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LA TECNOLOGIA del
DNA RICOMBINANTE o
CLONAZIONE MOLECOLARE
Corso di Biotecnologie
12 Maggio 2008
DNA SORGENTE
DNA BERSAGLIO
VETTORE DI CLONAZIONE
1
frammentazione enzimatica linearizzazione enzimatica
2
3
congiungimento DNA bersaglio-vettore di clonazione
Rappresentazione schematica del clonaggio (I)
introduzione del DNA nellacellula ospite (trasformazione) e isolamento delle cellule con il
gene clonato
cellula ospite
proteina codificata dal gene clonato
Produzione della proteina
dal gene clonato
tutto ciò è possibile… grazie alla scoperta delle endonucleasi di restrizione
5’- GAATTC - 3’3’- CTTAAG – 5’
SITO DI RICONOSCIMENTO
EcoRIEcoRI
Le Endonucleasi di Restrizione (I)Enzimi batterici: endonucleasi di TIPO II:
- Riconoscono e tagliano corte sequenze di DNA (4-8bp);- le sequenze riconosciute sono palindromiche, cioè risultano ugluali se lette su ogni filamento nella stessa direzione- il taglio produce estremità piatte o coesive
Esempio di una delle prime endonucleasi di tipo II meglio caratterizzate:EcoRI
genere: Escherichia specie:
Coliceppo:
R
Ordine di caratterizzazione di diverse endonucleasi appartenente allo stesso
organismo (I)
PRODOTTI FORMAZIONE DI ESTREMITÀCOESIVE
5’- G AATTC - 3’3’- CTTAA G – 5’
OH
OH
P
P
Le Endonucleasi di Restrizione (II)Enzima Sito di riconoscimento
EcoR I G A A T T C
C T T A A G
BamH I G G A T C C
C C T A G G
Hind III A A G C T T
T T C G A A
KPN I G G T A C C
C C A T G G
NOT I G C G G C C G C
C G C C G G C G
EcoR V G A T A T C
C T A T A G
Xho I C T C G A G
G A G C T C
IsoschizomeriSebbene gli enzimi di restrizione isolati siano oltre 3500, le sequenze bersaglio che possono essere tagliate sono molte di meno (appena più di duecento). E’ evidente che molti enzimi isolati da batteri diversi hanno la stessa specificità di sequenza,sono cioè isoschizomeri.
…grazie alla scoperta delle endonucleasi di restrizione…Le librerie geniche: collezione di cloni derivante dalla totalità di DNA estratto da un organismo e digerito con un enzima di restrizione:
Le librerie genomiche: composta dalla totalità del DNA cromosomico di un organismo (es: se si vuole studiare l’organizzazione genica);
Le librerie di cDNA: composta dall’mRNA di una cellula o di un tessuto in un particolare momento (es: studiare il profilo di espressione di una particolare proteina in u particolare momento o tessuto)
Estrazione del DNA cromosomico2
Taglio del DNA conendonucleasi di restrizione
(digestione parziale o totale)3
Inserimento di ogni frammentodi DNA in un vettore4
5
Trasformazione batterica
Confronto tra I principali passaggi richiesti per la costruzione di librerie genomiche e di cDNA
Libreria genomica1 Libreria di cDNA 1
Estrazione dell’mRNA 2
Produzione di cDNA(trascrittasi inversa) 3
Inserimento di ogni cDNA in un vettore 4
Screening di librerie geniche1. Ibridazione su colonia del DNA
o si piastrano cellule provenienti dalla reazione di trasformazionesu terreno con antibiotico
Piastra madre
Trasferimento cellule o ciascuna colonia formatasi sulla piastra madre, si trasferisce un campione su una matrice solida (membrana di nylon o nitrocellulosa)
matrice
o si lisano le cellule della matrice e si denatura il DNA liberato, deproteinizzandolo e legandolo irreversibilmente alla matrice
Incubazione con la sonda di DNAcomplementare al DNA di interesse. Lavaggi che eliminano la sonda non legata.Autoradiografia che rivela i cloni identificati con la sonda
Subcultura della cellule dalle colonie positive provenienti dalla piastra madre
Screening di librerie geniche2. Immunodosaggio di colonie
Piastra madre
2. ciascuna colonia formatasi sulla piastra madre, si trasferisce un campione su una matrice solida (membrana di nylon o nitrocellulosa)
1. Trasferimento cellule
matrice
3. si lisano le cellule della matrice e si ancorano le proteine alla matrice
4. Anticorpo primario (
5. Eliminazione per lavaggio del primario e incubazione con anticorpo secondario (
6. Eliminazione per lavaggio del secondario non legato e si effettua una reazione cromatica che funziona solo in presenza del secondario.
