La La ingeniería genéticaingeniería genética puede definirse puede definirse como un conjunto de técnicas, nacidas de como un conjunto de técnicas, nacidas de la Biología molecular, que permiten la Biología molecular, que permiten manipular el genoma de un ser vivo.manipular el genoma de un ser vivo.

Esta tecnología nos permite obtener fragmentos Esta tecnología nos permite obtener fragmentos de ADN en cantidades ilimitadas, que llevará de ADN en cantidades ilimitadas, que llevará además el además el gen o los genesgen o los genes que se desee. que se desee.

Este ADN puede incorporarse a las células de Este ADN puede incorporarse a las células de otros organismos (vegetales, animales, otros organismos (vegetales, animales, bacterias...) en los que se podrá "expresar" la bacterias...) en los que se podrá "expresar" la información de dichos genes. información de dichos genes.

En la tecnología del ADN recombinante En la tecnología del ADN recombinante podemos diferenciar cinco etapas básicas: podemos diferenciar cinco etapas básicas:

1º Corte específico del ADN1º Corte específico del ADN

Corte específico del ADN en fragmentos pequeños y Corte específico del ADN en fragmentos pequeños y manejables mediante la utilización de un tipo de enzimas manejables mediante la utilización de un tipo de enzimas conocidas como conocidas como enzimas de restricciónenzimas de restricción que pueden que pueden considerarse como las "tijeras moleculares". considerarse como las "tijeras moleculares". Cada enzima de restricción reconoce una secuencia Cada enzima de restricción reconoce una secuencia

específica de nucleótidos y corta en ese punto cada específica de nucleótidos y corta en ese punto cada una de las cadenas de ADN. una de las cadenas de ADN.

Los extremos libres que quedan se llaman Los extremos libres que quedan se llaman extremosextremos pegajpegajosos, porque pueden unirse a otros fragmentos de osos, porque pueden unirse a otros fragmentos de ADN que hayan sido cortados por la misma enzima de ADN que hayan sido cortados por la misma enzima de restricciónrestricción. .

En este esquema se indica el lugar en el que corta la enzima de restricción. Se aprecia la actuación en ambas hebras.

En este esquema se ve el resultado de la actuación de la enzima de restricción.

Ha quedado rota la molécula de ADN, quedando unos bordes pegajosos por donde puede unirse este ADN, con otro aunque sea de una especie diferente.

Esta inserción se realiza en Esta inserción se realiza en vectores de clonadovectores de clonado, que son los , que son los agentes transportadores capaces de introducirlos en las células agentes transportadores capaces de introducirlos en las células hospedadoras. hospedadoras.

Los vectores de clonación son pequeñas moléculas de Los vectores de clonación son pequeñas moléculas de ADN, que tienen capacidad para autorreplicarse dentro de las ADN, que tienen capacidad para autorreplicarse dentro de las células hospedadoras. células hospedadoras. Se utilizan con frecuencia dos tipos de vectores de clonación: Se utilizan con frecuencia dos tipos de vectores de clonación:

Plásmidos. Son moléculas de ADN circular, con un tamaño menor que el del cromosoma. Se replican con independencia del cromosoma bacteriano ya que tienen su propio origen de replicación.

Bacteriófagos. Se trata de virus que infectan a bacterias y que de manera natural insertan su material genético en el de la bacteria invadida.

2º Insercción de los fragmentos de ADN2º Insercción de los fragmentos de ADN

En la figura a tenemos un gen(color rojo) que interesa insertar en un plásmido (color turquesa)

En esta secuencia de dibujos se puede ver como se realiza la inserción de un gen en un plásmido

En la figura b, vemos como una enzima de restricción ha cortado el gen y el plásmido, quedando unos bordes cohesivos o pegajosos.

La unión del ADN que contiene el gen que se desea clonar con el vector de clonación, se realiza por medio de otras enzimas, denominadas ADN-ligasas, que unen ambos trozos de ADN. El resultado es una molécula de ADN recombinante, ya que contiene fragmentos de ADN de distinta procedencia.

Se trata de insertar el gen deseado en un fragmento de ADN vírico (figura d) Se trata de insertar el gen deseado en un fragmento de ADN vírico (figura d) Posteriormente se ensamblarán las distintas partes del virus (figura e). Así Posteriormente se ensamblarán las distintas partes del virus (figura e). Así quedará el virus completo(figura f). quedará el virus completo(figura f).

Además del origen de replicación, los vectores de clonación deben llevar otros genes denominados marcadores, que sirven para identificar las células que contienen el vector de clonación. Se suelen utilizar como marcadores, genes de resistencia a antibióticos y genes de bioluminiscencia.

