LA SEPSI PROCEDURE DI BASE E SPECIALISTICHE FASE

ANALITICA E POSTANALITICA

Paolina Cavalcanti

La SEPSI egrave una delle piugrave gravi sindromi infettive La SEPSI egrave una malattia progressiva

DIMENSIONE DEL PROBLEMA

MORTALITArsquo

Sepsi 10 ndash 40

Shock settico 40 ndash 70

Lrsquoaumento di incidenza della patologia settica egrave da attribuirsi a vari fattori quali

- aumento aspettativa di vita media della popolazione

- relativa frequenza di sepsi associata ad AIDS

- uso indiscriminato di antibiotici

- terapie cortisoniche prolungate

- migliorate possibilitagrave nellrsquouso della ventilazione artificiale

- terapie antiblastiche e radioterapia

- indagini strumentali invasive

Soggetti a rischio maggiore

immunodepressi ustionati traumatizzati anziani diabetici portatori di

catetere

LO SHOCK SETTICO Egrave LA PIUgrave COMUNE CAUSA DI MORTE NELLE

UNITAgrave DI TERAPIA INTENSIVA (ICU)

Se la diagnosi egrave rapida la prognosi egrave favorevole nellrsquo80 dei casi altrimenti si

ha una mortalitagrave di circa il 70

Crit Care Med 2004 Nov32(11 Suppl)S495-512

Antimicrobial therapy for patients with severe sepsis and septic shock

an evidence-based review Bochud PY Bonten M Marchetti O Calandra T

The Institute for Systems Biology Seattle WA USA

CONCLUSION Since the prompt institution of therapy that is active against the

causative pathogen is one of the most important predictors of

outcome clinicians must establish a system for rapid administration of

a rationally chosen drug or combination of drugs when sepsis or septic

shock is suspected

La SEPSI egrave una delle piugrave gravi sindromi infettive La SEPSI egrave una malattia progressiva

DIMENSIONE DEL PROBLEMA

MORTALITArsquo

Sepsi 10 ndash 40

Shock settico 40 ndash 70

Lrsquoaumento di incidenza della patologia settica egrave da attribuirsi a vari fattori quali

- aumento aspettativa di vita media della popolazione

- relativa frequenza di sepsi associata ad AIDS

- uso indiscriminato di antibiotici

- terapie cortisoniche prolungate

- migliorate possibilitagrave nellrsquouso della ventilazione artificiale

- terapie antiblastiche e radioterapia

- indagini strumentali invasive

Soggetti a rischio maggiore

immunodepressi ustionati traumatizzati anziani diabetici portatori di

catetere

LO SHOCK SETTICO Egrave LA PIUgrave COMUNE CAUSA DI MORTE NELLE

UNITAgrave DI TERAPIA INTENSIVA (ICU)

Se la diagnosi egrave rapida la prognosi egrave favorevole nellrsquo80 dei casi altrimenti si

ha una mortalitagrave di circa il 70

Crit Care Med 2004 Nov32(11 Suppl)S495-512

Antimicrobial therapy for patients with severe sepsis and septic shock

an evidence-based review Bochud PY Bonten M Marchetti O Calandra T

The Institute for Systems Biology Seattle WA USA

CONCLUSION Since the prompt institution of therapy that is active against the

causative pathogen is one of the most important predictors of

outcome clinicians must establish a system for rapid administration of

a rationally chosen drug or combination of drugs when sepsis or septic

shock is suspected

DIMENSIONE DEL PROBLEMA

MORTALITArsquo

Sepsi 10 ndash 40

Shock settico 40 ndash 70

Lrsquoaumento di incidenza della patologia settica egrave da attribuirsi a vari fattori quali

- aumento aspettativa di vita media della popolazione

- relativa frequenza di sepsi associata ad AIDS

- uso indiscriminato di antibiotici

- terapie cortisoniche prolungate

- migliorate possibilitagrave nellrsquouso della ventilazione artificiale

- terapie antiblastiche e radioterapia

- indagini strumentali invasive

Soggetti a rischio maggiore

immunodepressi ustionati traumatizzati anziani diabetici portatori di

catetere

LO SHOCK SETTICO Egrave LA PIUgrave COMUNE CAUSA DI MORTE NELLE

UNITAgrave DI TERAPIA INTENSIVA (ICU)

Se la diagnosi egrave rapida la prognosi egrave favorevole nellrsquo80 dei casi altrimenti si

ha una mortalitagrave di circa il 70

Crit Care Med 2004 Nov32(11 Suppl)S495-512

Antimicrobial therapy for patients with severe sepsis and septic shock

an evidence-based review Bochud PY Bonten M Marchetti O Calandra T

The Institute for Systems Biology Seattle WA USA

CONCLUSION Since the prompt institution of therapy that is active against the

causative pathogen is one of the most important predictors of

outcome clinicians must establish a system for rapid administration of

a rationally chosen drug or combination of drugs when sepsis or septic

shock is suspected

Soggetti a rischio maggiore

immunodepressi ustionati traumatizzati anziani diabetici portatori di

catetere

LO SHOCK SETTICO Egrave LA PIUgrave COMUNE CAUSA DI MORTE NELLE

UNITAgrave DI TERAPIA INTENSIVA (ICU)

Se la diagnosi egrave rapida la prognosi egrave favorevole nellrsquo80 dei casi altrimenti si

ha una mortalitagrave di circa il 70

Crit Care Med 2004 Nov32(11 Suppl)S495-512

Antimicrobial therapy for patients with severe sepsis and septic shock

an evidence-based review Bochud PY Bonten M Marchetti O Calandra T

The Institute for Systems Biology Seattle WA USA

CONCLUSION Since the prompt institution of therapy that is active against the

causative pathogen is one of the most important predictors of

outcome clinicians must establish a system for rapid administration of

a rationally chosen drug or combination of drugs when sepsis or septic

shock is suspected

Crit Care Med 2004 Nov32(11 Suppl)S495-512

Antimicrobial therapy for patients with severe sepsis and septic shock

an evidence-based review Bochud PY Bonten M Marchetti O Calandra T

The Institute for Systems Biology Seattle WA USA

CONCLUSION Since the prompt institution of therapy that is active against the

causative pathogen is one of the most important predictors of

outcome clinicians must establish a system for rapid administration of

a rationally chosen drug or combination of drugs when sepsis or septic

shock is suspected

Baseline characteristics of 2634 patients with suspected sepsis according to receipt of

adequate or inadequate antibiotic treatment

MacArthur R D et al Clin Infect Dis 200438284-288

copy 2004 by the Infectious Diseases Society of America

ldquoLa precocitagrave dellrsquointervento terapeuticocompresa la somministrazione della terapia antimicrobica attiva sullrsquoagente eziologicoegrave decisiva ai fini prognostici ed egrave associata ad una

concreta riduzione della mortalitagrave ldquo

(Camporese A IJLaM 20084 Suppl 45-49)

Far primahelliphelliphellip

Raggiungere lrsquoobiettivo in tempi rapidi mantenendo

lrsquoalta qualitagrave dei risultati

bull Tempo identificazione

bull Tempo prove di sensibilitagrave

bull Terapia empirica

bull Insorgenza resistenze

bull gt mortalitagrave

bull gt costi

Diagnosis

Obtain appropriate cultures before starting antibiotics provided

this does not significantly delay antimicrobial administration

bullObtain two or more BCs

bullOne or more BCs should be percutaneous

bullOne BC from each vascular access device in place gt 48 hrs

bullCulture other sites as clinically indicated

Perform imaging studies promply in order to confirm and sample

any source of infection if safe to do so

DIAGNOSI DI LABORATORIO

Emocoltura

Coltura sito drsquoinfezione

Diagnosi molecolare

Biomarkers (IL-6 PCR PCT LPS)

EMOCOLTURA

isolamento colturale

del microrganismo dal sangue

Il laboratorio nella diagnosi delle sepsi

FASE PRE-ANALITICA

INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO

Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da

14

Emocoltura fase pre-analitica

Emocoltura pre-analitica

Personale che effettua il prelievo

Sede del prelievo

Sterilizzazione della cute

Momento del prelievo

Numero dei prelievi

Volume del sangue

Mezzo di coltura

EMOCOLTURA

Ottimizzazione della procedura

Emocoltura team per il prelievo

Riduzione della contaminazione da 48 a 1 (Weinbaum J Clin Microbiol 2001)

da 42 a 22 (Shifman Arch Pathol Lab Med 1996)

Affidare il prelievo a personale competente ed informato

Lavare le mani prima e dopo il prelievo

Indossare guanti nei passaggi di raccolta e trasporto

Ricerca del sito di prelievo mediante palpazione

Disinfezione della cute

bull sgrassare con Alcool 70 (o Clorexidina)

bull disinfettare con Iodoforo (Iodiopovidone)

bull applicare con movimento circolare verso

lrsquoesterno lazione disinfettante egrave tempo-dipendente

Quando la cute egrave asciutta egrave pronta per il prelievo

Mai pungere prima di 1-3 minuti

Emocoltura il prelievo

Antiseptic skin preparation

Emocoltura sede del prelievo

Effettuare il prelievo da vena periferica

Tempo del prelievo

Prima di iniziare la terapia antibiotica

Prima della sommistrazione dellrsquoantibiotico

Nellrsquoarco di 5-10rsquo (eccezione infezioni endovascolari quali

endocardite o sepsi CVC correlate)

As a practical matter blood cultures should be obtained simultaneously (or over a short timeframe) Drawing blood at intervals is only indicated when it is necessary to document continuous bacteremia in patients with suspected infective endocarditis or other endovascular (eg catheter-related) infections

CLSI publication M47-AmdashPrinciples and Procedures for Blood Cultures

Tempi di incubazione

emocolture

I microorganismi ldquofastidious ldquo richiedono tempi piugrave lunghi di coltura almeno

2 - 3 settimane di incubazione

Washington JA Mayo Clin Proc 1982

Alcuni microorganismi possono generare segnali molto deboli o anche nessun segnale

di crescita

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

SOSPETTO CLINICO

Esami microscopici e subcoltura cieca delle emocolture negative

Aumento dei tempi di incubazione delle emocolture negative

Prelevare 2 - 3 set (anaerobi + aerobi) per aumentare la possibilitagrave di isolare il

microrganismo in causa

differenzia la vera batteriemia dalle

contaminazioni

At least 15 of positive BC are due to

contaminants the number can be as high as

40

819 of CoNS and 493 of viridans

streptococci were contaminants

Wenstein MP Clin Infect Dis 1997

Numero di emocolture

163 malati (non endocarditi) 20 mL per set (Cockerill FR 2004)

blood cultures

n 1 2 3

diagnostic () 63 80 96

Optimal volume of blood for culture

ldquoThe volume of blood is the single most

important factor for successful recovery of

microorganisms from the blood stream of patientsrdquo

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

What is the optimal volume

of blood for culture

Blood from patients with IE contains 1

to 10 bacteria per mL

There is approximately linear

relationship between the yield of

bacteria from blood and the volume of

blood

ldquoThe volume of blood sample drawn

should be 40-60 mlrdquo

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

23

24

The microbiological diagnosis

TAT

Emocoltura analitica

BACTEC 9240

Strumento modulare

Incubatore Agitatore Lettore

I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer

Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo

I flaconi sono inseriti nello strumento

BACTEC 9240

FASE PRE-ANALITICA

INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO

Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da

Emocoltura positiva

Interpretazione del risultato

RUOLO PATOGENO

DEL MICRORGANISMO

ISOLATO

IDENTIFICAZIONE

DEI MICROORGANISMI

CONTAMINANTI

29

Batteriemia significativa

Improbabile Incerta Probabile

Corynebacterium spp

Non-anthracis Bacillus spp

Propionibacterium acnes

Stafilococchi Coagulasi Negativi

S aureus

S pneumoniae

Enterobacteriaceae

P aeruginosa

C albicans

probabilitagrave post-test n positivi n colture

confrontare antibiogrammi confrontare genotipi

probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente

protesi evidenza clinica

Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7

Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo

Catetere venoso centrale

I CATETERI

sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono

monitoraggio di parametri vitali

somministrazione di nutrienti e di farmaci

Siti di inserzione

e tipologie doppio triplo lume

tunnellizzati e non impregnati e non

con diversi gauge

Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata

biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche

morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole

inserzione transcutanea

CRBSI

Catheter Related Blood Stream Infection

Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere

Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione

Mermel LA Clin Infect Dis 2001

Sepsi CVC-correlata

- definizione -

Infezioni nei portatori di CVC

Emocoltura quantitativa

da catetere centrale da vena periferica

bull Prelievo contemporaneo

bull Volume uguale

bull Incubazione contemporanea

DTP gt120 minuti

Sepsi CVC correlata

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Sistema

totalmente

impiantabile

Condizioni

generali

scadute

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

NO

NO

SI

SI

Emocoltura

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Emocoltura

Germi resistenti

Miceti

Germi sensibili

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Non

efficace

Trombolisi

Efficace

NO SI

Risposta alla terapia

Negativa Positiva

Permanenza

del catetere

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE

REPARTI chirurgie

neurochirurgia nefrologia+centro trapianti

pediatria rianimazione neonatologia

medicine

geriatria

Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259

Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012

2

48 43

2 5

bb+

bb-

cocchi+

anaerobi

lieviti

Molecular diagnosis

LightCycler SeptiFast Test

bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici

bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo

45

Bacterial Lysis amp

DNA Extraction

Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) bull Staphylococcus aureus

bull CoNS

bull Streptococcus pneumoniae

bull Streptococcus spp

bull Enterococcus faecium

bull Enterococcus faecalis

Fungi bull Candida (albicans

tropicalis

parapsilosis)

bull Candida (krusei glabrata)

bull Aspergillus (fumigatus)

PCR Analysis

MRSA (mecA)

VRE (van A B)

Sample Preparation

Sample whole blood

Septifast Analytical Concept

TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA

Rilevabili mediante PCR

Rilevabili mediante coltura

DNA batterico libero

Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati

Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

ldquoLa precocitagrave dellrsquointervento terapeuticocompresa la somministrazione della terapia antimicrobica attiva sullrsquoagente eziologicoegrave decisiva ai fini prognostici ed egrave associata ad una

concreta riduzione della mortalitagrave ldquo

(Camporese A IJLaM 20084 Suppl 45-49)

Far primahelliphelliphellip

Raggiungere lrsquoobiettivo in tempi rapidi mantenendo

lrsquoalta qualitagrave dei risultati

bull Tempo identificazione

bull Tempo prove di sensibilitagrave

bull Terapia empirica

bull Insorgenza resistenze

bull gt mortalitagrave

bull gt costi

Diagnosis

Obtain appropriate cultures before starting antibiotics provided

this does not significantly delay antimicrobial administration

bullObtain two or more BCs

bullOne or more BCs should be percutaneous

bullOne BC from each vascular access device in place gt 48 hrs

bullCulture other sites as clinically indicated

Perform imaging studies promply in order to confirm and sample

any source of infection if safe to do so

DIAGNOSI DI LABORATORIO

Emocoltura

Coltura sito drsquoinfezione

Diagnosi molecolare

Biomarkers (IL-6 PCR PCT LPS)

EMOCOLTURA

isolamento colturale

del microrganismo dal sangue

Il laboratorio nella diagnosi delle sepsi

FASE PRE-ANALITICA

INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO

Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da

14

Emocoltura fase pre-analitica

Emocoltura pre-analitica

Personale che effettua il prelievo

Sede del prelievo

Sterilizzazione della cute

Momento del prelievo

Numero dei prelievi

Volume del sangue

Mezzo di coltura

EMOCOLTURA

Ottimizzazione della procedura

Emocoltura team per il prelievo

Riduzione della contaminazione da 48 a 1 (Weinbaum J Clin Microbiol 2001)

da 42 a 22 (Shifman Arch Pathol Lab Med 1996)

Affidare il prelievo a personale competente ed informato

Lavare le mani prima e dopo il prelievo

Indossare guanti nei passaggi di raccolta e trasporto

Ricerca del sito di prelievo mediante palpazione

Disinfezione della cute

bull sgrassare con Alcool 70 (o Clorexidina)

bull disinfettare con Iodoforo (Iodiopovidone)

bull applicare con movimento circolare verso

lrsquoesterno lazione disinfettante egrave tempo-dipendente

Quando la cute egrave asciutta egrave pronta per il prelievo

Mai pungere prima di 1-3 minuti

Emocoltura il prelievo

Antiseptic skin preparation

Emocoltura sede del prelievo

Effettuare il prelievo da vena periferica

Tempo del prelievo

Prima di iniziare la terapia antibiotica

Prima della sommistrazione dellrsquoantibiotico

Nellrsquoarco di 5-10rsquo (eccezione infezioni endovascolari quali

endocardite o sepsi CVC correlate)

As a practical matter blood cultures should be obtained simultaneously (or over a short timeframe) Drawing blood at intervals is only indicated when it is necessary to document continuous bacteremia in patients with suspected infective endocarditis or other endovascular (eg catheter-related) infections

CLSI publication M47-AmdashPrinciples and Procedures for Blood Cultures

Tempi di incubazione

emocolture

I microorganismi ldquofastidious ldquo richiedono tempi piugrave lunghi di coltura almeno

2 - 3 settimane di incubazione

Washington JA Mayo Clin Proc 1982

Alcuni microorganismi possono generare segnali molto deboli o anche nessun segnale

di crescita

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

SOSPETTO CLINICO

Esami microscopici e subcoltura cieca delle emocolture negative

Aumento dei tempi di incubazione delle emocolture negative

Prelevare 2 - 3 set (anaerobi + aerobi) per aumentare la possibilitagrave di isolare il

microrganismo in causa

differenzia la vera batteriemia dalle

contaminazioni

At least 15 of positive BC are due to

contaminants the number can be as high as

40

819 of CoNS and 493 of viridans

streptococci were contaminants

Wenstein MP Clin Infect Dis 1997

Numero di emocolture

163 malati (non endocarditi) 20 mL per set (Cockerill FR 2004)

blood cultures

n 1 2 3

diagnostic () 63 80 96

Optimal volume of blood for culture

ldquoThe volume of blood is the single most

important factor for successful recovery of

microorganisms from the blood stream of patientsrdquo

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

What is the optimal volume

of blood for culture

Blood from patients with IE contains 1

to 10 bacteria per mL

There is approximately linear

relationship between the yield of

bacteria from blood and the volume of

blood

ldquoThe volume of blood sample drawn

should be 40-60 mlrdquo

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

23

24

The microbiological diagnosis

TAT

Emocoltura analitica

BACTEC 9240

Strumento modulare

Incubatore Agitatore Lettore

I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer

Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo

I flaconi sono inseriti nello strumento

BACTEC 9240

FASE PRE-ANALITICA

INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO

Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da

Emocoltura positiva

Interpretazione del risultato

RUOLO PATOGENO

DEL MICRORGANISMO

ISOLATO

IDENTIFICAZIONE

DEI MICROORGANISMI

CONTAMINANTI

29

Batteriemia significativa

Improbabile Incerta Probabile

Corynebacterium spp

Non-anthracis Bacillus spp

Propionibacterium acnes

Stafilococchi Coagulasi Negativi

S aureus

S pneumoniae

Enterobacteriaceae

P aeruginosa

C albicans

probabilitagrave post-test n positivi n colture

confrontare antibiogrammi confrontare genotipi

probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente

protesi evidenza clinica

Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7

Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo

Catetere venoso centrale

I CATETERI

sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono

monitoraggio di parametri vitali

somministrazione di nutrienti e di farmaci

Siti di inserzione

e tipologie doppio triplo lume

tunnellizzati e non impregnati e non

con diversi gauge

Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata

biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche

morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole

inserzione transcutanea

CRBSI

Catheter Related Blood Stream Infection

Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere

Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione

Mermel LA Clin Infect Dis 2001

Sepsi CVC-correlata

- definizione -

Infezioni nei portatori di CVC

Emocoltura quantitativa

da catetere centrale da vena periferica

bull Prelievo contemporaneo

bull Volume uguale

bull Incubazione contemporanea

DTP gt120 minuti

Sepsi CVC correlata

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Sistema

totalmente

impiantabile

Condizioni

generali

scadute

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

NO

NO

SI

SI

Emocoltura

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Emocoltura

Germi resistenti

Miceti

Germi sensibili

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Non

efficace

Trombolisi

Efficace

NO SI

Risposta alla terapia

Negativa Positiva

Permanenza

del catetere

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE

REPARTI chirurgie

neurochirurgia nefrologia+centro trapianti

pediatria rianimazione neonatologia

medicine

geriatria

Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259

Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012

2

48 43

2 5

bb+

bb-

cocchi+

anaerobi

lieviti

Molecular diagnosis

LightCycler SeptiFast Test

bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici

bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo

45

Bacterial Lysis amp

DNA Extraction

Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) bull Staphylococcus aureus

bull CoNS

bull Streptococcus pneumoniae

bull Streptococcus spp

bull Enterococcus faecium

bull Enterococcus faecalis

Fungi bull Candida (albicans

tropicalis

parapsilosis)

bull Candida (krusei glabrata)

bull Aspergillus (fumigatus)

PCR Analysis

MRSA (mecA)

VRE (van A B)

Sample Preparation

Sample whole blood

Septifast Analytical Concept

TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA

Rilevabili mediante PCR

Rilevabili mediante coltura

DNA batterico libero

Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati

Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

Far primahelliphelliphellip

Raggiungere lrsquoobiettivo in tempi rapidi mantenendo

lrsquoalta qualitagrave dei risultati

bull Tempo identificazione

bull Tempo prove di sensibilitagrave

bull Terapia empirica

bull Insorgenza resistenze

bull gt mortalitagrave

bull gt costi

Diagnosis

Obtain appropriate cultures before starting antibiotics provided

this does not significantly delay antimicrobial administration

bullObtain two or more BCs

bullOne or more BCs should be percutaneous

bullOne BC from each vascular access device in place gt 48 hrs

bullCulture other sites as clinically indicated

Perform imaging studies promply in order to confirm and sample

any source of infection if safe to do so

DIAGNOSI DI LABORATORIO

Emocoltura

Coltura sito drsquoinfezione

Diagnosi molecolare

Biomarkers (IL-6 PCR PCT LPS)

EMOCOLTURA

isolamento colturale

del microrganismo dal sangue

Il laboratorio nella diagnosi delle sepsi

FASE PRE-ANALITICA

INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO

Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da

14

Emocoltura fase pre-analitica

Emocoltura pre-analitica

Personale che effettua il prelievo

Sede del prelievo

Sterilizzazione della cute

Momento del prelievo

Numero dei prelievi

Volume del sangue

Mezzo di coltura

EMOCOLTURA

Ottimizzazione della procedura

Emocoltura team per il prelievo

Riduzione della contaminazione da 48 a 1 (Weinbaum J Clin Microbiol 2001)

da 42 a 22 (Shifman Arch Pathol Lab Med 1996)

Affidare il prelievo a personale competente ed informato

Lavare le mani prima e dopo il prelievo

Indossare guanti nei passaggi di raccolta e trasporto

Ricerca del sito di prelievo mediante palpazione

Disinfezione della cute

bull sgrassare con Alcool 70 (o Clorexidina)

bull disinfettare con Iodoforo (Iodiopovidone)

bull applicare con movimento circolare verso

lrsquoesterno lazione disinfettante egrave tempo-dipendente

Quando la cute egrave asciutta egrave pronta per il prelievo

Mai pungere prima di 1-3 minuti

Emocoltura il prelievo

Antiseptic skin preparation

Emocoltura sede del prelievo

Effettuare il prelievo da vena periferica

Tempo del prelievo

Prima di iniziare la terapia antibiotica

Prima della sommistrazione dellrsquoantibiotico

Nellrsquoarco di 5-10rsquo (eccezione infezioni endovascolari quali

endocardite o sepsi CVC correlate)

As a practical matter blood cultures should be obtained simultaneously (or over a short timeframe) Drawing blood at intervals is only indicated when it is necessary to document continuous bacteremia in patients with suspected infective endocarditis or other endovascular (eg catheter-related) infections

CLSI publication M47-AmdashPrinciples and Procedures for Blood Cultures

Tempi di incubazione

emocolture

I microorganismi ldquofastidious ldquo richiedono tempi piugrave lunghi di coltura almeno