Subcultura della cellule dalla colonia positiva proveniente dalla piastra madre
Estremità piatteEsempio: HaeIII (da Haemophilus
parainfluenzae)
La sequenza di DNA in doppia elica:
5’-NNNNGGCCNNNN-3’3’-NNNNCCGGNNNN-5’
viene tagliata nel seguente modo:
5’-NNNNGG pCCNNNN-3’3’-NNNNCCp GGNNNN-5’
La sequenza di DNA in doppia elica:
5’-NNNNGAATTCNNNN-3’3’-NNNNCTTAAGNNNN-5’
viene tagliata nel seguente modo:
5’-NNNNG pAATTCNNNN-3’3’-NNNNCTTAAp GNNNN-5’
Estremità coesiveEsempio: EcoRI
Tutte le estremità generate dagli enzimi che operano un taglio sfalsato, siano esse sporgenti in 5’ o in 3’, sono “appiccicose”, cioè possono formare ponti idrogeno tra le due code a filamento singolo complementari.
In questo caso il taglio è perfettamente simmetrico. Le estremità piatte sono saldate in modo inefficiente dalla DNA ligasi, perché non restano associate a lungo.
annealing
reannealing
Tutti questi appaiamenti (annealing-reannealing) sono transitori a causa della debolezza dei legami a idrogeno tra il numero ridotto di basi a livello delle estremità coesive. Questi legami vengono stabilizzati grazie all’uso dell’enzima DNA LIGASI in un processo noto con il nome di ligazione.Enzima T4 DNA ligasi (isolato dal batteriofago T4) forma legami covalenti tra il gruppo fosfato 5’ di una estremità e il gruppo 3’ OH della catena adiacente. L’enzima lavora a 10°C e richiede ATP.
Rappresentazione schematica del clonaggio (II) - estremità coesive
BAMH1
ECOR1
gene per resistenza ad antibiotico
BAMH1 ECOR1
Siti di restrizione
Siti di restrizione
AA
TT
CG
GCCTAGGATCC
G
GCTTAA
GATCCG
G
CTTAAGCCTAG
AATTCG
estremità coesive
BAMH1
ECOR1
BAMH1
ECOR1
Ibridazione delle estremità e ligazione
annealing
reannealing
plasmide
DNA estraneo
Rappresentazione schematica del clonaggio (III) - estremità coesive
Trattamento del DNA con estremità piatteLa ligazione di frammenti con estremità piatte non è efficiente quanto quella di frammenti con estremità coesive, perciò prima di unire il DNA con il vettore di clonaggio è necessario eseguire alcune procedure aggiuntive:
1. AGGIUNTA DEL LINKER
DNA a estremità piatte
5’ pGGGATCCC3 CCCTAGGG
linker
Unione del linker al DNA con estramitàpiatte mediante DNA ligasi
5’ pGGGATCCC3’ CCCTAGGG
GGGATCCCCCCTAGGG
plasmide
5’ pGATCCC3’ GG
GGCCCTAGp
Taglio con BamHI
Taglio con BamHI
CTAGp
5’pGATC3’
C T A G
G G
G G G A T CG A
T C C
C
C C C T A G
Unione delle estremità coesive mediante DNA ligasi
Vettori per il clonaggio (I)Per clonare una qualsiasi molecola di DNA è necessario inserirla in un vettore per il clonaggio.
Questi elementi di DNA possono essere mantenuti e propagati in un organismo ospite in cui il vettore possa replicarsi. Un tipico ospite è Escherichia Coli che cresce e si divide rapidamente. Qualsiasi vettore con un origine di replicazione adatta si replica con successo in E.Coli (assieme al DNA inserito). Quindi, qualsiasi DNA inserito in un vettore può essere amplificato (se ne possono produrre quantità illimitate) e usato per successive analisi
Libreria genica: ogni vettore contiene un frammento diverso di DNA estraneo
Isolamento di un clone mediante screening della libreria
Amplificazione del singolo clone
Vettori per il clonaggio (II)
- SONO STATI SVILUPPATI DA MOLECOLE PRESENTI IN NATURA (PLASMIDI BATTERICI, BATTERIOFAGI) O COMBINAZIONE DEGLI ELEMENTI CHE LI COMPONGONO (COSMIDI).
