti da trattamento improprio.

Artefatti da compressione

Sezioni semifini

• Sezioni dell’inclusione in resina spesse 1µm, colorate con blu di toluidina e osservate in microscopia ottica.

• La mielina è intensamente osmiofila, e le sezioni semifini sono il metodo migliore per studiare le alterazioni strutturali delle fibre nervose di grande e medio diametro.

• Sono inoltre facilmente accessibili per lo studio il perinervio e i vasi epineurali ed endoneurali.

Panoramica dell’intera superficie del nervo surale

Fascicolo nervoso

Vasi epineurali

Nervo surale normale

Nervo surale normale

Analisi quantitativa

• Fornisce informazioni importanti in microscopia ottica ed elettronica.

• Non è una procedura diffusamente applicata, poiché richiede elevati livelli di organizzazione delle procedure e tempi di elaborazione relativamente lunghi.

• Il progresso del supporto informatico rende l’analisi quantitativa sempre più efficiente e agevole.

Analisi quantitativa

Procedure

• Campionamento random-sistematico

• Misurazione individuale delle fibre nervose

• Misurazione dello spazio di riferimento

• Analisi statistica

Campionamento random – sistematicoLa superficie da misurare viene prelevata daogni fascicolo, senza altri criteri di scelta.

Morfometria in microscopia ottica. Misurazione automatica delle fibre.

Analisi quantitativa

Morfometria in microscopia ottica

• Densità numerica delle fibre mieliniche

• Analisi statistica: istogramma dei diametri e delle aree delle fibre

• Calcolo della G-ratio (valore medio = 0.8)

• Analisi della correlazione mielina-assone

V1

180,0170,0

160,0150,0

140,0130,0

120,0110,0

100,090,0

80,070,0

60,050,0

40,030,0

20,010,0

0,0

300

200

100

0

Std. Dev = 35,24

Mean = 42,3

N = 917,00

Istogramma dell’area assonaleNervo normaleDensità numerica 11200/mmq

V5

120100806040200

V4

80

60

40

20

0

Correlazione fra area della mielina(x)e area assonale (y) R= 0.965Nervo normale

Analisi quantitativa in microscopia elettronica

• Densità numerica e distribuzioni di frequenze delle fibre amieliniche. Questi parametri non sono molto attendibili, per la frequente coesistenza di fenomeni rigenerativi che possono mascherare la perdita assonale

• Misurazione delle cellule di Schwann e della correlazione con l’area assonale.

• La morfometria in m.e. non ha in atto significato diagnostico ma può essere utilizzata nella ricerca.

Neuropatia diabetica

• Neuropatia distale e simmetrica

Neuropatia sensitivo-motrice

Neuropatia vegetativa

• Neuropatia ischemica (interessamento asimmetrico di singoli tronchi nervosi)

Neuropatia distale e vegetativa

• Lesione primitiva assonale• Interessamento secondario della mielina• Degenerazione delle porzioni più distali delle

fibre nervose (diyng-back)• Alterazioni morfologiche aspecifiche• Nei nervi sensitivi e vegetativi, riduzione

numerica delle fibre amieliniche• Quote variabili di fenomeni rigenerativi che

possono rendere meno evidente l’effettiva perdita di fibre nervose.

Lesioni precoci nella neuropatia diabeticaNervo surale apparentemente normale

Densità numerica delle fibre conservata

Alterazioni del contorno della mielina e del rapporto mielina/assone

Contorno festonato della mielina

Neuropatia diabetica avanzataGrave riduzione numerica delle fibre mieliniche

Grave neuropatia assonale

*

Gravissima neuropatia assonale

*

Gravissima neuropatia assonale

Microscopia elettronica

• La patologia delle fibre mieliniche può essere studiata con maggiore precisione

• Sono inoltre accessibili per lo studio le fibre amieliniche, le cellule di Schwann, il perinervio e i capillari endoneurali.

Ipermielinizzazione

Mielina sottile, fibra in rigenerazione

Degenerazione laminare

Disposizione iniziale ad onion bulb delle cellule di Schwann

Fibre amieliniche normali

Riduzione numerica delle fibre amieliniche

Bande di Büngner amieliniche

Riduzione numerica, edema e ipotrofia delle fibre amieliniche

E

I

Collagen pockets e assoni nudi

AX

S

Microscopia elettronica

Alterazioni strutturali del perinervio:

• Ispessimento

• Deposizione di membrana basale

• Presenza di detriti osmiofili endocellulari

Ispessimento del perinervio

C

Ispessimento del perinervio e depositi elettrondensi

V5

20100

V4

14

12

10

8

6

4

2

0

Correlazione fra area della mielina (x)E area assonale (y) R=0.65Neuropatia diabeticadi media gravità

*

*

Neuropatia ischemica

Neuropatia ischemica

Neuropatia ischemica

Conclusioni

• La biopsia di nervo periferico è un esame invasivo che va limitato a casi di effettiva necessità.

• Per lo stesso motivo sarebbe preferibile che la biopsia fosse trattata nel modo più completo possibile, per garantire, una volta effettuata, la massima quantità di informazioni

• L’analisi quantitativa è fortemente raccomandata, in quanto può fornire informazioni dinamiche sui processi di mielinizzazione, importanti per la prognosi.