2 - 3 settimane di incubazione

Washington JA Mayo Clin Proc 1982

Alcuni microorganismi possono generare segnali molto deboli o anche nessun segnale

di crescita

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

SOSPETTO CLINICO

Esami microscopici e subcoltura cieca delle emocolture negative

Aumento dei tempi di incubazione delle emocolture negative

Prelevare 2 - 3 set (anaerobi + aerobi) per aumentare la possibilitagrave di isolare il

microrganismo in causa

differenzia la vera batteriemia dalle

contaminazioni

At least 15 of positive BC are due to

contaminants the number can be as high as

40

819 of CoNS and 493 of viridans

streptococci were contaminants

Wenstein MP Clin Infect Dis 1997

Numero di emocolture

163 malati (non endocarditi) 20 mL per set (Cockerill FR 2004)

blood cultures

n 1 2 3

diagnostic () 63 80 96

Optimal volume of blood for culture

ldquoThe volume of blood is the single most

important factor for successful recovery of

microorganisms from the blood stream of patientsrdquo

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

What is the optimal volume

of blood for culture

Blood from patients with IE contains 1

to 10 bacteria per mL

There is approximately linear

relationship between the yield of

bacteria from blood and the volume of

blood

ldquoThe volume of blood sample drawn

should be 40-60 mlrdquo

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

23

24

The microbiological diagnosis

TAT

Emocoltura analitica

BACTEC 9240

Strumento modulare

Incubatore Agitatore Lettore

I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer

Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo

I flaconi sono inseriti nello strumento

BACTEC 9240

FASE PRE-ANALITICA

INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO

Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da

Emocoltura positiva

Interpretazione del risultato

RUOLO PATOGENO

DEL MICRORGANISMO

ISOLATO

IDENTIFICAZIONE

DEI MICROORGANISMI

CONTAMINANTI

29

Batteriemia significativa

Improbabile Incerta Probabile

Corynebacterium spp

Non-anthracis Bacillus spp

Propionibacterium acnes

Stafilococchi Coagulasi Negativi

S aureus

S pneumoniae

Enterobacteriaceae

P aeruginosa

C albicans

probabilitagrave post-test n positivi n colture

confrontare antibiogrammi confrontare genotipi

probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente

protesi evidenza clinica

Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7

Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo

Catetere venoso centrale

I CATETERI

sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono

monitoraggio di parametri vitali

somministrazione di nutrienti e di farmaci

Siti di inserzione

e tipologie doppio triplo lume

tunnellizzati e non impregnati e non

con diversi gauge

Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata

biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche

morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole

inserzione transcutanea

CRBSI

Catheter Related Blood Stream Infection

Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere

Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione

Mermel LA Clin Infect Dis 2001

Sepsi CVC-correlata

- definizione -

Infezioni nei portatori di CVC

Emocoltura quantitativa

da catetere centrale da vena periferica

bull Prelievo contemporaneo

bull Volume uguale

bull Incubazione contemporanea

DTP gt120 minuti

Sepsi CVC correlata

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Sistema

totalmente

impiantabile

Condizioni

generali

scadute

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

NO

NO

SI

SI

Emocoltura

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Emocoltura

Germi resistenti

Miceti

Germi sensibili

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Non

efficace

Trombolisi

Efficace

NO SI

Risposta alla terapia

Negativa Positiva

Permanenza

del catetere

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE

REPARTI chirurgie

neurochirurgia nefrologia+centro trapianti

pediatria rianimazione neonatologia

medicine

geriatria

Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259

Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012

2

48 43

2 5

bb+

bb-

cocchi+

anaerobi

lieviti

Molecular diagnosis

LightCycler SeptiFast Test

bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici

bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo

45

Bacterial Lysis amp

DNA Extraction

Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) bull Staphylococcus aureus

bull CoNS

bull Streptococcus pneumoniae

bull Streptococcus spp

bull Enterococcus faecium

bull Enterococcus faecalis

Fungi bull Candida (albicans

tropicalis

parapsilosis)

bull Candida (krusei glabrata)

bull Aspergillus (fumigatus)

PCR Analysis

MRSA (mecA)

VRE (van A B)

Sample Preparation

Sample whole blood

Septifast Analytical Concept

TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA

Rilevabili mediante PCR

Rilevabili mediante coltura

DNA batterico libero

Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati

Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

bull Tempo identificazione

bull Tempo prove di sensibilitagrave

bull Terapia empirica

bull Insorgenza resistenze

bull gt mortalitagrave

bull gt costi

Diagnosis

Obtain appropriate cultures before starting antibiotics provided

this does not significantly delay antimicrobial administration

bullObtain two or more BCs

bullOne or more BCs should be percutaneous

bullOne BC from each vascular access device in place gt 48 hrs

bullCulture other sites as clinically indicated

Perform imaging studies promply in order to confirm and sample

any source of infection if safe to do so

DIAGNOSI DI LABORATORIO

Emocoltura

Coltura sito drsquoinfezione

Diagnosi molecolare

Biomarkers (IL-6 PCR PCT LPS)

EMOCOLTURA

isolamento colturale

del microrganismo dal sangue

Il laboratorio nella diagnosi delle sepsi

FASE PRE-ANALITICA

INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO

Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da

14

Emocoltura fase pre-analitica

Emocoltura pre-analitica

Personale che effettua il prelievo

Sede del prelievo

Sterilizzazione della cute

Momento del prelievo

Numero dei prelievi

Volume del sangue

Mezzo di coltura

EMOCOLTURA

Ottimizzazione della procedura

Emocoltura team per il prelievo

Riduzione della contaminazione da 48 a 1 (Weinbaum J Clin Microbiol 2001)

da 42 a 22 (Shifman Arch Pathol Lab Med 1996)

Affidare il prelievo a personale competente ed informato

Lavare le mani prima e dopo il prelievo

Indossare guanti nei passaggi di raccolta e trasporto

Ricerca del sito di prelievo mediante palpazione

Disinfezione della cute

bull sgrassare con Alcool 70 (o Clorexidina)

bull disinfettare con Iodoforo (Iodiopovidone)

bull applicare con movimento circolare verso

lrsquoesterno lazione disinfettante egrave tempo-dipendente

Quando la cute egrave asciutta egrave pronta per il prelievo

Mai pungere prima di 1-3 minuti

Emocoltura il prelievo

Antiseptic skin preparation

Emocoltura sede del prelievo

Effettuare il prelievo da vena periferica

Tempo del prelievo

Prima di iniziare la terapia antibiotica

Prima della sommistrazione dellrsquoantibiotico

Nellrsquoarco di 5-10rsquo (eccezione infezioni endovascolari quali

endocardite o sepsi CVC correlate)

As a practical matter blood cultures should be obtained simultaneously (or over a short timeframe) Drawing blood at intervals is only indicated when it is necessary to document continuous bacteremia in patients with suspected infective endocarditis or other endovascular (eg catheter-related) infections

CLSI publication M47-AmdashPrinciples and Procedures for Blood Cultures

Tempi di incubazione

emocolture

I microorganismi ldquofastidious ldquo richiedono tempi piugrave lunghi di coltura almeno

2 - 3 settimane di incubazione

Washington JA Mayo Clin Proc 1982

Alcuni microorganismi possono generare segnali molto deboli o anche nessun segnale

di crescita

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

SOSPETTO CLINICO

Esami microscopici e subcoltura cieca delle emocolture negative

Aumento dei tempi di incubazione delle emocolture negative

Prelevare 2 - 3 set (anaerobi + aerobi) per aumentare la possibilitagrave di isolare il

microrganismo in causa

differenzia la vera batteriemia dalle

contaminazioni

At least 15 of positive BC are due to

contaminants the number can be as high as

40

819 of CoNS and 493 of viridans

streptococci were contaminants

Wenstein MP Clin Infect Dis 1997

Numero di emocolture

163 malati (non endocarditi) 20 mL per set (Cockerill FR 2004)

blood cultures

n 1 2 3

diagnostic () 63 80 96

Optimal volume of blood for culture

ldquoThe volume of blood is the single most

important factor for successful recovery of

microorganisms from the blood stream of patientsrdquo

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

What is the optimal volume

of blood for culture

Blood from patients with IE contains 1

to 10 bacteria per mL

There is approximately linear

relationship between the yield of

bacteria from blood and the volume of

blood

ldquoThe volume of blood sample drawn

should be 40-60 mlrdquo

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

23

24

The microbiological diagnosis

TAT

Emocoltura analitica

BACTEC 9240

Strumento modulare

Incubatore Agitatore Lettore

I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer

Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo

I flaconi sono inseriti nello strumento

BACTEC 9240

FASE PRE-ANALITICA

INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO

Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da

Emocoltura positiva

Interpretazione del risultato

RUOLO PATOGENO

DEL MICRORGANISMO

ISOLATO

IDENTIFICAZIONE

DEI MICROORGANISMI

CONTAMINANTI

29

Batteriemia significativa

Improbabile Incerta Probabile

Corynebacterium spp

Non-anthracis Bacillus spp

Propionibacterium acnes

Stafilococchi Coagulasi Negativi

S aureus

S pneumoniae

Enterobacteriaceae

P aeruginosa

C albicans

probabilitagrave post-test n positivi n colture

confrontare antibiogrammi confrontare genotipi

probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente

protesi evidenza clinica

Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7

Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo

Catetere venoso centrale

I CATETERI

sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono

monitoraggio di parametri vitali

somministrazione di nutrienti e di farmaci

Siti di inserzione

e tipologie doppio triplo lume

tunnellizzati e non impregnati e non

con diversi gauge

Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata

biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche

morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole

inserzione transcutanea

CRBSI

Catheter Related Blood Stream Infection

Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere

Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione

Mermel LA Clin Infect Dis 2001

Sepsi CVC-correlata

- definizione -

Infezioni nei portatori di CVC

Emocoltura quantitativa

da catetere centrale da vena periferica

bull Prelievo contemporaneo

bull Volume uguale

bull Incubazione contemporanea

DTP gt120 minuti

Sepsi CVC correlata

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Sistema

totalmente

impiantabile

Condizioni

generali

scadute

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

NO

NO

SI

SI

Emocoltura

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Emocoltura

Germi resistenti

Miceti

Germi sensibili

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Non

efficace

Trombolisi

Efficace

NO SI

Risposta alla terapia

Negativa Positiva

Permanenza

del catetere

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE

REPARTI chirurgie

neurochirurgia nefrologia+centro trapianti

pediatria rianimazione neonatologia

medicine

geriatria

Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259

Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012

2

48 43

2 5

bb+

bb-

cocchi+

anaerobi

lieviti

Molecular diagnosis

LightCycler SeptiFast Test

bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici

bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo

45

Bacterial Lysis amp

DNA Extraction

Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) bull Staphylococcus aureus

bull CoNS

bull Streptococcus pneumoniae

bull Streptococcus spp

bull Enterococcus faecium

bull Enterococcus faecalis

Fungi bull Candida (albicans

tropicalis

parapsilosis)

bull Candida (krusei glabrata)

bull Aspergillus (fumigatus)

PCR Analysis

MRSA (mecA)

VRE (van A B)

Sample Preparation

Sample whole blood

Septifast Analytical Concept

TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA

Rilevabili mediante PCR

Rilevabili mediante coltura

DNA batterico libero

Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati

Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

Diagnosis

Obtain appropriate cultures before starting antibiotics provided

this does not significantly delay antimicrobial administration

bullObtain two or more BCs

bullOne or more BCs should be percutaneous

bullOne BC from each vascular access device in place gt 48 hrs

bullCulture other sites as clinically indicated

Perform imaging studies promply in order to confirm and sample

any source of infection if safe to do so

DIAGNOSI DI LABORATORIO

Emocoltura

Coltura sito drsquoinfezione

Diagnosi molecolare

Biomarkers (IL-6 PCR PCT LPS)

EMOCOLTURA

isolamento colturale

del microrganismo dal sangue

Il laboratorio nella diagnosi delle sepsi

FASE PRE-ANALITICA

INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO

Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da

14

Emocoltura fase pre-analitica

Emocoltura pre-analitica

Personale che effettua il prelievo

Sede del prelievo

Sterilizzazione della cute

Momento del prelievo

Numero dei prelievi

Volume del sangue

Mezzo di coltura

EMOCOLTURA

Ottimizzazione della procedura

Emocoltura team per il prelievo

Riduzione della contaminazione da 48 a 1 (Weinbaum J Clin Microbiol 2001)

da 42 a 22 (Shifman Arch Pathol Lab Med 1996)

Affidare il prelievo a personale competente ed informato

Lavare le mani prima e dopo il prelievo

Indossare guanti nei passaggi di raccolta e trasporto

Ricerca del sito di prelievo mediante palpazione

Disinfezione della cute

bull sgrassare con Alcool 70 (o Clorexidina)

bull disinfettare con Iodoforo (Iodiopovidone)

bull applicare con movimento circolare verso

lrsquoesterno lazione disinfettante egrave tempo-dipendente

Quando la cute egrave asciutta egrave pronta per il prelievo

Mai pungere prima di 1-3 minuti

Emocoltura il prelievo

Antiseptic skin preparation

Emocoltura sede del prelievo

Effettuare il prelievo da vena periferica

Tempo del prelievo

Prima di iniziare la terapia antibiotica

Prima della sommistrazione dellrsquoantibiotico

Nellrsquoarco di 5-10rsquo (eccezione infezioni endovascolari quali

endocardite o sepsi CVC correlate)

As a practical matter blood cultures should be obtained simultaneously (or over a short timeframe) Drawing blood at intervals is only indicated when it is necessary to document continuous bacteremia in patients with suspected infective endocarditis or other endovascular (eg catheter-related) infections

CLSI publication M47-AmdashPrinciples and Procedures for Blood Cultures

Tempi di incubazione

emocolture

I microorganismi ldquofastidious ldquo richiedono tempi piugrave lunghi di coltura almeno

2 - 3 settimane di incubazione

Washington JA Mayo Clin Proc 1982

Alcuni microorganismi possono generare segnali molto deboli o anche nessun segnale

di crescita

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

SOSPETTO CLINICO

Esami microscopici e subcoltura cieca delle emocolture negative

Aumento dei tempi di incubazione delle emocolture negative

Prelevare 2 - 3 set (anaerobi + aerobi) per aumentare la possibilitagrave di isolare il

microrganismo in causa

differenzia la vera batteriemia dalle

contaminazioni

At least 15 of positive BC are due to

contaminants the number can be as high as

40

819 of CoNS and 493 of viridans

streptococci were contaminants

Wenstein MP Clin Infect Dis 1997

Numero di emocolture

163 malati (non endocarditi) 20 mL per set (Cockerill FR 2004)

blood cultures

n 1 2 3

diagnostic () 63 80 96

Optimal volume of blood for culture

ldquoThe volume of blood is the single most

important factor for successful recovery of

microorganisms from the blood stream of patientsrdquo

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

What is the optimal volume

of blood for culture

Blood from patients with IE contains 1

to 10 bacteria per mL

There is approximately linear

relationship between the yield of

bacteria from blood and the volume of

blood

ldquoThe volume of blood sample drawn

should be 40-60 mlrdquo

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

23

24

The microbiological diagnosis

TAT

Emocoltura analitica

BACTEC 9240

Strumento modulare

Incubatore Agitatore Lettore

I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer

Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo

I flaconi sono inseriti nello strumento

BACTEC 9240

FASE PRE-ANALITICA

INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO

Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da

Emocoltura positiva

Interpretazione del risultato

RUOLO PATOGENO

DEL MICRORGANISMO

ISOLATO

IDENTIFICAZIONE

DEI MICROORGANISMI

CONTAMINANTI

29

Batteriemia significativa

Improbabile Incerta Probabile

Corynebacterium spp

Non-anthracis Bacillus spp

Propionibacterium acnes

Stafilococchi Coagulasi Negativi

S aureus

S pneumoniae

Enterobacteriaceae

P aeruginosa

C albicans

probabilitagrave post-test n positivi n colture

confrontare antibiogrammi confrontare genotipi

probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente

protesi evidenza clinica

Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7

Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo

Catetere venoso centrale

I CATETERI

sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono

monitoraggio di parametri vitali

somministrazione di nutrienti e di farmaci

Siti di inserzione

e tipologie doppio triplo lume

tunnellizzati e non impregnati e non

con diversi gauge

Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata

biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche

morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole

inserzione transcutanea

CRBSI

Catheter Related Blood Stream Infection

Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere

Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione

Mermel LA Clin Infect Dis 2001

Sepsi CVC-correlata

- definizione -

Infezioni nei portatori di CVC

Emocoltura quantitativa

da catetere centrale da vena periferica

bull Prelievo contemporaneo

bull Volume uguale

bull Incubazione contemporanea

DTP gt120 minuti

Sepsi CVC correlata

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Sistema

totalmente

impiantabile

Condizioni

generali

scadute

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

NO

NO

SI

SI

Emocoltura

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Emocoltura

Germi resistenti

Miceti

Germi sensibili

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Non

efficace

Trombolisi

Efficace

NO SI

Risposta alla terapia

Negativa Positiva

Permanenza

del catetere

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE

REPARTI chirurgie

neurochirurgia nefrologia+centro trapianti

pediatria rianimazione neonatologia

medicine

geriatria

Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259

Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012

2

48 43

2 5

bb+

bb-

cocchi+

anaerobi

lieviti

Molecular diagnosis

LightCycler SeptiFast Test

bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici

bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo

45

Bacterial Lysis amp

DNA Extraction

Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) bull Staphylococcus aureus

bull CoNS

bull Streptococcus pneumoniae

bull Streptococcus spp

bull Enterococcus faecium

bull Enterococcus faecalis

Fungi bull Candida (albicans

tropicalis

parapsilosis)

bull Candida (krusei glabrata)

bull Aspergillus (fumigatus)

PCR Analysis

MRSA (mecA)

VRE (van A B)

Sample Preparation

Sample whole blood

Septifast Analytical Concept

TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA

Rilevabili mediante PCR

Rilevabili mediante coltura

DNA batterico libero

Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati

Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

DIAGNOSI DI LABORATORIO

Emocoltura

Coltura sito drsquoinfezione

Diagnosi molecolare

Biomarkers (IL-6 PCR PCT LPS)

EMOCOLTURA

isolamento colturale

del microrganismo dal sangue

Il laboratorio nella diagnosi delle sepsi

FASE PRE-ANALITICA

INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO

Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da

14

Emocoltura fase pre-analitica

Emocoltura pre-analitica

Personale che effettua il prelievo

Sede del prelievo

Sterilizzazione della cute

Momento del prelievo

Numero dei prelievi

Volume del sangue

Mezzo di coltura

EMOCOLTURA

Ottimizzazione della procedura

Emocoltura team per il prelievo

Riduzione della contaminazione da 48 a 1 (Weinbaum J Clin Microbiol 2001)

da 42 a 22 (Shifman Arch Pathol Lab Med 1996)

Affidare il prelievo a personale competente ed informato

Lavare le mani prima e dopo il prelievo

Indossare guanti nei passaggi di raccolta e trasporto

Ricerca del sito di prelievo mediante palpazione

Disinfezione della cute

bull sgrassare con Alcool 70 (o Clorexidina)

bull disinfettare con Iodoforo (Iodiopovidone)

bull applicare con movimento circolare verso

lrsquoesterno lazione disinfettante egrave tempo-dipendente

Quando la cute egrave asciutta egrave pronta per il prelievo

Mai pungere prima di 1-3 minuti

Emocoltura il prelievo

Antiseptic skin preparation

Emocoltura sede del prelievo

Effettuare il prelievo da vena periferica

Tempo del prelievo

Prima di iniziare la terapia antibiotica

Prima della sommistrazione dellrsquoantibiotico

Nellrsquoarco di 5-10rsquo (eccezione infezioni endovascolari quali

endocardite o sepsi CVC correlate)

As a practical matter blood cultures should be obtained simultaneously (or over a short timeframe) Drawing blood at intervals is only indicated when it is necessary to document continuous bacteremia in patients with suspected infective endocarditis or other endovascular (eg catheter-related) infections

CLSI publication M47-AmdashPrinciples and Procedures for Blood Cultures

Tempi di incubazione

emocolture

I microorganismi ldquofastidious ldquo richiedono tempi piugrave lunghi di coltura almeno

2 - 3 settimane di incubazione

Washington JA Mayo Clin Proc 1982

Alcuni microorganismi possono generare segnali molto deboli o anche nessun segnale

di crescita

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

SOSPETTO CLINICO

Esami microscopici e subcoltura cieca delle emocolture negative

Aumento dei tempi di incubazione delle emocolture negative

Prelevare 2 - 3 set (anaerobi + aerobi) per aumentare la possibilitagrave di isolare il

microrganismo in causa

differenzia la vera batteriemia dalle

contaminazioni

At least 15 of positive BC are due to

contaminants the number can be as high as

40

819 of CoNS and 493 of viridans

streptococci were contaminants

Wenstein MP Clin Infect Dis 1997

Numero di emocolture

163 malati (non endocarditi) 20 mL per set (Cockerill FR 2004)

blood cultures

n 1 2 3

diagnostic () 63 80 96

Optimal volume of blood for culture

ldquoThe volume of blood is the single most

important factor for successful recovery of

microorganisms from the blood stream of patientsrdquo

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

What is the optimal volume

of blood for culture

Blood from patients with IE contains 1

to 10 bacteria per mL

There is approximately linear

relationship between the yield of

bacteria from blood and the volume of

blood

ldquoThe volume of blood sample drawn

should be 40-60 mlrdquo

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

23

24

The microbiological diagnosis

TAT

Emocoltura analitica

BACTEC 9240

Strumento modulare

Incubatore Agitatore Lettore

I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer

Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo

I flaconi sono inseriti nello strumento

BACTEC 9240

FASE PRE-ANALITICA

INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO

Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da

Emocoltura positiva

Interpretazione del risultato

RUOLO PATOGENO

DEL MICRORGANISMO

ISOLATO

IDENTIFICAZIONE

DEI MICROORGANISMI

CONTAMINANTI

29

Batteriemia significativa

Improbabile Incerta Probabile

Corynebacterium spp

Non-anthracis Bacillus spp

Propionibacterium acnes

Stafilococchi Coagulasi Negativi

S aureus

S pneumoniae

Enterobacteriaceae

P aeruginosa

C albicans

probabilitagrave post-test n positivi n colture

confrontare antibiogrammi confrontare genotipi

probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente

protesi evidenza clinica

Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7

Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo

Catetere venoso centrale

I CATETERI

sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono

monitoraggio di parametri vitali

somministrazione di nutrienti e di farmaci

Siti di inserzione

e tipologie doppio triplo lume

tunnellizzati e non impregnati e non

con diversi gauge

Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata

biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche

morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole

inserzione transcutanea

CRBSI

Catheter Related Blood Stream Infection

Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere

Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione

Mermel LA Clin Infect Dis 2001

Sepsi CVC-correlata

- definizione -

Infezioni nei portatori di CVC

Emocoltura quantitativa

da catetere centrale da vena periferica

bull Prelievo contemporaneo

bull Volume uguale

bull Incubazione contemporanea

DTP gt120 minuti

Sepsi CVC correlata

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Sistema

totalmente

impiantabile

Condizioni

generali

scadute

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

NO

NO

SI

SI

Emocoltura

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Emocoltura

Germi resistenti

Miceti

Germi sensibili

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Non

efficace

Trombolisi

Efficace

NO SI

Risposta alla terapia

Negativa Positiva

Permanenza

del catetere

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE

REPARTI chirurgie

neurochirurgia nefrologia+centro trapianti

pediatria rianimazione neonatologia

medicine

geriatria

Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259

Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012

2

48 43

2 5

bb+

bb-

cocchi+

anaerobi

lieviti

Molecular diagnosis

LightCycler SeptiFast Test

bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici

bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo

45

Bacterial Lysis amp

DNA Extraction

Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) bull Staphylococcus aureus

bull CoNS

bull Streptococcus pneumoniae

bull Streptococcus spp

bull Enterococcus faecium

bull Enterococcus faecalis

Fungi bull Candida (albicans

tropicalis

parapsilosis)

bull Candida (krusei glabrata)

bull Aspergillus (fumigatus)

PCR Analysis

MRSA (mecA)

VRE (van A B)

Sample Preparation

Sample whole blood

Septifast Analytical Concept

TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA

Rilevabili mediante PCR

Rilevabili mediante coltura

DNA batterico libero

Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati

Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

EMOCOLTURA

isolamento colturale

del microrganismo dal sangue

Il laboratorio nella diagnosi delle sepsi

FASE PRE-ANALITICA

INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO

Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da

14

Emocoltura fase pre-analitica

Emocoltura pre-analitica

Personale che effettua il prelievo

Sede del prelievo

Sterilizzazione della cute

Momento del prelievo

Numero dei prelievi

Volume del sangue

Mezzo di coltura

EMOCOLTURA

Ottimizzazione della procedura

Emocoltura team per il prelievo

Riduzione della contaminazione da 48 a 1 (Weinbaum J Clin Microbiol 2001)

da 42 a 22 (Shifman Arch Pathol Lab Med 1996)

Affidare il prelievo a personale competente ed informato

Lavare le mani prima e dopo il prelievo

Indossare guanti nei passaggi di raccolta e trasporto

Ricerca del sito di prelievo mediante palpazione

Disinfezione della cute

bull sgrassare con Alcool 70 (o Clorexidina)

bull disinfettare con Iodoforo (Iodiopovidone)

bull applicare con movimento circolare verso

lrsquoesterno lazione disinfettante egrave tempo-dipendente

Quando la cute egrave asciutta egrave pronta per il prelievo

Mai pungere prima di 1-3 minuti

Emocoltura il prelievo

Antiseptic skin preparation

Emocoltura sede del prelievo

Effettuare il prelievo da vena periferica

Tempo del prelievo

Prima di iniziare la terapia antibiotica

Prima della sommistrazione dellrsquoantibiotico

Nellrsquoarco di 5-10rsquo (eccezione infezioni endovascolari quali

endocardite o sepsi CVC correlate)

