La thérapie génique: quel espoir pour les patients

HAL Id: tel-02520613https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-02520613

Submitted on 26 Mar 2020

HAL is a multi-disciplinary open accessarchive for the deposit and dissemination of sci-entific research documents, whether they are pub-lished or not. The documents may come fromteaching and research institutions in France orabroad, or from public or private research centers.

L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, estdestinée au dépôt et à la diffusion de documentsscientifiques de niveau recherche, publiés ou non,émanant des établissements d’enseignement et derecherche français ou étrangers, des laboratoirespublics ou privés.

La thérapie génique: quel espoir pour les patientsatteints de drépanocytose ?

Flavien Bizot

To cite this version:Flavien Bizot. La thérapie génique: quel espoir pour les patients atteints de drépanocytose ?.Génomique, Transcriptomique et Protéomique [q-bio.GN]. université de lorraine, 2018. Français. �tel-02520613�

https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-02520613

https://hal.archives-ouvertes.fr

UNIVERSITÉ DE LORRAINE

2018

___________________________________________________________________________

FACULTÉ DE PHARMACIE

THESE

Présentée et soutenue publiquement le 28 septembre 2018, sur un sujet dédié à :

La thérapie génique:

quel espoir pour les patients atteints de drépanocytose ?

pour obtenir

le Diplôme d'État de Docteur en Pharmacie

par Flavien BIZOT

né le 09/05/1992

Membres du Jury

Président : Danièle BENSOUSSAN Professeur des Universités, Université de Lorraine

Directeur de thèse : Loïc REPPEL Maître de Conférences, Université de Lorraine

Juges : Julien PERRIN Maître de Conférences, Université de Lorraine

Dominique STESCHENKO Médecin au CHRU de Nancy

Fabrizia BIGNAMI Docteur en biologie

UNIVERSITÉ DE LORRAINE

FACULTÉ DE PHARMACIE

Année universitaire 2018-2019

DOYEN

Raphaël DUVAL

Vice-Doyen

Julien PERRIN

Directrice des études

Marie SOCHA

Conseil de la Pédagogie

Présidente, Brigitte LEININGER-MULLER

Vice-Présidente, Alexandrine LAMBERT

Collège d'Enseignement Pharmaceutique Hospitalier

Présidente, Béatrice DEMORE

Commission Prospective Facultaire

Président, Christophe GANTZER

Vice-Président, Jean-Louis MERLIN

Commission de la Recherche

Présidente, Caroline GAUCHER

Chargés de Mission

Communication Marie-Paule SAUDER

Innovation pédagogique Alexandrine LAMBERT

Référente ADE Virginie PICHON

Référent dotation sur projet (DSP) Dominique DECOLIN

Responsabilités

Filière Officine Caroline PERRIN-SARRADO

Julien GRAVOULET

Filière Industrie Isabelle LARTAUD,

Jean-Bernard REGNOUF de VAINS

Filière Hôpital Béatrice DEMORE

Marie SOCHA

Pharma Plus ENSIC Jean-Bernard REGNOUF de VAINS

Pharma Plus ENSAIA Xavier BELLANGER

Pharma Plus ENSGSI Igor CLAROT

Cellule de Formation Continue et Individuelle Béatrice FAIVRE

Commission d'agrément des maîtres de stage François DUPUIS

ERASMUS Mihayl VARBANOV

DOYENS HONORAIRES PROFESSEURS EMERITES

Chantal FINANCE Jeffrey ATKINSON

Francine PAULUS Jean-Claude BLOCK

Claude VIGNERON Max HENRY

Alain MARSURA

Claude VIGNERON

PROFESSEURS HONORAIRES MAITRES DE CONFERENCES HONORAIRES

Pierre DIXNEUF Monique ALBERT

Chantal FINANCE Mariette BEAUD

Marie-Madeleine GALTEAU François BONNEAUX

Thérèse GIRARD Gérald CATAU

Michel JACQUE Jean-Claude CHEVIN

Pierre LABRUDE Jocelyne COLLOMB

Vincent LOPPINET Bernard DANGIEN

Alain NICOLAS Marie-Claude FUZELLIER

Janine SCHWARTZBROD Françoise HINZELIN

Louis SCHWARTZBROD Marie-Hélène LIVERTOUX

Bernard MIGNOT

Blandine MOREAU

ASSISTANTS HONORAIRES Dominique NOTTER

Francine PAULUS

Christine PERDICAKIS

Marie-Catherine BERTHE Marie-France POCHON

Annie PAVIS Anne ROVEL

Gabriel TROCKLE

Maria WELLMAN-ROUSSEAU

Colette ZINUTTI

ENSEIGNANTS Section CNU* Discipline d'enseignement

PROFESSEURS DES UNIVERSITES - PRATICIENS HOSPITALIERS

Danièle BENSOUSSAN-LEJZEROWICZ 82 Thérapie cellulaire

Jean-Louis MERLIN 82 Biologie cellulaire

Jean-Michel SIMON 81 Economie de la santé, Législation pharmaceutique

Nathalie THILLY 81 Santé publique et Epidémiologie

PROFESSEURS DES UNIVERSITES

Christine CAPDEVILLE-ATKINSON 86 Pharmacologie

Igor CLAROT 85 Chimie analytique

Joël DUCOURNEAU 85 Biophysique, Acoustique, Audioprothèse

Raphaël DUVAL 87 Microbiologie clinique

Béatrice FAIVRE 87 Hématologie, Biologie cellulaire

Luc FERRARI 86 Toxicologie

Pascale FRIANT-MICHEL 85 Mathématiques, Physique

Christophe GANTZER 87 Microbiologie

Frédéric JORAND 87 Eau, Santé, Environnement

Isabelle LARTAUD 86 Pharmacologie

Dominique LAURAIN-MATTAR 86 Pharmacognosie

Brigitte LEININGER-MULLER 87 Biochimie

Pierre LEROY 85 Chimie physique

Philippe MAINCENT 85 Pharmacie galénique

Patrick MENU 86 Physiologie

Jean-Bernard REGNOUF de VAINS 86 Chimie thérapeutique

Bertrand RIHN 87 Biochimie, Biologie moléculaire

MAITRES DE CONFÉRENCES DES UNIVERSITÉS - PRATICIENS HOSPITALIERS

Béatrice DEMORE 81 Pharmacie clinique

Alexandre HARLE 82 Biologie cellulaire oncologique

Julien PERRIN 82 Hématologie biologique

Loïc REPPEL 82 Biothérapie

Marie SOCHA 81 Pharmacie clinique, thérapeutique et biotechnique

MAITRES DE CONFÉRENCES

Sandrine BANAS 87 Parasitologie

Xavier BELLANGER 87 Parasitologie, Mycologie médicale

Emmanuelle BENOIT 86 Communication et Santé

Isabelle BERTRAND 87 Microbiologie

Michel BOISBRUN 86 Chimie thérapeutique

Ariane BOUDIER 85 Chimie physique

Cédric BOURA 86 Physiologie

Joël COULON 87 Biochimie

Sébastien DADE 85 Bio-informatique

Dominique DECOLIN 85 Chimie analytique

Roudayna DIAB 85 Pharmacie galénique

Natacha DREUMONT 87 Biochimie générale, Biochimie clinique

Florence DUMARCAY 86 Chimie thérapeutique

François DUPUIS 86 Pharmacologie

Reine EL OMAR 86 Physiologie

Adil FAIZ 85 Biophysique, Acoustique

Anthony GANDIN 87 Mycologie, Botanique

Caroline GAUCHER 86 Chimie physique, Pharmacologie

Stéphane GIBAUD 86 Pharmacie clinique

Thierry HUMBERT 86 Chimie organique

Olivier JOUBERT 86 Toxicologie, Sécurité sanitaire

Alexandrine LAMBERT 85 Informatique, Biostatistiques

Julie LEONHARD 86/01 Droit en Santé

Christophe MERLIN 87 Microbiologie environnementale

Maxime MOURER 86 Chimie organique

Coumba NDIAYE 86 Epidémiologie et Santé publique

Marianne PARENT 85 Pharmacie galénique

Caroline PERRIN-SARRADO 86 Pharmacologie

Virginie PICHON 85 Biophysique

Sophie PINEL 85 Informatique en Santé (e-santé)

