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La fluorescence
Application à la biologieApplication à la biologie
La fluorescence
I. Principe de la fluorescence
II. Microscopie à épifluorescence
Généralités
• Les fluorophores sont avant tout des chromophores• Les chromophores sont des constituants moléculaires qui absorbent
la lumière hc/λ1,
Ce sont en général des composés aromatiques.
• Excités,les fluorophores peuvent, eux, émettre de la lumière à une longueur d’onde différente hc/λ2
4n+2 e-
Qu’est-ce qu’une molécule fluorescente ? Qu’est-ce qu’une molécule fluorescente ?
Photon(lumière d'excitation)
Émission de fluorescence,de plus faible énergie(plus grande longueur d’onde)
Perte d’énergie
La fluorescence est caractérisée par des transitions électroniques entre un état singulet fondamental et l'état singulet excité.La durée de vie moyenne de l'état excité est de l'ordre de 10-9 à 10-7 s
GFP : τ = 2,1 ns
e-
ENERGIE
Diagramme de Jablonski Diagramme de Jablonski (simplifié)(simplifié)
S0
S1
T1
ABS FL Relax th
PhospPhotoblanchiement
EEexcexc = E = Eemem + chaleur + chaleur (Eexc > Eem)
E = (hc)/ λλexcexc < < λλemem
Les molécules fluorescentes utiles en biologie
• Des protéines
• De petites molécules aromatiques
• Des nanocristaux de semiconducteurs
In
ten
sité
Longueur d’onde (nm)orange rouge
HcRed
EYFPEGFPECFPEBFP DsRed
0
20
60
80
40
100
350 400 450 500 550 600UV bleu vert
mRFP1
Longueur d’onde (nm)orange rouge
HcRed
EYFPEGFPECFPEBFP DsRed
0
20
60
80
40
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350 400 450 500 550 600UV bleu vert
mRFP1
HcRed
EYFPEGFPECFPEBFP DsRed
0
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0
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350 400 450 500 550 600350 400 450 500 550 600UV bleu vert
mRFP1
Longueur d’onde (nm)
HcRed
EYFPEGFPECFPEBFP DsRed
0
20
60
80
40
100
400 450 500 550 600 700650
UV bleu vert orange rouge IR
mRFP1
Longueur d’onde (nm)
HcRed
EYFPEGFPECFPEBFP DsRed
0
20
60
80
40
100
20
60
80
40
100
400400 450450 500500 550550 600600 700700650650
UV bleu vert orange rouge IR
mRFP1
Ex (nm) Em (nm) ε (M-1. cm-1) F brillance (ε . UA) pKa Remarque
wtGFP neutre 395 508 25-30 000 0,79 21 600 4,5 Aequorea victoria
wtGFP phénolate 475 503 9,5-14 000 ~9 400 Aequorea victoria
EBFP 380 440 31 000 0,18 5 600 bleu
ECFP 434 477 26 000 0,40 10 000 cyan
EGFP 488 509 55 000 0,60 33 000 5,5 vert
EYFP 515 529 80 400 0,61 49 000 6,9 jaune
Venus YFP 510 530 92 000 0,57 52 000 6,0 insensible Cl-1
DsRed ; DsRed2 558 583 57 000 0,79 45 000 4,7 Discosoma striata
mRFP1 584 607 44 000 0,25 11 000 4,5 DsRed monomère
HcRed1 ; HcRed-2A 588 618 faible Heteractis crispa
fluorescéine 490 520 80 000 0,90 72 000 6,3
Quantum Dot 405/605 605 2 400 000 0,40 1 000 000 à valider
GFP
Absorption Rendement Q
Représentation d’une protéine fluorescente tétramérique (asFP595)
Chromophore (GFP) :
-S-Y-G-
Maturation post-traductionnelle du fluorophore de la GFP
Les marquages en immunofluorescenceLes marquages en immunofluorescence
Coupe semi-fine
Antigène
Anticorps secondaire
Anticorps primaire
Echantillon
fluorochrome
Représentation d’un fluorophore inorganique (Alexa 568)
Exemple de quadruple marquageExemple de quadruple marquage
Alexa 488
400 500 600 700 nm
TRITC
Cy5
DAPI ex em
UV IR
PhotoPhotoblanchimentblanchiment (p (photobleachinghotobleaching, fading), fading)F
luor
esce
nce
(%
val
eur
initi
ale)
Temps (secondes)
Alexa 488Oregon Green 514
BODIPYOregon Green 488Fluorescein
Spectre
continu
Observation en lumière transmise
Observation en fluorescence avec un jeu de filtre spécifique de la GFP
Trajet optiqueMicroscope droit
Observation en fluorescence avec un jeu de filtre spécifique de l’Alexa
568.
