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8/17/2019 La Chromatographie Liquide
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La chromatographie liquide
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I. Généralités sur la chromatographie
1. Description
2. Paramètres intervenant dans la
séparation
3. Tableau résumé des diff érents types
de chromatographie
4. Les supports ou matrices pour phases
stationnaires
II. Chromatographie d'échange d'ions
1. Les diff érents types d'échangeurs
d'ions
2. Principe
III. Chromatographie d'exclusion ou
filtration sur gel
1. Remarque préliminaire
2. Principe
3. Détermination de la masse molaire
d'une molécule
IV. Chromatographie d'affinité
1. Principe et applications
2. Structure de gels d'affinité -
Activation du gel pour le couplage du ligand
- Bras espaceurs
V. Interactions hydrophobes
V.A. Chromatographie à polarité de
phase inversée ou en phase reverse
1. Structure du gel de silice
2. Principe de l'adsorption et de la
désorption en phase reverse
3. Exemples d'application
V.B. Chromatographie d'interactions
hydrophobes
1. Principe
2. Quelques particularités de la
chromatographie d'interactions
hydrophobes
VI. Chromatographie de partage etchromatographie d'adsorption
VII. Avantages et inconvénients des
diff érents types de chromatographie
liquide / solide
VIII. Liens Internet et réf érences
bibliographiques
I. Généralités sur la chromatographie
1. Description
http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/5Chromato.pdfhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/5Chromato.pdfhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#1.%20Descriptionhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#1.%20Descriptionhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#2.%20Param%C3%A8tres%20intervenant%20dans%20la%20s%C3%A9parationhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#2.%20Param%C3%A8tres%20intervenant%20dans%20la%20s%C3%A9parationhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#3.%20Tableau%20r%C3%A9sum%C3%A9%20des%20diff%C3%A9rents%20types%20de%20chromatographiehttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#3.%20Tableau%20r%C3%A9sum%C3%A9%20des%20diff%C3%A9rents%20types%20de%20chromatographiehttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#4.%20Les%20supports%20ou%20matrices%20pour%20phases%20stationnaires.http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#4.%20Les%20supports%20ou%20matrices%20pour%20phases%20stationnaires.http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#1.%20Les%20diff%C3%A9rents%20types%20d'%C3%A9changeurshttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#1.%20Les%20diff%C3%A9rents%20types%20d'%C3%A9changeurshttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#2.%20Principehttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#2.%20Principehttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#1.%20Remarque%20pr%C3%A9liminairehttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#1.%20Remarque%20pr%C3%A9liminairehttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#2.%20Principe.http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#2.%20Principe.http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#3.%20D%C3%A9termination%20de%20la%20masse%20molaire%20d'une%20mol%C3%A9culehttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#3.%20D%C3%A9termination%20de%20la%20masse%20molaire%20d'une%20mol%C3%A9culehttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#1.%20Principe%20et%20applications.http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#1.%20Principe%20et%20applications.http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#2.%20Structure%20de%20gels%20d'affinit%C3%A9http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#2.%20Structure%20de%20gels%20d'affinit%C3%A9http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#1.%20Structure%20du%20gel%20de%20silice.http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#2.%20Principe%20de%20l'adsorption%20et%20de%20la%20d%C3%A9sorption%20en%20phase%20reversehttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#3.%20Exemples%20d'applicationhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#1.%20Principehttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#2.%20Quelques%20particularit%C3%A9shttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#VI.%20Chromatographie%20de%20partage%20et%20chromatographie%20d'adsorptionhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#VII.%20Avantages%20et%20inconv%C3%A9nientshttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#Lienshttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/5Chromato.pdfhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/5Chromato.pdfhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#1.%20Descriptionhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#2.%20Param%C3%A8tres%20intervenant%20dans%20la%20s%C3%A9parationhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#3.%20Tableau%20r%C3%A9sum%C3%A9%20des%20diff%C3%A9rents%20types%20de%20chromatographiehttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#4.%20Les%20supports%20ou%20matrices%20pour%20phases%20stationnaires.http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#1.%20Les%20diff%C3%A9rents%20types%20d'%C3%A9changeurshttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#2.%20Principehttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#1.%20Remarque%20pr%C3%A9liminairehttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#2.%20Principe.http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#3.%20D%C3%A9termination%20de%20la%20masse%20molaire%20d'une%20mol%C3%A9culehttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#1.%20Principe%20et%20applications.http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#2.%20Structure%20de%20gels%20d'affinit%C3%A9http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#1.%20Structure%20du%20gel%20de%20silice.http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#2.%20Principe%20de%20l'adsorption%20et%20de%20la%20d%C3%A9sorption%20en%20phase%20reversehttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#3.%20Exemples%20d'applicationhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#1.%20Principehttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#2.%20Quelques%20particularit%C3%A9shttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#VI.%20Chromatographie%20de%20partage%20et%20chromatographie%20d'adsorptionhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#VII.%20Avantages%20et%20inconv%C3%A9nientshttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/1Chromatographie.htm#Liens
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La chromatographie est une technique d'analyse pour séparer les constituants d'un
mélange ;
• les molécules à séparer sont entraînées par un fluide (un liquide ou un gaz) que
l'on appelle la phase mobile.