Anne SAPIN-MINET 85 Pharmacie galénique

Marie-Paule SAUDER 87 Mycologie, Botanique

Guillaume SAUTREY 85 Chimie analytique

Rosella SPINA 86 Pharmacognosie

Sabrina TOUCHET 86 Pharmacochimie

Mihayl VARBANOV 87 Immuno-Virologie

Marie-Noëlle VAULTIER 87 Mycologie, Botanique

Emilie VELOT 86 Physiologie-Physiopathologie humaines

Mohamed ZAIOU 87 Biochimie et Biologie moléculaire

PROFESSEUR ASSOCIE

Julien GRAVOULET 86 Pharmacie clinique

Anne MAHEUT-BOSSER 86 Sémiologie

PROFESSEUR AGREGE

Christophe COCHAUD 11 Anglais

*Disciplines du Conseil National des Universités : 80 : Personnels enseignants et hospitaliers de pharmacie en

sciences physico-chimiques et ingénierie appliquée à la santé

81 : Personnels enseignants et hospitaliers de pharmacie en sciences du médicament et des autres produits de santé

11 Anglais

82 : Personnels enseignants et hospitaliers de pharmacie en sciences biologiques, fondamentales et cliniques

85 ; Personnels enseignants-chercheurs de pharmacie en sciences physico-chimiques et ingénierie appliquée à la santé

86 : Personnels enseignants-chercheurs de pharmacie en sciences du médicament et des autres produits de santé

87 : Personnels enseignants-chercheurs de pharmacie en sciences biologiques, fondamentales et cliniques

11 : Professeur agrégé de lettres et sciences humaines en langues et littératures anglaises et anglo-saxonnes

SERMENT DES APOTHICAIRES

Je jure, en présence des maîtres de la Faculté, des conseillers de

l’ordre des pharmaciens et de mes condisciples :

D’honorer ceux qui m’ont instruit dans les préceptes de

mon art et de leur témoigner ma reconnaissance en restant

fidèle à leur enseignement.

D’exercer, dans l’intérêt de la santé publique, ma

profession avec conscience et de respecter non seulement

la législation en vigueur, mais aussi les règles de l’honneur,

de la probité et du désintéressement.

De ne jamais oublier ma responsabilité et mes devoirs

envers le malade et sa dignité humaine ; en aucun cas, je ne

consentirai à utiliser mes connaissances et mon état pour

corrompre les mœurs et favoriser des actes criminels.

Que les hommes m’accordent leur estime si je suis fidèle à mes

promesses.

Que je sois couvert d’opprobre et méprisé de mes confrères si j’y

manque.

« LA FACULTÉ N’ENTEND DONNER AUCUNE APPROBATION NI

IMPROBATION AUX OPINIONS ÉMISES DANS LES THÈSES, CES

OPINIONS DOIVENT ÊTRE CONSIDÉRÉES COMME PROPRES À LEUR

AUTEUR ».

Remerciements

À mon père et ma mère :

Merci d’avoir toujours été là pour moi, d’avoir joué à la fois le rôle d’une fondation solide sur

laquelle je me suis construit et celui de paratonnerre en absorbant mes doutes, crainte et en

trouvant toujours les mots justes pour me rassurer et me faire aller de l’avant. Sans vous, je

ne serai jamais arrivé là où j’en suis aujourd’hui. Merci pour tout ce que vous avez fait et

continuez de faire pour moi.

À mon frère :

À ces bons moments passés en colocation, nos moments de rire et de partage. Malgré tes

efforts, tu n’as pas réussi à faire de moi un cordon bleu, préférant la facilité à la préparation

de bons petits plats. Tu as toujours été bon conseil, n’hésitant pas à me donner des astuces

et des coups de fouet pour me faire avancer. Merci pour ta bonne humeur.

À mes amis et collègues :

Merci pour tous ces bons moments passés dans la fac et en dehors.

Merci à Cédric, mon binôme et partenaire d’avoir supporté tous mes jeux de mots dont je

l’accorde tous n’étaient pas bons. Merci de m’avoir supporté tout ce temps. Nos

conversations et nos réunions révisions me manquent déjà.

Merci à Jennifer et Maud pour ces moments de joie passés à la fac et en dehors. J’espère

que nous pourrions tous nous revoir autour d’un verre pour continuer à rigoler ensemble.

Merci à Saïd, mon binôme de 2nde année qui était toujours prêt pour faire la fête et avec qui

j’ai bien rigolé.

Merci à Fayçal, Hervé, Renaud et tous les autres pour tous ces bons moments.

À mon directeur de thèse Loïc REPPEL :

Merci d’avoir accepté ce rôle et merci pour tout ce que tu as fait pour moi lors de ma

scolarité. Tu as été un très bon enseignant et un formidable maître de stage. J’espère avoir

été à la hauteur de tes espérances.

À mes professeurs et membres de mon jury :

Merci à tous pour votre investissement et votre disponibilité. Malgré vos emplois du temps

souvent surchargés, vous avez toujours trouvé du temps pour répondre aux questions des

étudiants.

Merci aux responsables de la faculté de pharmacie de Nancy qui m’ont permis de réaliser un

Master 2 à Amiens, renforçant ainsi mes connaissances.

Merci à Madame BENSOUSSAN qui m’a initié au domaine de la thérapie cellulaire et sans

qui je ne serai pas là où je suis aujourd’hui.

Merci à Madame DE ISLA et à sa doctorante Laurie TARGA qui m’initia à la culture cellulaire

et aux exigences de la recherche en biologie.

Merci à Madame GALY qui m’accueillit dans son laboratoire pour mon master 2 et qui

m’initia à la thérapie génique et à la transduction cellulaire.

1

Table des matières

LISTE DES ABREVIATIONS : ............................................................................................. 5

LISTE DES FIGURES ........................................................................................................... 6

LISTE DES TABLEAUX ....................................................................................................... 8

INTRODUCTION .................................................................................................................. 9

I. LA DREPANOCYTOSE ................................................................................................ 10

A. GENERALITE ......................................................................................................................................................... 11

1. Historique : les dates clefs de la recherche ............................................................................................... 11

2. Définition .................................................................................................................................................................. 13

3. Épidémiologie ........................................................................................................................................................ 14

a. Dans le monde........................................................................................................................................................................................ 14

b. En France ................................................................................................................................................................................................. 16

B. PHYSIOLOGIE DE L’HEMOGLOBINE ................................................................................................................... 19

1. Hémoglobine normale ........................................................................................................................................ 19

a. Structure ................................................................................................................................................................................................... 19

b. Composition de l’embryogénèse à la vie adulte .................................................................................................................... 20

2. Hémoglobine drépanocytaire ......................................................................................................................... 21

a. HbS/S ......................................................................................................................................................................................................... 21

b. HbS/C ......................................................................................................................................................................................................... 21

c. HbS/Thal ................................................................................................................................................................................................ 21

d. Les autres formes d’hémoglobines mutées ............................................................................................................................. 22

i. HbS/D-Punjab ................................................................................................................................................................................... 22

ii. HbS/E ................................................................................................................................................................................................... 22

C. DIAGNOSTIC .......................................................................................................................................................... 24

1. Diagnostic clinique .............................................................................................................................................. 24

a. Clinique du trait drépanocytaire................................................................................................................................................... 24

b. Principaux symptômes cliniques de la drépanocytose ...................................................................................................... 24

i. La crise vaso-occlusive ................................................................................................................................................................. 25

ii. L’anémie ............................................................................................................................................................................................. 26

iii. Le syndrome thoracique aiguë ............................................................................................................................................... 26

iv. La fièvre ............................................................................................................................................................................................. 27

v. Le priapisme ..................................................................................................................................................................................... 28

vi. Les Accidents Vasculaires Cérébraux.................................................................................................................................. 28

2. Diagnostic biologique ......................................................................................................................................... 29

3. Dépistage néonatal .............................................................................................................................................. 30

D. PRISE EN CHARGE ................................................................................................................................................ 31

2

1. Traitement symptomatique ............................................................................................................................. 31

a. Traitement des crises vaso-occlusives ....................................................................................................................................... 31

b. Traitement des anémies aiguës ..................................................................................................................................................... 31

c. Syndrome thoracique aiguë ............................................................................................................................................................. 31

d. Traitement des infections ................................................................................................................................................................ 31

e. Le priapisme ........................................................................................................................................................................................... 32

2. Traitement spécialisé ......................................................................................................................................... 32

a. Transfusion sanguine ......................................................................................................................................................................... 32

b. Hydroxyurée ........................................................................................................................................................................................... 33

c. Allogreffe de cellules souches hématopoïétiques ................................................................................................................. 33

II. LA THERAPIE GENIQUE ............................................................................................ 35

A. GENERALITE ......................................................................................................................................................... 36

B. LES OBJECTIFS DE LA THERAPIE GENIQUE ....................................................................................................... 37

1. La modification d’un gène ................................................................................................................................ 37

a. La méthode ZFN .................................................................................................................................................................................... 37

b. La méthode TALEN.............................................................................................................................................................................. 38

c. La méthode CRISPR ............................................................................................................................................................................. 39