Genes de resistencia a antibióticos. Sirven para identificar bacterias que contienen el vector de clonación, porque estas bacterias serán resistentes al antibiótico del gen marcador.

Genes de luminiscencia.. En este caso, la célula que contenga el gen que se quiere clonar, tendrá la propiedad de emitir luz, ya que el marcador que se le incorpora determina que se exprese esa característica. Este sistema se emplea cuando la célula hospedadora es una célula eucariota.

3º IDENTIFICACIÓN DEL VECTOR DE 3º IDENTIFICACIÓN DEL VECTOR DE

CLONACIÓNCLONACIÓN

El siguiente paso será introducir el vector de clonación que contiene el gen El siguiente paso será introducir el vector de clonación que contiene el gen que se quiere clonar en la célula hospedadora, para que ésta, al que se quiere clonar en la célula hospedadora, para que ésta, al multiplicarse, origine un multiplicarse, origine un clon celularclon celular que lleve el gen concreto. que lleve el gen concreto. Existen varios métodos que dependerán del tipo de célula Existen varios métodos que dependerán del tipo de célula fundamentalmente fundamentalmente

Transformación. Ocurre espontáneamente en ciertos tipos de bacterias y se consigue artificialmente sometiendo a la célula bacteriana a tratamientos físicos y químicos. La célula capta moléculas de ADN que se encuentran en el medio externo, las introduce en su interior y las incorpora a su genoma.

Transducción.Este método consiste en introducir el ADN en la célula hospedadora mediante un virus, utilizando como vector de clonación el genoma del virus.

4º INTRODUCIÓN DEL VECTOR EN LA 4º INTRODUCIÓN DEL VECTOR EN LA

CÉLULACÉLULA

5º Clonado del ADN5º Clonado del ADN

Una vez que se ha conseguido la población de Una vez que se ha conseguido la población de bacterias transformadas, el siguiente paso es bacterias transformadas, el siguiente paso es poner a las bacterias en un medio de cultivo poner a las bacterias en un medio de cultivo apropiado para que se multipliquen. A la vez apropiado para que se multipliquen. A la vez que se reproducen las bacterias lo hace también que se reproducen las bacterias lo hace también el plásmido con el gen que interesa, el resultado el plásmido con el gen que interesa, el resultado es que se obtiene un es que se obtiene un clon clon de células que llevan de células que llevan todas ese gen de interés. Se pueden formar por todas ese gen de interés. Se pueden formar por tanto diferentes clones con genes de interés tanto diferentes clones con genes de interés para el hombre. Este conjunto de clones se para el hombre. Este conjunto de clones se denomina denomina biblioteca genómicabiblioteca genómica. .

Otra técnica propia de la Ingeniería Genética es la Otra técnica propia de la Ingeniería Genética es la determinación de la secuencia de nucleótidos de un determinación de la secuencia de nucleótidos de un ADN, conocida como ADN, conocida como secuenciaciónsecuenciación de dicho ácido de dicho ácido nucléico. nucléico.

Se pueden conseguir muchos fragmentos , de Se pueden conseguir muchos fragmentos , de diversos tamaños y lo que se trata es de recomponer la diversos tamaños y lo que se trata es de recomponer la molécula original como si se tratase de un puzzle. molécula original como si se tratase de un puzzle.

El método más usado para la secuenciación es el conocido como técnica del didesoxi.

Se denomina así por ser necesario los didesoxirribonucleótidos que han perdido su grupo alcohol OH del carbono 3'.

Como los nucleótidos se unen por este grupo OH del carbono 3', hay que pensar que si nos encontramos con un didesoxinucleótido será imposible que se una otro nucleótido y la cadena terminará aquí.

Para hacer la Para hacer la reacción de secuenciaciónreacción de secuenciación se necesita: se necesita: Como "molde" se utiliza una de las cadenas del fragmento de ADN Como "molde" se utiliza una de las cadenas del fragmento de ADN

que se va a secuenciar. que se va a secuenciar.

desoxinucleótidos de las cuatro bases: A, T, C y G. didesoxinucleótidos de una base en cada una de las cuatro reacciones de secuenciación: dA, dT, dC y dG.

Al añadir la ADN-polimerasa, comienza la polimerización , pero Al añadir la ADN-polimerasa, comienza la polimerización , pero cesa el incorporarse un didesoxinucleótido cesa el incorporarse un didesoxinucleótido

Se produce un conjunto de cadenas dobles cuyas longitudes dependen de la situación del didesoxinucleótido incorporado. En el caso expuesto deducimos tres fragmentos con 8, 13 y 17 nucleótidos en cuyos extremos tenemos ADENINA, nos permite interpretar que en el ADN original, en esas situtaciones tendremos TIMINA.

