La plate-forme Protéomique

Génopole Toulouse Midi-

Pyrénées http://proteomique.ipbs.fr

http://www.genotoul.frRIO

Bernard Monsarrat – IPBS/CNRS

Proteomics Proteomics PlatformPlatform

From proteins to function……

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2D Gel Electrophoresi

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RobotizationPackard Multiprobe II

ScannersTyphoon

Peptide Mass Fingerprinting ABI MALDI Tof-Tof

Peptide SequencingProtein CharacterizationThermoFisher Orbitrap

Posttranlational ModificationsABI Q-TRAP

Quantitative Proteomics ABI Q-STAR

Biomolecular Interactions Biacore 3000, X

BioinformaticsSQL-LIMS

MascotIn-house software

RIO Label Toulouse Midi-PyrénéesToulouse Midi-Pyrénées

Technical Technical

SkillsSkills

IFR 40

IFR 109

IFR 31

IFR 30

IPBS

ICR

La Plateforme Génopole Toulouse Midi-Pyrénées

Renaud Albigot - BioinformaticsDavid Bouyssié - PhD in BioinformaticsEmmanuelle Mouton - Bioinformatics

Karima Chaoui - Biochemistry and Mass Spectrometry Florence Dalvai - Biochemistry and Mass Spectrometry Carine Froment - Biochemistry and Mass Spectrometry

Carole Pichereaux - Biochemistry and Mass Spectrometry Michel Rossignol - Biochemistry and Mass SpectrometryAlexandre Stella - Biochemistry and Mass Spectrometry

Ludovic Canelle - Post-doc, Marie-Pierre Bousquet - Researcher

Anne Gonzalez de Peredo – Researcher

Bernard Monsarrat CoordinationMariette Matondo - PhD student

Odile Schiltz – ResearcherSandrine Uttenweiler – Researcher

J.P. Estève and F. Lopez (IFR 31), F. Pont (IFR 30), P. Valenti (IFR 109), A. Cuider (ICR)

The Proteomics Platform - Staff

Patterson, S.D. & Aebersold, R.H (2003) Nature Genetics

Differential Proteomics

Differential Proteomics

Interacting Proteins

Interacting Proteins

Post-Translational Modifications

Post-Translational Modifications

Challenges in Proteomics

2006-2007

Mise en place d’une nouvelle génération d’instruments :

- LTQ-FT-Orbitrap

Développement de nouvelles stratégies :

- Identification de protéines de faible abondance

Un spectromètre de masse hybride de nouvelle génération : LTQ-FT-Orbitrap

• Mass resolution > 60,000 (FWHM) at m/z 400 at 1 sec cycle

• Max. resolution > 100,000 at m/z 400 in a full scan

• Mass accuracy < 5 ppm external calibration (2 days old)• < 2 ppm internal calibration (lock mass)

• Mass range : 50 – 2,000; 200 – 4,000

• Sensitivity : sub-femtomol on column

• Dynamic range : 3000 in a single scan

• Throughput : 3 accurate mass scans per second or 4 scans per second parallel detection (1 HR Orbitrap scan + 3 LR LTQ MS/MS scans)

IPBS Toulouse : Inst 15/09, Recept. 20/10 -2006

zm

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Mouvement des ions dans l’Orbitrap

““ comment maintenir des ions stables, dans un champ électrostatique” comment maintenir des ions stables, dans un champ électrostatique”

Dr. Alexander MakarovDr. Alexander Makarov, ,

Paramètres affectant le degré de couverture d’un protéome

100g total protein lysate ↔100 copy/cell ↔ 20 fmol

Trap filled with 5.106 ionsDetection of signal ~ 500 ionsDynamic range ~ 104

Eucaryotic cells : ~105 -106

Biological fluids : ~ 1010 (serum)

Red blood cell :97-98% haemoglobin2% other proteins

de Godoy et al. Genome Biol. 2006

Low abundance peptides not picked for MS/MS: 60%

Reduction de la gamme dynamique ?

ETUDE DU «PROTEOME CACHE» DE L’ERYTHROCYTE PAR LIGANDS PEPTIDIQUES COMBINATOIRES ET LC-MS/MS SUR LTQ-FT-ORBITRAP

Echantillon protéiqueLarge gamme dynamique

RBC : 98% d’hémoglobine 64 millions de ligands peptidiques

Flow-Through : Majeure partie des protéines de haute abondance

Eluat :Réduction de la

gamme dynamique

« Equalization des érythrocytes »

Collaboration : E. Boschetti (R&D), BioRad

SE

-Bea

ds

E-B

ead

s

E-B

ead

s

ElutionTUC

ElutionUH

Organicelution

SE

-Bea

ds

ElutionTUC

ElutionUH

-NH2 -COOHStart

E1

E2

E3 S1

S2

S3FT

Organicelution

RBC lysat fraction Soluble

« Equalization des érythrocytes »

250 kDa

150 kDa

100 kDa

75 kDa

50 kDa

37 kDa

25 kDa

20 kDa

15 kDa

10 kDa

Mq Start FT E1 S1 E2 S2 E3 S3

SDS-PAGEanalytique

« Equalization des érythrocytes »

N° spots: 80 (1300 g)Silver staining

N° spots: 950 (640 g)Silver staining

E1+E2+E3+S1+S2+S3Start

Start : 2mg

E1 : 100µg

E2 : 100µg

E3 : 100µg

S1 : 100µg

S2 : 100µg

S3 : total

SDS-PAGE gelCut 20 bands per sample

Trypsin digestion

NanoLC-MSMSon LTQ-Orbitrap 1 MS Orbitrap reso=60000 5 MSMS Ion trap (Data Depedent Acquisition)

Analyse par nanoLC-MSMS LTQ-FT-Orbitrap

Mascot 2.0 :Search in IPI human

MFPaQ :Protein Validation

False Postive Rate: 0.7%

MFPaQ : Bouyssié et al. Mol. Cell. Prot., 2007

Effet de l’”Equalization” sur MS/MS des peptides ?

Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

Before equalization After equalization

Number of identified peptides decreases after equalizationMore time for minor peptides sequencing

Effect of equalization on high abundance proteins

Hepatoma-derived growth factor

Before equalization After equalization

Effect of equalization on low abundance proteins

Number of identified peptides increases after equalization+ sequencing of additional proteins

110748060

Après Equalization E1+E2+E3+S1+S2+S3 fractions

1587 proteins

Avant Equalization « Start » fraction540 proteins

Identifications : 1647 proteines ! Pasini et al MCP 2006 : 252

Avant versus Après « Equalization »

NanoLC-MSMSon LTQ-Orbitrap

Analyse systématique :

Evolution des approches protéomiques

Identification de l'ensemble des protéines d'un système

Analyse fonctionnelle :

Quantification relative d'un ensemble de protéines

dans deux conditions distinctes

Interactions protéine/protéine :

Caractérisation des partenaires protéiques au sein d’un complexe

Analyse fonctionnelle ciblée : (Bioinformatique)

Analyse différentielle : (Bioinformatique)

Modifications post-traductionnelles

Etude différentielle de sous-protéomes

Quantification absolue de protéines d’intérêt

•Réseau National des Génopoles

•CNRS,

•Région Midi-Pyrénées

Remerciements

• Pôle de Compétitivité Cancer Bio Santé

• Cancéropole GSO, INCa

• FRM, ANR…

CPER 2007_2013, Protéomique : 5.2 M€