2. La modulation de l’expression d’un gène .................................................................................................. 40

a. ARN interférent ..................................................................................................................................................................................... 40

b. Ribozymes et déoxyribozymes ...................................................................................................................................................... 41

3. L’ajout d’un gène .................................................................................................................................................. 42

C. LES MODALITES D’ADMINISTRATION ............................................................................................................... 43

1. La thérapie génique ex vivo ............................................................................................................................. 43

2. La thérapie génique in vivo ............................................................................................................................. 44

D. LES PRINCIPAUX VECTEURS DE TRANSDUCTION CELLULAIRE ..................................................................... 46

1. Les vecteurs viraux .............................................................................................................................................. 46

a. Adénovirus .............................................................................................................................................................................................. 47

b. Les virus adéno-associés .................................................................................................................................................................. 49

c. Rétroviridae ............................................................................................................................................................................................ 49

d. Herpès simplex virus .......................................................................................................................................................................... 51

2. Les vecteurs synthétiques ................................................................................................................................. 53

a. Lipides cationiques .............................................................................................................................................................................. 54

b. Polymères cationiques ...................................................................................................................................................................... 56

3. Les méthodes physiques .................................................................................................................................... 57

a. ADN nu ....................................................................................................................................................................................................... 57

b. Le canon à ADN ..................................................................................................................................................................................... 58

c. L’électroporation .................................................................................................................................................................................. 58

d. La sonoporation .................................................................................................................................................................................... 59

e. La magnétofection................................................................................................................................................................................ 60

3

III. LES ESSAIS CLINIQUES DE THERAPIES GENIQUES POUR LE TRAITEMENT DE

LA DREPANOCYTOSE ...................................................................................................... 62

A. INTRODUCTION SUR LES ESSAIS CLINIQUES DE THERAPIE GENIQUE ........................................................... 63

B. LA REGLEMENTATION SPECIFIQUE AUX ESSAIS CLINIQUES .......................................................................... 65

1. Définition d’un essai clinique .......................................................................................................................... 65

a. Le promoteur.......................................................................................................................................................................................... 65

b. L’investigateur ....................................................................................................................................................................................... 65

2. Statut réglementaire des médicaments de thérapie génique .......................................................... 66

a. Définition des médicaments de thérapie innovante ........................................................................................................... 66

b. Les normes de fabrication ............................................................................................................................................................... 68

i. Des MTI ................................................................................................................................................................................................ 68

ii. Des MTI-PP ........................................................................................................................................................................................ 68

c. La réglementation pour les essais cliniques utilisant des MTI ....................................................................................... 69

d. Les acteurs des essais cliniques .................................................................................................................................................... 69

e. La traçabilité ........................................................................................................................................................................................... 70

C. LES ETAPES CLEFS POUR LA MISE EN PLACE D’ESSAIS CLINIQUES DE THERAPIE GENIQUE EX VIVO. ...... 71

1. Obtention des cellules ......................................................................................................................................... 71

a. Prélèvement de Moelle Osseuse .................................................................................................................................................... 71

b. Mobilisation cellulaire ....................................................................................................................................................................... 72

c. Cellules de sang de cordon ombilical .......................................................................................................................................... 73

2. Transduction cellulaire ..................................................................................................................................... 74

a. Nombre de copies de gène ............................................................................................................................................................... 74

b. Étude du ou des sites d’intégration ............................................................................................................................................. 75

3. Greffe cellulaire ..................................................................................................................................................... 75

D. LES ESSAIS CLINIQUES DE THERAPIE GENIQUE EN COURS POUR LE TRAITEMENT DE LA

DREPANOCYTOSE .......................................................................................................................................................... 77

1. Apporter un gène fonctionnel de la chaine bêta de l’hémoglobine ............................................... 80

a. Le vecteur HPV569 .............................................................................................................................................................................. 80

i. La construction du vecteur ......................................................................................................................................................... 80

ii. Protocole de greffe cellulaire ................................................................................................................................................... 81

iii. Résultats ........................................................................................................................................................................................... 81

b. Le vecteur BB305 ................................................................................................................................................................................. 83

i. Construction du vecteur .............................................................................................................................................................. 83


iii. Résultats ........................................................................................................................................................................................... 83

c. Le vecteur βAS3-FB ............................................................................................................................................................................. 86



iii. Résultats ........................................................................................................................................................................................... 88

2. Augmenter la production d’HbF .................................................................................................................... 89

a. Ajout du gène gamma de l’hémoglobine ................................................................................................................................... 89

4



iii. Résultats ........................................................................................................................................................................................... 90

b. Inhibition de BCL11A ......................................................................................................................................................................... 91



iii. Résultats ........................................................................................................................................................................................... 94

E. AUTRES PISTES THERAPEUTIQUES ENVISAGEES ............................................................................................. 95

1. Inhibition de KLF1 ............................................................................................................................................... 95

2. Édition du génome ............................................................................................................................................... 96

IV. CONCLUSION ET PERSPECTIVES .......................................................................... 99

BIBLIOGRAPHIE ............................................................................................................. 102

ANNEXE 1 : BROCHURE DE DEPISTAGE NEONATAL DE AFDPHE ........................... 114

ANNEXE 2 : PROCEDURE D’INSTRUCTION DES DOSSIERS DE THERAPIE GENIQUE.

......................................................................................................................................... 115

ANNEXE 3 : SEQUENCE NUCLEOTIDIQUE, AVEC LES ACIDES AMINES

CORRESPONDANTS, DE LA CHAINE BETA DE L'HEMOGLOBINE. ........................... 116

5

Liste des abréviations :

AAV : virus adéno-associés

ADN : acide désoxyribonucléique

AFDPHE : Association Française pour le Dépistage et la Prévention des Handicaps de

l’Enfant

ANSM : Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé

ARN : acide ribonucléique

AVC : Accidents Vasculaires Cérébraux

cm : centimètre

CRISPR : clustered short palindromic repeats

CVO : Crise Vaso Occlusive

GVHD : maladie du greffon versus l’hote

Hb : Hémoglobine

HCB : Haut Conseil en Biotechnologie

kb : kilobase

ms : milliseconde

MTI-PP : Médicament de Thérapie Innovante Préparé Ponctuellement

OMS : Organisation Mondiale de la Santé

siARN : petit ARN interférents

shARN : ARN en épingle à cheveux

TALEN : transcription activator-like effector nucleases

VCN : copie de gène intégré (vector copy number)

ZFN : zinc finger nuclease

6

Liste des figures

Figure 1: Arbre généalogique présentant le génotype d'une famille porteuse de la mutation responsable de la

drépanocytose (gène S). ___________________________________________________________________________________________ 14

Figure 2: Taux de Prévalence de l'hémoglobine S en Afrique . __________________________________________________ 16

Figure 3: Répartition des décès dus au paludisme dans le monde (en 2010). __________________________________ 16

Figure 4: Répartition géographique des enfants nés drépanocytaires (en rouge) ou hétérozygotes (en bleu)

en France métropolitaine en 2016. _______________________________________________________________________________ 18

Figure 5: Structure d'une molécule d'hémoglobine . ____________________________________________________________ 19

Figure 6: Site de l’hématopoïèse et expression des différentes chaines de l'hémoglobine au cours du

développement. ____________________________________________________________________________________________________ 20

Figure 7: Schéma bilan de la clinique drépanocytaire. __________________________________________________________ 25

Figure 8: Radiographie du thorax montrant des infiltrats alvéolaires prédominant aux bases, accompagnés

d'un possible épanchement pleural à la base pulmonaire droite. _______________________________________________ 27

Figure 9: Présentation du fonctionnement des ZFN. _____________________________________________________________ 38

Figure 10: Méthodes de réparation de l'ADN suite à une coupure double brin induite par la méthode CRISPR.