• elles interagissent ou au contraire n'interagissent pas avec un support (ou matrice)
fie (un solide ou un liquide fié) que l'on appelle la phase stationnaire ! il y a donc
une distribution ou partition des composants entre ces deu types de phase.
• le flu du fluide vecteur étant continu" c'est la rétention plus ou moins longue des
différentes molécules sur le support fie" qui va les séparer les unes des autres.
#istoriquement" c'est au russe $i%ha&l emenovivch sett (*+,- */*/) que l'on doit lapremi0re pu1lication (*/23) de travau de chromatographie" ayant utilisé cette technique
pour séparer les pigments d'épinard (voir historique 1 et historique 2 de la
chromatographie). Le mot chromatographie vient du grec 4kroma 4 (couleur) et
4 graphein 4 (écrire).
2. Paramtres inter!enant dans la séparation
Les param0tres physicochimiques sur lesquels reposent les principes de séparation sont !
param0tres type de chromatographie domaine d'application
la charge électrique échange d'ions
• protéines
• polypeptides
• acides aminés
• acides nucléiques
• sucres
http://www.123bio.net/cours/chromato/tswett.htmlhttp://www.techniques-ingenieur.fr/affichage/DispIntro.asp?nGcmId=P1445&introID=345931&pdfID=345930http://www.techniques-ingenieur.fr/affichage/DispIntro.asp?nGcmId=P1445&introID=345931&pdfID=345930http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/7RelStructFonction/3Structure/1StructPrimQuat/1Introduction.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/7RelStructFonction/3Structure/1StructPrimQuat/3AcidesAmines/1AcidAmine.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/7RelStructFonction/3Structure/1StructPrimQuat/3AcidesAmines/1AcidAmine.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/3CoursdeBiochSTRUCT/2GLUCIDES/1Glucides.htmhttp://www.123bio.net/cours/chromato/tswett.htmlhttp://www.techniques-ingenieur.fr/affichage/DispIntro.asp?nGcmId=P1445&introID=345931&pdfID=345930http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/7RelStructFonction/3Structure/1StructPrimQuat/1Introduction.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/7RelStructFonction/3Structure/1StructPrimQuat/3AcidesAmines/1AcidAmine.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/3CoursdeBiochSTRUCT/2GLUCIDES/1Glucides.htm
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la taille et la forme (en fait, levolume)
exclusion ou gel defiltration
• protéines
• polypeptides
• acides nucléiques
• sucres
• lipides
l'existence de structures
particulières qui permettent
d'établir des liaisons spécifiques
affinité • protéines
la polarité
et/ou
l'hydrophobicité
polarité de phase inversée
ou phase reverse
• protéines
• polypeptides
• acides aminés
• acides nucléiques
• sucres
• acides gras
interactions hydrophobes • protéines
Cependant, si un type de chromatographie repose sur une caractéristique physico-
chimique donnée, la séparation peut être influencée de manière "secondaire" par d'autres
caractéristiques.
Par exemple :
• un échangeur d'ions comportant un groupement hydrophobe, comme le noyau
phényl du " DOWEX ™", interagit aussi par interactions hydrophobes : ainsi pour
2 acides aminés de charge identique, l'hydrophobicité de la cha î ne latérale
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influencera en second lieu la séparation de ces molécules.
• un gel de filtration ""ephade#™" peut être utilisé comme gel d'affinité pour les
protéines qui fixent les dérivés du glucose tel que le dextran.
$. %ableau résumé des différents t&pes de chromatographie
phase
stationnair
e
principe de
séparation
catatéristiques de
la phase stationnaire
principe de la fixation
et de l'élution
liquide partageliquide fixé sur un support
inerte (papier, silice...)