Exemple d’image en épifluorescence (dendrites de neurone P-GFP)
C’est tout et c’est déjà pas mal !!!!
- immunofluorescence :FITC, TRITC, lissamine rhodamine, Texas Red, Cy3, Cy5, Alexa Fluors
- ADN :iodure de propidium, YOYO, Syto16, chromomycine A3, mithramycine; DAPI, Hoechst, DRAQ5, TOTO3
- mitochondie : sensible au potentiel membranaireRhodamine 123, DiOC6(3), DiOC7(3), JC-1, MitoTracker Red CMXRos (post-fixation possible)
- membranes :FM1-43, FM4-64, fusions-GFP, divers anticorps de surface
- Viabilité : FDA, exclusion d’iodure de propidium,… morphologie, avec DIC
- réticulum endoplasmique:(non spécifique) DiOC6(5), GFP-taggée
- appareil de Golgi : GFP-taggée,anticorps, NBD-C6-ceramide (pas pour
végétaux)
- dépendance envers le pH :carboxy-SNARF-1, BCECF
- dépendance envers le calcium :Fluo-3 ou -4 (± FF), FuraRed, CalciGreen, Indo-1, Cameleon
- divers :Acridine Orange, Neutral Red, Lucifer Yellow, chlorophylle,
- Protéines Autofluorescentes
Principaux fluorochromes utilisés en microscopie Principaux fluorochromes utilisés en microscopie en épifluorescence et confocaleen épifluorescence et confocale
Quelques documents
• Wikipedia http://fr.wikipedia.org/wiki/Fluorescence
• Live Cell Imaging (Goldman&Spector, Cell Press)
• Invitation à la fluorescence moléculaire (Valeur, De Boeck)
• Cell Imaging Techniques (Mossman, Brooke, Taatjes, Douglas, Humanan Press)
• Fluorescence microscopy (Rost , Fre, Cambridge University Press)
Bonus
• GFP photoactivable, photoconversion
• Quantum dots
Les paramètres caractéristiques d’un fluorophore :http://fr.wikipedia.org/wiki/Fluorescence
• Spectre d’absorption : capacité à absorber la lumière (chromophore) caractérisé par son maximum
• Spectre d’émission : capacité à émettre de la lumière après excitation caractérisé par son maximum
• Décalage de Stokes : mesure l’écartement des deux spectres précédents, en général on préfère les fluorophores ayant un grand « Stokes shift »
• Coefficient d'extinction molaire ε : il mesure la quantité de lumière absorbée par mole de fluorophore (excitabilité) (λ donné)
• Rendement quantique Φ : probabilité qu’un fluorophore excité émette un photon (efficacité de fluorescence) 0<Φ<1
• Brillance : proportionnelle à la quantité de lumière émise par fluorescence à une lumière d’excitation donnée. B = ε x Φ
• Cinétique de photoblanchiment : sensibilité du fluorophore
• Durée de vie à l’état excité (pour certaines applications)
e-
Photo-activation exemple : PA-GFP
Ando, Ryoko et al. (2002) PNAS. 99, 12651-12656
Quantum dot: particule fluorescente non aromatique !!!
10 - 15 nm
Core nanocrystals with size between 3-8 nm(CdSe, CdTe, CdS, ZnSe)
anorganic shell(ZnS, CdS)
organic shell (silica/siloxane,phospholipides, proteins)
Ordre de grandeur - Q-dot
Propriétés
300
200
100
emis
sion
inte
nsity
6040200 t (s)
sampling rate 26.7 Hz
Alexa 488
Q-Dot
bleach resistance of Q-Dots
Brillance = ε.ΦF
eGFP 33 000
Q Dot 1 000 000
• Forte brillance
• Résistance au photoblanchiement
• Clignotement
• Large gamme de spectre accessible en excitant dans le domaine UV
Exemple d’application : suivi de molécules uniques
1 μm