_____________________________________________________________________________________________________________________ 40

Figure 11: Structure d'une molécule de ribozyme. ______________________________________________________________ 41

Figure 12: Comparaison des stratégies de thérapie génique : in vivo, où les cellules sont directement

modifiées dans l’organisme et ex vivo avec des cellules modifiées avant injection au patient. ________________ 43

Figure 13: Structure d'un adénovirus . ___________________________________________________________________________ 47

Figure 14: Schéma de transduction cellulaire des adénovirus __________________________________________________ 48

Figure 15: Structure d'un rétrovirus, exemple du lentivirus VIH-1. _____________________________________________ 50

Figure 16: Schéma de transduction cellulaire des rétrovirus. ___________________________________________________ 50

Figure 17: Représentation de la structure génomique provirale du VIH-1. ____________________________________ 51

Figure 18: Schéma de transduction cellulaire des vecteurs dérivés d'HSV _____________________________________ 52

Figure 19: Structure générale d'un lipide cationique ___________________________________________________________ 54

Figure 20: Exemple de particules lipidiques formées dans un solvant aqueux. ________________________________ 55

Figure 21: Structure des principaux polymères cationiques. ____________________________________________________ 56

Figure 22: Effets de la cavitation stable (A à C) et inertielle (D et E) sur la membrane cellulaire lors de

l'internalisation de la microbulle. ________________________________________________________________________________ 60

Figure 23: Répartition des essais cliniques de thérapie géniques dans le monde (n) en fonction de la nature

de la pathologie. ___________________________________________________________________________________________________ 63

Figure 24: différence entre préparation cellulaire, et médicament de thérapie innovante. ___________________ 67

Figure 25: Induction de la polymérisation de l'hémoglobine S. _________________________________________________ 78

Figure 26: Partie intégrée dans le génome cellulaire du vecteur lentiviral utilisé pour le traitement de la

drépanocytose par thérapie génique. ____________________________________________________________________________ 78

Figure 27: Vecteur lentiviral HPV569. ___________________________________________________________________________ 81

Figure 28: Vecteur lentiviral BB305. _____________________________________________________________________________ 83

7

Figure 29: Vecteur βAS3-FB. ______________________________________________________________________________________ 87

Figure 30: Vecteur lentiviral contenant le gène de la chaine gamma de l’Hb. _________________________________ 89

Figure 31: Complexe BCL11 avec ses cofacteurs principaux. ____________________________________________________ 92

Figure 32: Représentation du shARNmir . _________________________________________________________________________ 93

Figure 33: Vecteur LCR-shARNmir. ________________________________________________________________________________ 93

Figure 34: Principe de la recombinaison homologue. ___________________________________________________________ 97

8

Liste des tableaux

Tableau I: présentation du taux de drépanocytose à la naissance et du nombre d’habitants pour chaque

région du monde. __________________________________________________________________________________________________ 15

Tableau II: proportion en % de chaque type d'hémoglobine pour les génotypes drépanocytaires les plus

fréquents ainsi que pour le trait drépanocytaire et le génotype sain. __________________________________________ 23

Tableau III: Résumé des avantages et des limites des méthodes de thérapie génique _________________________ 45

Tableau IV : Résumé des avantages et inconvénients des vecteurs et méthodes de thérapie génique ________ 61

Tableau V: Nombre d'essais clinique dans le champs des produits biologiques de 2011 à 2016. _____________ 64

Tableau VI: Nombre d'unité de thérapie génique/cellulaire, banque de tissus et établissement MTI-PP

(Médicament de Thérapie Innovante Préparé Ponctuellement) en France de 2012 à 2016. __________________ 64

Tableau VII: Présentation des résultats obtenus chez 4 patients atteints de drépanocytoses ayant subi une

greffe de CSH allogéniques ________________________________________________________________________________________ 76

Tableau VIII: Présentation des essais cliniques de thérapie génique dans le traitement de la drépanocytose en

cours de réalisation. _______________________________________________________________________________________________ 79

Tableau IX: Présentation des résultats obtenus en cliniques avec le vecteur HPV569 _________________________ 82

Tableau X: Présentation des résultats obtenus chez 7 patients traités à l'aide du vecteur BB305. ___________ 84

Tableau XI: Présentation des résultats obtenus chez un patient français traité à l'aide du vecteur BB305. _ 85

Tableau XII: Bilan des résultats obtenus avec les différentes thérapies actuellement testées en clinique ____ 98

9

Introduction

La thérapie génique représente, à l’heure actuelle, un enjeu majeur dans la prise en charge

des patients. Apparu dans la seconde moitié du XXème siècle, suite à la découverte de la

structure de l’ADN en 1953 par J.D. Watson et F.H. Crick, cette nouvelle thérapie a déjà

permis la mise sur le marché de nouveaux traitements (immunothérapies, vaccins

recombinants, hormones de croissance…). Ce développement très rapide a redonné espoir

aux patients pour lesquels aucun traitement n’était disponible. La thérapie génique s’est

donc intéressée à ces patients qui souffraient pour la plupart de maladies orphelines telles

que les maladies génétiques (comme la drépanocytose que nous développerons), les

déficits immunitaires (comme le syndrome de Wiskott Aldrich) ou les cancers.

Pour pouvoir traiter efficacement ces patients, la thérapie génique s’attaque à l’essence

même de la maladie. Ici, la cause principale des pathologies est une modification génétique

par ajout, retrait ou changement de séquence d’un ou plusieurs gènes. Si la thérapie

génique arrive à identifier le gène en cause et à le corriger, on peut alors espérer guérir de

cette maladie voir l’éradiquer.

Pour atteindre ces objectifs, un large panel d’outils et de méthodes a été développé. Il est

aujourd’hui possible d’isoler des cellules multipotentes, de les modifier et de les réimplanter

afin de traiter durablement un tissu (exemple des cellules souches hématopoïétiques pour

traiter le sang). Il est également possible de modifier le génome des cellules directement in

vivo à l’aide de vecteurs spécifiques (exemple vecteurs anticancéreux).

L’objectif de cette thèse est donc de faire un point sur les avancées en thérapie génique et

plus précisément celles qui visent à traiter une maladie particulière : la drépanocytose. Pour

ce faire, nous définirons la drépanocytose puis nous étudierons les outils de thérapie

génique à notre disposition et nous finirons par donner les premiers résultats cliniques

obtenus par la thérapie génique pour le traitement de cette maladie.

10

I. La drépanocytose

11

A. Généralité

La drépanocytose ou anémie falciforme fut à son origine considérée comme la maladie des

personnes noires. Cette croyance est due aux origines de la pathologie et à son histoire.

Afin de mieux comprendre pourquoi l’Homme africain noir est plus sujet à cette maladie que

le reste du monde, nous reviendrons sur l’histoire de la maladie et sa répartition dans le

monde.

1. Historique : les dates clefs de la recherche

La drépanocytose, dont l’apparition remonte à plusieurs siècles, n’a été décrite pour la

première fois qu’en 1904 par le professeur James HERRICK après consultation d’un

étudiant antillais de 20 ans hospitalisé pour un rhume (1). Le professeur donne pour la

première fois un tableau clinique de la maladie comprenant tous les symptômes de l’anémie

hémolytique chronique ainsi que les cellules responsables : les hématies falciformes.

En 1917, le Dr EMMEL découvre que les hématies des patients atteints de drépanocytose

ont une forme normale en présence d’oxygène. Il montre que la forme des érythrocytes est

dépendante du taux d’oxygène et il introduit les notions de falciformation et défalciformation

ainsi que la notion de test diagnostic (test d’Emmel) (2).

En 1940, Irving SHERMAN alors étudiant à l’université Johns HOPKINS constate que les

hématies des patients atteints de drépanocytose ne possèdent pas les mêmes propriétés

physico-chimique que celles des patients sains (3). En se basant sur ce constat, le

professeur Linus PAULING découvre en 1949 deux types d’hémoglobine : l’hémoglobine A

présente chez les patients sains et l’hémoglobine S chez les patients drépanocytaires. Le

professeur PAULING montre que l’hémoglobine S possède plus de cations que

l’hémoglobine A (4). Il émet également les hypothèses que ce sont ces cations qui, en se

couplant avec l’atome de fer présent dans les hématies, donnent la forme de faucille à la

cellule et qui sont des inhibiteurs compétitifs aux molécules d’oxygènes ; expliquant ainsi les

difficultés d’oxygénation des patients lors d’efforts physiques.

En 1949, James NEEL découvre que la drépanocytose est une maladie génétique à

transmission autosomique récessive (5). Il décrit des patients sains n’ayant que de

l’hémoglobine A, des porteurs sains ayant autant d’hémoglobine A que S et des patients

drépanocytaires ayant uniquement de l’hémoglobine S. Cette découverte fut le premier pas

vers la thérapie génique.

12

En 1956, Vernon INGRAM complète la découverte du professeur PAULING et découvre que

les deux types d’hémoglobines n’ont qu’un acide aminé de différent (6). Dans les années

1960, le projet mondial de séquençage du génome humain a permis aux scientifiques de

mettre en évidence le gène de la chaine bêta de l’hémoglobine sur le chromosome 11. En

1978, Tom Maniatis isole et séquence les gènes des chaines bêta et delta de l’hémoglobine

(7). La même année, Richard Rifkind découvre le fonctionnement de l’érythropoïèse et

différencie des cellules en érythrocyte in vitro (8).