distribution des composants du
mélange à séparer dans les
deux phases liquides selon leur
coefficient de partage
solide
adsorption adsorbant solide polaire
phénomène de surface :
formation de liaisons
spécifiques entre les
composants et la surface
adsorbante
adsorption
(phase
inverse)
molécules hydrophobes
greff ées sur de la silice
interactions hydrophobes et
élution par diminution de la
polarité de la phase mobile
échange
d'ions
résine (polymères d'oses)
porteuse de groupements
chargés négativement ou
positivement
interactions électrostatiques
avec les composants de charge
opposée
exclusion
(filtration
sur gel)
solide poreux les composants de diamètre
supérieur à celui des billes du
support sont "exclus" et ceux
de diamètre inf érieur y
diffusent et sont freinés
http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/2GelFiltration/3SEPHADEX/1GelSephadex.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/2GelFiltration/3SEPHADEX/1GelSephadex.htm
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affinité
support sur lequel est greff ée
une molécule (le ligand)
spécifiquement reconnue par
un des composants de
l'échantillon à analyser
déplacement de l'équilibre de
liaison [molécule - ligand
greff é] en faveur de l'équilibre
[molécule - tierce molécule]
'. Les supports ou matrices pour phases stationnaires
Le support ou matrice utilisé pour constituer la phase stationnaire s'appelle un gel de
résine.
Ce gel se présente souvent sous la forme de billes (sphériques ou, plus rarement, de forme
irrégulière). Ces billes sont elles mêmes des polymères de diff érents types de molécules,
par exemple :
• de st&rne ( di!in&lben)ne pour certaines résines d'échange d'ions
• de pol&holosides pour les gels de filtration
• de silice pour la chromatographie en phase reverse
Diff érents traitements ou modifications de ces diff érentes résines permettent d'obtenir tel
type de phase stationnaire ou tel autre type.
II. *hromatographie d+échange d+ions
http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/1ECHANGEions/11BilleRESINE/1ResinBILLE.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/1ECHANGEions/11BilleRESINE/1ResinBILLE.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/2GelFiltration/3SEPHADEX/1GelSephadex.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/2BilleSILICE/11BILLEsilice.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/1ECHANGEions/11BilleRESINE/1ResinBILLE.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/2GelFiltration/3SEPHADEX/1GelSephadex.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/2BilleSILICE/11BILLEsilice.htm
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1. Les différents t&pes d+échangeurs d+ions
Les échangeurs d'ions sont des billes qui portent des groupements ionisables dont la
charge est :
positi!e : résines échangeuses d'anions
qui fixent des molécules chargées négativement :
---R+...M
-
négati!e : résines échangeuses de
cations
qui fixent des molécules chargées
positivement : ---R-...M
+
nature de la fonction ionisable : ---R+
nature de la fonction ionisable :
---R-
base forte base faible acide fort acide faible
ammonium
quaternaire : ---NR3+
exemple :
triméthylammonium
---N(CH3)3+
forme protonnée d'une amine
I, II ou III :
---NHR2+
exemple :
diéthylaminoéthylammonium
exemple :
sulfonate
---SO3-
exemple :
carboxyméthyl
---O-CH2-CO2-
2. Principe.
Dans un premier temps, la résine est équilibrée dans un tampon dont le pH est tel que le
groupement porté par l'échangeur d'ions soit ionisé :
• dans le cas d'une base (échangeur d'anions), le pH doit être inférieur au pKa du
groupement ionisable (exemple : le pKa du groupement
diéthylaminoéthylammonium est 9,5)
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• dans le cas d'un acide (échangeur de cations), le pH doit être supérieur au pKa du
groupement ionisable (exemple : le pKa du groupement carboxyméthyl est 4)
Les molécules à séparer sont dans le même tampon (donc au même pH) et en fonction de
leur point isoélectrique (pI), elle porte une charge nette :
• négative : le pI de l'albumine de sérum bo!in est 4,9, cette protéine est chargée
négativement à pH 7
• nulle
• positive : le pI du cytochrome c est 10,7, cette protéine est chargée positivement à
pH 7
,oir un e#emple de la variation de la charge nette d'une protéine en fonction du pH
Il y a deux manières d'éluer les molécules fixées sur la résine :
• En modifiant le p- de la phase mobile de telle sorte que les molécules qui sont
chargées ne le soient plus (ou qu'elles portent une charge de même signe que
l'échangeur d'ions) ; il n'y a plus alors d'interaction électrostatique entre les
molécules et le groupement chargé porté par la résine et les molécules sont éluées.
• En aoutant un sel (à une concentration croissante) qui apporte forcément un ion
de même charge que les molécules fixées à la résine : cet ion s'appelle un contre (ion.
L' ordre d'efficacité croissant des contre - ions pour les résines échangeuses de cations est
le suivant :
• cations monovalents : Li+
< H+
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1. /emarque préliminaire
Le principe de la chromatographie d'exclusion (appelée aussi filtration sur gel ou
tamisage moléculaire ou chromatographie de perméation) repose en première
approximation sur la masse molaire des molécules à séparer.
En toute rigueur, le paramètre physico-chimique qui intervient est la dimension des
molécules, donc leur volume et donc plus précisément leur ra&on de "tokes. Mais cette
relation univoque [masse molaire - rayon de Stokes] n'est valable que pour des protéines
dites "globulaires", c'est-à-dire assimilées à des sphères.