As a practical matter blood cultures should be obtained simultaneously (or over a short timeframe) Drawing blood at intervals is only indicated when it is necessary to document continuous bacteremia in patients with suspected infective endocarditis or other endovascular (eg catheter-related) infections

CLSI publication M47-AmdashPrinciples and Procedures for Blood Cultures

Tempi di incubazione

emocolture

I microorganismi ldquofastidious ldquo richiedono tempi piugrave lunghi di coltura almeno

2 - 3 settimane di incubazione

Washington JA Mayo Clin Proc 1982

Alcuni microorganismi possono generare segnali molto deboli o anche nessun segnale

di crescita

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

SOSPETTO CLINICO

Esami microscopici e subcoltura cieca delle emocolture negative

Aumento dei tempi di incubazione delle emocolture negative

Prelevare 2 - 3 set (anaerobi + aerobi) per aumentare la possibilitagrave di isolare il

microrganismo in causa

differenzia la vera batteriemia dalle

contaminazioni

At least 15 of positive BC are due to

contaminants the number can be as high as

40

819 of CoNS and 493 of viridans

streptococci were contaminants

Wenstein MP Clin Infect Dis 1997

Numero di emocolture

163 malati (non endocarditi) 20 mL per set (Cockerill FR 2004)

blood cultures

n 1 2 3

diagnostic () 63 80 96

Optimal volume of blood for culture

ldquoThe volume of blood is the single most

important factor for successful recovery of

microorganisms from the blood stream of patientsrdquo

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

What is the optimal volume

of blood for culture

Blood from patients with IE contains 1

to 10 bacteria per mL

There is approximately linear

relationship between the yield of

bacteria from blood and the volume of

blood

ldquoThe volume of blood sample drawn

should be 40-60 mlrdquo

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

23

24

The microbiological diagnosis

TAT

Emocoltura analitica

BACTEC 9240

Strumento modulare

Incubatore Agitatore Lettore

I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer

Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo

I flaconi sono inseriti nello strumento

BACTEC 9240

FASE PRE-ANALITICA

INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO

Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da

Emocoltura positiva

Interpretazione del risultato

RUOLO PATOGENO

DEL MICRORGANISMO

ISOLATO

IDENTIFICAZIONE

DEI MICROORGANISMI

CONTAMINANTI

29

Batteriemia significativa

Improbabile Incerta Probabile

Corynebacterium spp

Non-anthracis Bacillus spp

Propionibacterium acnes

Stafilococchi Coagulasi Negativi

S aureus

S pneumoniae

Enterobacteriaceae

P aeruginosa

C albicans

probabilitagrave post-test n positivi n colture

confrontare antibiogrammi confrontare genotipi

probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente

protesi evidenza clinica

Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7

Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo

Catetere venoso centrale

I CATETERI

sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono

monitoraggio di parametri vitali

somministrazione di nutrienti e di farmaci

Siti di inserzione

e tipologie doppio triplo lume

tunnellizzati e non impregnati e non

con diversi gauge

Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata

biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche

morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole

inserzione transcutanea

CRBSI

Catheter Related Blood Stream Infection

Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere

Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione

Mermel LA Clin Infect Dis 2001

Sepsi CVC-correlata

- definizione -

Infezioni nei portatori di CVC

Emocoltura quantitativa

da catetere centrale da vena periferica

bull Prelievo contemporaneo

bull Volume uguale

bull Incubazione contemporanea

DTP gt120 minuti

Sepsi CVC correlata

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Sistema

totalmente

impiantabile

Condizioni

generali

scadute

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

NO

NO

SI

SI

Emocoltura

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Emocoltura

Germi resistenti

Miceti

Germi sensibili

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Non

efficace

Trombolisi

Efficace

NO SI

Risposta alla terapia

Negativa Positiva

Permanenza

del catetere

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE

REPARTI chirurgie

neurochirurgia nefrologia+centro trapianti

pediatria rianimazione neonatologia

medicine

geriatria

Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259

Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012

2

48 43

2 5

bb+

bb-

cocchi+

anaerobi

lieviti

Molecular diagnosis

LightCycler SeptiFast Test

bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici

bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo

45

Bacterial Lysis amp

DNA Extraction

Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) bull Staphylococcus aureus

bull CoNS

bull Streptococcus pneumoniae

bull Streptococcus spp

bull Enterococcus faecium

bull Enterococcus faecalis

Fungi bull Candida (albicans

tropicalis

parapsilosis)

bull Candida (krusei glabrata)

bull Aspergillus (fumigatus)

PCR Analysis

MRSA (mecA)

VRE (van A B)

Sample Preparation

Sample whole blood

Septifast Analytical Concept

TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA

Rilevabili mediante PCR

Rilevabili mediante coltura

DNA batterico libero

Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati

Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

FASE PRE-ANALITICA

INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO

Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da

14

Emocoltura fase pre-analitica

Emocoltura pre-analitica

Personale che effettua il prelievo

Sede del prelievo

Sterilizzazione della cute

Momento del prelievo

Numero dei prelievi

Volume del sangue

Mezzo di coltura

EMOCOLTURA

Ottimizzazione della procedura

Emocoltura team per il prelievo

Riduzione della contaminazione da 48 a 1 (Weinbaum J Clin Microbiol 2001)

da 42 a 22 (Shifman Arch Pathol Lab Med 1996)

Affidare il prelievo a personale competente ed informato

Lavare le mani prima e dopo il prelievo

Indossare guanti nei passaggi di raccolta e trasporto

Ricerca del sito di prelievo mediante palpazione

Disinfezione della cute

bull sgrassare con Alcool 70 (o Clorexidina)

bull disinfettare con Iodoforo (Iodiopovidone)

bull applicare con movimento circolare verso

lrsquoesterno lazione disinfettante egrave tempo-dipendente

Quando la cute egrave asciutta egrave pronta per il prelievo

Mai pungere prima di 1-3 minuti

Emocoltura il prelievo

Antiseptic skin preparation

Emocoltura sede del prelievo

Effettuare il prelievo da vena periferica

Tempo del prelievo

Prima di iniziare la terapia antibiotica

Prima della sommistrazione dellrsquoantibiotico

Nellrsquoarco di 5-10rsquo (eccezione infezioni endovascolari quali

endocardite o sepsi CVC correlate)

As a practical matter blood cultures should be obtained simultaneously (or over a short timeframe) Drawing blood at intervals is only indicated when it is necessary to document continuous bacteremia in patients with suspected infective endocarditis or other endovascular (eg catheter-related) infections

CLSI publication M47-AmdashPrinciples and Procedures for Blood Cultures

Tempi di incubazione

emocolture

I microorganismi ldquofastidious ldquo richiedono tempi piugrave lunghi di coltura almeno

2 - 3 settimane di incubazione

Washington JA Mayo Clin Proc 1982

Alcuni microorganismi possono generare segnali molto deboli o anche nessun segnale

di crescita

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

SOSPETTO CLINICO

Esami microscopici e subcoltura cieca delle emocolture negative

Aumento dei tempi di incubazione delle emocolture negative

Prelevare 2 - 3 set (anaerobi + aerobi) per aumentare la possibilitagrave di isolare il

microrganismo in causa

differenzia la vera batteriemia dalle

contaminazioni

At least 15 of positive BC are due to

contaminants the number can be as high as

40

819 of CoNS and 493 of viridans

streptococci were contaminants

Wenstein MP Clin Infect Dis 1997

Numero di emocolture

163 malati (non endocarditi) 20 mL per set (Cockerill FR 2004)

blood cultures

n 1 2 3

diagnostic () 63 80 96

Optimal volume of blood for culture

ldquoThe volume of blood is the single most

important factor for successful recovery of

microorganisms from the blood stream of patientsrdquo

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

What is the optimal volume

of blood for culture

Blood from patients with IE contains 1

to 10 bacteria per mL

There is approximately linear

relationship between the yield of

bacteria from blood and the volume of

blood

ldquoThe volume of blood sample drawn

should be 40-60 mlrdquo

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

23

24

The microbiological diagnosis

TAT

Emocoltura analitica

BACTEC 9240

Strumento modulare

Incubatore Agitatore Lettore

I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer

Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo

I flaconi sono inseriti nello strumento

BACTEC 9240

FASE PRE-ANALITICA

INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO

Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da

Emocoltura positiva

Interpretazione del risultato

RUOLO PATOGENO

DEL MICRORGANISMO

ISOLATO

IDENTIFICAZIONE

DEI MICROORGANISMI

CONTAMINANTI

29

Batteriemia significativa

Improbabile Incerta Probabile

Corynebacterium spp

Non-anthracis Bacillus spp

Propionibacterium acnes

Stafilococchi Coagulasi Negativi

S aureus

S pneumoniae

Enterobacteriaceae

P aeruginosa

C albicans

probabilitagrave post-test n positivi n colture

confrontare antibiogrammi confrontare genotipi

probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente

protesi evidenza clinica

Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7

Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo

Catetere venoso centrale

I CATETERI

sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono

monitoraggio di parametri vitali

somministrazione di nutrienti e di farmaci

Siti di inserzione

e tipologie doppio triplo lume

tunnellizzati e non impregnati e non

con diversi gauge

Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata

biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche

morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole

inserzione transcutanea

CRBSI

Catheter Related Blood Stream Infection

Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere

Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione

Mermel LA Clin Infect Dis 2001

Sepsi CVC-correlata

- definizione -

Infezioni nei portatori di CVC

Emocoltura quantitativa

da catetere centrale da vena periferica

bull Prelievo contemporaneo

bull Volume uguale

bull Incubazione contemporanea

DTP gt120 minuti

Sepsi CVC correlata

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Sistema

totalmente

impiantabile

Condizioni

generali

scadute

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

NO

NO

SI

SI

Emocoltura

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Emocoltura

Germi resistenti

Miceti

Germi sensibili

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Non

efficace

Trombolisi

Efficace

NO SI

Risposta alla terapia

Negativa Positiva

Permanenza

del catetere

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE

REPARTI chirurgie

neurochirurgia nefrologia+centro trapianti

pediatria rianimazione neonatologia

medicine

geriatria

Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259

Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012

2

48 43

2 5

bb+

bb-

cocchi+

anaerobi

lieviti

Molecular diagnosis

LightCycler SeptiFast Test

bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici

bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo

45

Bacterial Lysis amp

DNA Extraction

Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) bull Staphylococcus aureus

bull CoNS

bull Streptococcus pneumoniae

bull Streptococcus spp

bull Enterococcus faecium

bull Enterococcus faecalis

Fungi bull Candida (albicans

tropicalis

parapsilosis)

bull Candida (krusei glabrata)

bull Aspergillus (fumigatus)

PCR Analysis

MRSA (mecA)

VRE (van A B)

Sample Preparation

Sample whole blood

Septifast Analytical Concept

TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA

Rilevabili mediante PCR

Rilevabili mediante coltura

DNA batterico libero

Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati

Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

14

Emocoltura fase pre-analitica

Emocoltura pre-analitica

Personale che effettua il prelievo

Sede del prelievo

Sterilizzazione della cute

Momento del prelievo

Numero dei prelievi

Volume del sangue

Mezzo di coltura

EMOCOLTURA

Ottimizzazione della procedura

Emocoltura team per il prelievo

Riduzione della contaminazione da 48 a 1 (Weinbaum J Clin Microbiol 2001)

da 42 a 22 (Shifman Arch Pathol Lab Med 1996)

Affidare il prelievo a personale competente ed informato

Lavare le mani prima e dopo il prelievo

Indossare guanti nei passaggi di raccolta e trasporto

Ricerca del sito di prelievo mediante palpazione

Disinfezione della cute

bull sgrassare con Alcool 70 (o Clorexidina)

bull disinfettare con Iodoforo (Iodiopovidone)

bull applicare con movimento circolare verso

lrsquoesterno lazione disinfettante egrave tempo-dipendente

Quando la cute egrave asciutta egrave pronta per il prelievo

Mai pungere prima di 1-3 minuti

Emocoltura il prelievo

Antiseptic skin preparation

Emocoltura sede del prelievo

Effettuare il prelievo da vena periferica

Tempo del prelievo

Prima di iniziare la terapia antibiotica

Prima della sommistrazione dellrsquoantibiotico

Nellrsquoarco di 5-10rsquo (eccezione infezioni endovascolari quali

endocardite o sepsi CVC correlate)

As a practical matter blood cultures should be obtained simultaneously (or over a short timeframe) Drawing blood at intervals is only indicated when it is necessary to document continuous bacteremia in patients with suspected infective endocarditis or other endovascular (eg catheter-related) infections

CLSI publication M47-AmdashPrinciples and Procedures for Blood Cultures

Tempi di incubazione

emocolture

I microorganismi ldquofastidious ldquo richiedono tempi piugrave lunghi di coltura almeno

2 - 3 settimane di incubazione

Washington JA Mayo Clin Proc 1982

Alcuni microorganismi possono generare segnali molto deboli o anche nessun segnale

di crescita

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

SOSPETTO CLINICO

Esami microscopici e subcoltura cieca delle emocolture negative

Aumento dei tempi di incubazione delle emocolture negative

Prelevare 2 - 3 set (anaerobi + aerobi) per aumentare la possibilitagrave di isolare il

microrganismo in causa

differenzia la vera batteriemia dalle

contaminazioni

At least 15 of positive BC are due to

contaminants the number can be as high as

40

819 of CoNS and 493 of viridans

streptococci were contaminants

Wenstein MP Clin Infect Dis 1997

Numero di emocolture

163 malati (non endocarditi) 20 mL per set (Cockerill FR 2004)

blood cultures

n 1 2 3

diagnostic () 63 80 96

Optimal volume of blood for culture

ldquoThe volume of blood is the single most

important factor for successful recovery of

microorganisms from the blood stream of patientsrdquo

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

What is the optimal volume

of blood for culture

Blood from patients with IE contains 1

to 10 bacteria per mL

There is approximately linear

relationship between the yield of

bacteria from blood and the volume of

blood

ldquoThe volume of blood sample drawn

should be 40-60 mlrdquo

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

23

24

The microbiological diagnosis

TAT

Emocoltura analitica

BACTEC 9240

Strumento modulare

Incubatore Agitatore Lettore

I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer

Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo

I flaconi sono inseriti nello strumento

BACTEC 9240

FASE PRE-ANALITICA

INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO

Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da

Emocoltura positiva

Interpretazione del risultato

RUOLO PATOGENO

DEL MICRORGANISMO

ISOLATO

IDENTIFICAZIONE

DEI MICROORGANISMI

CONTAMINANTI

29

Batteriemia significativa

Improbabile Incerta Probabile

Corynebacterium spp

Non-anthracis Bacillus spp

Propionibacterium acnes

Stafilococchi Coagulasi Negativi

S aureus

S pneumoniae

Enterobacteriaceae

P aeruginosa

C albicans

probabilitagrave post-test n positivi n colture

confrontare antibiogrammi confrontare genotipi

probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente

protesi evidenza clinica

Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7

Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo

Catetere venoso centrale

I CATETERI

sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono

monitoraggio di parametri vitali

somministrazione di nutrienti e di farmaci

Siti di inserzione

e tipologie doppio triplo lume

tunnellizzati e non impregnati e non

con diversi gauge

Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata

biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche

morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole

inserzione transcutanea

CRBSI

Catheter Related Blood Stream Infection

Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere

Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione

Mermel LA Clin Infect Dis 2001

Sepsi CVC-correlata

- definizione -

Infezioni nei portatori di CVC

Emocoltura quantitativa

da catetere centrale da vena periferica

bull Prelievo contemporaneo

bull Volume uguale

bull Incubazione contemporanea

DTP gt120 minuti

Sepsi CVC correlata

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Sistema

totalmente

impiantabile

Condizioni

generali

scadute

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

NO

NO

SI

SI

Emocoltura

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Emocoltura

Germi resistenti

Miceti

Germi sensibili

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Non

efficace

Trombolisi

Efficace

NO SI

Risposta alla terapia

Negativa Positiva

Permanenza

del catetere

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE

REPARTI chirurgie

neurochirurgia nefrologia+centro trapianti

pediatria rianimazione neonatologia

medicine

geriatria

Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259

Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012

2

48 43

2 5

bb+

bb-

cocchi+

anaerobi

lieviti

Molecular diagnosis

LightCycler SeptiFast Test

bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici

bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo

45

Bacterial Lysis amp

DNA Extraction

Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) bull Staphylococcus aureus

bull CoNS

bull Streptococcus pneumoniae

bull Streptococcus spp

bull Enterococcus faecium

bull Enterococcus faecalis

Fungi bull Candida (albicans

tropicalis

parapsilosis)

bull Candida (krusei glabrata)

bull Aspergillus (fumigatus)

PCR Analysis

MRSA (mecA)

VRE (van A B)

Sample Preparation

Sample whole blood

Septifast Analytical Concept

TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA

Rilevabili mediante PCR

Rilevabili mediante coltura

DNA batterico libero

Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati

Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

Personale che effettua il prelievo

Sede del prelievo

Sterilizzazione della cute

Momento del prelievo

Numero dei prelievi

Volume del sangue

Mezzo di coltura

EMOCOLTURA

Ottimizzazione della procedura

Emocoltura team per il prelievo

Riduzione della contaminazione da 48 a 1 (Weinbaum J Clin Microbiol 2001)

da 42 a 22 (Shifman Arch Pathol Lab Med 1996)

Affidare il prelievo a personale competente ed informato

Lavare le mani prima e dopo il prelievo

Indossare guanti nei passaggi di raccolta e trasporto

Ricerca del sito di prelievo mediante palpazione

Disinfezione della cute

bull sgrassare con Alcool 70 (o Clorexidina)

bull disinfettare con Iodoforo (Iodiopovidone)

bull applicare con movimento circolare verso

lrsquoesterno lazione disinfettante egrave tempo-dipendente

Quando la cute egrave asciutta egrave pronta per il prelievo

Mai pungere prima di 1-3 minuti

Emocoltura il prelievo

Antiseptic skin preparation

Emocoltura sede del prelievo

Effettuare il prelievo da vena periferica

Tempo del prelievo

Prima di iniziare la terapia antibiotica

Prima della sommistrazione dellrsquoantibiotico

Nellrsquoarco di 5-10rsquo (eccezione infezioni endovascolari quali

endocardite o sepsi CVC correlate)

As a practical matter blood cultures should be obtained simultaneously (or over a short timeframe) Drawing blood at intervals is only indicated when it is necessary to document continuous bacteremia in patients with suspected infective endocarditis or other endovascular (eg catheter-related) infections

CLSI publication M47-AmdashPrinciples and Procedures for Blood Cultures

Tempi di incubazione

emocolture

I microorganismi ldquofastidious ldquo richiedono tempi piugrave lunghi di coltura almeno

2 - 3 settimane di incubazione

Washington JA Mayo Clin Proc 1982

Alcuni microorganismi possono generare segnali molto deboli o anche nessun segnale

di crescita

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

SOSPETTO CLINICO

Esami microscopici e subcoltura cieca delle emocolture negative

Aumento dei tempi di incubazione delle emocolture negative

Prelevare 2 - 3 set (anaerobi + aerobi) per aumentare la possibilitagrave di isolare il

microrganismo in causa

differenzia la vera batteriemia dalle

contaminazioni

At least 15 of positive BC are due to

contaminants the number can be as high as

40

819 of CoNS and 493 of viridans

streptococci were contaminants

Wenstein MP Clin Infect Dis 1997

Numero di emocolture

163 malati (non endocarditi) 20 mL per set (Cockerill FR 2004)

blood cultures

n 1 2 3

diagnostic () 63 80 96

Optimal volume of blood for culture

ldquoThe volume of blood is the single most

important factor for successful recovery of

microorganisms from the blood stream of patientsrdquo

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

What is the optimal volume

of blood for culture

Blood from patients with IE contains 1

to 10 bacteria per mL

There is approximately linear

relationship between the yield of

bacteria from blood and the volume of

blood

ldquoThe volume of blood sample drawn

should be 40-60 mlrdquo

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

23

24

The microbiological diagnosis

TAT

Emocoltura analitica

BACTEC 9240

Strumento modulare

Incubatore Agitatore Lettore

I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer

Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo

I flaconi sono inseriti nello strumento

BACTEC 9240

FASE PRE-ANALITICA

INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO

Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da

Emocoltura positiva

Interpretazione del risultato

RUOLO PATOGENO

DEL MICRORGANISMO

ISOLATO

IDENTIFICAZIONE

DEI MICROORGANISMI

CONTAMINANTI

29

Batteriemia significativa

Improbabile Incerta Probabile

Corynebacterium spp

Non-anthracis Bacillus spp

Propionibacterium acnes

Stafilococchi Coagulasi Negativi

S aureus

S pneumoniae

Enterobacteriaceae

P aeruginosa

C albicans

probabilitagrave post-test n positivi n colture

confrontare antibiogrammi confrontare genotipi

probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente

protesi evidenza clinica

Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7

Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo

Catetere venoso centrale

I CATETERI

sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono

monitoraggio di parametri vitali

somministrazione di nutrienti e di farmaci

Siti di inserzione

e tipologie doppio triplo lume

tunnellizzati e non impregnati e non

con diversi gauge

Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata

biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche

morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole

inserzione transcutanea

CRBSI

Catheter Related Blood Stream Infection

Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere

Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione

Mermel LA Clin Infect Dis 2001

Sepsi CVC-correlata

- definizione -

Infezioni nei portatori di CVC

Emocoltura quantitativa

da catetere centrale da vena periferica

bull Prelievo contemporaneo

bull Volume uguale

bull Incubazione contemporanea

DTP gt120 minuti

Sepsi CVC correlata

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Sistema

totalmente

impiantabile

Condizioni

generali

scadute

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

NO

NO

SI

SI

Emocoltura

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Emocoltura

Germi resistenti

Miceti

Germi sensibili

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Non

efficace

Trombolisi

Efficace

NO SI

Risposta alla terapia

Negativa Positiva

Permanenza

del catetere

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE

REPARTI chirurgie

neurochirurgia nefrologia+centro trapianti

pediatria rianimazione neonatologia

medicine

geriatria

Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259

Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012

2

48 43

2 5

bb+

bb-

cocchi+

anaerobi

lieviti

Molecular diagnosis

LightCycler SeptiFast Test

bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici

bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo

45

Bacterial Lysis amp

DNA Extraction

Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) bull Staphylococcus aureus

bull CoNS

bull Streptococcus pneumoniae

bull Streptococcus spp

bull Enterococcus faecium

bull Enterococcus faecalis

Fungi bull Candida (albicans

tropicalis

parapsilosis)

bull Candida (krusei glabrata)

bull Aspergillus (fumigatus)

PCR Analysis

MRSA (mecA)

VRE (van A B)

Sample Preparation

Sample whole blood

Septifast Analytical Concept

TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA

Rilevabili mediante PCR

Rilevabili mediante coltura

DNA batterico libero

Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati

Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

Emocoltura team per il prelievo

Riduzione della contaminazione da 48 a 1 (Weinbaum J Clin Microbiol 2001)

da 42 a 22 (Shifman Arch Pathol Lab Med 1996)

Affidare il prelievo a personale competente ed informato

Lavare le mani prima e dopo il prelievo

Indossare guanti nei passaggi di raccolta e trasporto

Ricerca del sito di prelievo mediante palpazione

Disinfezione della cute

bull sgrassare con Alcool 70 (o Clorexidina)

bull disinfettare con Iodoforo (Iodiopovidone)

bull applicare con movimento circolare verso

lrsquoesterno lazione disinfettante egrave tempo-dipendente

Quando la cute egrave asciutta egrave pronta per il prelievo

Mai pungere prima di 1-3 minuti

Emocoltura il prelievo

Antiseptic skin preparation

Emocoltura sede del prelievo

Effettuare il prelievo da vena periferica

Tempo del prelievo

Prima di iniziare la terapia antibiotica

Prima della sommistrazione dellrsquoantibiotico

Nellrsquoarco di 5-10rsquo (eccezione infezioni endovascolari quali

endocardite o sepsi CVC correlate)

As a practical matter blood cultures should be obtained simultaneously (or over a short timeframe) Drawing blood at intervals is only indicated when it is necessary to document continuous bacteremia in patients with suspected infective endocarditis or other endovascular (eg catheter-related) infections

CLSI publication M47-AmdashPrinciples and Procedures for Blood Cultures

Tempi di incubazione

emocolture

I microorganismi ldquofastidious ldquo richiedono tempi piugrave lunghi di coltura almeno