En 1981, un premier programme de dépistage fut mis en place aux Antilles. Une goutte de

sang des enfants présentant un risque de développer la drépanocytose en raison de leurs

origines a été prélevée dès les premiers jours de vie afin de séquencer le gène de la chaine

bêta de l’hémoglobine. La France métropolitaine fit ces premiers dépistages en 1985 à

Marseille puis à Paris et Lille à partir de 1987 avant de l’étendre à tout le territoire en 2000.

Ces premiers tests furent très importants, car ils permirent à la fois de réaliser des

statistiques sur le nombre d’enfants porteurs d’une ou de deux mutations, mais aussi

d’améliorer la prise en charge des enfants (développé dans le point I.D de ce manuscrit).

En 1995, la prise en charge des patients prend un tournant avec la mise sur le marché du

premier médicament pour le traitement de la drépanocytose : l’hydroxycarbamide (ou

hydroxyurée). Cette molécule engendre la production d’hémoglobine fœtale, plus affine que

l’hémoglobine S pour l’oxygène. Ce changement de composition en hémoglobine des

hématies permet de réduire le nombre de crises vaso-occlusives, les recours à la

transfusion et les complications menaçant le pronostic vital des patients, mais sans guérir

les patients de la maladie.

À partir du milieu des années 1980, les médecins ont traité les patients à l’aide d’allogreffes

de cellules souches hématopoïétiques (CSH) de moelle osseuse. Les cellules sont

prélevées chez des donneurs apparentés sains dont le groupe HLA (human leucocyte

antigen) est le plus proche possible de celui du patient. Seuls les patients présentant les

symptômes les plus graves, nécessitant plusieurs transfusions sanguines par semaine

étaient éligibles à ce traitement à cause des effets secondaires graves associés. Les risques

les plus importants étant : la non prise de greffe, la leucémie, la maladie du greffon versus

l’hôte (GVHD : graft versus host disease) et des infections secondaires à l’aplasie médullaire

initiale (9). En 1998, alors que les protocoles de greffes de CSH de moelle osseuse

commencent à être maitrisés, un patient reçoit une greffe de CSH issues d’un sang de

cordon ombilical. Cette greffe fut réalisée en raison de la sévérité de la maladie et du

manque de donneur HLA compatible. Le patient fut déclaré guéri un an après la greffe et

13

des études ont démontré que les CSH issues de sang de cordons ombilicaux provoquaient

moins de GVHD, mais qu’elles ne pouvaient être utilisées que chez les enfants ou jeunes

adolescents en raison du nombre limité de cellules souches par prélèvement (10).

En conclusion, les avancés réalisées depuis 1904 ont permis de mieux connaître la

pathologie, de mettre au point une méthode efficace de dépistage et d’améliorer

considérablement la prise en charge des patients. Grâce à ces découvertes, une définition

précise de la maladie a pu être obtenue.

2. Définition

La drépanocytose est une hémoglobinopathie, autosomique récessive touchant la

production de l’hémoglobine impliquée dans le fonctionnement des hématies. Les

hémoglobinopathies sont classées en deux grandes familles :

Les quantitatives qui ont une production réduite en hémoglobine. La maladie majeure

de ce groupe est la thalassémie.

Les structurales qui sont définies par une production d’hémoglobine anormale

présentant une ou plusieurs mutations. La maladie majeure de ce groupe est la

drépanocytose.

Le mot drépanocytose est composé de deux mots grecs : « drepanon » qui signifie faucille

et « kutos » pour cellule. Cette maladie est donc caractérisée par la présence d’hématies

falciformes possédant une faible affinité pour l’oxygène. Cette modification des hématies va

entre autres impacter l’oxygénation des organes et provoquer des crises vaso-occlusives

sévères en cas d’activité physique intense et prolongée.

La drépanocytose est causée par une mutation du gène de la chaine bêta de l’hémoglobine

présent sur le chromosome 11. Cette mutation conduit à la production en quantité normale

d’hémoglobine mutée. La transmission de l’allèle S muté est mendélienne récessive, c’est-à-

dire qu’il faut que les deux allèles (celui venant du père et celui de la mère) soient mutés

pour déclarer la maladie. Ainsi, une personne, dont les deux parents sont porteurs sains

(AS), a 25% de risque d’être drépanocytaire (SS) et 25% de n’avoir aucun allèle muté (AA)

(Figure 1). Par contre si un des parents est drépanocytaire et l’autre porteur sain, alors la

probabilité que l’enfant soit malade est de 50%. De même si un des deux parents ne

possède pas d’allèle S, aucun enfant ne sera drépanocytaire.

14

Figure 1: Arbre généalogique présentant le génotype d'une famille porteuse de la mutation

responsable de la drépanocytose (gène S).

En vert : personne saine (AA), en orange : porteur sain (AS), en rouge : personne atteinte de

drépanocytose (SS).

Maintenant que nous avons une définition précise de la maladie, étudions sa répartition

géographique dans le Monde et en France métropolitaine.

3. Épidémiologie

a. Dans le monde

La drépanocytose fait partie des maladies acquises dès la naissance les plus répandues

dans le monde (11). Elle touche 276 000 naissances par an et concerne principalement

l’Afrique avec 233 000 nouveaux cas par an soit 10,68/1 000 nouveau-nés et à un plus faible

niveau le Proche et Moyen-Orient (0,84/1 000) et l’Asie équatoriale (0,68/1 000) (Tableau I).

15

Tableau I: présentation du taux de drépanocytose à la naissance et du nombre d’habitants

pour chaque région du monde (12).

Région du monde Population

(millions)

Naissance annuelle

(milliers)

Naissance drépanocytaire

(pour 1000 naissances)

Afrique 586 22 895 10,68

Amérique 853 16 609 0,49

Proche et Moyen

Orient 573 16 798 0,84

Europe 879 10 459 0,07

Asie 1 564 38 139 0,68

Asie pacifique et

Océanie 1 761 23 914 0,00

Monde 6 217 128 814 2,28

Cette répartition des patients (Figure 2) fait penser à l’incidence d’une autre maladie : le

paludisme (Figure 3). Le paludisme, avec un taux de mortalité entre 1 mois et 4 ans de

8,3/1000, est la 2ème cause de mortalité infantile en Afrique après les pneumonies

(13,2/1000) et avant les diarrhées (7,9/1000) (chiffres OMS année 2015 (13)). Le fort taux

de mortalité infantile du paludisme a, avec le temps, fait augmenter la proportion des

personnes possédant un allèle S muté et donc le nombre de patient drépanocytaire dans

ces territoires. En effet, les patients atteints de trait drépanocytaire ont moins de risque

d’être infectés par le Plasmodium responsable du paludisme et font moins d’infections

sévères que les patients possédant les deux allèles sauvages A (14,15). Cette protection

relative vis-à-vis de cette pathologie s’explique par deux processus (16) :

1. La déformation en forme de faucille des hématies infectées par le parasite.

2. La phagocytose des hématies falciformes par les leucocytes avant que le parasite

n’ait pu proliférer.

Ainsi, à l’échelle mondiale, la drépanocytose est très majoritairement localisée en Afrique

équatoriale en raison de sa protection relative vis-à-vis d’un parasite : le Plasmodium. Quelle

est l’incidence de la drépanocytose dans les Pays comme la France où le paludisme n’est

pas présent ?

16

Figure 2: Taux de Prévalence de l'hémoglobine S en Afrique (17).

Figure 3: Répartition des décès dus au paludisme dans le monde (en 2010).

b. En France

La drépanocytose est la maladie héréditaire la plus fréquente en France en concernant une

naissance sur 1836 en 2016 (outre-mer inclus) (Source : Bilan d’activité 2016 de

l’Association Française pour le Dépistage et la Prévention des Handicaps de l’Enfant

(AFDPHE)). Son incidence dans la population générale n’est pas connue avec précision.

Seuls les chiffres liés aux hospitalisations et aux dépistages néonataux sont connus avec

17

précision. En 2009, 9.000 personnes ont été hospitalisées pour traiter une crise

drépanocytaire (rapport 2011 du ministère de la Santé). Le nombre de patients

drépanocytaires en France peut donc être estimé à plus de 10.000. Le nombre de patients

porteurs du trait drépanocytaire ne peut pas être estimé, car, étant asymptomatiques, ces

personnes ne font pas de crise drépanocytaire nécessitant une hospitalisation.

Les programmes de dépistage des enfants à risques, menés par l’AFDPHE, se sont

généralisés de 2006 à 2016 passant de 27% à 39,39% de nouveau-nés testés. Cette

augmentation a permis le diagnostic de 100 enfants supplémentaires. L’incidence globale de

la maladie en France métropolitaine est ainsi passée de 1/2789 en 2006 à 1/2088 en 2016

avec 356 naissances annuelles porteuses de la double mutation. De même, en 2016, 8172

enfants sont nés hétérozygotes avec un seul allèle muté.

