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“La ingeniería genética de
levaduras como herramienta
para el desarrollo
Biotecnológico del vino”
Ivan Ciklic, Laura Mercado y Mariana Combina
Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) EEA Mendoza
Resumen de la presentación
1) Importancia de Saccharomyces cerevisiae
Historica
Biotecnología
Organismo Modelo
2) Definición y aclaración de conceptos biotecnológicos
4) Ejemplificación: Reducción del nivel de alcohol en vinos
Estrategias previas
Nuestro proyecto en INTA
3) Principales areas de aplicación de la ingeniería genética de levaduras de vino
5) Conclusiones
Importancia de Saccharomyces cerevisiae
Biotecnología Tradicional
Uso extensivo en la industria debido a su larga historia en la producción De bebidas alcoholicas y en panaderías
Biotecnología Moderna
Mejoramiento génetico de levaduras para uso industrial. Producción deenzimas, hormonas y compuestos quimicos en Farmaceutica
Importancia de Saccharomyces cerevisiae
✱ Microorganismo con tiempos breves de generaión (1,5 h), alta densidad (108 cel/ml) y eleveda proporción superficie/volumen
✱ Génetica Mendeliana (ciclo de vida sexual, análisis de tetradas)
✱ Gran eficiencia de recombinación homologa
✱Colección de cepas delecionadas para cada uno de los 6000 genes
Organismo modelo
✱ Eucariota unicelular con todas las características típicas (e.g. organelas, regulación del ciclo celular, envejecimiento, apoptosis)
✱ Primer organismo eucariota en contar con la secuencia completa del genoma (1996)
Definición y aclaración de algunos
conceptos importantes
Biotecnología
Cualquier aplicación tecnologica que utilice sistemas biológicos, organismos vivientes o derivados de ellos para fabricar o
modificar productos o procesos para un uso específico
Organismo modificado geneticamente (GMO)
Un GMO es un organismo cuya composición genética ha sido alterada mediante la aplicación de técnicas de ingenieria génetica.Estas alteraciones generalmente implican la incorporación de un
nuevo gen/genes o el reemplazo de un gen/genes prexistente por uno diferente
Transgénico
Es un caso particular de GMO en el cual el gen/genes incorporado
proviene de una especie distinta de la del organismo receptor
Aceptación de productos derivados de
GMOs en la industria de alimentos
Aceptación de GMOs
Percepción de riesgo
Europa aceptaciónUSA aceptación
- Desconfianza en
entes reguladores
- Gran influencia de
ONGs conservadoras
- Credibilidad en los
entes reguladores
- Desconfianza en las
ONGs conservadoras
Ventajas para
el consumidor
- Productos más saludables
- Menor impacto en el ambiente
“Iniciativa
intragénica”
- Variabilidad intraespecie
- Transgénico de especie familiar
Areas de aplicación de ingeniería
genética de levaduras de vino
Mejoramiento de la performance durante la fermentación
(Adaptado de I. Pretorius y F. Bauer, 2002)
Areas de aplicación de ingeniería
genética de levaduras de vino
Mejoramiento de la eficienciade procesamiento
(Adaptado de I. Pretorius y F. Bauer, 2002)
Aplicación de ingeniería genética en
levaduras de vino
Mejoramiento del control biológico de microorganismos contaminantes
(Adaptado de I. Pretorius y F. Bauer, 2002)
Aplicación de ingeniería genética en
levaduras de vino
Mejoramiento del sabor y otras características sensoriales
(Adaptado de I. Pretorius y F. Bauer, 2002)
Aplicación de ingeniería genética en
levaduras de vino
Mejoramiento de las propiedades saludables del vino
(Adaptado de I. Pretorius y F. Bauer, 2002)
Problema abordado y principales
estrategias para solucionarlo
_ Uvas cosechadas con madurez azucarina muy avanzada
_ Veranos cálidos con un aumento en la incidencia solar
Problema
“Vinos con alta concentración dealcohol, indeseable para el Mercado de exportación“
Causas
Principales estrategias biológicas
1) Desarrollo de una levadura genéticamente modificada (GMO) conun redireccionamiento del metabolismo de glucosa hacia glicerol
2) Redireccionamiento del metabolismo de glucosa hacia glicerol sinutilizar técnicas de ingeniería genética (sin GMOs)
Metabolismo anaerobico de glucosa en
S. cerevisiae y disponibilidad de NADH/NAD+
Ad
ap
tad
o d
e D
. K
uti
na e
t al.,
2010
Sobre-expresión de la glicerol fosfato
dehidrogenasa GPD1/2A
dap
tad
o d
e D
. K
uti
na e
t al.