Plasmidi (i)• DNA extracromosomico circolare di piccole dimensioni presente in molti batteri che conferisce resistenza a antibiotici, capacità di metabolizzare substrati e capacità di coniugazione.• anni ’70: alcuni di questi vettori sono stati modificati in laboratorio (digestioni e successive ligazioni) pr costruire vettori di clonaggio (es: pBR322 da Bolivar e Rodriguez);• un plasmide artificiale è molto più piccolo di quello naturale e viene più facilmente inserito nei batteri nel processo noto come trasformazione;• un origine di replicazione del DNA di tipo batterico cosicchè il DNA può essere replicato dalla cellula ospite• plasmidi come pBR322 hanno un origine di replicazione rilassata, che non segue cioè la divisione cellulare, in modo che la replicazione del plasmide è molto più frequente di quella cromosomica. In questo modo ogni cellula produce molte molecole di plasmide.• Sono stati introdotti due geni che codificano per la rsistenza agli antibiotici• in vari punti del palsmide ci sono siti singoli di riconoscimento per una serie di enzimi di restrizione. Alcuni di questi siti possono essere inseriti in un gene che codifica per la resistenza ad un antibiotico, cosicchè la presenza di un particolare inserto può essere rivelata dalla perdita di resistenza a quello stesso antibiotico (inattivazione inserzionale).
Vettori per il clonaggio (III)pBR322
Esempio di mutagenesi inserzionale (singolo taglio con BamHI)
Inattivazione Inserzionale
pBR322 dig BamHIsingolo sito di restrizione
Frammento di DNA cromosomico dig BamHI
+
Plasmide contenente l’inserto
Plasmide ricircolarizzato
Plasmide che contiene più copie del frammento
T4 DNA LIGASI
TRASFORMAZIONE: incorporazione di piccole molecole circolari in E.Coli
colonie cresciute su piastra contenente Ampicillina, crescono solo le cellule che contengono il plasmide
Piastramento in replica utilizzando un tampone di velluto sterile
Piastra contenente Tetraciclina
crescono solo le cellule con plasmide senza insertto:
incubazione
Recupero delle colonie contenenti
plasmide+inserto presenti sulla piastra AmpR
Plasmidi (ii) : pUC
• gene per la resistenza alla tetraciclina;
• origine di replicazione per E.Coli;
• Multiple Cloning Site (MCS) o polylinker: siti di restrizione unici più comuni;
• MCS è parte del gene lacZ che codifica per la -galattosidasi;
Plasmidi (iii) : pUC
Quando si trasformano cellule di E.Coli con il plasmide pUC, il gene può essere attivato aggiungnedo nel terreno l’induttore isopropil--D-tiogalattopiranoside (IPTG), la cui presenza induce l’espressione della -galattosidasi. L’ezima funzionale idrolizza una sostanza incolore detta 5-bromo-4-cloro-3-indolil--galattopiranoside (X-Gal) producendo un composto blu insolubile.
1. Vettori non ricombinanti (senza inserto)
MCSGENE PER LA -GALATTOSIDASI
X-Gal idrolizzato: placca blu
INDUZIONE CON IPTG
2. Vettori ricombinanti (senza inserto)
INSERIMENTO DEL DNA NEL MCS CON INTERRUZIONE DEL GENE -GAL
INDUZIONE CON IPTG
GENE INSERITO X-Gal NON idrolizzato: placca bianca
Vettori derivati da virus (I)- Per inserti lunghi (più di 5kb) si usano vettori derivanti dal batteriofago in quanto offrono
una efficienza di clonaggio superiore di circa 16 volte rispetto ai vettori plasmidici;- il batteriofago è un fago con DNA lieare a doppia elica, lungo circa 49 kb in grado di
infettare E.Coli, inserendogli il proprio DNA attraverso la membrana cellulare- il DNA del fago può replicarsi secondo due modalità:
1. si integra nel cromosoma di E. Coli dove resta quiesciente fino a quando un segnale ne promuove l’escissione (ciclo lisogenico)
2. si replica aapena infetta la cellula, sintetizza le proteine della testa e della coda, si formano nuove particelle fagiche (ciclo litico)
Vettori derivati da virus (II)
coda
DNAtesta
I fagi sono stati utilizzati per la costruzione di librerie geniche perchè hanno permesso di introdurre frammenti più grandi di DNA rispetto ai plasmidi. Il DNA del batteriofago l è lungo circa 50 kb, approssimativamente 20 dei quali risultano indispensabili agli eventi di integrazione-escissione (I/E). Per formare le genoteche si è ragionato sulla possibilità di sostituire queste 20 kb con altrettante kb di DNA clonato. Una simile molecola di DNA si potrebbe perpetuare sotto forma di batteriofago l “ricombinante” tramite cicli litici forzosi.