2 - 3 settimane di incubazione

Washington JA Mayo Clin Proc 1982

Alcuni microorganismi possono generare segnali molto deboli o anche nessun segnale

di crescita

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

SOSPETTO CLINICO

Esami microscopici e subcoltura cieca delle emocolture negative

Aumento dei tempi di incubazione delle emocolture negative

Prelevare 2 - 3 set (anaerobi + aerobi) per aumentare la possibilitagrave di isolare il

microrganismo in causa

differenzia la vera batteriemia dalle

contaminazioni

At least 15 of positive BC are due to

contaminants the number can be as high as

40

819 of CoNS and 493 of viridans

streptococci were contaminants

Wenstein MP Clin Infect Dis 1997

Numero di emocolture

163 malati (non endocarditi) 20 mL per set (Cockerill FR 2004)

blood cultures

n 1 2 3

diagnostic () 63 80 96

Optimal volume of blood for culture

ldquoThe volume of blood is the single most

important factor for successful recovery of

microorganisms from the blood stream of patientsrdquo

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

What is the optimal volume

of blood for culture

Blood from patients with IE contains 1

to 10 bacteria per mL

There is approximately linear

relationship between the yield of

bacteria from blood and the volume of

blood

ldquoThe volume of blood sample drawn

should be 40-60 mlrdquo

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

23

24

The microbiological diagnosis

TAT

Emocoltura analitica

BACTEC 9240

Strumento modulare

Incubatore Agitatore Lettore

I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer

Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo

I flaconi sono inseriti nello strumento

BACTEC 9240

FASE PRE-ANALITICA

INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO

Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da

Emocoltura positiva

Interpretazione del risultato

RUOLO PATOGENO

DEL MICRORGANISMO

ISOLATO

IDENTIFICAZIONE

DEI MICROORGANISMI

CONTAMINANTI

29

Batteriemia significativa

Improbabile Incerta Probabile

Corynebacterium spp

Non-anthracis Bacillus spp

Propionibacterium acnes

Stafilococchi Coagulasi Negativi

S aureus

S pneumoniae

Enterobacteriaceae

P aeruginosa

C albicans

probabilitagrave post-test n positivi n colture

confrontare antibiogrammi confrontare genotipi

probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente

protesi evidenza clinica

Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7

Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo

Catetere venoso centrale

I CATETERI

sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono

monitoraggio di parametri vitali

somministrazione di nutrienti e di farmaci

Siti di inserzione

e tipologie doppio triplo lume

tunnellizzati e non impregnati e non

con diversi gauge

Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata

biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche

morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole

inserzione transcutanea

CRBSI

Catheter Related Blood Stream Infection

Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere

Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione

Mermel LA Clin Infect Dis 2001

Sepsi CVC-correlata

- definizione -

Infezioni nei portatori di CVC

Emocoltura quantitativa

da catetere centrale da vena periferica

bull Prelievo contemporaneo

bull Volume uguale

bull Incubazione contemporanea

DTP gt120 minuti

Sepsi CVC correlata

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Sistema

totalmente

impiantabile

Condizioni

generali

scadute

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

NO

NO

SI

SI

Emocoltura

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Emocoltura

Germi resistenti

Miceti

Germi sensibili

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Non

efficace

Trombolisi

Efficace

NO SI

Risposta alla terapia

Negativa Positiva

Permanenza

del catetere

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE

REPARTI chirurgie

neurochirurgia nefrologia+centro trapianti

pediatria rianimazione neonatologia

medicine

geriatria

Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259

Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012

2

48 43

2 5

bb+

bb-

cocchi+

anaerobi

lieviti

Molecular diagnosis

LightCycler SeptiFast Test

bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici

bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo

45

Bacterial Lysis amp

DNA Extraction

Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) bull Staphylococcus aureus

bull CoNS

bull Streptococcus pneumoniae

bull Streptococcus spp

bull Enterococcus faecium

bull Enterococcus faecalis

Fungi bull Candida (albicans

tropicalis

parapsilosis)

bull Candida (krusei glabrata)

bull Aspergillus (fumigatus)

PCR Analysis

MRSA (mecA)

VRE (van A B)

Sample Preparation

Sample whole blood

Septifast Analytical Concept

TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA

Rilevabili mediante PCR

Rilevabili mediante coltura

DNA batterico libero

Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati

Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

Lavare le mani prima e dopo il prelievo

Indossare guanti nei passaggi di raccolta e trasporto

Ricerca del sito di prelievo mediante palpazione

Disinfezione della cute

bull sgrassare con Alcool 70 (o Clorexidina)

bull disinfettare con Iodoforo (Iodiopovidone)

bull applicare con movimento circolare verso

lrsquoesterno lazione disinfettante egrave tempo-dipendente

Quando la cute egrave asciutta egrave pronta per il prelievo

Mai pungere prima di 1-3 minuti

Emocoltura il prelievo

Antiseptic skin preparation

Emocoltura sede del prelievo

Effettuare il prelievo da vena periferica

Tempo del prelievo

Prima di iniziare la terapia antibiotica

Prima della sommistrazione dellrsquoantibiotico

Nellrsquoarco di 5-10rsquo (eccezione infezioni endovascolari quali

endocardite o sepsi CVC correlate)

As a practical matter blood cultures should be obtained simultaneously (or over a short timeframe) Drawing blood at intervals is only indicated when it is necessary to document continuous bacteremia in patients with suspected infective endocarditis or other endovascular (eg catheter-related) infections

CLSI publication M47-AmdashPrinciples and Procedures for Blood Cultures

Tempi di incubazione

emocolture

I microorganismi ldquofastidious ldquo richiedono tempi piugrave lunghi di coltura almeno

2 - 3 settimane di incubazione

Washington JA Mayo Clin Proc 1982

Alcuni microorganismi possono generare segnali molto deboli o anche nessun segnale

di crescita

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

SOSPETTO CLINICO

Esami microscopici e subcoltura cieca delle emocolture negative

Aumento dei tempi di incubazione delle emocolture negative

Prelevare 2 - 3 set (anaerobi + aerobi) per aumentare la possibilitagrave di isolare il

microrganismo in causa

differenzia la vera batteriemia dalle

contaminazioni

At least 15 of positive BC are due to

contaminants the number can be as high as

40

819 of CoNS and 493 of viridans

streptococci were contaminants

Wenstein MP Clin Infect Dis 1997

Numero di emocolture

163 malati (non endocarditi) 20 mL per set (Cockerill FR 2004)

blood cultures

n 1 2 3

diagnostic () 63 80 96

Optimal volume of blood for culture

ldquoThe volume of blood is the single most

important factor for successful recovery of

microorganisms from the blood stream of patientsrdquo

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

What is the optimal volume

of blood for culture

Blood from patients with IE contains 1

to 10 bacteria per mL

There is approximately linear

relationship between the yield of

bacteria from blood and the volume of

blood

ldquoThe volume of blood sample drawn

should be 40-60 mlrdquo

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

23

24

The microbiological diagnosis

TAT

Emocoltura analitica

BACTEC 9240

Strumento modulare

Incubatore Agitatore Lettore

I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer

Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo

I flaconi sono inseriti nello strumento

BACTEC 9240

FASE PRE-ANALITICA

INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO

Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da

Emocoltura positiva

Interpretazione del risultato

RUOLO PATOGENO

DEL MICRORGANISMO

ISOLATO

IDENTIFICAZIONE

DEI MICROORGANISMI

CONTAMINANTI

29

Batteriemia significativa

Improbabile Incerta Probabile

Corynebacterium spp

Non-anthracis Bacillus spp

Propionibacterium acnes

Stafilococchi Coagulasi Negativi

S aureus

S pneumoniae

Enterobacteriaceae

P aeruginosa

C albicans

probabilitagrave post-test n positivi n colture

confrontare antibiogrammi confrontare genotipi

probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente

protesi evidenza clinica

Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7

Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo

Catetere venoso centrale

I CATETERI

sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono

monitoraggio di parametri vitali

somministrazione di nutrienti e di farmaci

Siti di inserzione

e tipologie doppio triplo lume

tunnellizzati e non impregnati e non

con diversi gauge

Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata

biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche

morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole

inserzione transcutanea

CRBSI

Catheter Related Blood Stream Infection

Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere

Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione

Mermel LA Clin Infect Dis 2001

Sepsi CVC-correlata

- definizione -

Infezioni nei portatori di CVC

Emocoltura quantitativa

da catetere centrale da vena periferica

bull Prelievo contemporaneo

bull Volume uguale

bull Incubazione contemporanea

DTP gt120 minuti

Sepsi CVC correlata

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Sistema

totalmente

impiantabile

Condizioni

generali

scadute

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

NO

NO

SI

SI

Emocoltura

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Emocoltura

Germi resistenti

Miceti

Germi sensibili

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Non

efficace

Trombolisi

Efficace

NO SI

Risposta alla terapia

Negativa Positiva

Permanenza

del catetere

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE

REPARTI chirurgie

neurochirurgia nefrologia+centro trapianti

pediatria rianimazione neonatologia

medicine

geriatria

Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259

Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012

2

48 43

2 5

bb+

bb-

cocchi+

anaerobi

lieviti

Molecular diagnosis

LightCycler SeptiFast Test

bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici

bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo

45

Bacterial Lysis amp

DNA Extraction

Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) bull Staphylococcus aureus

bull CoNS

bull Streptococcus pneumoniae

bull Streptococcus spp

bull Enterococcus faecium

bull Enterococcus faecalis

Fungi bull Candida (albicans

tropicalis

parapsilosis)

bull Candida (krusei glabrata)

bull Aspergillus (fumigatus)

PCR Analysis

MRSA (mecA)

VRE (van A B)

Sample Preparation

Sample whole blood

Septifast Analytical Concept

TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA

Rilevabili mediante PCR

Rilevabili mediante coltura

DNA batterico libero

Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati

Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

Emocoltura sede del prelievo

Effettuare il prelievo da vena periferica

Tempo del prelievo

Prima di iniziare la terapia antibiotica

Prima della sommistrazione dellrsquoantibiotico

Nellrsquoarco di 5-10rsquo (eccezione infezioni endovascolari quali

endocardite o sepsi CVC correlate)

As a practical matter blood cultures should be obtained simultaneously (or over a short timeframe) Drawing blood at intervals is only indicated when it is necessary to document continuous bacteremia in patients with suspected infective endocarditis or other endovascular (eg catheter-related) infections

CLSI publication M47-AmdashPrinciples and Procedures for Blood Cultures

Tempi di incubazione

emocolture

I microorganismi ldquofastidious ldquo richiedono tempi piugrave lunghi di coltura almeno

2 - 3 settimane di incubazione

Washington JA Mayo Clin Proc 1982

Alcuni microorganismi possono generare segnali molto deboli o anche nessun segnale

di crescita

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

SOSPETTO CLINICO

Esami microscopici e subcoltura cieca delle emocolture negative

Aumento dei tempi di incubazione delle emocolture negative

Prelevare 2 - 3 set (anaerobi + aerobi) per aumentare la possibilitagrave di isolare il

microrganismo in causa

differenzia la vera batteriemia dalle

contaminazioni

At least 15 of positive BC are due to

contaminants the number can be as high as

40

819 of CoNS and 493 of viridans

streptococci were contaminants

Wenstein MP Clin Infect Dis 1997

Numero di emocolture

163 malati (non endocarditi) 20 mL per set (Cockerill FR 2004)

blood cultures

n 1 2 3

diagnostic () 63 80 96

Optimal volume of blood for culture

ldquoThe volume of blood is the single most

important factor for successful recovery of

microorganisms from the blood stream of patientsrdquo

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

What is the optimal volume

of blood for culture

Blood from patients with IE contains 1

to 10 bacteria per mL

There is approximately linear

relationship between the yield of

bacteria from blood and the volume of

blood

ldquoThe volume of blood sample drawn

should be 40-60 mlrdquo

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

23

24

The microbiological diagnosis

TAT

Emocoltura analitica

BACTEC 9240

Strumento modulare

Incubatore Agitatore Lettore

I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer

Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo

I flaconi sono inseriti nello strumento

BACTEC 9240

FASE PRE-ANALITICA

INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO

Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da

Emocoltura positiva

Interpretazione del risultato

RUOLO PATOGENO

DEL MICRORGANISMO

ISOLATO

IDENTIFICAZIONE

DEI MICROORGANISMI

CONTAMINANTI

29

Batteriemia significativa

Improbabile Incerta Probabile

Corynebacterium spp

Non-anthracis Bacillus spp

Propionibacterium acnes

Stafilococchi Coagulasi Negativi

S aureus

S pneumoniae

Enterobacteriaceae

P aeruginosa

C albicans

probabilitagrave post-test n positivi n colture

confrontare antibiogrammi confrontare genotipi

probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente

protesi evidenza clinica

Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7

Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo

Catetere venoso centrale

I CATETERI

sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono

monitoraggio di parametri vitali

somministrazione di nutrienti e di farmaci

Siti di inserzione

e tipologie doppio triplo lume

tunnellizzati e non impregnati e non

con diversi gauge

Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata

biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche

morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole

inserzione transcutanea

CRBSI

Catheter Related Blood Stream Infection

Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere

Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione

Mermel LA Clin Infect Dis 2001

Sepsi CVC-correlata

- definizione -

Infezioni nei portatori di CVC

Emocoltura quantitativa

da catetere centrale da vena periferica

bull Prelievo contemporaneo

bull Volume uguale

bull Incubazione contemporanea

DTP gt120 minuti

Sepsi CVC correlata

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Sistema

totalmente

impiantabile

Condizioni

generali

scadute

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

NO

NO

SI

SI

Emocoltura

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Emocoltura

Germi resistenti

Miceti

Germi sensibili

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Non

efficace

Trombolisi

Efficace

NO SI

Risposta alla terapia

Negativa Positiva

Permanenza

del catetere

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE

REPARTI chirurgie

neurochirurgia nefrologia+centro trapianti

pediatria rianimazione neonatologia

medicine

geriatria

Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259

Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012

2

48 43

2 5

bb+

bb-

cocchi+

anaerobi

lieviti

Molecular diagnosis

LightCycler SeptiFast Test

bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici

bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo

45

Bacterial Lysis amp

DNA Extraction

Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) bull Staphylococcus aureus

bull CoNS

bull Streptococcus pneumoniae

bull Streptococcus spp

bull Enterococcus faecium

bull Enterococcus faecalis

Fungi bull Candida (albicans

tropicalis

parapsilosis)

bull Candida (krusei glabrata)

bull Aspergillus (fumigatus)

PCR Analysis

MRSA (mecA)

VRE (van A B)

Sample Preparation

Sample whole blood

Septifast Analytical Concept

TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA

Rilevabili mediante PCR

Rilevabili mediante coltura

DNA batterico libero

Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati

Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

Tempo del prelievo

Prima di iniziare la terapia antibiotica

Prima della sommistrazione dellrsquoantibiotico

Nellrsquoarco di 5-10rsquo (eccezione infezioni endovascolari quali

endocardite o sepsi CVC correlate)

As a practical matter blood cultures should be obtained simultaneously (or over a short timeframe) Drawing blood at intervals is only indicated when it is necessary to document continuous bacteremia in patients with suspected infective endocarditis or other endovascular (eg catheter-related) infections

CLSI publication M47-AmdashPrinciples and Procedures for Blood Cultures

Tempi di incubazione

emocolture

I microorganismi ldquofastidious ldquo richiedono tempi piugrave lunghi di coltura almeno

2 - 3 settimane di incubazione

Washington JA Mayo Clin Proc 1982

Alcuni microorganismi possono generare segnali molto deboli o anche nessun segnale

di crescita

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

SOSPETTO CLINICO

Esami microscopici e subcoltura cieca delle emocolture negative

Aumento dei tempi di incubazione delle emocolture negative

Prelevare 2 - 3 set (anaerobi + aerobi) per aumentare la possibilitagrave di isolare il

microrganismo in causa

differenzia la vera batteriemia dalle

contaminazioni

At least 15 of positive BC are due to

contaminants the number can be as high as

40

819 of CoNS and 493 of viridans

streptococci were contaminants

Wenstein MP Clin Infect Dis 1997

Numero di emocolture

163 malati (non endocarditi) 20 mL per set (Cockerill FR 2004)

blood cultures

n 1 2 3

diagnostic () 63 80 96

Optimal volume of blood for culture

ldquoThe volume of blood is the single most

important factor for successful recovery of

microorganisms from the blood stream of patientsrdquo

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

What is the optimal volume

of blood for culture

Blood from patients with IE contains 1

to 10 bacteria per mL

There is approximately linear

relationship between the yield of

bacteria from blood and the volume of

blood

ldquoThe volume of blood sample drawn

should be 40-60 mlrdquo

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

23

24

The microbiological diagnosis

TAT

Emocoltura analitica

BACTEC 9240

Strumento modulare

Incubatore Agitatore Lettore

I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer

Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo

I flaconi sono inseriti nello strumento

BACTEC 9240

FASE PRE-ANALITICA

INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO

Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da

Emocoltura positiva

Interpretazione del risultato

RUOLO PATOGENO

DEL MICRORGANISMO

ISOLATO

IDENTIFICAZIONE

DEI MICROORGANISMI

CONTAMINANTI

29

Batteriemia significativa

Improbabile Incerta Probabile

Corynebacterium spp

Non-anthracis Bacillus spp

Propionibacterium acnes

Stafilococchi Coagulasi Negativi

S aureus

S pneumoniae

Enterobacteriaceae

P aeruginosa

C albicans

probabilitagrave post-test n positivi n colture

confrontare antibiogrammi confrontare genotipi

probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente

protesi evidenza clinica

Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7

Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo

Catetere venoso centrale

I CATETERI

sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono

monitoraggio di parametri vitali

somministrazione di nutrienti e di farmaci

Siti di inserzione

e tipologie doppio triplo lume

tunnellizzati e non impregnati e non

con diversi gauge

Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata

biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche

morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole

inserzione transcutanea

CRBSI

Catheter Related Blood Stream Infection

Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere

Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione

Mermel LA Clin Infect Dis 2001

Sepsi CVC-correlata

- definizione -

Infezioni nei portatori di CVC

Emocoltura quantitativa

da catetere centrale da vena periferica

bull Prelievo contemporaneo

bull Volume uguale

bull Incubazione contemporanea

DTP gt120 minuti

Sepsi CVC correlata

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Sistema

totalmente

impiantabile

Condizioni

generali

scadute

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

NO

NO

SI

SI

Emocoltura

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Emocoltura

Germi resistenti

Miceti

Germi sensibili

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Non

efficace

Trombolisi

Efficace

NO SI

Risposta alla terapia

Negativa Positiva

Permanenza

del catetere

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE

REPARTI chirurgie

neurochirurgia nefrologia+centro trapianti

pediatria rianimazione neonatologia

medicine

geriatria

Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259

Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012

2

48 43

2 5

bb+

bb-

cocchi+

anaerobi

lieviti

Molecular diagnosis

LightCycler SeptiFast Test

bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici

bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo

45

Bacterial Lysis amp

DNA Extraction

Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) bull Staphylococcus aureus

bull CoNS

bull Streptococcus pneumoniae

bull Streptococcus spp

bull Enterococcus faecium

bull Enterococcus faecalis

Fungi bull Candida (albicans

tropicalis

parapsilosis)

bull Candida (krusei glabrata)

bull Aspergillus (fumigatus)

PCR Analysis

MRSA (mecA)

VRE (van A B)

Sample Preparation

Sample whole blood

Septifast Analytical Concept

TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA

Rilevabili mediante PCR

Rilevabili mediante coltura

DNA batterico libero

Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati

Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

Tempi di incubazione

emocolture

I microorganismi ldquofastidious ldquo richiedono tempi piugrave lunghi di coltura almeno

2 - 3 settimane di incubazione

Washington JA Mayo Clin Proc 1982

Alcuni microorganismi possono generare segnali molto deboli o anche nessun segnale

di crescita

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

SOSPETTO CLINICO

Esami microscopici e subcoltura cieca delle emocolture negative

Aumento dei tempi di incubazione delle emocolture negative

Prelevare 2 - 3 set (anaerobi + aerobi) per aumentare la possibilitagrave di isolare il

microrganismo in causa

differenzia la vera batteriemia dalle

contaminazioni

At least 15 of positive BC are due to

contaminants the number can be as high as

40

819 of CoNS and 493 of viridans

streptococci were contaminants

Wenstein MP Clin Infect Dis 1997

Numero di emocolture

163 malati (non endocarditi) 20 mL per set (Cockerill FR 2004)

blood cultures

n 1 2 3

diagnostic () 63 80 96

Optimal volume of blood for culture

ldquoThe volume of blood is the single most

important factor for successful recovery of

microorganisms from the blood stream of patientsrdquo

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

What is the optimal volume

of blood for culture

Blood from patients with IE contains 1

to 10 bacteria per mL

There is approximately linear

relationship between the yield of

bacteria from blood and the volume of

blood

ldquoThe volume of blood sample drawn

should be 40-60 mlrdquo

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

23

24

The microbiological diagnosis

TAT

Emocoltura analitica

BACTEC 9240

Strumento modulare

Incubatore Agitatore Lettore

I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer

Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo

I flaconi sono inseriti nello strumento

BACTEC 9240

FASE PRE-ANALITICA

INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO

Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da

Emocoltura positiva

Interpretazione del risultato

RUOLO PATOGENO

DEL MICRORGANISMO

ISOLATO

IDENTIFICAZIONE

DEI MICROORGANISMI

CONTAMINANTI

29

Batteriemia significativa

Improbabile Incerta Probabile

Corynebacterium spp

Non-anthracis Bacillus spp

Propionibacterium acnes

Stafilococchi Coagulasi Negativi

S aureus

S pneumoniae

Enterobacteriaceae

P aeruginosa

C albicans

probabilitagrave post-test n positivi n colture

confrontare antibiogrammi confrontare genotipi

probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente

protesi evidenza clinica

Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7

Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo

Catetere venoso centrale

I CATETERI

sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono

monitoraggio di parametri vitali

somministrazione di nutrienti e di farmaci

Siti di inserzione

e tipologie doppio triplo lume

tunnellizzati e non impregnati e non

con diversi gauge

Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata

biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche

morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole

inserzione transcutanea

CRBSI

Catheter Related Blood Stream Infection

Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere

Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione

Mermel LA Clin Infect Dis 2001

Sepsi CVC-correlata

- definizione -

Infezioni nei portatori di CVC

Emocoltura quantitativa

da catetere centrale da vena periferica

bull Prelievo contemporaneo

bull Volume uguale

bull Incubazione contemporanea

DTP gt120 minuti

Sepsi CVC correlata

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Sistema

totalmente

impiantabile

Condizioni

generali

scadute

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

NO

NO

SI

SI

Emocoltura

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Emocoltura

Germi resistenti

Miceti

Germi sensibili

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Non

efficace

Trombolisi

Efficace

NO SI

Risposta alla terapia

Negativa Positiva

Permanenza

del catetere

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE

REPARTI chirurgie

neurochirurgia nefrologia+centro trapianti

pediatria rianimazione neonatologia

medicine

geriatria

Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259

Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012

2

48 43

2 5

bb+

bb-

cocchi+

anaerobi

lieviti

Molecular diagnosis

LightCycler SeptiFast Test

bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici

bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo

45

Bacterial Lysis amp

DNA Extraction

Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) bull Staphylococcus aureus

bull CoNS

bull Streptococcus pneumoniae

bull Streptococcus spp

bull Enterococcus faecium

bull Enterococcus faecalis

Fungi bull Candida (albicans

tropicalis

parapsilosis)

bull Candida (krusei glabrata)

bull Aspergillus (fumigatus)

PCR Analysis

MRSA (mecA)

VRE (van A B)