La répartition de la maladie est inégale sur le territoire avec une forte incidence en Guyane

(1 naissance sur 206) où le paludisme est présent et une absence de nouveau cas à Saint

Pierre et Miquelon où le paludisme est absent. En métropole, la région la plus concernée,

représentant plus de 60% des cas, est l’Ile de France avec une incidence de 1/824 et la

moins concernée est la Corse avec aucun cas (Figure 4). Cette différence entre l’Ile de

France et le reste de la métropole s’explique par une proportion plus importante de

personnes originaires d’Afrique noire dans cette région.

Maintenant que nous connaissons la définition et l’histoire de la drépanocytose, nous allons

étudier ses conséquences sur la molécule au centre de la pathologie : l’hémoglobine.

18

Figure 4: Répartition géographique des enfants nés drépanocytaires (en rouge) ou

hétérozygotes (en bleu) en France métropolitaine en 2016.

En noir : l’incidence de la maladie par région (porteur homozygote). (Données issus du bilan

d’activité 2016 de AFDPHE paru le 16/10/2017)

19

B. Physiologie de l’hémoglobine

La drépanocytose étant une hémoglobinopathie, il est nécessaire de connaitre le rôle et la

structure de l’hémoglobine pour comprendre les conséquences des modifications apportées

par la pathologie. Dans un premier temps, nous étudierons l’hémoglobine du développement

normal de l’embryon à l’âge adulte, puis nous introduirons les différentes mutations portées

sur le gène codant sa chaine bêta.

1. Hémoglobine normale

a. Structure

L’hémoglobine est la protéine des hématies. Elle est formée de deux parties : une protéique

la globine et une non protéique : l’hème (Figure 5). Les quatre chaines de globines

présentes dans l’hémoglobine sont réparties en deux types différents : 2 font partie de la

famille alpha, codées par un cluster de gène présent sur le chromosome 16 et deux de la

famille bêta, codées par un cluster de gène présent sur le chromosome 11. Les chaines

d’hémoglobines sont retenues dans les hématies par les protéines de la membrane et du

cytosquelette. Ces protéines leurs donnent les propriétés physiques de déformabilité

nécessaires pour traverser les capillaires dont le diamètre est inférieur à la taille des

hématies. L’hémoglobine permet également par les atomes de fer présents sur les

molécules d’hèmes de fixer et de transporter l’oxygène.

Figure 5: Structure d'une molécule d'hémoglobine (18).

20

b. Composition de l’embryogénèse à la vie adulte

La composition et l’origine des hématies évoluent avec le développement de l’embryon en

Homme adulte afin de pouvoir assurer l’oxygénation de toutes les cellules de l’organisme

(Figure 6). Les premiers hémoglobines, présentes chez l’embryon, sont composées de 2

chaines epsilon et 2 chaines zêta. Cette hémoglobine est plus affine pour l’oxygène que la

forme adulte ce qui permet le transfert de ce dernier du sang de la mère à l’embryon.

À partir de 6 semaines après la conception, le foie et la rate fœtaux vont produire un

nouveau type d’hémoglobine : l’hémoglobine fœtale (HbF) alpha2gamma2. Cette

hémoglobine est plus affine pour l’oxygène que la forme adulte ce qui permet également le

transfert, au niveau du placenta, de l’oxygène du sang de la mère à celui du fœtus.

À la naissance, la moelle osseuse de l’enfant va produire les érythrocytes adultes qui sont

composés de deux types d’hémoglobines différentes que sont :

HbA composée de 2 chaines alpha et deux chaines bêta. Cette hémoglobine est

présente dans plus de 95% des hématies adultes.

HbA2, dont la composition est alpha2delta2, est présente dans 2 à 3% des hématies

adultes.

Figure 6: Site de l’hématopoïèse et expression des différentes chaines de l'hémoglobine au

cours du développement (19).

21

2. Hémoglobine drépanocytaire

a. HbS/S

C’est la mutation la plus fréquemment retrouvée chez les patients drépanocytaires. Elle est

caractérisée par la présence sur les deux chromosomes 11 du gène HbS. Ce gène est un

mutant de celui codant pour la chaine bêta de l’hémoglobine (HbA). Il existe un seul

nucléotide de différent entre les deux gènes : l’Adénine en position 17 qui devient une

Thymine. Cette mutation entraîne le remplacement, dans la protéine, de l'acide glutamique

en position 6 par de la valine.

Bien que l’HbS soit la mutation responsable de la drépanocytose, d’autres mutations

peuvent, quand elles y sont associées provoquer un syndrome drépanocytaire.

b. HbS/C

Les patients souffrant de la forme SC de la drépanocytose les SC sont double-

hétérozygotes pour une mutation de la beta globine, une responsable de production d'Hb S,

une responsable de la production d'Hb C. Cette dernière est caractérisée, comme pour HbS,

par une mutation ponctuelle du gène HbA au niveau du 6ème acide aminé. L’acide

glutamique devient ici une lysine.

La présence de l’HbC dans l’hématie stimule les transports ioniques membranaires et est à

l’origine d’une microcytose. Sa combinaison avec l’hémoglobine S est responsable d’une

forme modérée de la maladie drépanocytaire.

c. HbS/Thal

Les patients atteints de ce type de drépanocytose présentent sur un chromosome 11 la

mutation HbS et sur l’autre chromosome une bêta thalassémie (Thal). La thalassémie est

une maladie où l’hémoglobine n’est pas produite (Thal 0) ou produite sous une forme

normale mais en quantité faible (Thal +).

La sévérité de ce type de drépanocytose est fonction de la gravité de la thalassémie

associée. Si la thalassémie est faible, le patient souffrira d’une forme modérée de

drépanocytose avec jusqu’à 30% d’hémoglobine normale. Au contraire, en cas de

22

thalassémie 0, le patient ne produira pas d’HbA et aura le même phénotype que ceux

souffrant de la forme S/S.

d. Les autres formes d’hémoglobines mutées

i. HbS/D-Punjab

Les patients souffrant de la forme S/D Punjab de la drépanocytose possèdent deux

mutations différentes du gène HbA. Le gène HbS est présent sur le premier chromosome et

le gène HbD Punjab sur le second. Ce dernier est caractérisé par une mutation ponctuelle

du gène HbA au niveau du 121ème acide aminé : la glutamine devient de l’acide glutamique.

Ce type de drépanocytose est principalement présent en Inde. Les symptômes sont

similaires à ceux de la forme S/S avec un plus fort risque d’hémolyse. Ce phénomène

s’explique par la capacité de l’HbD à augmenter la polymérisation de HbS et donc la

falciformation des érythrocytes (20).

D’autres variants de l’hémoglobine D, moins rependus, existent : Hb D-Agri, Hb D-Bushman,

Hb D-Ouled Rabah, Hb D-Iran, Hb D-Granada, Hb D-Ibadan et Hb D-Neath. Ils ont un

phénotype similaire à celui de Punjab mais comportent des mutations différentes.

ii. HbS/E

L’hémoglobine E est principalement présente en Asie du Sud-est et se caractérise par une

mutation au niveau de 26ème triplet du gène de l’HbA. Cette mutation engendre le

remplacement de la glutamine par une lysine et provoque l’apparition, sur l’ARN (acide

ribonucléique) messager, d’un site alternatif d’épissage. Ce dernier est à l’origine d’une β-

thalassémie modérée. La clinique des patients souffrant de la double mutation HbS/HbE est

similaire à ceux souffrant de la forme HbS/βThal+.

Comme nous venons de le voir, il existe différents génotypes pour la drépanocytose et ils ne

sont pas tous associés au même phénotype. Les formes les moins graves produisent

encore un peu d’hémoglobine A alors que les plus sévères produisent quasi exclusivement

de l’hémoglobine mutée (Tableau II). Intéressons-nous désormais aux méthodes

diagnostiques et à la clinique de la maladie.

23

Tableau II: proportion en % de chaque type d'hémoglobine pour les génotypes

drépanocytaires les plus fréquents ainsi que pour le trait drépanocytaire et le génotype sain.