Cosmidi
Vector system Host cell Insert capacity (kb)
Plasmid E. coli 0.1-10
Bacteriophage l E. coli 10-20
Cosmid E. coli 35-45
Bacteriophage P1 E. coli 80-100
BAC (bacterial artificial chromosome)
E. coli 50-300
P1 bacteriophage-derived AC
E. coli 100-300
YAC Yeast 100-2,000
Vettori di clonaggio
Possono trasportare 40 kb di DNA clonato e possono essere mantenuti come plasmidi in E. Coli.
introduzione del DNA nellacellula ospite (trasformazione) e
isolamento delle cellule con il gene clonato
proteina codificata dal gene clonato
Produzione della proteina
dal gene clonato
La trasformazione (I)
TRASFORMAZIONE: assunzione di DNA da parte di un organismo
COMPETENZA: capacità di assumere DNA
= numero di colonie positive/microgrammo di DNA trasformato
1970: Mandel and Higa osservarono che batteri, trattati con soluzioni di CaCl2 e riscaldati velocemente, potevano essere trasformati con DNA del batteriofago λ quindi questo trattamento conferiva ai batteri un transiente stato di “competenza”
Nel corso degli anni sono stati fatti diversi tentativi per migliorare l’efficienza di trasformazione. Le due tecniche maggiormente utilizzate oggi sono:
Trasformazione per CaCl2
Elettroporazione
La trasformazione (II)
Trasformazione Per Elettroporazione
Le cellule batteriche unite al DNA vengono sottoposte ad una veloce scarica elettrica che permette la formazione di “elettropori” che favoriscono l’entrata di DNA.
Competenza: 108-1010
cellule trasformate /μg di DNA
Trasformazione in CaCl2
Crescita di un ceppo E.Coli interreno ricco di nutrienti. Le cellule si raccolgono quando sono in fase logaritmica
I cationi divalenti schermano le cariche negative sul DNA (dei gruppi fosfato)
La combinazione di bassa temperatura e di cationi divalenti può aiutare a cristallizzare regioni della membrana rendendo più accessibili i canali di assunzione del DNA
Sommario delle fasi importanti nella clonazione del DNA
1. Vettore plasmidico e DNA esogeno da inserire devono avere estremità compatibili. I due “pezzi” di DNA sono fusi creando molecole di DNA ricombinante;
2. Introduzione del DNA in cellule batteriche ospiti idonee (trasformazione)3. Selezione delle cellule resistenti all’antibiotico e selezione dei cloni che hanno assunto il DNA
ricombinante
Primo esempio di clonaggiogene di interesse
BamHI EcoRI
VETTORE I
Secondo esempio di clonaggio
gene di interesse
Not1 BglII
VETTORE I
…Come si procede ???...