Diff érents paramètres influencent le volume des molécules et peuvent fausser la
détermination de la masse molaire réelle par ce type de chromatographie :
• la géométrie : pour une même masse molaire, une protéine "allongée" (exemple, lacalmoduline) n'aura pas les mêmes dimensions qu'une protéine globulaire.
• les modifications post(traductionnelles : par exemple, les longues cha î nes d'oses
modifient fortement la géomètrie des protéines gl&cos&lées et les rend plus denses ;
à l'inverse, les lipoprotéines sont "allégées" par la présence de lipides.
• la présence de sels, d'agents chaotropiques, de détergents ...
2. Principe.
La phase stationnaire est constituée de billes de pol&saccharides (type ""ephade#™" ou
""epharose™") gonflées dans le solvant utilisé pour l'élution :
• le !olume des billes est très finement calibré ;
• ainsi les molécules dont le volume est supérieur à celui des billes ne peuvent y
pénétrer et sont éluées rapidement ;
• en revanche, les molécules dont le volume est inférieur à celui des billes y pénétrent
et y subissent des frottements qui les retardent.
En conclusion, si l'on connait la masse molaire de la molécule que l'on veut séparer d'un
mélange par cette technique, il faut choisir le gel le mieux adapté : c'est celui dont le
http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/7RelStructFonction/2Biochimie/2ModifPOSTtraduc/1ModPostTrad.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/7RelStructFonction/2Biochimie/2ModifPOSTtraduc/8Glycosylation/1Glycosylation.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/2GelFiltration/3SEPHADEX/1GelSephadex.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/3AFFINITE/2Sepharose/11Sepharose.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/7RelStructFonction/2Biochimie/2ModifPOSTtraduc/1ModPostTrad.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/7RelStructFonction/2Biochimie/2ModifPOSTtraduc/8Glycosylation/1Glycosylation.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/2GelFiltration/3SEPHADEX/1GelSephadex.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/3AFFINITE/2Sepharose/11Sepharose.htm
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domaine de fractionnement, c'est-à-dire la gamme des masses molaires pour lesquelles il y
a diffusion partielle ou totale, englobe la masse molaire de la molécule à purifier (!oir un
e#emple).
$. Détermination de la masse molaire d+une molécule.
Un mélange de molécules que l'on appelle standards, de masses molaires connues, est séparé
par chromatographie de filtration sur gel (voir un e#emple de séparation) :
• chaque molécule est éluée avec un volume d'élution ,e.
• par ailleurs, le volume d'e#clusion du gel (V0) est le volume d'élution d'une
molécule non retardée par le gel, c'est-à-dire une molécule de taille supérieure à celle des billes et qui n'y diffuse pas. Bien souvent, on utilise le bleu de#tran,
polymère d'ose de masse molaire supérieure à 2 106 Da.
• enfin, le volume total du gel (,t) est la somme du volume des billes et du volume
externe aux billes : il est donné par le volume d'élution d'une molécule qui diffuse
totalement dans les billes et qui est donc totalement retardée.
On définit le coefficient de partition :
Ve - V0
KD = -----------
Vt - V0
• on trace la droite étalon : log 0masse molaire f 03D (ou masse molaire = f (KD)
sur une échelle semi-logarithmique)
• on détermine le volume d'élution d'une molécule X dans les m4mes conditions de
chromatographie que pour le mélange des standards
• on reporte le KD de la molécule X sur la partie linéaire de la droite étalon et ainsi
on détermine sa masse molaire
http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/2GelFiltration/2GuideSELECGelFilt/11GUIDEselect.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/2GelFiltration/2GuideSELECGelFilt/11GUIDEselect.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/2GelFiltration/1GamETALON/11GAMetalon.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/2GelFiltration/1GamETALON/11GAMetalon.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/2GelFiltration/2GuideSELECGelFilt/11GUIDEselect.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/2GelFiltration/2GuideSELECGelFilt/11GUIDEselect.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/2GelFiltration/1GamETALON/11GAMetalon.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/2GelFiltration/1GamETALON/11GAMetalon.htm
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I,. *hromatographie d+affinité
1. Principe et applications
C'est le type de chromatographie le plus sélectif, une protéine pouvant être purifiée d'un
facteur 103 à 104 en une seule fois.
Le principe de la chromatographie d'affinité repose sur la reconnaissance entre une
molécule du mélange à séparer et une molécule greffée sur la résine, que l'on appelle le
ligand, ces deux molécules interagissant de manière hautement spécifique :
•
l'adsorption de la molécule à séparer sur le ligand fixé à la
résine est effectuée dans des
conditions physico-chimiques
(pH, force ionique, concentration
de la molécule à adsorber...)
fa!orables ˆ la liaison molécule -
ligand
• dans ces conditions, les molécules
du mélange à séparer qui n'ontpas (ou peu) d'affinité pour le
ligand sont éluées au fur et à
mesure qu'on le fait passer sur la
résine
• on désorbe ensuite les molécules
spécifiquement fixées au ligand
en modifiant les conditions
physico-chimiques de telle sorte
que la liaison molécule - ligandsoit rompue : le plus souvent, on
ajoute une tierce molécule qui
entre en compétition avec le
ligand greff é pour la molécule à
séparer.