(21).

condition génotype HbA HbS HbC HbF HbA2

normale A/A 95-98 0 0 <1 <3,5

Trait

drépanocytaire A/S 50-60 35-45 0 1-3 <3,5

drépanocytose

S/S 0 85-90 0 2-15 <3,5

S/C 0 45-50 45-80 1-8 <3,5

S/Thal + 5-30 65-90 0 2-10 >3,5

S/Thal 0 0 80-92 0 2-15 >3,5

24

C. Diagnostic

Comme nous venons de le voir, il existe différents types de drépanocytose. Pour pouvoir

prendre en charge efficacement les patients, il est nécessaire d’adapter les protocoles de

prise en charge aux risques associés à chaque type. Pour ce faire, le personnel soignant a à

sa disposition différentes méthodes de diagnostic : allant du diagnostic

clinique/symptomatique au diagnostic néonatal (22).

1. Diagnostic clinique

a. Clinique du trait drépanocytaire

Les patients atteints de trait drépanocytaire sont des porteurs hétérozygotes aux gènes de

l’HbS. Ils sont également appelés porteurs sains, car ils ne présentent pas les symptômes

cliniques de la maladie. Des études ont été réalisées sur cette population afin de connaitre

les risques cardiaques encourus en cas d’exercices physiques. Les résultats ont conclu à

l’absence de différence significative avec les patients porteurs d’aucune mutation de

l’hémoglobine (23,24).

Les patients porteurs sains, étant asymptomatiques, n’ont besoin d’aucune prise en charge

médicale particulière proprement dite. Les seules consultations médicales qu’ils devront

réaliser seront pour du conseil génétique afin de minimiser le risque d’engendrer des enfants

drépanocytaires.

b. Principaux symptômes cliniques de la drépanocytose

Les symptômes cliniques de la drépanocytose sont secondaires à l’hémolyse chronique et

aux crises vaso-occlusives intermittentes qui provoquent des ischémies transitoires. Ces

deux causes sont responsables de dysfonctions multi-organes dont la sévérité est patient-

dépendante (Figure 7).

25

Figure 7: Schéma bilan de la clinique drépanocytaire.

Figure traduite en français (25).

i. La crise vaso-occlusive

La crise vaso-occlusive (CVO) est la complication aiguë la plus fréquente chez les patients

drépanocytaires. Elle est causée par l’agglutination des hématies falciformes dans les

vaisseaux sanguins et est secondaire à différents facteurs de risque comme :

L’hypoxémie et l’acidose qui favorisent la forme falciforme des hématies.

La déshydratation qui diminue la fluidité du sang.

La CVO s’accompagne de douleurs extrêmement fortes, d’apparitions plus ou moins

brutales et prolongées dans le temps. Les douleurs sont provoquées par des lésions

secondaires à un phénomène d’occlusion microvasculaire touchant préférentiellement la

moelle osseuse, la rate, le foie, le cerveau, les poumons et les reins (22).

Le syndrome pieds-mains de l’enfant de moins de 2 ans (ou dactylite) est également une

conséquence de la CVO. Il se caractérise par un œdème inflammatoire des extrémités

26

accompagné de douleurs, d’atteintes osseuses et de lésions musculaires ou tendineuses. Il

est à l’origine d’une tuméfaction du dos, des pieds et/ou des mains et d’une impotence

fonctionnelle en raison de la douleur associée.

ii. L’anémie

L’anémie est définie comme étant une diminution de la quantité d’hémoglobine dans le sang.

Elle se traduit par une fatigue excessive et une sensation de faiblesse générale quand elle

est modérée et par un essoufflement associé à une tachycardie (accélération du rythme

cardiaque) quand elle est plus sévère. L’anémie chronique est généralement bien tolérée et

est symptomatique qu’à l’effort (plus ou moins intense selon le taux d’Hb circulant). Un ictère

(coloration jaune de la peau et des muqueuses) peut également apparaître en cas

d’hémolyse importante.

L’anémie drépanocytaire peut être de deux types différents :

Une anémie hémolytique régénérative secondaire à la CVO et à une séquestration

splénique des hématies falciformes.

Une anémie arégénérative suite à une infection par le parvovirus B19 qui inhibe la

production d’hématie par la moelle osseuse.

L’anémie la plus courante est l’hémolytique. Elle se caractérise par un taux d’hémoglobine

circulante de 2g/dL inférieur à la normale (13 à 17g/dL pour un homme) (26). Elle est

aggravée par le froid, qui provoque une vasoconstriction périphérique source de CVO, et par

l’activité physique, qui fait augmenter la consommation d’oxygène par l’organisme et donc la

falciformation des hématies.

iii. Le syndrome thoracique aiguë

Le syndrome thoracique aiguë est la première cause de mortalité chez les patients

drépanocytaires ayant accès à un traitement (27). Il est défini par la présence d’un infiltrat

radiologique pulmonaire (Figure 8). Il est généralement associé à des symptômes des voies

respiratoires comme la dyspnée et la toux, mais aussi de douleur à la poitrine et de fièvre.

Le syndrome thoracique aiguë peut être secondaire à la CVO, à une pneumonie ou à une

embolie pulmonaire (22).

27

Figure 8: Radiographie du thorax montrant des infiltrats alvéolaires prédominant aux bases,

accompagnés d'un possible épanchement pleural à la base pulmonaire droite (28).

iv. La fièvre

La fièvre est un signe d’infections. Les infections sont la première cause de mortalité en

absence de traitements préventifs et sont principalement bactériennes. Chez l’enfant de

moins de 5 ans les bactéries majoritaires sont encapsulées comme Streptococcus

pneumoniae et Haemophilus influenzae. Après l’âge de 5 ans, les bactéries les plus

retrouvées sont les bacilles gram négatifs comme Klebsiella spp. et Escherichia coli.

L’hospitalisation et l’utilisation de cathéter, dans le traitement du syndrome thoracique aiguë,

est également une source de contamination bactérienne par des coccis gram positif,

principalement Staphylococcus aureus (29).

Afin de limiter les infections, les patients drépanocytaires doivent être à jour dans leurs

vaccinations et prendre de la pénicilline comme traitement préventif.

28

v. Le priapisme

Le priapisme est une érection violente, prolongée, souvent douloureuse, née sans

stimulation sexuelle et n’aboutissant à aucune éjaculation. Il touche près de la moitié des

hommes drépanocytaires et peut être à l’origine d’impuissance définitive (30).

C’est essentiellement le corps caverneux qui est touché par le priapisme, le corps spongieux

plus rarement. Ce symptôme est dû à une crise vaso-occlusive dans le corps caverneux, ce

qui provoque un défaut de drainage veineux et donc une stase sanguine. En l’absence de

traitement, le priapisme peut provoquer une nécrose du muscle érectile du pénis.

vi. Les Accidents Vasculaires Cérébraux

La survenue d’Accidents Vasculaires Cérébraux (AVC) concerne plus de 20% des enfants

drépanocytaires et est la principale cause d’atteinte neurologique de la maladie. Les AVC

sont responsables d’une morbi-mortalité très importante et provoquent des séquelles

neurologiques et psychomotrices (31).

Différents facteurs de risques sont associés aux AVC (32) :

Une oxygénation faible de l’encéphale suite à une anémie ou à une désaturation de

l’hémoglobine.

La présence d’une vasculopathie, ralentissant le flux sanguin cérébral.

La fièvre, qui augmente le métabolisme cérébral.

Les facteurs de risque cardio-vasculaire usuels (hypertension, diabète, dyslipidémie

par exemple).

Un antécédent d’infarctus cérébral augmente le risque d’être sujet à un nouvel AVC

Une augmentation rapide de l’Hb circulante (>12g/dL) suite à une transfusion

sanguine.

Comme nous venons de le voir, le diagnostic clinique n’est pas toujours évident et se

caractérise principalement par des symptômes non spécifiques (douleurs, anémie,

infection). Pour établir un diagnostique définitif, le personnel soignant sera amené à

effectuer d’autres tests : les tests biologiques.

29

2. Diagnostic biologique

La méthode de référence pour le diagnostic de la drépanocytose est actuellement

l’isoélectrofocalisation (33). Afin de quantifier de manière précise tous les types

d’hémoglobine, la société française de biologie clinique recommande d’effectuer 3 tests

phénotypiques distincts, dont au moins une technique électrophorétique.

Deux tests phénotypiques seront choisis parmi les suivants pour mettre en évidence l’HbS :

Le test d’Itano : l’hémoglobine est placée dans un milieu réducteur à forte

concentration saline. Dans ces conditions, seul l’HbS précipite et la turbidité de la

solution est proportionnelle à la quantité d’HbS (test quantitatif).

La focalisation isoélectrique : technique de séparation basée sur la migration des

protéines sur un gel comportant un gradient de pH. Après migration, la position des

protéines sur le gel est fonction de leur point isoélectrique.

L’électrophorèse de l’Hb à pH alcalin ou acide.

La chromatographie liquide hautes performances en phase inverse des chaînes de

globine.