1. se decido di clonare il gene di interesse BamHI-EcoRI devo essere sicura che gli stessi enzimi non tagliano all’interno della mia sequenza genica;
2. Devo disegnare due oligo, uno frw con la sequenza che possiede il sito di riconoscimento per l’enzima BamHI e uno reverse che contiene il sito di riconoscimento per l’enzima EcoRI
3. Amplificazione per PCR della sequenza genica di interesse con gli oligo disegnati;4. Purificazione della PCR preparativa5. Digestione con gli enzimi BamHI e EcoRI per la formazione delle estremità coesive6. Digestione del vettore pOTB7 con BamH1 e EcoRI 7. Ligazione con l’ezima T4 DNA ligasi
1. se decido di clonare il gene di interesse BamHI-EcoRI devo essere sicura che gli stessi enzimi non tagliano all’interno della mia sequenza genica;
1 atggagatgg aaaaggagtt cgagcagatc gacaagtccg ggagctgggc ggccatttac 61 caggatatcc gacatgaagc cagtgacttc ccatgtagag tggccaagct tcctaagaac 121 aaaaaccgaa ataggtacag agacgtcagt ccctttgacc atagtcggat taaactacat 181 caagaagata atgactatat caacgctagt ttgataaaaa tggaagaagc ccaaaggagt 241 tacattctta cccagggccc tttgcctaac acatgcggtc acttttggga gatggtgtgg 301 gagcagaaaa gcaggggtgt cgtcatgctc aacagagtga tggagaaagg ttcgttaaaa 361 tgcgcacaat actggccaca aaaagaagaa aaagagatga tctttgaaga cacaaatttg 421 aaattaacat tgatctctga agatatcaag tcatattata cagtgcgaca gctagaattg 481 gaaaacctta caacccaaga aactcgagag atcttacatt tccactatac cacatggcct 541 gactttggag tccctgaatc accagcctca ttcttgaact ttcttttcaa agtccgagag 601 tcagggtcac tcagcccgga gcacgggccc gttgtggtgc actgcagtgc aggcatcggc 661 aggtctggaa ccttctgtct ggctgatacc tgcctcttgc tgatggacaa gaggaaagac 721 ccttcttccg ttgatatcaa gaaagtgctg ttagaaatga ggaagtttcg gatggggctg 781 atccagacag ccgaccagct gcgcttctcc tacctggctg tgatcgaagg tgccaaattc 841 atcatggggg actcttccgt gcaggatcag tggaaggagc tttcccacga ggacctggag 901 cccccacccg agcatatccc cccacctccc cggccaccca aacgaatcct ggagccacac 961 aatgggaaat gcagggagtt cttcccaaat caccagtggg tgaaggaaga gacccaggag 1021 gataaagact gccccatcaa ggaagaaaaa ggaagcccct taaatgccgc accctacggc 1081 atcgaaagca tgagtcaaga cactgaagtt agaagtcggg tcgtgggggg aagtcttcga 1141 ggtgcccagg ctgcctcccc agccaaaggg gagccgtcac tgcccgagaa ggacgaggac 1201 catgcactga gttactggaa gcccttcctg gtcaacatgt gcgtggctac ggtcctcacg 1261 gccggcgctt acctctgcta caggttcctg ttcaacagca acacatag
Programma che permette di fare un’analisi di restrizione della sequenza
ggcccgtcatggagatggaaaaggagttcgagcagatcgacaagtccgggagctgggcggccatttac ------------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------------ gccggcgcttacctctgctacaggttcctgttcaacagcaacacatag
2. Devo disegnare due oligo, uno frw con la sequenza che possiede il sito di riconoscimento per l’enzima BamHI e uno reverse che contiene il sito di riconoscimento per l’enzima EcoRI
Costruzione dell’oligo frw
Codina di 5-6 nt - sequenza riconosciuta dall’enzima di restrizione (BamHI) – sequenza compresa di atg (codone di inizio). L’oligo deve essere lungo circa 15-30 nt
CTAGCGGATCCGGCCCGTCATGGAGATGGAA
Costruzione dell’oligo reverse
Sequenza fino al codone di stop (stop incluso)- sequenza riconosciuta dall’enzima di restrizione- e codina di 5-6 nt. Fare il reverse complement
TTCCTGTTCAACAGCAACACATAGGAATTCCTAGC
GCTAGGAATTCCTATGTGTTGCTGTTGAACAGGAA
• Amplificazione per PCR della sequenza genica di interesse con gli oligo disegnati;
• Purificazione della PCR preparativa• Digestione con gli enzimi BamHI e EcoRI per la formazione delle estremità
coesive• Digestione del vettore pOTB7 con BamH1 e EcoRI • Ligazione con l’ezima T4 DNA ligasi
CCGGGCAGTACCTCTACCTTTTCCTC--------------------------------------------
GGCCCGTCATGGAGATGGAAAAGGAGTTCGAGCAGATCGACAAGTCCGGGAGCTGGGCGGCCATTTAC ------------------------------------------------------------------ CGGCCGCGAATGGAGACGATGTCCAAGGACAAGTTGTCGTTGTGTATC
GCCGGCGCTTACCTCTGCTACAGGTTCCTGTTCAACAGCAACACATAG
CTAGCGGATCCGGCCCGTCATGGAGATGGAA
AAGGACAAGTTTGTCGTTGTGTATCCTTAAGGATCG