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En d'autres termes, on déplace l+équilibre de liaison molécule - [ligand greff é] en faveur de
l'équilibre molécule - [tierce molécule]. Cette tierce molécule peut-être :
• le ligand greff é lui-même (sous forme libre) à une concentration plus éle!ée que
celle du ligand greff é
• une molécule dont la structure est analogue à celle du ligand greff é mais pour
laquelle la molécule a plus d'affinité
L'une des principales applications de la chromatographie d'affinité est l'isolement de
protéines ou d'acides nucléiques dont voici quelques exemples :
ligand exemples de molécules isolées
•protéine 5 (recombinante) : protéine deStaphylococcus aureus à haute affinité
pour le fragment Fc des anticorps de type
IgG ;
• protéine G (recombinante) : protéine de
surface des streptocoques du groupe G,
recepteur de type III du fragment Fc des
anticorrs de type IgG.
• IgG de mammif ères
• exonucléases
• concana!aline 5 (les lectines en général) :
protéines qui se fixent sur des résidus
spécifiques de la partie osidique des
glycoprotéines et qui ont des propriétés
agglutinantes (exemple : érythrocytes).
• fixation sur des résidus -D-
mannopyranosylou -D-
glucopyranosyl terminaux des
gl&coprotéines
• 5D6 natif ou dénaturé de thymus de veau
• pol&merases (ADN, ARN)
• exonucléases
• l&sine
• plasminogne
• 5/6 ribosomal
http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/7RelStructFonction/2Biochimie/1SyntheseProteines/1SyntheseProt.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/7RelStructFonction/2Biochimie/1SyntheseProteines/1SyntheseProt.htm
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• iminodiacétate : chélateur de métaux
• boronate
• métalloprotéines
• protéines à groupements cis-
diol
• colorants de l'industrie textile (exemple :
bleu de procion ou "Cibacron blue®") : les
enzymes qui fixent les mono- ou
dinucléotides puriques interagissent avec
les cycles portés par les colorants dont la
structure est très proche de celle du 65D7.
!oir l+e#emple du 89leu 5™"
• désh&drogénases à NAD(P)+
• kinases dépendantes de l'ATP
• pol&0: (acide polyuridylique)
• 5/6 messagers par hybridation
à leur queue poly(A)
• protéines se liant au poly (U)
(interf éron, transcriptase
inverse)
2. "tructure de gels d+affinité ( 5cti!ation du gel pour le couplage du ligand ( 9rasespaceurs
Les supports ou matrices utilisés pour la chromatographie d'affinité peuvent être des
billes d'agarose ("Sepharose™", Pharmacia®), de polyacrylamide d'agarose, de verre
poreux, de polyvinyle, de polyméthacrylate ...
L'immobilisation du ligand sur la matrice nécessite qu'il soit préalablement acti!é, c'est-
à-dire qu'il faut créer des sites réactionnels qui permettent d'établir des liaisons
covalentes. Parmi les di!erses méthodes d+acti!ation, on peut citer :
• l'activation des groupes hydroxyles du support (l'agarose par exemple) par le
bromure de c&anogne dans une solution dont le pH est finement contrôlé (pH 8,3).
Des groupements imidocarbonates sont formés sur lesquels on peut fixer des
ligands contenant des amines libres, par exemple une protéine par la cha î ne
http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/1VELATPOxRedNAD/2OxRedNAD.htm/222OxydoRedNAD.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/1VELATPOxRedNAD/2OxRedNAD.htm/222OxydoRedNAD.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/3AFFINITE/1AffinCOLORANT/11AFFcolor.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/7RelStructFonction/2Biochimie/1SyntheseProteines/1SyntheseProt.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/3AFFINITE/2Sepharose/11Sepharose.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/3AFFINITE/3ActivCouplage/11ActivCOUP.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/1VELATPOxRedNAD/2OxRedNAD.htm/222OxydoRedNAD.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/3AFFINITE/1AffinCOLORANT/11AFFcolor.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/7RelStructFonction/2Biochimie/1SyntheseProteines/1SyntheseProt.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/3AFFINITE/2Sepharose/11Sepharose.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/3AFFINITE/3ActivCouplage/11ActivCOUP.htm
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latérale de ces lysines. Les groupes hydroxyles qui n'ont pas réagit sont bloqués
par action de l'éthanolamine ou la glycine.