Sample Preparation

Sample whole blood

Septifast Analytical Concept

TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA

Rilevabili mediante PCR

Rilevabili mediante coltura

DNA batterico libero

Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati

Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

Prelevare 2 - 3 set (anaerobi + aerobi) per aumentare la possibilitagrave di isolare il

microrganismo in causa

differenzia la vera batteriemia dalle

contaminazioni

At least 15 of positive BC are due to

contaminants the number can be as high as

40

819 of CoNS and 493 of viridans

streptococci were contaminants

Wenstein MP Clin Infect Dis 1997

Numero di emocolture

163 malati (non endocarditi) 20 mL per set (Cockerill FR 2004)

blood cultures

n 1 2 3

diagnostic () 63 80 96

Optimal volume of blood for culture

ldquoThe volume of blood is the single most

important factor for successful recovery of

microorganisms from the blood stream of patientsrdquo

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

What is the optimal volume

of blood for culture

Blood from patients with IE contains 1

to 10 bacteria per mL

There is approximately linear

relationship between the yield of

bacteria from blood and the volume of

blood

ldquoThe volume of blood sample drawn

should be 40-60 mlrdquo

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

23

24

The microbiological diagnosis

TAT

Emocoltura analitica

BACTEC 9240

Strumento modulare

Incubatore Agitatore Lettore

I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer

Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo

I flaconi sono inseriti nello strumento

BACTEC 9240

FASE PRE-ANALITICA

INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO

Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da

Emocoltura positiva

Interpretazione del risultato

RUOLO PATOGENO

DEL MICRORGANISMO

ISOLATO

IDENTIFICAZIONE

DEI MICROORGANISMI

CONTAMINANTI

29

Batteriemia significativa

Improbabile Incerta Probabile

Corynebacterium spp

Non-anthracis Bacillus spp

Propionibacterium acnes

Stafilococchi Coagulasi Negativi

S aureus

S pneumoniae

Enterobacteriaceae

P aeruginosa

C albicans

probabilitagrave post-test n positivi n colture

confrontare antibiogrammi confrontare genotipi

probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente

protesi evidenza clinica

Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7

Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo

Catetere venoso centrale

I CATETERI

sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono

monitoraggio di parametri vitali

somministrazione di nutrienti e di farmaci

Siti di inserzione

e tipologie doppio triplo lume

tunnellizzati e non impregnati e non

con diversi gauge

Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata

biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche

morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole

inserzione transcutanea

CRBSI

Catheter Related Blood Stream Infection

Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere

Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione

Mermel LA Clin Infect Dis 2001

Sepsi CVC-correlata

- definizione -

Infezioni nei portatori di CVC

Emocoltura quantitativa

da catetere centrale da vena periferica

bull Prelievo contemporaneo

bull Volume uguale

bull Incubazione contemporanea

DTP gt120 minuti

Sepsi CVC correlata

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Sistema

totalmente

impiantabile

Condizioni

generali

scadute

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

NO

NO

SI

SI

Emocoltura

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Emocoltura

Germi resistenti

Miceti

Germi sensibili

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Non

efficace

Trombolisi

Efficace

NO SI

Risposta alla terapia

Negativa Positiva

Permanenza

del catetere

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE

REPARTI chirurgie

neurochirurgia nefrologia+centro trapianti

pediatria rianimazione neonatologia

medicine

geriatria

Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259

Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012

2

48 43

2 5

bb+

bb-

cocchi+

anaerobi

lieviti

Molecular diagnosis

LightCycler SeptiFast Test

bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici

bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo

45

Bacterial Lysis amp

DNA Extraction

Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) bull Staphylococcus aureus

bull CoNS

bull Streptococcus pneumoniae

bull Streptococcus spp

bull Enterococcus faecium

bull Enterococcus faecalis

Fungi bull Candida (albicans

tropicalis

parapsilosis)

bull Candida (krusei glabrata)

bull Aspergillus (fumigatus)

PCR Analysis

MRSA (mecA)

VRE (van A B)

Sample Preparation

Sample whole blood

Septifast Analytical Concept

TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA

Rilevabili mediante PCR

Rilevabili mediante coltura

DNA batterico libero

Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati

Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

Optimal volume of blood for culture

ldquoThe volume of blood is the single most

important factor for successful recovery of

microorganisms from the blood stream of patientsrdquo

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

What is the optimal volume

of blood for culture

Blood from patients with IE contains 1

to 10 bacteria per mL

There is approximately linear

relationship between the yield of

bacteria from blood and the volume of

blood

ldquoThe volume of blood sample drawn

should be 40-60 mlrdquo

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

23

24

The microbiological diagnosis

TAT

Emocoltura analitica

BACTEC 9240

Strumento modulare

Incubatore Agitatore Lettore

I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer

Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo

I flaconi sono inseriti nello strumento

BACTEC 9240

FASE PRE-ANALITICA

INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO

Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da

Emocoltura positiva

Interpretazione del risultato

RUOLO PATOGENO

DEL MICRORGANISMO

ISOLATO

IDENTIFICAZIONE

DEI MICROORGANISMI

CONTAMINANTI

29

Batteriemia significativa

Improbabile Incerta Probabile

Corynebacterium spp

Non-anthracis Bacillus spp

Propionibacterium acnes

Stafilococchi Coagulasi Negativi

S aureus

S pneumoniae

Enterobacteriaceae

P aeruginosa

C albicans

probabilitagrave post-test n positivi n colture

confrontare antibiogrammi confrontare genotipi

probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente

protesi evidenza clinica

Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7

Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo

Catetere venoso centrale

I CATETERI

sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono

monitoraggio di parametri vitali

somministrazione di nutrienti e di farmaci

Siti di inserzione

e tipologie doppio triplo lume

tunnellizzati e non impregnati e non

con diversi gauge

Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata

biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche

morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole

inserzione transcutanea

CRBSI

Catheter Related Blood Stream Infection

Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere

Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione

Mermel LA Clin Infect Dis 2001

Sepsi CVC-correlata

- definizione -

Infezioni nei portatori di CVC

Emocoltura quantitativa

da catetere centrale da vena periferica

bull Prelievo contemporaneo

bull Volume uguale

bull Incubazione contemporanea

DTP gt120 minuti

Sepsi CVC correlata

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Sistema

totalmente

impiantabile

Condizioni

generali

scadute

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

NO

NO

SI

SI

Emocoltura

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Emocoltura

Germi resistenti

Miceti

Germi sensibili

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Non

efficace

Trombolisi

Efficace

NO SI

Risposta alla terapia

Negativa Positiva

Permanenza

del catetere

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE

REPARTI chirurgie

neurochirurgia nefrologia+centro trapianti

pediatria rianimazione neonatologia

medicine

geriatria

Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259

Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012

2

48 43

2 5

bb+

bb-

cocchi+

anaerobi

lieviti

Molecular diagnosis

LightCycler SeptiFast Test

bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici

bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo

45

Bacterial Lysis amp

DNA Extraction

Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) bull Staphylococcus aureus

bull CoNS

bull Streptococcus pneumoniae

bull Streptococcus spp

bull Enterococcus faecium

bull Enterococcus faecalis

Fungi bull Candida (albicans

tropicalis

parapsilosis)

bull Candida (krusei glabrata)

bull Aspergillus (fumigatus)

PCR Analysis

MRSA (mecA)

VRE (van A B)

Sample Preparation

Sample whole blood

Septifast Analytical Concept

TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA

Rilevabili mediante PCR

Rilevabili mediante coltura

DNA batterico libero

Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati

Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

What is the optimal volume

of blood for culture

Blood from patients with IE contains 1

to 10 bacteria per mL

There is approximately linear

relationship between the yield of

bacteria from blood and the volume of

blood

ldquoThe volume of blood sample drawn

should be 40-60 mlrdquo

Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002

23

24

The microbiological diagnosis

TAT

Emocoltura analitica

BACTEC 9240

Strumento modulare

Incubatore Agitatore Lettore

I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer

Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo

I flaconi sono inseriti nello strumento

BACTEC 9240

FASE PRE-ANALITICA

INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO

Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da

Emocoltura positiva

Interpretazione del risultato

RUOLO PATOGENO

DEL MICRORGANISMO

ISOLATO

IDENTIFICAZIONE

DEI MICROORGANISMI

CONTAMINANTI

29

Batteriemia significativa

Improbabile Incerta Probabile

Corynebacterium spp

Non-anthracis Bacillus spp

Propionibacterium acnes

Stafilococchi Coagulasi Negativi

S aureus

S pneumoniae

Enterobacteriaceae

P aeruginosa

C albicans

probabilitagrave post-test n positivi n colture

confrontare antibiogrammi confrontare genotipi

probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente

protesi evidenza clinica

Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7

Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo

Catetere venoso centrale

I CATETERI

sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono

monitoraggio di parametri vitali

somministrazione di nutrienti e di farmaci

Siti di inserzione

e tipologie doppio triplo lume

tunnellizzati e non impregnati e non

con diversi gauge

Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata

biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche

morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole

inserzione transcutanea

CRBSI

Catheter Related Blood Stream Infection

Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere

Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione

Mermel LA Clin Infect Dis 2001

Sepsi CVC-correlata

- definizione -

Infezioni nei portatori di CVC

Emocoltura quantitativa

da catetere centrale da vena periferica

bull Prelievo contemporaneo

bull Volume uguale

bull Incubazione contemporanea

DTP gt120 minuti

Sepsi CVC correlata

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Sistema

totalmente

impiantabile

Condizioni

generali

scadute

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

NO

NO

SI

SI

Emocoltura

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Emocoltura

Germi resistenti

Miceti

Germi sensibili

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Non

efficace

Trombolisi

Efficace

NO SI

Risposta alla terapia

Negativa Positiva

Permanenza

del catetere

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE

REPARTI chirurgie

neurochirurgia nefrologia+centro trapianti

pediatria rianimazione neonatologia

medicine

geriatria

Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259

Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012

2

48 43

2 5

bb+

bb-

cocchi+

anaerobi

lieviti

Molecular diagnosis

LightCycler SeptiFast Test

bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici

bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo

45

Bacterial Lysis amp

DNA Extraction

Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) bull Staphylococcus aureus

bull CoNS

bull Streptococcus pneumoniae

bull Streptococcus spp

bull Enterococcus faecium

bull Enterococcus faecalis

Fungi bull Candida (albicans

tropicalis

parapsilosis)

bull Candida (krusei glabrata)

bull Aspergillus (fumigatus)

PCR Analysis

MRSA (mecA)

VRE (van A B)

Sample Preparation

Sample whole blood

Septifast Analytical Concept

TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA

Rilevabili mediante PCR

Rilevabili mediante coltura

DNA batterico libero

Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati

Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

24

The microbiological diagnosis

TAT

Emocoltura analitica

BACTEC 9240

Strumento modulare

Incubatore Agitatore Lettore

I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer

Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo

I flaconi sono inseriti nello strumento

BACTEC 9240

FASE PRE-ANALITICA

INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO

Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da

Emocoltura positiva

Interpretazione del risultato

RUOLO PATOGENO

DEL MICRORGANISMO

ISOLATO

IDENTIFICAZIONE

DEI MICROORGANISMI

CONTAMINANTI

29

Batteriemia significativa

Improbabile Incerta Probabile

Corynebacterium spp

Non-anthracis Bacillus spp

Propionibacterium acnes

Stafilococchi Coagulasi Negativi

S aureus

S pneumoniae

Enterobacteriaceae

P aeruginosa

C albicans

probabilitagrave post-test n positivi n colture

confrontare antibiogrammi confrontare genotipi

probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente

protesi evidenza clinica

Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7

Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo

Catetere venoso centrale

I CATETERI

sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono

monitoraggio di parametri vitali

somministrazione di nutrienti e di farmaci

Siti di inserzione

e tipologie doppio triplo lume

tunnellizzati e non impregnati e non

con diversi gauge

Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata

biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche

morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole

inserzione transcutanea

CRBSI

Catheter Related Blood Stream Infection

Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere

Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione

Mermel LA Clin Infect Dis 2001

Sepsi CVC-correlata

- definizione -

Infezioni nei portatori di CVC

Emocoltura quantitativa

da catetere centrale da vena periferica

bull Prelievo contemporaneo

bull Volume uguale

bull Incubazione contemporanea

DTP gt120 minuti

Sepsi CVC correlata

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Sistema

totalmente

impiantabile

Condizioni

generali

scadute

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

NO

NO

SI

SI

Emocoltura

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Emocoltura

Germi resistenti

Miceti

Germi sensibili

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Non

efficace

Trombolisi

Efficace

NO SI

Risposta alla terapia

Negativa Positiva

Permanenza

del catetere

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE

REPARTI chirurgie

neurochirurgia nefrologia+centro trapianti

pediatria rianimazione neonatologia

medicine

geriatria

Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259

Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012

2

48 43

2 5

bb+

bb-

cocchi+

anaerobi

lieviti

Molecular diagnosis

LightCycler SeptiFast Test

bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici

bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo

45

Bacterial Lysis amp

DNA Extraction

Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) bull Staphylococcus aureus

bull CoNS

bull Streptococcus pneumoniae

bull Streptococcus spp

bull Enterococcus faecium

bull Enterococcus faecalis

Fungi bull Candida (albicans

tropicalis

parapsilosis)

bull Candida (krusei glabrata)

bull Aspergillus (fumigatus)

PCR Analysis

MRSA (mecA)

VRE (van A B)

Sample Preparation

Sample whole blood

Septifast Analytical Concept

TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA

Rilevabili mediante PCR

Rilevabili mediante coltura

DNA batterico libero

Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati

Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

BACTEC 9240

Strumento modulare

Incubatore Agitatore Lettore

I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer

Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo

I flaconi sono inseriti nello strumento

BACTEC 9240

FASE PRE-ANALITICA

INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO

Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da

Emocoltura positiva

Interpretazione del risultato

RUOLO PATOGENO

DEL MICRORGANISMO

ISOLATO

IDENTIFICAZIONE

DEI MICROORGANISMI

CONTAMINANTI

29

Batteriemia significativa

Improbabile Incerta Probabile

Corynebacterium spp

Non-anthracis Bacillus spp

Propionibacterium acnes

Stafilococchi Coagulasi Negativi

S aureus

S pneumoniae

Enterobacteriaceae

P aeruginosa

C albicans

probabilitagrave post-test n positivi n colture

confrontare antibiogrammi confrontare genotipi

probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente

protesi evidenza clinica

Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7

Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo

Catetere venoso centrale

I CATETERI

sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono

monitoraggio di parametri vitali

somministrazione di nutrienti e di farmaci

Siti di inserzione

e tipologie doppio triplo lume

tunnellizzati e non impregnati e non

con diversi gauge

Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata

biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche

morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole

inserzione transcutanea

CRBSI

Catheter Related Blood Stream Infection

Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere

Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione

Mermel LA Clin Infect Dis 2001

Sepsi CVC-correlata

- definizione -

Infezioni nei portatori di CVC

Emocoltura quantitativa

da catetere centrale da vena periferica

bull Prelievo contemporaneo

bull Volume uguale

bull Incubazione contemporanea

DTP gt120 minuti

Sepsi CVC correlata

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Sistema

totalmente

impiantabile

Condizioni

generali

scadute

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

NO

NO

SI

SI

Emocoltura

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Emocoltura

Germi resistenti

Miceti

Germi sensibili

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Non

efficace

Trombolisi

Efficace

NO SI

Risposta alla terapia

Negativa Positiva

Permanenza

del catetere

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE

REPARTI chirurgie

neurochirurgia nefrologia+centro trapianti

pediatria rianimazione neonatologia

medicine

geriatria

Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259

Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012

2

48 43

2 5

bb+

bb-

cocchi+

anaerobi

lieviti

Molecular diagnosis

LightCycler SeptiFast Test

bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici

bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo

45

Bacterial Lysis amp

DNA Extraction

Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) bull Staphylococcus aureus

bull CoNS

bull Streptococcus pneumoniae

bull Streptococcus spp

bull Enterococcus faecium

bull Enterococcus faecalis

Fungi bull Candida (albicans

tropicalis

parapsilosis)

bull Candida (krusei glabrata)

bull Aspergillus (fumigatus)

PCR Analysis

MRSA (mecA)

VRE (van A B)

Sample Preparation

Sample whole blood

Septifast Analytical Concept

TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA

Rilevabili mediante PCR

Rilevabili mediante coltura

DNA batterico libero

Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati

Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer

Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo

I flaconi sono inseriti nello strumento

BACTEC 9240

FASE PRE-ANALITICA

INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO

Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da

Emocoltura positiva

Interpretazione del risultato

RUOLO PATOGENO

DEL MICRORGANISMO

ISOLATO

IDENTIFICAZIONE

DEI MICROORGANISMI

CONTAMINANTI

29

Batteriemia significativa

Improbabile Incerta Probabile

Corynebacterium spp

Non-anthracis Bacillus spp

Propionibacterium acnes

Stafilococchi Coagulasi Negativi

S aureus

S pneumoniae

Enterobacteriaceae

P aeruginosa

C albicans

probabilitagrave post-test n positivi n colture

confrontare antibiogrammi confrontare genotipi

probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente

protesi evidenza clinica

Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7

Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo

Catetere venoso centrale

I CATETERI

sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono

monitoraggio di parametri vitali

somministrazione di nutrienti e di farmaci

Siti di inserzione

e tipologie doppio triplo lume

tunnellizzati e non impregnati e non

con diversi gauge

Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata

biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche

morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole

inserzione transcutanea

CRBSI

Catheter Related Blood Stream Infection

Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere

Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione

Mermel LA Clin Infect Dis 2001

Sepsi CVC-correlata

- definizione -

Infezioni nei portatori di CVC

Emocoltura quantitativa

da catetere centrale da vena periferica

bull Prelievo contemporaneo

bull Volume uguale

bull Incubazione contemporanea

DTP gt120 minuti

Sepsi CVC correlata

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Sistema

totalmente

impiantabile

Condizioni

generali

scadute

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

NO

NO

SI

SI

Emocoltura

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Emocoltura

Germi resistenti

Miceti

Germi sensibili

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Non

efficace

Trombolisi

Efficace

NO SI

Risposta alla terapia

Negativa Positiva

Permanenza

del catetere

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE

REPARTI chirurgie

neurochirurgia nefrologia+centro trapianti

pediatria rianimazione neonatologia

medicine

geriatria

Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259

Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012

2

48 43

2 5

bb+

bb-

cocchi+

anaerobi

lieviti

Molecular diagnosis

LightCycler SeptiFast Test

bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici

bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo

45

Bacterial Lysis amp

DNA Extraction

Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) bull Staphylococcus aureus

bull CoNS

bull Streptococcus pneumoniae

bull Streptococcus spp

bull Enterococcus faecium

bull Enterococcus faecalis

Fungi bull Candida (albicans

tropicalis

parapsilosis)

bull Candida (krusei glabrata)

bull Aspergillus (fumigatus)

PCR Analysis

MRSA (mecA)

VRE (van A B)

Sample Preparation

Sample whole blood

Septifast Analytical Concept

TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA

Rilevabili mediante PCR

Rilevabili mediante coltura

DNA batterico libero

Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati

Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

FASE PRE-ANALITICA

INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO

Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da

Emocoltura positiva

Interpretazione del risultato

RUOLO PATOGENO

DEL MICRORGANISMO

ISOLATO

IDENTIFICAZIONE

DEI MICROORGANISMI

CONTAMINANTI

29

Batteriemia significativa

Improbabile Incerta Probabile

Corynebacterium spp

Non-anthracis Bacillus spp

Propionibacterium acnes

Stafilococchi Coagulasi Negativi

S aureus

S pneumoniae

Enterobacteriaceae

P aeruginosa

C albicans

probabilitagrave post-test n positivi n colture

confrontare antibiogrammi confrontare genotipi

probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente

protesi evidenza clinica

Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7

Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo

Catetere venoso centrale

I CATETERI

sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono

monitoraggio di parametri vitali

somministrazione di nutrienti e di farmaci

Siti di inserzione

e tipologie doppio triplo lume

tunnellizzati e non impregnati e non

con diversi gauge

Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata

biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche

morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole

inserzione transcutanea

CRBSI

Catheter Related Blood Stream Infection

Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere

Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione

Mermel LA Clin Infect Dis 2001

Sepsi CVC-correlata

- definizione -

Infezioni nei portatori di CVC

Emocoltura quantitativa

da catetere centrale da vena periferica

bull Prelievo contemporaneo

bull Volume uguale

bull Incubazione contemporanea

DTP gt120 minuti

Sepsi CVC correlata

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Sistema

totalmente

impiantabile

Condizioni

generali

scadute

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

NO

NO

SI

SI

Emocoltura

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Emocoltura

Germi resistenti

Miceti

Germi sensibili

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Non

efficace

Trombolisi

Efficace

NO SI

Risposta alla terapia

Negativa Positiva

Permanenza

del catetere

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE

REPARTI chirurgie

neurochirurgia nefrologia+centro trapianti

pediatria rianimazione neonatologia

medicine

geriatria

Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259

Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012

2

48 43

2 5

bb+

bb-

cocchi+

anaerobi

lieviti

Molecular diagnosis

LightCycler SeptiFast Test

bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici

bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo

45

Bacterial Lysis amp

DNA Extraction

Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) bull Staphylococcus aureus

bull CoNS

bull Streptococcus pneumoniae

bull Streptococcus spp

bull Enterococcus faecium

bull Enterococcus faecalis

Fungi bull Candida (albicans

tropicalis

parapsilosis)

bull Candida (krusei glabrata)

bull Aspergillus (fumigatus)

PCR Analysis

MRSA (mecA)

VRE (van A B)

Sample Preparation

Sample whole blood

Septifast Analytical Concept

TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA

Rilevabili mediante PCR

Rilevabili mediante coltura

DNA batterico libero

Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati

Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

Emocoltura positiva

Interpretazione del risultato

RUOLO PATOGENO

DEL MICRORGANISMO

ISOLATO

IDENTIFICAZIONE

DEI MICROORGANISMI

CONTAMINANTI

29

Batteriemia significativa

Improbabile Incerta Probabile

Corynebacterium spp

Non-anthracis Bacillus spp

Propionibacterium acnes

Stafilococchi Coagulasi Negativi

S aureus

S pneumoniae

Enterobacteriaceae

P aeruginosa

C albicans

probabilitagrave post-test n positivi n colture

confrontare antibiogrammi confrontare genotipi

probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente

protesi evidenza clinica

Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7

Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo

Catetere venoso centrale

I CATETERI

sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono

monitoraggio di parametri vitali

somministrazione di nutrienti e di farmaci

Siti di inserzione

e tipologie doppio triplo lume

tunnellizzati e non impregnati e non

con diversi gauge

Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata

biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche

morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole

inserzione transcutanea

CRBSI

Catheter Related Blood Stream Infection

Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere

Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione

Mermel LA Clin Infect Dis 2001

Sepsi CVC-correlata

- definizione -

Infezioni nei portatori di CVC

Emocoltura quantitativa

da catetere centrale da vena periferica

bull Prelievo contemporaneo

bull Volume uguale

bull Incubazione contemporanea

DTP gt120 minuti

Sepsi CVC correlata

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Sistema

totalmente

impiantabile

Condizioni

generali

scadute

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

NO

NO

SI

SI

Emocoltura

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Emocoltura

Germi resistenti

Miceti

Germi sensibili

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Non

efficace

Trombolisi

Efficace

NO SI

Risposta alla terapia

Negativa Positiva

Permanenza

del catetere

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE

REPARTI chirurgie

neurochirurgia nefrologia+centro trapianti

pediatria rianimazione neonatologia

medicine

geriatria

Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259

Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012

2

48 43

2 5

bb+

bb-

cocchi+

anaerobi

lieviti

Molecular diagnosis

LightCycler SeptiFast Test

bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici

bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo

45

Bacterial Lysis amp

DNA Extraction

Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) bull Staphylococcus aureus

bull CoNS

bull Streptococcus pneumoniae

bull Streptococcus spp

bull Enterococcus faecium

bull Enterococcus faecalis

Fungi bull Candida (albicans

tropicalis

parapsilosis)

bull Candida (krusei glabrata)

bull Aspergillus (fumigatus)

PCR Analysis

MRSA (mecA)

VRE (van A B)

Sample Preparation

Sample whole blood

Septifast Analytical Concept

TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA

Rilevabili mediante PCR

Rilevabili mediante coltura

DNA batterico libero

Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati

Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

29

Batteriemia significativa

Improbabile Incerta Probabile

Corynebacterium spp

Non-anthracis Bacillus spp

Propionibacterium acnes

Stafilococchi Coagulasi Negativi

S aureus

S pneumoniae

Enterobacteriaceae

P aeruginosa

C albicans

probabilitagrave post-test n positivi n colture

confrontare antibiogrammi confrontare genotipi

probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente

protesi evidenza clinica

Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7

Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo

Catetere venoso centrale

I CATETERI

sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono

monitoraggio di parametri vitali

somministrazione di nutrienti e di farmaci

Siti di inserzione

e tipologie doppio triplo lume

tunnellizzati e non impregnati e non

con diversi gauge

Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata

biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche

morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole

inserzione transcutanea

CRBSI

Catheter Related Blood Stream Infection

Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere

Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione

Mermel LA Clin Infect Dis 2001

Sepsi CVC-correlata

- definizione -

Infezioni nei portatori di CVC

Emocoltura quantitativa

da catetere centrale da vena periferica

bull Prelievo contemporaneo

bull Volume uguale

bull Incubazione contemporanea

DTP gt120 minuti

Sepsi CVC correlata

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Sistema

totalmente

impiantabile

Condizioni

generali

scadute

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

NO

NO

SI

SI

Emocoltura

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Emocoltura

Germi resistenti

Miceti

Germi sensibili

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Non

efficace

Trombolisi

Efficace

NO SI

Risposta alla terapia

Negativa Positiva

Permanenza

del catetere

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE

REPARTI chirurgie

neurochirurgia nefrologia+centro trapianti

pediatria rianimazione neonatologia

medicine

geriatria

Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259

Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012

2

48 43

2 5

bb+

bb-

cocchi+

anaerobi

lieviti

Molecular diagnosis

LightCycler SeptiFast Test

bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici

bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo

45

Bacterial Lysis amp

DNA Extraction

Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) bull Staphylococcus aureus

bull CoNS

bull Streptococcus pneumoniae

bull Streptococcus spp

bull Enterococcus faecium

bull Enterococcus faecalis

Fungi bull Candida (albicans

tropicalis

parapsilosis)

bull Candida (krusei glabrata)

bull Aspergillus (fumigatus)

PCR Analysis

MRSA (mecA)

VRE (van A B)