, 2010
- Reducción de hasta 45 % etanol y aumento
de hasta 700 % en glicerol
-Alta producción deacido acético
Deleción de Piruvato descarboxilasas
PDC1, PDC2, PDC5 y PDC6
Ad
ap
tad
o d
e D
. K
uti
na e
t al.,
2010
Hipotesis de trabajo
PDC2 = factor de transcripción que
regula positivamente la expresión de las
piruvato decarboxilasas PDC1 y PDC5
PDC2
Mutagénesis
pdc2
Reducción de regulación
positiva de PDC1 y PDC5
Reducción nivel de expresión
de PDC1 y PDC5
Selección
Redución en la producciónde etanol
PDC1 y PDC5 = Dos
isoformas de la piruvatodecarboxilasa que
cataliza la conversiónde piruvato enacetaldehído
Mutagénesis de PDC2 y reducción de la
producción de etanol
Deleción Δpdc2
Reducción actividad de Pdc - 80%
Nevoigt y Stahl 1996
Reducción etanol - 30%
Proyecto Actual
Mutagenesis de PDC2
1°Selección: mutantes pdc2con actividad Pdc reducida
2°Selección: mutantes pdc2con etanol reducido
Fermentación a escala pilotocon mutantes seleccionados
Proyecto actual vs. estrategias anteriores
para reducir niveles de etanol
Sobreexpresión de genes GPD1/2 de la vía de glicerol
(Remize et al., 1999; Lopes Barros
et al., 2000; Eglinton et al.,2002)
Sobreexpresión del gen de laLa glucosa oxidasa de A. Niger(Malherbe et al., 2003)
Deleción del gen PDC2(Nevoigt y Stahl 1996)
Mutagénesis de PDC2 y selección
de variantes mutantes apropiadas
Estrategia y autores Desventajas asociadas
Proyecto actual Ventajas asociadas
-Causa un severo efecto en el metabolismo del
Etanol con reducciones de hasta un 30 %.
-Los mutantes no pueden crecer en glucosa
-Aumento en la producción de acidoacético,
a consecuencia del desequilibrio redox.
-Problemas asociados con plásmidos de
multicopia: número variable de copias p/célula,
es necesario mantener una presión selectiva
-Problemas asociados al uso de plásmidos de
multicopia.
-Producto transgénico, poca acepta-
ción por la industria y consumidores
-Variabilidad genética intraespecie. -Mutación
integrada establemente en el genoma.
-Efectos moderados sobre el metabolismo.
Estrategias alternativas sin alteración directa de
un componente de la via metabolica de glucosa
NADH oxidasa - Fermentación incompleta- Reducción hasta 7 % etanol
- Bajas tasas de consumo de azucar y altaproducción de acetaldehído, acetona y acetoina
Transportadoresde glicerol
- Elevada producción de glicerol- 30 % reducción en la producción de biomasa
Glucosa oxidasa - Reducción en etanol de hasta 2 % v/v- Requiere oxigeno para funcionar
Transportadoresde hexosas
- Fermentación incompleta- Reducción hasta 7 % etanol
- Bajas tasas de consumo de azucar y altaproducción de acetaldehído, acetona y acetoina
Estrategias biológicas sin uso de
GMOs
✱ Sondeo de variantes naturales con baja producción de etanol-Poco probable de hayar ya que la levadura esta altamente
adaptada para producir etanol por selección natural
✱ Generación de híbridos interespecíficos-Hasta el momento no se ha encontrado ningún hibrido ya sea
artificial o natural que produzca menos etanol
✱ Evolución adaptativa -Es muy difícil generar condiciones de presión selectiva que
favorezcan un redireccionamiento del metabolismo de etanol
Conclusiones
✱ La biotecnología de levaduras es una herramienta poderosa paraobtener mejoras en el proceso de elaboración del vino, especialmente
en la etapa de fermentación
✱ Como ejemplo hemos visto que en el problema de la reducción de los niveles de alcohol, distintas estrategias de GMOs han logrado
reducir en menor o mayor proporción la producción de etanol asociado casi siempre a un aumento en la producción de glicerol
✱ Las principales limitaciones de las estrategias con GMOs derivan en muchos casos de factores intrínsecos como un aumento de productosindeseados como el ácido acético, o de factores externos como la baja
aceptación particularmente de los productos transgénicos
✱ El proyecto que desarrollamos en el INTA potencialmente posee varias ventajas sobre trabajos anteriores ya que se busca un
alteración moderada del metabolismo y se obtendría una cepa nativa GMO pero que no es transgénica lo cual aumenta la aceptación