• les groupes hydroyles du support peuvent 5tre activés par le carbon&l di(imida)ole.
• l'activation du support peut 5tre faite avec le gtutaraldéh&de qui se polymérise et
forme des chaînes à 6 car1ones qui constituent des points de fiation à une
certaine distance de la matrice.
• une autre méthode d'activation utilise le chlorure de tos&le et elle permet le
couplage de molécules qui poss0dent un groupement aminé" thiol ou phénol.
7our rendre certains ligands accessi1les au site de fiation sur la molécule avec laquelle
ils interagissent" il est nécessaire d'augmenter la longueur de la chaîne car1onée àl'etrémité de laquelle se situe le groupement activé. 8ette chaîne additive s'appelle un
bras espaceur.
La chromatographie d'affinité est la méthode la plus sélecti!e. 8ependant" c'est aussi la
plus délicate à mettre en oeuvre car elle nécessite la mise au point des conditions
epérimentales idoines pour o1tenir un gel correctement activé !
• le ligand doit 5tre orienté de mani0re optimale pour une parfaite reconnaissance
stéréochimique de la molécule que l'on veut séparer
• il ne faut pas que le ligand su1isse l'action des enzymes" c'est pour celà qu'on
utilise davantage des analogues de su1strats (inhibiteurs compétitfs par eemple)que les su1strats eum5mes
• il faut trouver des conditions d'élution de la molécule fiée au ligand qui préserve
sa fonction 1iologique
• en conséquence" cette méthode chromatographique est co;teuse
,. *hromatographie d+adsorption < polarité de phase in!ersée ouphase re!erse
,.5. *hromatographie < polarité de phase in!ersée ou en phase re!erse
1. "tructure du gel de silice
http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/3AFFINITE/4Espaceurs/11BRASespac.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/3AFFINITE/4Espaceurs/11BRASespac.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/3AFFINITE/4Espaceurs/11BRASespac.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/4EnzymologieLicence/3CoursINHIBITEURS/1CoursInhibition.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/4EnzymologieLicence/3CoursINHIBITEURS/1CoursInhibition.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/3AFFINITE/4Espaceurs/11BRASespac.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/3AFFINITE/4Espaceurs/11BRASespac.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/4EnzymologieLicence/3CoursINHIBITEURS/1CoursInhibition.htm
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Les matrices pour chromatographie en phase reverse sont souvent à base de silice 0"i=2,
appelée aussi gel de silice car elle est plus ou moins hyratée :
• la silice provient de la déshydratation de l'acide silicique et se présente sous forme
d'une poudre dont les grains (les billes) sont très fins
• ces billes peuvent être sphériques ou irrégulières
• à la surface de la silice on trouve des groupes silanols (-OH) et des groupes
siloxanes (-O-) qui lui conf èrent un caractère polaire et acide et qui lui permettent
de former des liaisons hydrogènes
• on utilise fréquemment une silice sur laquelle des cha>nes alk&lées (ou autres, voir
les différents groupes utilisés) sont greff ées au niveau des groupements silanols
2. Principe de l+adsorption et de la désorption en phase re!erse 0!oir un schéma
Les cha î nes alkylées conf ère à la silice un caractère très h&drophobe :
• si la phase mobile est très polaire (donc très peu hydrophobe), certaines molécules
hydrophobes vont établir des interactions h&drophobes avec la phase stationnaire et
ainsi être adsorbées
• on augmente alors la concentration en sol!ant organique (apolaire donc hydrophobe)
dans la phase mobile
• à une concentration donnée l'hydrophobicité de la phase mobile étant plus
importante que celle de la phase stationnaire, les molécules hydrophobes sont
désorbées et éluées
La phase mobile est donc constituée d'un mélange eau ? sol!ant organique, en proportion
variable :
a. la phase aqueuse :
• l+eau est le sol!ant le plus polaire (le moins hydrophobe).
On ajoute un sel pour tamponner le milieu. Cependant, on emploie souvent un acide fort
(l'acide trifluoroacétique) et une amine quaternaire (la triéthylamine, par exemple) car
http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/2BilleSILICE/11BILLEsilice.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/2BilleSILICE/11BILLEsilice.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/2BilleSILICE/11BILLEsilice.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/2BilleSILICE/11BILLEsilice.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/3Greffons/1TypeGREFFONS.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/1Adsoprtion/1PhenADSORP.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/4ProprieteSO/1PROPRso.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/3CoursdeBiochSTRUCT/1EAU/1H2O.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/2BilleSILICE/11BILLEsilice.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/2BilleSILICE/11BILLEsilice.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/3Greffons/1TypeGREFFONS.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/1Adsoprtion/1PhenADSORP.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/4ProprieteSO/1PROPRso.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/3CoursdeBiochSTRUCT/1EAU/1H2O.htm
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ces deux composés ioniques forment des paires d+ions avec les molécules à séparer,
neutralisant ainsi des charges portées par ces dernières. Celà a pour conséquence
d'augmenter l'hydrophobicité des molécules et ainsi qu'elles s'adsorbent davantage sur la
phase stationnaire.
b. le sol!ant organique :
• il en existe un grand nombre que l'on peut utiliser puisque la siliceleur résiste. Cependant, les plus employés sont l'acétonitrile etle méthanol.