Sample Preparation

Sample whole blood

Septifast Analytical Concept

TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA

Rilevabili mediante PCR

Rilevabili mediante coltura

DNA batterico libero

Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati

Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

Catetere venoso centrale

I CATETERI

sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono

monitoraggio di parametri vitali

somministrazione di nutrienti e di farmaci

Siti di inserzione

e tipologie doppio triplo lume

tunnellizzati e non impregnati e non

con diversi gauge

Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata

biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche

morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole

inserzione transcutanea

CRBSI

Catheter Related Blood Stream Infection

Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere

Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione

Mermel LA Clin Infect Dis 2001

Sepsi CVC-correlata

- definizione -

Infezioni nei portatori di CVC

Emocoltura quantitativa

da catetere centrale da vena periferica

bull Prelievo contemporaneo

bull Volume uguale

bull Incubazione contemporanea

DTP gt120 minuti

Sepsi CVC correlata

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Sistema

totalmente

impiantabile

Condizioni

generali

scadute

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

NO

NO

SI

SI

Emocoltura

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Emocoltura

Germi resistenti

Miceti

Germi sensibili

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Non

efficace

Trombolisi

Efficace

NO SI

Risposta alla terapia

Negativa Positiva

Permanenza

del catetere

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE

REPARTI chirurgie

neurochirurgia nefrologia+centro trapianti

pediatria rianimazione neonatologia

medicine

geriatria

Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259

Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012

2

48 43

2 5

bb+

bb-

cocchi+

anaerobi

lieviti

Molecular diagnosis

LightCycler SeptiFast Test

bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici

bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo

45

Bacterial Lysis amp

DNA Extraction

Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) bull Staphylococcus aureus

bull CoNS

bull Streptococcus pneumoniae

bull Streptococcus spp

bull Enterococcus faecium

bull Enterococcus faecalis

Fungi bull Candida (albicans

tropicalis

parapsilosis)

bull Candida (krusei glabrata)

bull Aspergillus (fumigatus)

PCR Analysis

MRSA (mecA)

VRE (van A B)

Sample Preparation

Sample whole blood

Septifast Analytical Concept

TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA

Rilevabili mediante PCR

Rilevabili mediante coltura

DNA batterico libero

Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati

Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

I CATETERI

sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono

monitoraggio di parametri vitali

somministrazione di nutrienti e di farmaci

Siti di inserzione

e tipologie doppio triplo lume

tunnellizzati e non impregnati e non

con diversi gauge

Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata

biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche

morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole

inserzione transcutanea

CRBSI

Catheter Related Blood Stream Infection

Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere

Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione

Mermel LA Clin Infect Dis 2001

Sepsi CVC-correlata

- definizione -

Infezioni nei portatori di CVC

Emocoltura quantitativa

da catetere centrale da vena periferica

bull Prelievo contemporaneo

bull Volume uguale

bull Incubazione contemporanea

DTP gt120 minuti

Sepsi CVC correlata

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Sistema

totalmente

impiantabile

Condizioni

generali

scadute

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

NO

NO

SI

SI

Emocoltura

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Emocoltura

Germi resistenti

Miceti

Germi sensibili

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Non

efficace

Trombolisi

Efficace

NO SI

Risposta alla terapia

Negativa Positiva

Permanenza

del catetere

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE

REPARTI chirurgie

neurochirurgia nefrologia+centro trapianti

pediatria rianimazione neonatologia

medicine

geriatria

Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259

Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012

2

48 43

2 5

bb+

bb-

cocchi+

anaerobi

lieviti

Molecular diagnosis

LightCycler SeptiFast Test

bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici

bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo

45

Bacterial Lysis amp

DNA Extraction

Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) bull Staphylococcus aureus

bull CoNS

bull Streptococcus pneumoniae

bull Streptococcus spp

bull Enterococcus faecium

bull Enterococcus faecalis

Fungi bull Candida (albicans

tropicalis

parapsilosis)

bull Candida (krusei glabrata)

bull Aspergillus (fumigatus)

PCR Analysis

MRSA (mecA)

VRE (van A B)

Sample Preparation

Sample whole blood

Septifast Analytical Concept

TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA

Rilevabili mediante PCR

Rilevabili mediante coltura

DNA batterico libero

Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati

Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

Siti di inserzione

e tipologie doppio triplo lume

tunnellizzati e non impregnati e non

con diversi gauge

Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata

biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche

morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole

inserzione transcutanea

CRBSI

Catheter Related Blood Stream Infection

Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere

Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione

Mermel LA Clin Infect Dis 2001

Sepsi CVC-correlata

- definizione -

Infezioni nei portatori di CVC

Emocoltura quantitativa

da catetere centrale da vena periferica

bull Prelievo contemporaneo

bull Volume uguale

bull Incubazione contemporanea

DTP gt120 minuti

Sepsi CVC correlata

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Sistema

totalmente

impiantabile

Condizioni

generali

scadute

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

NO

NO

SI

SI

Emocoltura

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Emocoltura

Germi resistenti

Miceti

Germi sensibili

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Non

efficace

Trombolisi

Efficace

NO SI

Risposta alla terapia

Negativa Positiva

Permanenza

del catetere

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE

REPARTI chirurgie

neurochirurgia nefrologia+centro trapianti

pediatria rianimazione neonatologia

medicine

geriatria

Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259

Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012

2

48 43

2 5

bb+

bb-

cocchi+

anaerobi

lieviti

Molecular diagnosis

LightCycler SeptiFast Test

bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici

bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo

45

Bacterial Lysis amp

DNA Extraction

Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) bull Staphylococcus aureus

bull CoNS

bull Streptococcus pneumoniae

bull Streptococcus spp

bull Enterococcus faecium

bull Enterococcus faecalis

Fungi bull Candida (albicans

tropicalis

parapsilosis)

bull Candida (krusei glabrata)

bull Aspergillus (fumigatus)

PCR Analysis

MRSA (mecA)

VRE (van A B)

Sample Preparation

Sample whole blood

Septifast Analytical Concept

TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA

Rilevabili mediante PCR

Rilevabili mediante coltura

DNA batterico libero

Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati

Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

CRBSI

Catheter Related Blood Stream Infection

Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere

Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione

Mermel LA Clin Infect Dis 2001

Sepsi CVC-correlata

- definizione -

Infezioni nei portatori di CVC

Emocoltura quantitativa

da catetere centrale da vena periferica

bull Prelievo contemporaneo

bull Volume uguale

bull Incubazione contemporanea

DTP gt120 minuti

Sepsi CVC correlata

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Sistema

totalmente

impiantabile

Condizioni

generali

scadute

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

NO

NO

SI

SI

Emocoltura

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Emocoltura

Germi resistenti

Miceti

Germi sensibili

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Non

efficace

Trombolisi

Efficace

NO SI

Risposta alla terapia

Negativa Positiva

Permanenza

del catetere

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE

REPARTI chirurgie

neurochirurgia nefrologia+centro trapianti

pediatria rianimazione neonatologia

medicine

geriatria

Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259

Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012

2

48 43

2 5

bb+

bb-

cocchi+

anaerobi

lieviti

Molecular diagnosis

LightCycler SeptiFast Test

bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici

bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo

45

Bacterial Lysis amp

DNA Extraction

Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) bull Staphylococcus aureus

bull CoNS

bull Streptococcus pneumoniae

bull Streptococcus spp

bull Enterococcus faecium

bull Enterococcus faecalis

Fungi bull Candida (albicans

tropicalis

parapsilosis)

bull Candida (krusei glabrata)

bull Aspergillus (fumigatus)

PCR Analysis

MRSA (mecA)

VRE (van A B)

Sample Preparation

Sample whole blood

Septifast Analytical Concept

TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA

Rilevabili mediante PCR

Rilevabili mediante coltura

DNA batterico libero

Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati

Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione

Mermel LA Clin Infect Dis 2001

Sepsi CVC-correlata

- definizione -

Infezioni nei portatori di CVC

Emocoltura quantitativa

da catetere centrale da vena periferica

bull Prelievo contemporaneo

bull Volume uguale

bull Incubazione contemporanea

DTP gt120 minuti

Sepsi CVC correlata

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Sistema

totalmente

impiantabile

Condizioni

generali

scadute

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

NO

NO

SI

SI

Emocoltura

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Emocoltura

Germi resistenti

Miceti

Germi sensibili

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Non

efficace

Trombolisi

Efficace

NO SI

Risposta alla terapia

Negativa Positiva

Permanenza

del catetere

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE

REPARTI chirurgie

neurochirurgia nefrologia+centro trapianti

pediatria rianimazione neonatologia

medicine

geriatria

Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259

Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012

2

48 43

2 5

bb+

bb-

cocchi+

anaerobi

lieviti

Molecular diagnosis

LightCycler SeptiFast Test

bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici

bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo

45

Bacterial Lysis amp

DNA Extraction

Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) bull Staphylococcus aureus

bull CoNS

bull Streptococcus pneumoniae

bull Streptococcus spp

bull Enterococcus faecium

bull Enterococcus faecalis

Fungi bull Candida (albicans

tropicalis

parapsilosis)

bull Candida (krusei glabrata)

bull Aspergillus (fumigatus)

PCR Analysis

MRSA (mecA)

VRE (van A B)

Sample Preparation

Sample whole blood

Septifast Analytical Concept

TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA

Rilevabili mediante PCR

Rilevabili mediante coltura

DNA batterico libero

Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati

Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

Infezioni nei portatori di CVC

Emocoltura quantitativa

da catetere centrale da vena periferica

bull Prelievo contemporaneo

bull Volume uguale

bull Incubazione contemporanea

DTP gt120 minuti

Sepsi CVC correlata

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Sistema

totalmente

impiantabile

Condizioni

generali

scadute

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

NO

NO

SI

SI

Emocoltura

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Emocoltura

Germi resistenti

Miceti

Germi sensibili

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Non

efficace

Trombolisi

Efficace

NO SI

Risposta alla terapia

Negativa Positiva

Permanenza

del catetere

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE

REPARTI chirurgie

neurochirurgia nefrologia+centro trapianti

pediatria rianimazione neonatologia

medicine

geriatria

Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259

Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012

2

48 43

2 5

bb+

bb-

cocchi+

anaerobi

lieviti

Molecular diagnosis

LightCycler SeptiFast Test

bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici

bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo

45

Bacterial Lysis amp

DNA Extraction

Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) bull Staphylococcus aureus

bull CoNS

bull Streptococcus pneumoniae

bull Streptococcus spp

bull Enterococcus faecium

bull Enterococcus faecalis

Fungi bull Candida (albicans

tropicalis

parapsilosis)

bull Candida (krusei glabrata)

bull Aspergillus (fumigatus)

PCR Analysis

MRSA (mecA)

VRE (van A B)

Sample Preparation

Sample whole blood

Septifast Analytical Concept

TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA

Rilevabili mediante PCR

Rilevabili mediante coltura

DNA batterico libero

Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati

Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Sistema

totalmente

impiantabile

Condizioni

generali

scadute

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

NO

NO

SI

SI

Emocoltura

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Emocoltura

Germi resistenti

Miceti

Germi sensibili

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Non

efficace

Trombolisi

Efficace

NO SI

Risposta alla terapia

Negativa Positiva

Permanenza

del catetere

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE

REPARTI chirurgie

neurochirurgia nefrologia+centro trapianti

pediatria rianimazione neonatologia

medicine

geriatria

Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259

Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012

2

48 43

2 5

bb+

bb-

cocchi+

anaerobi

lieviti

Molecular diagnosis

LightCycler SeptiFast Test

bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici

bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo

45

Bacterial Lysis amp

DNA Extraction

Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) bull Staphylococcus aureus

bull CoNS

bull Streptococcus pneumoniae

bull Streptococcus spp

bull Enterococcus faecium

bull Enterococcus faecalis

Fungi bull Candida (albicans

tropicalis

parapsilosis)

bull Candida (krusei glabrata)

bull Aspergillus (fumigatus)

PCR Analysis

MRSA (mecA)

VRE (van A B)

Sample Preparation

Sample whole blood

Septifast Analytical Concept

TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA

Rilevabili mediante PCR

Rilevabili mediante coltura

DNA batterico libero

Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati

Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

Sistema

totalmente

impiantabile

Condizioni

generali

scadute

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

NO

NO

SI

SI

Emocoltura

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Emocoltura

Germi resistenti

Miceti

Germi sensibili

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Non

efficace

Trombolisi

Efficace

NO SI

Risposta alla terapia

Negativa Positiva

Permanenza

del catetere

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE

REPARTI chirurgie

neurochirurgia nefrologia+centro trapianti

pediatria rianimazione neonatologia

medicine

geriatria

Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259

Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012

2

48 43

2 5

bb+

bb-

cocchi+

anaerobi

lieviti

Molecular diagnosis

LightCycler SeptiFast Test

bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici

bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo

45

Bacterial Lysis amp

DNA Extraction

Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) bull Staphylococcus aureus

bull CoNS

bull Streptococcus pneumoniae

bull Streptococcus spp

bull Enterococcus faecium

bull Enterococcus faecalis

Fungi bull Candida (albicans

tropicalis

parapsilosis)

bull Candida (krusei glabrata)

bull Aspergillus (fumigatus)

PCR Analysis

MRSA (mecA)

VRE (van A B)

Sample Preparation

Sample whole blood

Septifast Analytical Concept

TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA

Rilevabili mediante PCR

Rilevabili mediante coltura

DNA batterico libero

Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati

Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

Terapia antibiotica

ad ampio spettro

Emocoltura

Germi resistenti

Miceti

Germi sensibili

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Non

efficace

Trombolisi

Efficace

NO SI

Risposta alla terapia

Negativa Positiva

Permanenza

del catetere

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE

REPARTI chirurgie

neurochirurgia nefrologia+centro trapianti

pediatria rianimazione neonatologia

medicine

geriatria

Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259

Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012

2

48 43

2 5

bb+

bb-

cocchi+

anaerobi

lieviti

Molecular diagnosis

LightCycler SeptiFast Test

bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici

bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo

45

Bacterial Lysis amp

DNA Extraction

Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) bull Staphylococcus aureus

bull CoNS

bull Streptococcus pneumoniae

bull Streptococcus spp

bull Enterococcus faecium

bull Enterococcus faecalis

Fungi bull Candida (albicans

tropicalis

parapsilosis)

bull Candida (krusei glabrata)

bull Aspergillus (fumigatus)

PCR Analysis

MRSA (mecA)

VRE (van A B)

Sample Preparation

Sample whole blood

Septifast Analytical Concept

TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA

Rilevabili mediante PCR

Rilevabili mediante coltura

DNA batterico libero

Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati

Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

Terapia mirata

Presenza di

trombo distale

Rimozione catetere

(Eventuale sostituzione)

Non

efficace

Trombolisi

Efficace

NO SI

Risposta alla terapia

Negativa Positiva

Permanenza

del catetere

SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE

REPARTI chirurgie

neurochirurgia nefrologia+centro trapianti

pediatria rianimazione neonatologia

medicine

geriatria

Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259

Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012

2

48 43

2 5

bb+

bb-

cocchi+

anaerobi

lieviti

Molecular diagnosis

LightCycler SeptiFast Test

bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici

bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo

45

Bacterial Lysis amp

DNA Extraction

Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) bull Staphylococcus aureus

bull CoNS

bull Streptococcus pneumoniae

bull Streptococcus spp

bull Enterococcus faecium

bull Enterococcus faecalis

Fungi bull Candida (albicans

tropicalis

parapsilosis)

bull Candida (krusei glabrata)

bull Aspergillus (fumigatus)

PCR Analysis

MRSA (mecA)

VRE (van A B)

Sample Preparation

Sample whole blood

Septifast Analytical Concept

TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA

Rilevabili mediante PCR

Rilevabili mediante coltura

DNA batterico libero

Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati

Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE

REPARTI chirurgie

neurochirurgia nefrologia+centro trapianti

pediatria rianimazione neonatologia

medicine

geriatria

Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259

Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012

2

48 43

2 5

bb+

bb-

cocchi+

anaerobi

lieviti

Molecular diagnosis

LightCycler SeptiFast Test

bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici

bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo

45

Bacterial Lysis amp

DNA Extraction

Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) bull Staphylococcus aureus

bull CoNS

bull Streptococcus pneumoniae

bull Streptococcus spp

bull Enterococcus faecium

bull Enterococcus faecalis

Fungi bull Candida (albicans

tropicalis

parapsilosis)

bull Candida (krusei glabrata)

bull Aspergillus (fumigatus)

PCR Analysis

MRSA (mecA)

VRE (van A B)

Sample Preparation

Sample whole blood

Septifast Analytical Concept

TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA

Rilevabili mediante PCR

Rilevabili mediante coltura

DNA batterico libero

Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati

Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012

2

48 43

2 5

bb+

bb-

cocchi+

anaerobi

lieviti

Molecular diagnosis

LightCycler SeptiFast Test

bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici

bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo

45

Bacterial Lysis amp

DNA Extraction

Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) bull Staphylococcus aureus

bull CoNS

bull Streptococcus pneumoniae

bull Streptococcus spp

bull Enterococcus faecium

bull Enterococcus faecalis

Fungi bull Candida (albicans

tropicalis

parapsilosis)

bull Candida (krusei glabrata)

bull Aspergillus (fumigatus)

PCR Analysis

MRSA (mecA)

VRE (van A B)

Sample Preparation

Sample whole blood

Septifast Analytical Concept

TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA

Rilevabili mediante PCR

Rilevabili mediante coltura

DNA batterico libero

Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati

Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

Molecular diagnosis

LightCycler SeptiFast Test

bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici

bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo

45

Bacterial Lysis amp

DNA Extraction

Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) bull Staphylococcus aureus

bull CoNS

bull Streptococcus pneumoniae

bull Streptococcus spp

bull Enterococcus faecium

bull Enterococcus faecalis

Fungi bull Candida (albicans

tropicalis

parapsilosis)

bull Candida (krusei glabrata)

bull Aspergillus (fumigatus)

PCR Analysis

MRSA (mecA)

VRE (van A B)

Sample Preparation

Sample whole blood

Septifast Analytical Concept

TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA

Rilevabili mediante PCR

Rilevabili mediante coltura

DNA batterico libero

Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati

Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

LightCycler SeptiFast Test

bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici

bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo

45

Bacterial Lysis amp

DNA Extraction

Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) bull Staphylococcus aureus

bull CoNS

bull Streptococcus pneumoniae

bull Streptococcus spp

bull Enterococcus faecium

bull Enterococcus faecalis

Fungi bull Candida (albicans

tropicalis

parapsilosis)

bull Candida (krusei glabrata)

bull Aspergillus (fumigatus)

PCR Analysis

MRSA (mecA)

VRE (van A B)

Sample Preparation

Sample whole blood

Septifast Analytical Concept

TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA

Rilevabili mediante PCR

Rilevabili mediante coltura

DNA batterico libero

Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati

Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

45

Bacterial Lysis amp

DNA Extraction

Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) bull Staphylococcus aureus

bull CoNS

bull Streptococcus pneumoniae

bull Streptococcus spp

bull Enterococcus faecium

bull Enterococcus faecalis

Fungi bull Candida (albicans

tropicalis

parapsilosis)

bull Candida (krusei glabrata)

bull Aspergillus (fumigatus)

PCR Analysis

MRSA (mecA)

VRE (van A B)

Sample Preparation

Sample whole blood

Septifast Analytical Concept

TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA

Rilevabili mediante PCR

Rilevabili mediante coltura

DNA batterico libero

Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati

Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA

Rilevabili mediante PCR

Rilevabili mediante coltura

DNA batterico libero

Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati

Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi

Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica

Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)

Per ogni paziente sono stati eseguiti esami

emocoltura

ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA

EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus

confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano

TOT septifast emocoltura

Concordanza Septifast ed emocoltura

K pneumoniae 6 6 (1) 5 833

E aerogenes cloacae 1 1 1 100

Ecoli 7 5 7 7140

Saureus 2 2 2 100

L monocytogenes 1 0 1 0

P mirabilis 1 1 1 100

P aeruginosa 1 1 1 100

E faecalis 1 1 0 0

A fumigatus 1 1 (2) 0 0

M morganii 1 0 1 0

P stuartii 1 0 1 0

Negativi 31 30 28 93

Risultati LightCycler SeptiFast

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico

bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico

bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico

bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT

Biomarkers non molecolari di sepsi

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

Conclusion

ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove

sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo

ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases

with a correlation of 68

In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60

in bacterial sepsisrdquo

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

Biomarkers non molecolari di sepsi

rilevamento di antigeni fungini

bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva

Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)

bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica

Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile

MACROARRAY

IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY

Substrato del Test

TECNOLOGIA

NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE

Empio di lettura

del Microarray

Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati

sono concordi viene prodotto il referto

eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization

MALDI-TOF-MS

Sample plate

Analyte molecules in matrix substance

Acceleration

grids

Drift tube Ion detector

Mass spectrum

Vacuum system

Vacuum

lock

Mass spectrum essentially reflects analyte molecules

Principle

Tecnologia FilmArray DID

102 pozzetti

In ogni pozzetto primer specie specifici

Tutti I target sono testati in 3 pozzetti

diversi

Per ogni pozzetto vengono generate curve

di Melting

Ecoli

Quando un campione egrave positivo

3 criteri

1) Almeno 2 su 3 devono

avere Curve Melting

specifiche

2) Curve Melting devono

cadere nella finestra

specifica

3) Curve Melting devono

essere significativamente

simili

Pannello per emocoltura Gram +

bull S aureus

bull S pyogenes

bull S agalactiae

bull S pneumoniae

bull Coagulase Neg Staph

bull Enterococcus spp

bull Streptococcus spp

bull L monocytogenes

Funghi

bull C albicansdubliniensis

bull C parapsiolosistropicalis

bull C glabrata

bull C krusei

Gram -

bull H influenzae

bull N meningitidis

bull P aeruginosa

bull E coli

bull A Spp

bull A baumannii

bull E Cloacae

bull Enteric spp Pan

bull K pneumoniae

bull K oxytoca

bull S marcescens

Resistenze

bull mecA

bull Van AB

bull KPC

Tempo necessario 1h

refertazione

Risultati definitivi

ID + ATB

72-96 h

Colonie

24 h

ID + ATB

24 ore

Colorazione

di Gram =gt 2 h

Test diretti

Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari

ID =gt 6-8 h

grazie

Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and

epidemiologic situation

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

Abiotrophia spp

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q

fever endocarditis

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

HACEK Organisms

bull Haemophilus species

bull Actinobacillus actinomycetemcomitas

bull Cardiobacterium hominis

bull Eikenella corrodens

bull Kingella species

Clinical

Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis

Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users

Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses

Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess

Infections frequently associated with dental procedure

Haemophilus IE

bull Cause up to 1 of IE

bull Of these

ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae

ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia

bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen

ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus

Actinobacillus Clinical

bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis

ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)

bull Also associated with gingivitis

ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes

bull IE infections

ndash 86 have underlying heart disease

ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)

ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases

Eikenella Clinical

bull Usually associated with mixed bacterial infections

bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries

bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)

bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers

ndash Most patients have underlying valve lesions

Kingella Clinical

bull Frequently associated with diseases in children

ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children

ndash Bacteremia in infants

ndash IE in school aged children and adults

bull Vary rapid progress is characteristic

ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection

Haemophilus Hints

bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus

ndash Also includes H paraphrophilus

bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments

bull Require 5-10 CO2

bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable

bull Colonies opaque granular amp yellow

bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable

Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans

bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs

bull Does not require X or V factors

bull Microaerophilic optimal temp 370 C

bull Colonies firm star shaped rough and pitting

bull Slime maybe produced colonies sticky

bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg

bull Floating colonies in TSB

Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum

bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters

bull May find some of these cells are gram +

bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially

ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2

ndash Optimal temp-----30 to 370 C

bull Colonies smooth opaque butyrous

bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg

Eikenella Hints

bull Monospecies corrodens

bull Straight unbranched non-spore forming

bull May take several days to grow bleach odor

bull Flat colonies maybe surrounded by spreading

ndash Pitting common yellow color in older cultures

ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen

ndash Optimal temperature 35-370 C

ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen

bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg

Kingella Hints

bull Three species--- kingae denitrificans oralis

bull Straight rods with rounded or square end

ndash Tendency to decolorize poorly

bull Two colony types Neither requiring X or V

ndash Spreading corroding

ndash Smooth convex

ndash Zone of beta hemolysis

bull Optimal temperature---33-370 C

bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg

HACEK Organisms

H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like

ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar

2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction

3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture

Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University

IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY

Substrato del Test

TECNOLOGIA

NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE

Empio di lettura

del Microarray

Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati

sono concordi viene prodotto il referto

eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization

MALDI-TOF-MS

Sample plate

Analyte molecules in matrix substance

Acceleration

grids

Drift tube Ion detector

Mass spectrum

Vacuum system

Vacuum

lock

Mass spectrum essentially reflects analyte molecules

Principle

Tecnologia FilmArray DID

102 pozzetti

In ogni pozzetto primer specie specifici

Tutti I target sono testati in 3 pozzetti

diversi

Per ogni pozzetto vengono generate curve

di Melting

Ecoli

Quando un campione egrave positivo

3 criteri

1) Almeno 2 su 3 devono

avere Curve Melting

specifiche

2) Curve Melting devono

cadere nella finestra

specifica

3) Curve Melting devono

essere significativamente

simili

Pannello per emocoltura Gram +

bull S aureus

bull S pyogenes

bull S agalactiae

bull S pneumoniae

bull Coagulase Neg Staph

bull Enterococcus spp

bull Streptococcus spp

bull L monocytogenes

Funghi

bull C albicansdubliniensis

bull C parapsiolosistropicalis

bull C glabrata

bull C krusei

Gram -

bull H influenzae

bull N meningitidis

bull P aeruginosa

bull E coli

bull A Spp

bull A baumannii

bull E Cloacae

bull Enteric spp Pan

bull K pneumoniae

bull K oxytoca

bull S marcescens

Resistenze

bull mecA

bull Van AB

bull KPC

Tempo necessario 1h

refertazione

Risultati definitivi

ID + ATB

72-96 h

Colonie

24 h

ID + ATB

24 ore

Colorazione

di Gram =gt 2 h

Test diretti

Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari

ID =gt 6-8 h

grazie

Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and

epidemiologic situation

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

Abiotrophia spp

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q

fever endocarditis

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

HACEK Organisms

bull Haemophilus species

bull Actinobacillus actinomycetemcomitas

bull Cardiobacterium hominis

bull Eikenella corrodens

bull Kingella species

Clinical

Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis

Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users

Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses

Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess

Infections frequently associated with dental procedure

Haemophilus IE

bull Cause up to 1 of IE

bull Of these

ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae

ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia

bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen

ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus

Actinobacillus Clinical

bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis

ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)

bull Also associated with gingivitis

ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes

bull IE infections

ndash 86 have underlying heart disease

ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)

ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases

Eikenella Clinical

bull Usually associated with mixed bacterial infections

bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries

bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)

bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers

ndash Most patients have underlying valve lesions

Kingella Clinical

bull Frequently associated with diseases in children

ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children

ndash Bacteremia in infants

ndash IE in school aged children and adults

bull Vary rapid progress is characteristic

ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection

Haemophilus Hints

bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus

ndash Also includes H paraphrophilus

bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments

bull Require 5-10 CO2

bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable

bull Colonies opaque granular amp yellow

bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable

Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans

bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs

bull Does not require X or V factors

bull Microaerophilic optimal temp 370 C

bull Colonies firm star shaped rough and pitting

bull Slime maybe produced colonies sticky

bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg

bull Floating colonies in TSB

Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum

bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters

bull May find some of these cells are gram +

bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially

ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2

ndash Optimal temp-----30 to 370 C

bull Colonies smooth opaque butyrous

bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg

Eikenella Hints

bull Monospecies corrodens

bull Straight unbranched non-spore forming

bull May take several days to grow bleach odor

bull Flat colonies maybe surrounded by spreading

ndash Pitting common yellow color in older cultures

ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen

ndash Optimal temperature 35-370 C

ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen

bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg

Kingella Hints

bull Three species--- kingae denitrificans oralis

bull Straight rods with rounded or square end

ndash Tendency to decolorize poorly

bull Two colony types Neither requiring X or V

ndash Spreading corroding

ndash Smooth convex

ndash Zone of beta hemolysis

bull Optimal temperature---33-370 C

bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg

HACEK Organisms

H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like

ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar

2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction

3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture

Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University

eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization

MALDI-TOF-MS

Sample plate

Analyte molecules in matrix substance

Acceleration

grids

Drift tube Ion detector

Mass spectrum

Vacuum system

Vacuum

lock

Mass spectrum essentially reflects analyte molecules

Principle

Tecnologia FilmArray DID

102 pozzetti

In ogni pozzetto primer specie specifici

Tutti I target sono testati in 3 pozzetti

diversi

Per ogni pozzetto vengono generate curve

di Melting

Ecoli

Quando un campione egrave positivo

3 criteri

1) Almeno 2 su 3 devono

avere Curve Melting

specifiche

2) Curve Melting devono

cadere nella finestra

specifica

3) Curve Melting devono

essere significativamente

simili

Pannello per emocoltura Gram +

bull S aureus

bull S pyogenes

bull S agalactiae

bull S pneumoniae

bull Coagulase Neg Staph

bull Enterococcus spp

bull Streptococcus spp

bull L monocytogenes

Funghi

bull C albicansdubliniensis

bull C parapsiolosistropicalis

bull C glabrata

bull C krusei

Gram -

bull H influenzae

bull N meningitidis

bull P aeruginosa

bull E coli

bull A Spp

bull A baumannii

bull E Cloacae

bull Enteric spp Pan

bull K pneumoniae

bull K oxytoca

bull S marcescens

Resistenze

bull mecA

bull Van AB

bull KPC

Tempo necessario 1h

refertazione

Risultati definitivi

ID + ATB

72-96 h

Colonie

24 h

ID + ATB

24 ore

Colorazione

di Gram =gt 2 h

Test diretti

Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari

ID =gt 6-8 h

grazie

Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and

epidemiologic situation

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207

Abiotrophia spp

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207

Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)

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207

Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q

fever endocarditis

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

HACEK Organisms

bull Haemophilus species

bull Actinobacillus actinomycetemcomitas

bull Cardiobacterium hominis

bull Eikenella corrodens

bull Kingella species

Clinical

Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis

Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users

Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses

Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess

Infections frequently associated with dental procedure

Haemophilus IE

bull Cause up to 1 of IE

bull Of these

ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae

ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia

bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen

ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus

Actinobacillus Clinical

bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis

ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)

bull Also associated with gingivitis

ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes

bull IE infections

ndash 86 have underlying heart disease

ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)

ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases

Eikenella Clinical

bull Usually associated with mixed bacterial infections

bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries

bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)

bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers

ndash Most patients have underlying valve lesions

Kingella Clinical

bull Frequently associated with diseases in children

ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children

ndash Bacteremia in infants

ndash IE in school aged children and adults

bull Vary rapid progress is characteristic

ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection

Haemophilus Hints

bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus

ndash Also includes H paraphrophilus

bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments

bull Require 5-10 CO2

bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable

bull Colonies opaque granular amp yellow

bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable

Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans

bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs

bull Does not require X or V factors

bull Microaerophilic optimal temp 370 C

bull Colonies firm star shaped rough and pitting

bull Slime maybe produced colonies sticky

bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg

bull Floating colonies in TSB

Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum

bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters

bull May find some of these cells are gram +

bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially

ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2

ndash Optimal temp-----30 to 370 C

bull Colonies smooth opaque butyrous

bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg

Eikenella Hints

bull Monospecies corrodens

bull Straight unbranched non-spore forming

bull May take several days to grow bleach odor

bull Flat colonies maybe surrounded by spreading

ndash Pitting common yellow color in older cultures

ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen

ndash Optimal temperature 35-370 C

ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen

bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg

Kingella Hints

bull Three species--- kingae denitrificans oralis

bull Straight rods with rounded or square end

ndash Tendency to decolorize poorly

bull Two colony types Neither requiring X or V

ndash Spreading corroding

ndash Smooth convex

ndash Zone of beta hemolysis

bull Optimal temperature---33-370 C

bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg

HACEK Organisms

H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like

ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar

2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction

3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture

Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University

MALDI-TOF-MS

Sample plate

Analyte molecules in matrix substance

Acceleration

grids

Drift tube Ion detector

Mass spectrum

Vacuum system

Vacuum

lock

Mass spectrum essentially reflects analyte molecules

Principle

Tecnologia FilmArray DID

102 pozzetti

In ogni pozzetto primer specie specifici

Tutti I target sono testati in 3 pozzetti

diversi

Per ogni pozzetto vengono generate curve

di Melting

Ecoli

Quando un campione egrave positivo

3 criteri

1) Almeno 2 su 3 devono

avere Curve Melting

specifiche

2) Curve Melting devono

cadere nella finestra

specifica

3) Curve Melting devono

essere significativamente

simili

Pannello per emocoltura Gram +

bull S aureus

bull S pyogenes

bull S agalactiae

bull S pneumoniae

bull Coagulase Neg Staph

bull Enterococcus spp

bull Streptococcus spp

bull L monocytogenes

Funghi

bull C albicansdubliniensis

bull C parapsiolosistropicalis

bull C glabrata

bull C krusei

Gram -

bull H influenzae

bull N meningitidis

bull P aeruginosa

bull E coli

bull A Spp

bull A baumannii

bull E Cloacae

bull Enteric spp Pan

bull K pneumoniae

bull K oxytoca

bull S marcescens

Resistenze

bull mecA

bull Van AB

bull KPC

Tempo necessario 1h

refertazione

Risultati definitivi

ID + ATB

72-96 h

Colonie

24 h

ID + ATB

24 ore

Colorazione

di Gram =gt 2 h

Test diretti

Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari

ID =gt 6-8 h

grazie

Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and

epidemiologic situation

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

Abiotrophia spp

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q

fever endocarditis

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

HACEK Organisms

bull Haemophilus species

bull Actinobacillus actinomycetemcomitas

bull Cardiobacterium hominis

bull Eikenella corrodens

bull Kingella species

Clinical

Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis

Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users

Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses

Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess

Infections frequently associated with dental procedure

Haemophilus IE

bull Cause up to 1 of IE

bull Of these

ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae

ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia

bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen

ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus

Actinobacillus Clinical

bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis

ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)

bull Also associated with gingivitis

ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes

bull IE infections

ndash 86 have underlying heart disease

ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)

ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases

Eikenella Clinical

bull Usually associated with mixed bacterial infections

bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries

bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)

bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers

ndash Most patients have underlying valve lesions

Kingella Clinical

bull Frequently associated with diseases in children

ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children

ndash Bacteremia in infants

ndash IE in school aged children and adults

bull Vary rapid progress is characteristic

ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection

Haemophilus Hints

bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus

ndash Also includes H paraphrophilus

bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments

bull Require 5-10 CO2

bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable

bull Colonies opaque granular amp yellow

bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable

Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans

bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs

bull Does not require X or V factors

bull Microaerophilic optimal temp 370 C

bull Colonies firm star shaped rough and pitting

bull Slime maybe produced colonies sticky

bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg

bull Floating colonies in TSB

Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum

bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters

bull May find some of these cells are gram +

bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially

ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2

ndash Optimal temp-----30 to 370 C

bull Colonies smooth opaque butyrous

bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg

Eikenella Hints

bull Monospecies corrodens

bull Straight unbranched non-spore forming

bull May take several days to grow bleach odor

bull Flat colonies maybe surrounded by spreading

ndash Pitting common yellow color in older cultures

ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen

ndash Optimal temperature 35-370 C

ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen

bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg

Kingella Hints

bull Three species--- kingae denitrificans oralis

bull Straight rods with rounded or square end

ndash Tendency to decolorize poorly

bull Two colony types Neither requiring X or V

ndash Spreading corroding

ndash Smooth convex

ndash Zone of beta hemolysis

bull Optimal temperature---33-370 C

bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg

HACEK Organisms

H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like

ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar

2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction

3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture

Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University

Tecnologia FilmArray DID

102 pozzetti

In ogni pozzetto primer specie specifici

Tutti I target sono testati in 3 pozzetti

diversi

Per ogni pozzetto vengono generate curve

di Melting

Ecoli

Quando un campione egrave positivo

3 criteri

1) Almeno 2 su 3 devono

avere Curve Melting

specifiche

2) Curve Melting devono

cadere nella finestra

specifica

3) Curve Melting devono

essere significativamente

simili

Pannello per emocoltura Gram +

bull S aureus

bull S pyogenes

bull S agalactiae

bull S pneumoniae

bull Coagulase Neg Staph

bull Enterococcus spp

bull Streptococcus spp

bull L monocytogenes

Funghi

bull C albicansdubliniensis

bull C parapsiolosistropicalis

bull C glabrata

bull C krusei

Gram -

bull H influenzae

bull N meningitidis

bull P aeruginosa

bull E coli

bull A Spp

bull A baumannii

bull E Cloacae

bull Enteric spp Pan

bull K pneumoniae

bull K oxytoca

bull S marcescens

Resistenze

bull mecA

bull Van AB

bull KPC

Tempo necessario 1h

refertazione

Risultati definitivi

ID + ATB

72-96 h

Colonie

24 h

ID + ATB

24 ore

Colorazione

di Gram =gt 2 h

Test diretti

Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari

ID =gt 6-8 h

grazie

Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and

epidemiologic situation

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

Abiotrophia spp

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q

fever endocarditis

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

HACEK Organisms

bull Haemophilus species

bull Actinobacillus actinomycetemcomitas

bull Cardiobacterium hominis

bull Eikenella corrodens

bull Kingella species

Clinical

Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis

Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users

Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses

Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess

Infections frequently associated with dental procedure

Haemophilus IE

bull Cause up to 1 of IE

bull Of these

ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae

ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia

bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen

ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus

Actinobacillus Clinical

bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis

ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)

bull Also associated with gingivitis

ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes

bull IE infections

ndash 86 have underlying heart disease

ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)

ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases

Eikenella Clinical

bull Usually associated with mixed bacterial infections

bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries

bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)

bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers

ndash Most patients have underlying valve lesions

Kingella Clinical

bull Frequently associated with diseases in children

ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children

ndash Bacteremia in infants

ndash IE in school aged children and adults

bull Vary rapid progress is characteristic

ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection

Haemophilus Hints

bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus

ndash Also includes H paraphrophilus

bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments

bull Require 5-10 CO2

bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable

bull Colonies opaque granular amp yellow

bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable

Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans

bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs

bull Does not require X or V factors

bull Microaerophilic optimal temp 370 C

bull Colonies firm star shaped rough and pitting

bull Slime maybe produced colonies sticky

bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg

bull Floating colonies in TSB

Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum

bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters

bull May find some of these cells are gram +

bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially

ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2

ndash Optimal temp-----30 to 370 C

bull Colonies smooth opaque butyrous

bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg

Eikenella Hints

bull Monospecies corrodens

bull Straight unbranched non-spore forming

bull May take several days to grow bleach odor

bull Flat colonies maybe surrounded by spreading

ndash Pitting common yellow color in older cultures

ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen

ndash Optimal temperature 35-370 C

ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen

bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg

Kingella Hints

bull Three species--- kingae denitrificans oralis

bull Straight rods with rounded or square end

ndash Tendency to decolorize poorly

bull Two colony types Neither requiring X or V

ndash Spreading corroding

ndash Smooth convex

ndash Zone of beta hemolysis

bull Optimal temperature---33-370 C

bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg

HACEK Organisms

H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like

ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar

2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction

3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture

Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University

102 pozzetti

In ogni pozzetto primer specie specifici

Tutti I target sono testati in 3 pozzetti

diversi

Per ogni pozzetto vengono generate curve

di Melting

Ecoli

Quando un campione egrave positivo

3 criteri

1) Almeno 2 su 3 devono

avere Curve Melting

specifiche

2) Curve Melting devono

cadere nella finestra

specifica

3) Curve Melting devono

essere significativamente

simili

Pannello per emocoltura Gram +

bull S aureus

bull S pyogenes

bull S agalactiae

bull S pneumoniae

bull Coagulase Neg Staph

bull Enterococcus spp

bull Streptococcus spp

bull L monocytogenes

Funghi

bull C albicansdubliniensis

bull C parapsiolosistropicalis

bull C glabrata

bull C krusei

Gram -

bull H influenzae

bull N meningitidis

bull P aeruginosa

bull E coli

bull A Spp

bull A baumannii

bull E Cloacae

bull Enteric spp Pan

bull K pneumoniae

bull K oxytoca

bull S marcescens

Resistenze

bull mecA

bull Van AB

bull KPC

Tempo necessario 1h

refertazione

Risultati definitivi

ID + ATB

72-96 h

Colonie

24 h

ID + ATB

24 ore

Colorazione

di Gram =gt 2 h

Test diretti

Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari

ID =gt 6-8 h

grazie

Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and

epidemiologic situation

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

Abiotrophia spp

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q

fever endocarditis

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

HACEK Organisms

bull Haemophilus species

bull Actinobacillus actinomycetemcomitas

bull Cardiobacterium hominis

bull Eikenella corrodens

bull Kingella species

Clinical

Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis

Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users

Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses

Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess

Infections frequently associated with dental procedure

Haemophilus IE

bull Cause up to 1 of IE

bull Of these

ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae

ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia

bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen

ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus

Actinobacillus Clinical

bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis

ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)

bull Also associated with gingivitis

ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes

bull IE infections

ndash 86 have underlying heart disease

ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)

ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases

Eikenella Clinical

bull Usually associated with mixed bacterial infections

bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries

bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)

bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers

ndash Most patients have underlying valve lesions

Kingella Clinical

bull Frequently associated with diseases in children

ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children

ndash Bacteremia in infants

ndash IE in school aged children and adults

bull Vary rapid progress is characteristic

ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection

Haemophilus Hints

bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus

ndash Also includes H paraphrophilus

bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments

bull Require 5-10 CO2

bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable

bull Colonies opaque granular amp yellow

bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable

Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans

bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs

bull Does not require X or V factors

bull Microaerophilic optimal temp 370 C

bull Colonies firm star shaped rough and pitting

bull Slime maybe produced colonies sticky

bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg

bull Floating colonies in TSB

Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum

bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters

bull May find some of these cells are gram +

bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially

ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2

ndash Optimal temp-----30 to 370 C

bull Colonies smooth opaque butyrous

bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg

Eikenella Hints

bull Monospecies corrodens

bull Straight unbranched non-spore forming

bull May take several days to grow bleach odor

bull Flat colonies maybe surrounded by spreading

ndash Pitting common yellow color in older cultures

ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen

ndash Optimal temperature 35-370 C

ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen

bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg

Kingella Hints

bull Three species--- kingae denitrificans oralis

bull Straight rods with rounded or square end

ndash Tendency to decolorize poorly

bull Two colony types Neither requiring X or V

ndash Spreading corroding

ndash Smooth convex

ndash Zone of beta hemolysis

bull Optimal temperature---33-370 C

bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg

HACEK Organisms

H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like

ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar

2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction

3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture

Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University

Quando un campione egrave positivo

3 criteri

1) Almeno 2 su 3 devono

avere Curve Melting

specifiche

2) Curve Melting devono

cadere nella finestra

specifica

3) Curve Melting devono

essere significativamente

simili

Pannello per emocoltura Gram +

bull S aureus

bull S pyogenes

bull S agalactiae

bull S pneumoniae

bull Coagulase Neg Staph

bull Enterococcus spp

bull Streptococcus spp

bull L monocytogenes

Funghi

bull C albicansdubliniensis

bull C parapsiolosistropicalis

bull C glabrata

bull C krusei

Gram -

bull H influenzae

bull N meningitidis

bull P aeruginosa

bull E coli

bull A Spp

bull A baumannii

bull E Cloacae

bull Enteric spp Pan

bull K pneumoniae

bull K oxytoca

bull S marcescens

Resistenze

bull mecA

bull Van AB

bull KPC

Tempo necessario 1h

refertazione

Risultati definitivi

ID + ATB

72-96 h

Colonie

24 h

ID + ATB

24 ore

Colorazione

di Gram =gt 2 h

Test diretti

Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari

ID =gt 6-8 h

grazie

Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and

epidemiologic situation

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Abiotrophia spp

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q

fever endocarditis

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

HACEK Organisms

bull Haemophilus species

bull Actinobacillus actinomycetemcomitas

bull Cardiobacterium hominis

bull Eikenella corrodens

bull Kingella species

Clinical

Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis

Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users

Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses

Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess

Infections frequently associated with dental procedure

Haemophilus IE

bull Cause up to 1 of IE

bull Of these

ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae

ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia

bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen

ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus

Actinobacillus Clinical

bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis

ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)

bull Also associated with gingivitis

ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes

bull IE infections

ndash 86 have underlying heart disease

ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)

ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases

Eikenella Clinical

bull Usually associated with mixed bacterial infections

bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries

bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)

bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers

ndash Most patients have underlying valve lesions

Kingella Clinical

bull Frequently associated with diseases in children

ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children

ndash Bacteremia in infants

ndash IE in school aged children and adults

bull Vary rapid progress is characteristic

ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection

Haemophilus Hints

bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus

ndash Also includes H paraphrophilus

bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments

bull Require 5-10 CO2

bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable

bull Colonies opaque granular amp yellow

bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable

Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans

bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs

bull Does not require X or V factors

bull Microaerophilic optimal temp 370 C

bull Colonies firm star shaped rough and pitting

bull Slime maybe produced colonies sticky

bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg

bull Floating colonies in TSB

Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum

bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters

bull May find some of these cells are gram +

bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially

ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2

ndash Optimal temp-----30 to 370 C

bull Colonies smooth opaque butyrous

bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg

Eikenella Hints

bull Monospecies corrodens

bull Straight unbranched non-spore forming

bull May take several days to grow bleach odor

bull Flat colonies maybe surrounded by spreading

ndash Pitting common yellow color in older cultures

ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen

ndash Optimal temperature 35-370 C

ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen

bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg

Kingella Hints

bull Three species--- kingae denitrificans oralis

bull Straight rods with rounded or square end

ndash Tendency to decolorize poorly

bull Two colony types Neither requiring X or V

ndash Spreading corroding

ndash Smooth convex

ndash Zone of beta hemolysis

bull Optimal temperature---33-370 C

bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg

HACEK Organisms

H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like

ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar

2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction

3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture

Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University

Pannello per emocoltura Gram +

bull S aureus

bull S pyogenes

bull S agalactiae

bull S pneumoniae

bull Coagulase Neg Staph

bull Enterococcus spp

bull Streptococcus spp

bull L monocytogenes

Funghi

bull C albicansdubliniensis

bull C parapsiolosistropicalis

bull C glabrata

bull C krusei

Gram -

bull H influenzae

bull N meningitidis

bull P aeruginosa

bull E coli

bull A Spp

bull A baumannii

bull E Cloacae

bull Enteric spp Pan

bull K pneumoniae

bull K oxytoca

bull S marcescens

Resistenze

bull mecA

bull Van AB

bull KPC

Tempo necessario 1h

refertazione

Risultati definitivi

ID + ATB

72-96 h

Colonie

24 h

ID + ATB

24 ore

Colorazione

di Gram =gt 2 h

Test diretti

Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari

ID =gt 6-8 h

grazie

Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and

epidemiologic situation

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Abiotrophia spp

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Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)

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207

Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

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Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q

fever endocarditis

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207

HACEK Organisms

bull Haemophilus species

bull Actinobacillus actinomycetemcomitas

bull Cardiobacterium hominis

bull Eikenella corrodens

bull Kingella species

Clinical

Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis

Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users

Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses

Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess

Infections frequently associated with dental procedure

Haemophilus IE

bull Cause up to 1 of IE

bull Of these

ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae

ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia

bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen

ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus

Actinobacillus Clinical

bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis

ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)

bull Also associated with gingivitis

ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes

bull IE infections

ndash 86 have underlying heart disease

ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)

ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases

Eikenella Clinical

bull Usually associated with mixed bacterial infections

bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries

bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)

bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers

ndash Most patients have underlying valve lesions

Kingella Clinical

bull Frequently associated with diseases in children

ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children

ndash Bacteremia in infants

ndash IE in school aged children and adults

bull Vary rapid progress is characteristic

ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection

Haemophilus Hints

bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus

ndash Also includes H paraphrophilus

bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments

bull Require 5-10 CO2

bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable

bull Colonies opaque granular amp yellow

bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable

Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans

bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs

bull Does not require X or V factors

bull Microaerophilic optimal temp 370 C

bull Colonies firm star shaped rough and pitting

bull Slime maybe produced colonies sticky

bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg

bull Floating colonies in TSB

Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum

bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters

bull May find some of these cells are gram +

bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially

ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2

ndash Optimal temp-----30 to 370 C

bull Colonies smooth opaque butyrous

bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg

Eikenella Hints

bull Monospecies corrodens

bull Straight unbranched non-spore forming

bull May take several days to grow bleach odor

bull Flat colonies maybe surrounded by spreading

ndash Pitting common yellow color in older cultures

ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen

ndash Optimal temperature 35-370 C

ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen

bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg

Kingella Hints

bull Three species--- kingae denitrificans oralis

bull Straight rods with rounded or square end

ndash Tendency to decolorize poorly

bull Two colony types Neither requiring X or V

ndash Spreading corroding

ndash Smooth convex

ndash Zone of beta hemolysis

bull Optimal temperature---33-370 C

bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg

HACEK Organisms

H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like

ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar

2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction

3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture

Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University

refertazione

Risultati definitivi

ID + ATB

72-96 h

Colonie

24 h

ID + ATB

24 ore

Colorazione

di Gram =gt 2 h

Test diretti

Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari

ID =gt 6-8 h

grazie

Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and

epidemiologic situation

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

Abiotrophia spp

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q

fever endocarditis

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

HACEK Organisms

bull Haemophilus species

bull Actinobacillus actinomycetemcomitas

bull Cardiobacterium hominis

bull Eikenella corrodens

bull Kingella species

Clinical

Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis

Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users

Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses

Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess

Infections frequently associated with dental procedure

Haemophilus IE

bull Cause up to 1 of IE

bull Of these

ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae

ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia

bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen

ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus

Actinobacillus Clinical

bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis

ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)

bull Also associated with gingivitis

ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes

bull IE infections

ndash 86 have underlying heart disease

ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)

ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases

Eikenella Clinical

bull Usually associated with mixed bacterial infections

bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries

bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)

bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers

ndash Most patients have underlying valve lesions

Kingella Clinical

bull Frequently associated with diseases in children

ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children

ndash Bacteremia in infants

ndash IE in school aged children and adults

bull Vary rapid progress is characteristic

ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection

Haemophilus Hints

bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus

ndash Also includes H paraphrophilus

bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments

bull Require 5-10 CO2

bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable

bull Colonies opaque granular amp yellow

bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable

Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans

bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs

bull Does not require X or V factors

bull Microaerophilic optimal temp 370 C

bull Colonies firm star shaped rough and pitting

bull Slime maybe produced colonies sticky

bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg

bull Floating colonies in TSB

Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum

bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters

bull May find some of these cells are gram +

bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially

ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2

ndash Optimal temp-----30 to 370 C

bull Colonies smooth opaque butyrous

bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg

Eikenella Hints

bull Monospecies corrodens

bull Straight unbranched non-spore forming

bull May take several days to grow bleach odor

bull Flat colonies maybe surrounded by spreading

ndash Pitting common yellow color in older cultures

ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen

ndash Optimal temperature 35-370 C

ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen

bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg

Kingella Hints

bull Three species--- kingae denitrificans oralis

bull Straight rods with rounded or square end

ndash Tendency to decolorize poorly

bull Two colony types Neither requiring X or V

ndash Spreading corroding

ndash Smooth convex

ndash Zone of beta hemolysis

bull Optimal temperature---33-370 C

bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg

HACEK Organisms

H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like

ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar

2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction

3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture

Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University

Risultati definitivi

ID + ATB

72-96 h

Colonie

24 h

ID + ATB

24 ore

Colorazione

di Gram =gt 2 h

Test diretti

Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari

ID =gt 6-8 h

grazie

Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and

epidemiologic situation

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

Abiotrophia spp

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q

fever endocarditis

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

HACEK Organisms

bull Haemophilus species

bull Actinobacillus actinomycetemcomitas

bull Cardiobacterium hominis

bull Eikenella corrodens

bull Kingella species

Clinical

Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis

Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users

Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses

Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess

Infections frequently associated with dental procedure

Haemophilus IE

bull Cause up to 1 of IE

bull Of these

ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae

ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia

bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen

ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus

Actinobacillus Clinical

bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis

ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)

bull Also associated with gingivitis

ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes

bull IE infections

ndash 86 have underlying heart disease

ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)

ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases

Eikenella Clinical

bull Usually associated with mixed bacterial infections

bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries

bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)

bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers

ndash Most patients have underlying valve lesions

Kingella Clinical

bull Frequently associated with diseases in children

ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children

ndash Bacteremia in infants

ndash IE in school aged children and adults

bull Vary rapid progress is characteristic

ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection

Haemophilus Hints

bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus

ndash Also includes H paraphrophilus

bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments

bull Require 5-10 CO2

bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable

bull Colonies opaque granular amp yellow

bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable

Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans

bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs

bull Does not require X or V factors

bull Microaerophilic optimal temp 370 C

bull Colonies firm star shaped rough and pitting

bull Slime maybe produced colonies sticky

bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg

bull Floating colonies in TSB

Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum

bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters

bull May find some of these cells are gram +

bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially

ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2

ndash Optimal temp-----30 to 370 C

bull Colonies smooth opaque butyrous

bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg

Eikenella Hints

bull Monospecies corrodens

bull Straight unbranched non-spore forming

bull May take several days to grow bleach odor

bull Flat colonies maybe surrounded by spreading

ndash Pitting common yellow color in older cultures

ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen

ndash Optimal temperature 35-370 C

ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen

bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg

Kingella Hints

bull Three species--- kingae denitrificans oralis

bull Straight rods with rounded or square end

ndash Tendency to decolorize poorly

bull Two colony types Neither requiring X or V

ndash Spreading corroding

ndash Smooth convex

ndash Zone of beta hemolysis

bull Optimal temperature---33-370 C

bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg

HACEK Organisms

H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like

ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar

2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction

3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture

Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University

grazie

Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and

epidemiologic situation

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

Abiotrophia spp

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q

fever endocarditis

Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-

207

HACEK Organisms

bull Haemophilus species

bull Actinobacillus actinomycetemcomitas

bull Cardiobacterium hominis

bull Eikenella corrodens

bull Kingella species

Clinical

Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis

Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users

Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses

Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess

Infections frequently associated with dental procedure

Haemophilus IE

bull Cause up to 1 of IE

bull Of these

ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae

ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia

bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen

ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus

Actinobacillus Clinical

bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis

ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)

bull Also associated with gingivitis

ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes

bull IE infections

ndash 86 have underlying heart disease

ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)

ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases

Eikenella Clinical

bull Usually associated with mixed bacterial infections

bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries

bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)

bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers

ndash Most patients have underlying valve lesions

Kingella Clinical

bull Frequently associated with diseases in children

ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children

ndash Bacteremia in infants

ndash IE in school aged children and adults

bull Vary rapid progress is characteristic

ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection

Haemophilus Hints

bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus

ndash Also includes H paraphrophilus

bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments

bull Require 5-10 CO2

bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable

bull Colonies opaque granular amp yellow

bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable

Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans

bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs

bull Does not require X or V factors

bull Microaerophilic optimal temp 370 C

bull Colonies firm star shaped rough and pitting

bull Slime maybe produced colonies sticky

bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg

bull Floating colonies in TSB

Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum

bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters

bull May find some of these cells are gram +

bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially

ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2

ndash Optimal temp-----30 to 370 C

bull Colonies smooth opaque butyrous

bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg

Eikenella Hints

bull Monospecies corrodens

bull Straight unbranched non-spore forming

bull May take several days to grow bleach odor

bull Flat colonies maybe surrounded by spreading

ndash Pitting common yellow color in older cultures

ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen

ndash Optimal temperature 35-370 C

ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen

bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg

Kingella Hints

bull Three species--- kingae denitrificans oralis

bull Straight rods with rounded or square end

ndash Tendency to decolorize poorly

bull Two colony types Neither requiring X or V

ndash Spreading corroding

ndash Smooth convex

ndash Zone of beta hemolysis

bull Optimal temperature---33-370 C

bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg

HACEK Organisms

H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like

ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar

2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction

3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture

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epidemiologic situation

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Abiotrophia spp

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Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)

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Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve

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fever endocarditis

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HACEK Organisms

bull Haemophilus species

bull Actinobacillus actinomycetemcomitas

bull Cardiobacterium hominis

bull Eikenella corrodens

bull Kingella species

Clinical

Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis

Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users

Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses

Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess

Infections frequently associated with dental procedure

Haemophilus IE

bull Cause up to 1 of IE

bull Of these

ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae

ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia

bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen

ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus

Actinobacillus Clinical

bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis

ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)

bull Also associated with gingivitis

ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes

bull IE infections

ndash 86 have underlying heart disease

ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)

ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases

Eikenella Clinical

bull Usually associated with mixed bacterial infections

bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries

bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)

bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers

ndash Most patients have underlying valve lesions

Kingella Clinical

bull Frequently associated with diseases in children

ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children

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ndash IE in school aged children and adults

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Haemophilus Hints

bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus

ndash Also includes H paraphrophilus

bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments

bull Require 5-10 CO2

bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable

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bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable

Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans

bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs

bull Does not require X or V factors

bull Microaerophilic optimal temp 370 C

bull Colonies firm star shaped rough and pitting

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Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum

bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters

bull May find some of these cells are gram +

bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially

ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2

ndash Optimal temp-----30 to 370 C

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bull Monospecies corrodens

bull Straight unbranched non-spore forming

bull May take several days to grow bleach odor

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ndash Optimal temperature 35-370 C

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bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg

Kingella Hints

bull Three species--- kingae denitrificans oralis

bull Straight rods with rounded or square end

ndash Tendency to decolorize poorly

bull Two colony types Neither requiring X or V

ndash Spreading corroding

ndash Smooth convex

ndash Zone of beta hemolysis

bull Optimal temperature---33-370 C

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H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like

ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar

2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction

3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture

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Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q

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Clinical

Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis

Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users

Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses

Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess

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Haemophilus IE

bull Cause up to 1 of IE

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ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae

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bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen

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Actinobacillus Clinical

bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis

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bull Also associated with gingivitis

ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes

bull IE infections

ndash 86 have underlying heart disease

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Eikenella Clinical

bull Usually associated with mixed bacterial infections

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Kingella Clinical

bull Frequently associated with diseases in children

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Haemophilus Hints

bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus

ndash Also includes H paraphrophilus

bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments

bull Require 5-10 CO2

bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable

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Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans

bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs

bull Does not require X or V factors

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Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum

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bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially

ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2

ndash Optimal temp-----30 to 370 C

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Eikenella Hints

bull Monospecies corrodens

bull Straight unbranched non-spore forming

bull May take several days to grow bleach odor

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ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen

ndash Optimal temperature 35-370 C

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Kingella Hints

bull Three species--- kingae denitrificans oralis

bull Straight rods with rounded or square end

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bull Optimal temperature---33-370 C

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3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture

Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University

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Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q

fever endocarditis

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HACEK Organisms

bull Haemophilus species

bull Actinobacillus actinomycetemcomitas

bull Cardiobacterium hominis

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Clinical

Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis

Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users

Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses

Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess

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Haemophilus IE

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Actinobacillus Clinical

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Eikenella Clinical

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Kingella Clinical

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Haemophilus Hints

bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus

ndash Also includes H paraphrophilus

bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments

bull Require 5-10 CO2

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Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans

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Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum

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bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially

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ndash Optimal temp-----30 to 370 C

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bull Straight unbranched non-spore forming

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ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen

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3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture

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bull Cardiobacterium hominis

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Clinical

Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis

Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users

Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses

Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess

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Haemophilus IE

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Haemophilus IE

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Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum

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Kingella Hints

bull Three species--- kingae denitrificans oralis

bull Straight rods with rounded or square end

ndash Tendency to decolorize poorly

bull Two colony types Neither requiring X or V

ndash Spreading corroding

ndash Smooth convex

ndash Zone of beta hemolysis

bull Optimal temperature---33-370 C

bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg

HACEK Organisms

H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like

ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar

2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction

3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture

Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University

HACEK Organisms

bull Haemophilus species

bull Actinobacillus actinomycetemcomitas

bull Cardiobacterium hominis

bull Eikenella corrodens

bull Kingella species

Clinical

Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis

Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users

Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses

Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess

Infections frequently associated with dental procedure

Haemophilus IE

bull Cause up to 1 of IE

bull Of these

ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae

ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia

bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen

ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus

Actinobacillus Clinical

bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis

ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)

bull Also associated with gingivitis

ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes

bull IE infections

ndash 86 have underlying heart disease

ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)

ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases

Eikenella Clinical

bull Usually associated with mixed bacterial infections

bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries

bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)

bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers

ndash Most patients have underlying valve lesions

Kingella Clinical

bull Frequently associated with diseases in children

ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children

ndash Bacteremia in infants

ndash IE in school aged children and adults

bull Vary rapid progress is characteristic

ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection

Haemophilus Hints

bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus

ndash Also includes H paraphrophilus

bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments

bull Require 5-10 CO2

bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable

bull Colonies opaque granular amp yellow

bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable

Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans

bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs

bull Does not require X or V factors

bull Microaerophilic optimal temp 370 C

bull Colonies firm star shaped rough and pitting

bull Slime maybe produced colonies sticky

bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg

bull Floating colonies in TSB

Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum

bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters

bull May find some of these cells are gram +

bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially

ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2

ndash Optimal temp-----30 to 370 C

bull Colonies smooth opaque butyrous

bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg

Eikenella Hints

bull Monospecies corrodens

bull Straight unbranched non-spore forming

bull May take several days to grow bleach odor

bull Flat colonies maybe surrounded by spreading

ndash Pitting common yellow color in older cultures

ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen

ndash Optimal temperature 35-370 C

ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen

bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg

Kingella Hints

bull Three species--- kingae denitrificans oralis

bull Straight rods with rounded or square end

ndash Tendency to decolorize poorly

bull Two colony types Neither requiring X or V

ndash Spreading corroding

ndash Smooth convex

ndash Zone of beta hemolysis

bull Optimal temperature---33-370 C

bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg

HACEK Organisms

H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like

ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar

2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction

3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture

Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University

Clinical

Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis

Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users

Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses

Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess

Infections frequently associated with dental procedure

Haemophilus IE

bull Cause up to 1 of IE

bull Of these

ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae

ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia

bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen

ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus

Actinobacillus Clinical

bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis

ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)

bull Also associated with gingivitis

ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes

bull IE infections

ndash 86 have underlying heart disease

ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)

ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases

Eikenella Clinical

bull Usually associated with mixed bacterial infections

bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries

bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)

bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers

ndash Most patients have underlying valve lesions

Kingella Clinical

bull Frequently associated with diseases in children

ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children

ndash Bacteremia in infants

ndash IE in school aged children and adults

bull Vary rapid progress is characteristic

ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection

Haemophilus Hints

bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus

ndash Also includes H paraphrophilus

bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments

bull Require 5-10 CO2

bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable

bull Colonies opaque granular amp yellow

bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable

Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans

bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs

bull Does not require X or V factors

bull Microaerophilic optimal temp 370 C

bull Colonies firm star shaped rough and pitting

bull Slime maybe produced colonies sticky

bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg

bull Floating colonies in TSB

Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum

bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters

bull May find some of these cells are gram +

bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially

ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2

ndash Optimal temp-----30 to 370 C

bull Colonies smooth opaque butyrous

bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg

Eikenella Hints

bull Monospecies corrodens

bull Straight unbranched non-spore forming

bull May take several days to grow bleach odor

bull Flat colonies maybe surrounded by spreading

ndash Pitting common yellow color in older cultures

ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen

ndash Optimal temperature 35-370 C

ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen

bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg

Kingella Hints

bull Three species--- kingae denitrificans oralis

bull Straight rods with rounded or square end

ndash Tendency to decolorize poorly

bull Two colony types Neither requiring X or V

ndash Spreading corroding

ndash Smooth convex

ndash Zone of beta hemolysis

bull Optimal temperature---33-370 C

bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg

HACEK Organisms

H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like

ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar

2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction

3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture

Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University

Haemophilus IE

bull Cause up to 1 of IE

bull Of these

ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae

ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia

bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen

ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus

Actinobacillus Clinical

bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis

ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)

bull Also associated with gingivitis

ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes

bull IE infections

ndash 86 have underlying heart disease

ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)

ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases

Eikenella Clinical

bull Usually associated with mixed bacterial infections

bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries

bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)

bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers

ndash Most patients have underlying valve lesions

Kingella Clinical

bull Frequently associated with diseases in children

ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children

ndash Bacteremia in infants

ndash IE in school aged children and adults

bull Vary rapid progress is characteristic

ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection

Haemophilus Hints

bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus

ndash Also includes H paraphrophilus

bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments

bull Require 5-10 CO2

bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable

bull Colonies opaque granular amp yellow

bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable

Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans

bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs

bull Does not require X or V factors

bull Microaerophilic optimal temp 370 C

bull Colonies firm star shaped rough and pitting

bull Slime maybe produced colonies sticky

bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg

bull Floating colonies in TSB

Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum

bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters

bull May find some of these cells are gram +

bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially

ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2

ndash Optimal temp-----30 to 370 C

bull Colonies smooth opaque butyrous

bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg

Eikenella Hints

bull Monospecies corrodens

bull Straight unbranched non-spore forming

bull May take several days to grow bleach odor

bull Flat colonies maybe surrounded by spreading

ndash Pitting common yellow color in older cultures

ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen

ndash Optimal temperature 35-370 C

ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen

bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg

Kingella Hints

bull Three species--- kingae denitrificans oralis

bull Straight rods with rounded or square end

ndash Tendency to decolorize poorly

bull Two colony types Neither requiring X or V

ndash Spreading corroding

ndash Smooth convex

ndash Zone of beta hemolysis

bull Optimal temperature---33-370 C

bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg

HACEK Organisms

H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like

ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar

2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction

3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture

Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University

Actinobacillus Clinical

bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis

ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)

bull Also associated with gingivitis

ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes

bull IE infections

ndash 86 have underlying heart disease

ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)

ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases

Eikenella Clinical

bull Usually associated with mixed bacterial infections

bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries

bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)

bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers

ndash Most patients have underlying valve lesions

Kingella Clinical

bull Frequently associated with diseases in children

ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children

ndash Bacteremia in infants

ndash IE in school aged children and adults

bull Vary rapid progress is characteristic

ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection

Haemophilus Hints

bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus

ndash Also includes H paraphrophilus

bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments

bull Require 5-10 CO2

bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable

bull Colonies opaque granular amp yellow

bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable

Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans

bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs

bull Does not require X or V factors

bull Microaerophilic optimal temp 370 C

bull Colonies firm star shaped rough and pitting

bull Slime maybe produced colonies sticky

bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg

bull Floating colonies in TSB

Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum

bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters

bull May find some of these cells are gram +

bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially

ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2

ndash Optimal temp-----30 to 370 C

bull Colonies smooth opaque butyrous

bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg

Eikenella Hints

bull Monospecies corrodens

bull Straight unbranched non-spore forming

bull May take several days to grow bleach odor

bull Flat colonies maybe surrounded by spreading

ndash Pitting common yellow color in older cultures

ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen

ndash Optimal temperature 35-370 C

ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen

bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg

Kingella Hints

bull Three species--- kingae denitrificans oralis

bull Straight rods with rounded or square end

ndash Tendency to decolorize poorly

bull Two colony types Neither requiring X or V

ndash Spreading corroding

ndash Smooth convex

ndash Zone of beta hemolysis

bull Optimal temperature---33-370 C

bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg

HACEK Organisms

H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like

ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar

2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction

3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture

Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University

Eikenella Clinical

bull Usually associated with mixed bacterial infections

bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries

bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)

bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers

ndash Most patients have underlying valve lesions

Kingella Clinical

bull Frequently associated with diseases in children

ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children

ndash Bacteremia in infants

ndash IE in school aged children and adults

bull Vary rapid progress is characteristic

ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection

Haemophilus Hints

bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus

ndash Also includes H paraphrophilus

bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments

bull Require 5-10 CO2

bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable

bull Colonies opaque granular amp yellow

bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable

Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans

bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs

bull Does not require X or V factors

bull Microaerophilic optimal temp 370 C

bull Colonies firm star shaped rough and pitting

bull Slime maybe produced colonies sticky

bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg

bull Floating colonies in TSB

Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum

bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters

bull May find some of these cells are gram +

bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially

ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2

ndash Optimal temp-----30 to 370 C

bull Colonies smooth opaque butyrous

bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg

Eikenella Hints

bull Monospecies corrodens

bull Straight unbranched non-spore forming

bull May take several days to grow bleach odor

bull Flat colonies maybe surrounded by spreading

ndash Pitting common yellow color in older cultures

ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen

ndash Optimal temperature 35-370 C

ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen

bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg

Kingella Hints

bull Three species--- kingae denitrificans oralis

bull Straight rods with rounded or square end

ndash Tendency to decolorize poorly

bull Two colony types Neither requiring X or V

ndash Spreading corroding

ndash Smooth convex

ndash Zone of beta hemolysis

bull Optimal temperature---33-370 C

bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg

HACEK Organisms

H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like

ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar

2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction

3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture

Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University

Kingella Clinical

bull Frequently associated with diseases in children

ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children

ndash Bacteremia in infants

ndash IE in school aged children and adults

bull Vary rapid progress is characteristic

ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection

Haemophilus Hints

bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus

ndash Also includes H paraphrophilus

bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments

bull Require 5-10 CO2

bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable

bull Colonies opaque granular amp yellow

bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable

Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans

bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs

bull Does not require X or V factors

bull Microaerophilic optimal temp 370 C

bull Colonies firm star shaped rough and pitting

bull Slime maybe produced colonies sticky

bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg

bull Floating colonies in TSB

Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum

bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters

bull May find some of these cells are gram +

bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially

ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2

ndash Optimal temp-----30 to 370 C

bull Colonies smooth opaque butyrous

bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg

Eikenella Hints

bull Monospecies corrodens

bull Straight unbranched non-spore forming

bull May take several days to grow bleach odor

bull Flat colonies maybe surrounded by spreading

ndash Pitting common yellow color in older cultures

ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen

ndash Optimal temperature 35-370 C

ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen

bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg

Kingella Hints

bull Three species--- kingae denitrificans oralis

bull Straight rods with rounded or square end

ndash Tendency to decolorize poorly

bull Two colony types Neither requiring X or V

ndash Spreading corroding

ndash Smooth convex

ndash Zone of beta hemolysis

bull Optimal temperature---33-370 C

bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg

HACEK Organisms

H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like

ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar

2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction

3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture

Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University

Haemophilus Hints

bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus

ndash Also includes H paraphrophilus

bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments

bull Require 5-10 CO2

bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable

bull Colonies opaque granular amp yellow

bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable

Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans

bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs

bull Does not require X or V factors

bull Microaerophilic optimal temp 370 C

bull Colonies firm star shaped rough and pitting

bull Slime maybe produced colonies sticky

bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg

bull Floating colonies in TSB

Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum

bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters

bull May find some of these cells are gram +

bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially

ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2

ndash Optimal temp-----30 to 370 C

bull Colonies smooth opaque butyrous

bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg

Eikenella Hints

bull Monospecies corrodens

bull Straight unbranched non-spore forming

bull May take several days to grow bleach odor

bull Flat colonies maybe surrounded by spreading

ndash Pitting common yellow color in older cultures

ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen

ndash Optimal temperature 35-370 C

ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen

bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg

Kingella Hints

bull Three species--- kingae denitrificans oralis

bull Straight rods with rounded or square end

ndash Tendency to decolorize poorly

bull Two colony types Neither requiring X or V

ndash Spreading corroding

ndash Smooth convex

ndash Zone of beta hemolysis

bull Optimal temperature---33-370 C

bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg

HACEK Organisms

H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like

ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar

2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction

3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture

Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University

Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans

bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs

bull Does not require X or V factors

bull Microaerophilic optimal temp 370 C

bull Colonies firm star shaped rough and pitting

bull Slime maybe produced colonies sticky

bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg

bull Floating colonies in TSB

Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum

bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters

bull May find some of these cells are gram +

bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially

ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2

ndash Optimal temp-----30 to 370 C

bull Colonies smooth opaque butyrous

bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg

Eikenella Hints

bull Monospecies corrodens

bull Straight unbranched non-spore forming

bull May take several days to grow bleach odor

bull Flat colonies maybe surrounded by spreading

ndash Pitting common yellow color in older cultures

ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen

ndash Optimal temperature 35-370 C

ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen

bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg

Kingella Hints

bull Three species--- kingae denitrificans oralis

bull Straight rods with rounded or square end

ndash Tendency to decolorize poorly

bull Two colony types Neither requiring X or V

ndash Spreading corroding

ndash Smooth convex

ndash Zone of beta hemolysis

bull Optimal temperature---33-370 C

bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg

HACEK Organisms

H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like

ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar

2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction

3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture

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Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum

bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters

bull May find some of these cells are gram +

bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially

ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2

ndash Optimal temp-----30 to 370 C

bull Colonies smooth opaque butyrous

bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg

Eikenella Hints

bull Monospecies corrodens

bull Straight unbranched non-spore forming

bull May take several days to grow bleach odor

bull Flat colonies maybe surrounded by spreading

ndash Pitting common yellow color in older cultures

ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen

ndash Optimal temperature 35-370 C

ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen

bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg

Kingella Hints

bull Three species--- kingae denitrificans oralis

bull Straight rods with rounded or square end

ndash Tendency to decolorize poorly

bull Two colony types Neither requiring X or V

ndash Spreading corroding

ndash Smooth convex

ndash Zone of beta hemolysis

bull Optimal temperature---33-370 C

bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg

HACEK Organisms

H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like

ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar

2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction

3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture

Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University

Eikenella Hints

bull Monospecies corrodens

bull Straight unbranched non-spore forming

bull May take several days to grow bleach odor

bull Flat colonies maybe surrounded by spreading

ndash Pitting common yellow color in older cultures

ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen

ndash Optimal temperature 35-370 C

ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen

bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg

Kingella Hints

bull Three species--- kingae denitrificans oralis

bull Straight rods with rounded or square end

ndash Tendency to decolorize poorly

bull Two colony types Neither requiring X or V

ndash Spreading corroding

ndash Smooth convex

ndash Zone of beta hemolysis

bull Optimal temperature---33-370 C

bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg

HACEK Organisms

H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like

ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar

2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction

3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture

Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University

Kingella Hints

bull Three species--- kingae denitrificans oralis

bull Straight rods with rounded or square end

ndash Tendency to decolorize poorly

bull Two colony types Neither requiring X or V

ndash Spreading corroding

ndash Smooth convex

ndash Zone of beta hemolysis

bull Optimal temperature---33-370 C

bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg

HACEK Organisms

H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like

ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar

2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction

3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture

Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University

HACEK Organisms

H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like

ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar

2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction

3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture

Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University