Deben prepararse cuatro reacciones de secuenciación, cada una Deben prepararse cuatro reacciones de secuenciación, cada una con un didesoxi distinto . Los fragmentos resultantes se separan por con un didesoxi distinto . Los fragmentos resultantes se separan por tamaño mediante electroforesis, se autorradiografían, y la sucesión tamaño mediante electroforesis, se autorradiografían, y la sucesión de bandas de cada una de las cuatro reacciones, comparándolas de bandas de cada una de las cuatro reacciones, comparándolas entre sí,dan la secuencia del ADN. entre sí,dan la secuencia del ADN.

Es una técnica que permite duplicar un número ilimitado de veces Es una técnica que permite duplicar un número ilimitado de veces un fragmento de ADN en un tubo de ensayo. Mediante esta técnica un fragmento de ADN en un tubo de ensayo. Mediante esta técnica pueden generarse millones de moléculas idénticas, a partir de una pueden generarse millones de moléculas idénticas, a partir de una molécula de ADN. Esto se puede conseguir en unas horas molécula de ADN. Esto se puede conseguir en unas horas

La reacción es un proceso cíclico: La molécula de ADN que va a copiarse se calienta para que se La molécula de ADN que va a copiarse se calienta para que se

desnaturalice y se separe las dos hebras. desnaturalice y se separe las dos hebras. Cada una de las hebras es copiada por la ADN-polimerasa. (Cada una de las hebras es copiada por la ADN-polimerasa. (Se Se

utiliza la ADN-polimerasa de una bacteria que vive en aguas termales, utiliza la ADN-polimerasa de una bacteria que vive en aguas termales, Thermus aquaticusThermus aquaticus, así la enzima puede trabajar a altas , así la enzima puede trabajar a altas

temperaturastemperaturas).). Las cadenas recién formadas son separadas de nuevo por el Las cadenas recién formadas son separadas de nuevo por el

calor y comienza otro nuevo ciclo de copias. Estos ciclos se calor y comienza otro nuevo ciclo de copias. Estos ciclos se

repiten hasta que se obtiene el número de copias deseadorepiten hasta que se obtiene el número de copias deseado. .

CuriosidadesLa potencialidad de

esta técnica es impresionante, a partir de una sola

molécula de ADN, la PCR puede generar 100000 millones de moléculas idénticas

en una tarde.El ADN puede

proceder de una muestra de tejido de un hospital, de una

gota de sangre o semen en la escena de un delito, o de un cerebro momificado.

La técnica fue desarrollada por La técnica fue desarrollada por K.B. Mullis a partir de 1983. K.B. Mullis a partir de 1983.

Cada ciclo dura Cada ciclo dura aproximadamente 5 minutos y aproximadamente 5 minutos y para conseguir una cantidad útil para conseguir una cantidad útil se requieren al menos 20 ciclos se requieren al menos 20 ciclos de reacciones.de reacciones.

Se realiza de forma automática Se realiza de forma automática en un aparato como se ve en la en un aparato como se ve en la fotografía, con lo que se fotografía, con lo que se consigue un clonaje rápido en consigue un clonaje rápido en un sistema libre de células. un sistema libre de células.

En esta animación puede verse simplificado el proceso. Las dos hebras se separan, en cada hebra se fija una pequeña cadena de nucleótidos (el cebador o promotor, en color amarillo ), que se fija sobre una parte concreta del ADN y a continuación empieza el proceso de la replicación. En unos segundos se completa el ciclo, y de un trozo de ADN, tenemos ya dos cadenas.

Secuenciación Una de las razones mas comunes para el uso de la PCR es la formación de suficiente cantidad de ADN molde para su secuenciación. Es mucho mas sencillo y rápido que la clonación en células.

Estudios evolutivos Mediante la PCR se pueden amplificar genes de organismos ya extinguidos, como del mamut, o restos antiguos humanos. Se pueden comparar estos genes con los genes semejantes de organismos actuales y poder reconstruir árboles filogenéticos. El PCR también se ha utilizado para conseguir el mapa del genoma humano.

Huellas dactilares del ADN. La determinación de las huellas dactilares genéticas constituye una de las aplicaciones mas interesantes de la PCR. Mediante esta técnica es posible comparar muestras diferentes de ADN para comprobar si pertenecen al mismo individuo o no, o si existe parentesco entre ellas.

Esta técnica se aplica actualmente en Medicina forense e investigaciones policiales, con el fin de identificar indiividuos a partir de muestras biológicas, como sangre, semen, piel o cabellos. También se utiliza en las pruebas de paternidad.

APLICACIONES DE LA PCR