• le choix du solvant organique dépend grandement de l'hydrophobicité des
molécules à séparer : pour des molécules très hydrophobes, on peut choisir
d'utiliser une forte concentration d'un solvant organique de polarité moyenne ou
une faible concentration d'un solvant organique de polarité faible.
• les solvants organiques ne doi!ent pas comporter d+impurétés ni avoir une forte
absorbance aux faibles longueurs d'onde (ultra-violet) pour ne pas interf érer avec
les propriétés optiques des molécules à séparer. De plus selon sa qualité, on peut
ou non utiliser un solvant organique pour un type d'analyse donnée. En
conséquence, il faut prendre des solvants certifiés "ultra-purs" qui coûtent chers.
$. @#emples d+application
La chromatographie en phase reverse s'applique quasiment à tous les types de molécules.
C'est une méthode de chromatographie extrêmement efficace qui permet de séparer des
échantillons complexes.
Parmi les applications, on peut citer la détermination de la séquence primaire des protéines
par la dégradation de Pehr @dman :
•
la fonction -aminée de l'acide aminé en position N-terminale de la cha î nepolypeptidique d'une protéine (ou d'un polypeptide) est traitée à pH alcalin par
l'isothioc&anate de phén&le 0PI%*, appelé aussi réactif d'Edman.
• après action d'acides et de solvant organique, la liaison peptidique liant l'acide
aminé en position N-terminale est spécifiquement coupée.
http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/4ProprieteSO/1PROPRso.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/4ProprieteSO/2ACN.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/5Edman/1DegEdman.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/5Edman/1DegEdman.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/4ProprieteSO/1PROPRso.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/4ProprieteSO/2ACN.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/6CoursDEUST/CHROMATOGRAPHIE/2FIGURES/4PhaseREVERSE/5Edman/1DegEdman.htm
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• l'analyse des des acides aminés libres (!oir un e#emple d+application < Aedicago
truncatula ).
Dans les deux cas, les acides aminés sont dérivés par le PITC qui incorpore un
groupement qui absorbe dans l'ultra-violet. On peut ainsi séparer, identifier et quantifierles PTH - acide aminés par chromatographie en phase re!erse avec une phase stationnaire
sur laquelle est greff ée une cha î ne alkylée en C18 (octadécyl).
,. 9. *hromatographie d+interactions h&drophobes
On peut considérer que ce type de chromatographie est une "!ariante" de lachromatographie en phase reverse, puisque l'adsorption des molécules sur la phase
stationnaire met en jeu le même type d'interactions. Les gels de chromatographie
d'interactions hydrophobes portent un groupement h&drophobe à l'extrémité d'une cha î ne
carbonée.
1. Principe.
Quand un composé hydrophobe se trouve dans un environnement polaire comme l'eau, il
en résulte un état thermodynamiquement défavorable. L+interaction h&drophobe est la
conséquence de deu# phénomnes opposés B une augmentation de l+entropie des molécules
d+eau autour du composé h&drophobe (c+est(
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des protéines fixées est obtenue :
• en faisant passer un tampon de force ionique décroissante, les ions du sel étant ainsi
progressivement éliminés.
• les acides aminés chargés ou polaires à la surface des protéines peuvent de
nouveau établir des liaisons hydrogène avec la phase mobile, c'est-à-dire que la
solubilité des protéines dans la phase mobile rede!ient ma#imale et elles sont éluées.
Il existe d'autres moyens d'éluer les protéines fixées :
• ajouter un ion aux propriétés chaotropiques qui induit une diminution de
l+organisation des molécules d'eau (donc une augmentation de leur entropie) : la force
des interactions hydrophobes est ainsi diminuée
• ajouter un détergent /
augmenter le pH /
diminuer la température puisque la forcedes interactions hydrophobes diminue avec celle -ci
2. Cuelques particularités de la chromatographie d+interactions h&drophobes.
Le choix de la matrice :
• la densité du ligand fixé sur les matrices utilisées pour la chromatographie
d'interactions hydrophobes est moindre que celle des supports de phase reverse.
• le profil d'hydrophobicité d'une protéine dépend essentiellement de la présence et
de la répartition des acides aminés : Ile, Leu, Val et Phe. Donc pour une protéine
donnée, on ne peut déterminer le support de chromatographie d'interactions
hydrophobes le mieux adapté qu'en testant diff érents types de gels.
• cependant, le meilleur choix pour commencer est un gel avec un groupement
phényl. En effet, ce groupement est d'hydrophobicité intermédiaire entre le n -butyl et le n - pentyl. Par ailleurs, les protéines très hydrophobes ne sont pas
facilement éluées des gels contenant le groupement octyl.
Les listes suivantes présentent certains anions et cations dans un ordre de moins en moins
favorable à la formation d'interactions hydrophobes :
http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/7RelStructFonction/3Structure/1StructPrimQuat/3AcidesAmines/1AcidAmine.htmhttp://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/7RelStructFonction/3Structure/1StructPrimQuat/3AcidesAmines/1AcidAmine.htm
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C2
K = --------(relation 1)
C1
C2 = 3 . C1n (avec n
inf érieur ou égal à 1)
ou bien encore :
K C2
------------ =
--------
C11-n
C1
• K est le coefficient de partage entre les deux phases et il dépend de la
température ;
• C1 est la concentration du composant C dans le solvant S1 ;
• C2 est la concentration du composant C dans la phase stationnaire : soit le solvant
S2 (partage), soit le solide (adsorption).
En fait, la chromatographie de partage et la chromatographie l'adsorption peuvent être
rapprochés :
• en effet, la solubilité et l'adsorption sont deux phénomènes liés aux forces de Van
der Waals et aux affinités respectives du composant C dans chacune des deux
phases ;
• par ailleurs, la relation 1 n'est qu'un cas particulier de la loi de Freundlich.
,II. 5!antages et incon!énients des différents t&pes de chromatographie liquide ? solide
caractéristiques échange d'ionsfiltration
sur gelaffinité
phase
reverse
interactions
hydrophobes
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résolution de laséparation
moyenne à
éle!ée
moyenne à
éle!ée
e#ceptionnelle
élevée pour
les
protéines et
les
polypeptide
s de faible
masse
molaire
moyenne
concentration
de la molécule
d'intérêt à
l'issue de la
chromatographi
e
augmentée souvent
diminuée augmentée augmentée augmentée
recouvrement
de l'activité
enzymatique
bon bon bon
la phasemobile
organique
peut
dénaturer
les enzymes
bon
capacité de
rétention
(fixation) du gel
éle!ée moyenne éle!ée moyenne éle!ée
régéneration du
gel
supporte l+action
d+une base forte
domainesd+application
trsnombreu#
ne supportepas les
agents
chimiques
agressifs
ne supportepas les
agents
chimiques
agressifs
supporte l+action
d+une base forte
autres
domainesd+application trs
nombreu#
-------
domaines
d'applicatio
n restreints
domainesd+application
trsnombreu#
domaines
d'application
restreints
nécessité de
"dessaler"l'échantillon à
l'issue de la
chromatographi
e
permet ledessalage
d+échantillons
nécessité de
coupler le
ligand d'où
un coût
élevé du gel
-------
nécessité de
"dessaler"l'échantillon à
l'issue de la
chromatographi
e
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,III. Liens Internet et références bibliographiques
ikipédia B portail 8*hromatograph& 8 0!ersion anglaise plus complte quela !ersion farnEaise.
"ite
"ite trés complet sur la chromatographie et d+autres techniques.
%echniques de
l+Ingénieur
"ociété Waters "ite
8@n)&mes B catal&seurs du monde !i!ant 8 ean Pelmont 01H Presses :ni!ersitaires deGrenoble ( I"96 B 2(JK1(KHH(J
8Principes de 9iochimie8 -orton Aoran =chs /aMn et "crimgeour 01' @d. De9oeck:ni!ersités ( I"96 B 2(NK'1(1HJN(O
8L@5 Database8 5ller au site
http://en.wikipedia.org/wiki/Category%3AChromatographyhttp://www.techniques-ingenieur.fr/affichage/DispIntro.asp?nGcmId=P1445&introID=345931&pdfID=345930&cookie=okhttp://www.techniques-ingenieur.fr/affichage/DispIntro.asp?nGcmId=P1445&introID=345931&pdfID=345930&cookie=okhttp://www.waters.com/watersdivision/ContentD.asp?watersit=JDRS-5KJJZ2http://forge.info.univ-angers.fr/~gh/Leadb/index.phphttp://en.wikipedia.org/wiki/Category%3AChromatographyhttp://www.techniques-ingenieur.fr/affichage/DispIntro.asp?nGcmId=P1445&introID=345931&pdfID=345930&cookie=okhttp://www.techniques-ingenieur.fr/affichage/DispIntro.asp?nGcmId=P1445&introID=345931&pdfID=345930&cookie=okhttp://www.waters.com/watersdivision/ContentD.asp?watersit=JDRS-5KJJZ2http://forge.info.univ-angers.fr/~gh/Leadb/index.php