Afin de quantifier de manière précise l’HbA2, on utilisera un troisième test qui peut être :

La chromatographie liquide hautes performances par échange de cations.

L’électrophorèse capillaire.

D’autres tests biologiques peuvent également être réalisés :

Le test d’Emmel pour orienter le diagnostic. Sur une lame, du sang est mélangé à

une solution composée de métabisulfite de sodium à 2% qui consomme l’oxygène du

milieu. Après 10 minutes, les hématies drépanocytaires deviennent falciformes. Ce

test est qualitatif et non quantitatif.

L’étude génotypique de l’hémoglobine pour connaître avec précision le type de

drépanocytose.

L’hémogramme complet avec la numération des réticulocytes pour suivre l’évolution

de l’anémie.

Le groupage sanguin complet nécessaire à la mise en place des protocoles de

transfusion sanguine.

30

3. Dépistage néonatal

Le dépistage néonatal est réalisé, dès 3 jours de vie, sur les enfants à risques de

développer la drépanocytose. Une goutte de sang est prélevée sur le talon de l’enfant, est

séchée sur la feuille de prélèvement et est envoyée au centre de dépistage le plus proche

(annexe 1). Une fois arrivé dans le laboratoire, le sang sera remis en suspension et une

focalisation isoélectrique sera réalisée afin de séparer et de caractériser les différents types

d’hémoglobine.

Les enfants à risque, comme défini par l’Association Française pour le Dépistage et la

Prévention des Handicaps de l’Enfant (AFDPHE) sont ceux :

Ayant 2 parents originaires d’une région à risque

Ayant 1 parent originaire d’une région à risque et le second non connu

Ayant des antécédents familiaux de syndrome drépanocytaire majeur

Pour lesquels il existe un doute pour un des trois points précédents.

Les régions à risques sont quant à elles définies comme étant :

Les départements français d’outre-mer

L’Afrique subsaharienne et le Cap-Vert

Amérique du Sud (Brésil) et noirs d’Amérique du Nord

Inde, océan indien, Madagascar, Ile Maurice, Comores

Afrique du Nord : Algérie, Tunisie, Maroc

Italie du Sud, Sicile, Grèce, Turquie

Moyen-Orient : Liban, Syrie, Arabie Saoudite, Yémen, Oman.

Après avoir vu les symptômes et méthodes diagnostiques de la drépanocytose, intéressons-

nous à son traitement.

31

D. Prise en charge

1. Traitement symptomatique

L’ensemble des données proviennent des recommandations 2005 de la HAS (34).

a. Traitement des crises vaso-occlusives

Le traitement recommandé pour les CVO est à base d’antalgiques et de réhydratation. Les

antalgiques de palier 1, (paracétamol, anti-inflammatoires non stéroïdien) seront les

premiers utilisés par le patient, puis en cas d’échec, il passera au palier 2 (paracétamol +

codéine). Si la douleur persiste, le patient sera hospitalisé et un antalgique de palier 3

(morphine) pourra être prescrit. Une oxygénothérapie peut être proposée en cas de

désaturation mais n’est pas systématique.

b. Traitement des anémies aiguës

La transfusion sanguine est le seul traitement de l’anémie. Si l’anémie est due à une

séquestration splénique aiguë, une splénectomie peut être réalisée en cas de récidive.

c. Syndrome thoracique aiguë

Le traitement comprend :

Une transfusion sanguine ou un échange transfusionnel.

La prise d’antalgique.

Une hydratation.

Une antibiothérapie large spectre active sur les bactéries intracellulaires et sur le

pneumocoque (macrolides et céfotaxime ou ceftriaxone).

Une oxygénothérapie.

Une spirométrie incitative.

Le traitement par bêta mimétique n’est pas systématique.

d. Traitement des infections

En cas de suspicion d’infection, un traitement probabiliste doit être mis en place avant les

résultats des cultures bactériologiques. Les antibiotiques doivent être bactéricides, de large

spectre, adaptés aux sites infectieux et actifs sur les pneumocoques à sensibilité diminuée à

32

la pénicilline. Si le patient à moins de 3 ans ou une fièvre de plus de 39,5°C ou un

antécédent de septicémie, il sera immédiatement hospitalisé et sera traité en urgence par

céfotaxime ou ceftriaxone en parentéral.

e. Le priapisme

Il n’existe à ce jour aucun traitement qui puisse diminuer la fréquence de ce symptôme (30).

Le patient doit s’hydrater et tenter d’uriner pour faire passer le priapisme. En cas d’échec,

les alpha-stimulants seront utilisés. Si le patient ne répond toujours pas au traitement, la

ponction intra-caverneuse puis plus exceptionnellement la chirurgie avec la pose d’un shunt

caverno-spongieux seront réalisées.

2. Traitement spécialisé

a. Transfusion sanguine

Il existe deux méthodes de transfusion sanguine : la transfusion simple et l’échange

transfusionnel. Dans cette dernière, le sang du patient est prélevé et remplacé par du sang

provenant d’un donneur sain afin de maintenir la volémie constante tout en faisant diminuer

le taux d’HbS.

Les indications de la transfusion simple sont :

L’anémie aiguë.

Le syndrome thoracique aigu sans défaillance viscérale associée et avec un taux

plasmatique en hémoglobine <9g/dl.

Les indications de l’échange transfusionnel sont :

Les autres syndromes thoraciques aigus.

Les AVC.

Les crises douloureuses hyperalgiques résistantes à la morphine.

La préparation à une chirurgie nécessitant une anesthésie générale.

Le priapisme résistant au drainage et à l’injection d’étiléfrine .

Les indications des programmes chroniques d’échange transfusionnel sont :

La prévention primaire ou secondaire de l’accident vasculaire cérébral.

La prévention secondaire de l’hémorragie intracérébrale.

L’échec de l’hydroxyurée.

33

b. Hydroxyurée

L’hydroxyurée (également appelé hydroxycarbamide) est utilisée chez les patients atteints

de drépanocytose afin d’augmenter les concentrations en hémoglobine fœtale. Le

mécanisme d’action de la molécule n’est pas connu avec précision. Il a récemment été

démontré que l'hydroxyurée conduisait à la formation d'oxyde nitrique qui semble stimuler la

production de guanosine monophosphatase cyclique (GMPc), responsable de l’activation

d’une protéine kinase et de l’augmentation de la production d'HbF. Cette production d’HbF

permet de faire baisser les concentrations en HbS et d’augmenter la déformabilité des

hématies. L’hydroxyurée possède également un effet myéloablatif. Cette propriété lui permet

de faire diminuer les concentrations sanguines en polynucléaires neutrophiles ; diminution

conduisant à la réduction de la fréquence des crises drépanocytaires (35).

L’hydroxyurée est indiquée pour les patients ayant eu :

Plus de 3 crises vaso-occlusives ayant nécessité une hospitalisation par an.

Plus de 2 syndromes thoraciques aigus.

Les risques de ce traitement sont principalement :

Nausée et vomissement responsables de déshydratation.

Aplasie médullaire plus ou moins prononcée.

Azoospermie et infertilité chez la femme.

Tératogénicité donc nécessité d’une contraception efficace.

c. Allogreffe de cellules souches hématopoïétiques

Les cellules souches hématopoïétiques sont des cellules non adhérentes, reparties dans

des niches (Moelle Osseuse, sang de cordon ombilical). En fonction des stimuli qu’elles

reçoivent, elles ont la capacité de s’auto-renouveler et de se différencier vers toutes les

lignées de l’hématopoïèse (lymphoïdes ou myéloïdes). Elles sont une cible de choix pour la

thérapie génique, car elles assurent l’hématopoïèse en produisant tous les éléments figurés

du sang.

L’allogreffe de CSH (issues de moelle osseuse ou de sang placentaire intra-familial) est le

seul traitement vraiment curatif de la drépanocytose à ce jour. Actuellement, elle offre 95 %

de chance de « guérison » lorsqu’elle est réalisée durant l’enfance à partir d’un donneur HLA

identique de la fratrie (33). Elle est réservée aux patients souffrant d’une forme grave de la

34

maladie et pour lesquels il existe un donneur HLA compatible (généralement familial). Les

indications à cette greffe sont :

L’existence d’une vasculopathie cérébrale.

La récidive d’un syndrome thoracique aigu ou d’une crise vaso-occlusive malgré le

traitement par l’hydroxyurée.

Les risques liés à ce traitement ne sont pas négligeables. Les patients ayant déjà une santé

fragile en raison de leur maladie doivent subir une myéloablation. Ce conditionnement d’en

moyenne 10 jours est réalisé grâce à une chimiothérapie associée ou non à une

radiothérapie. Les patients ayant supporté le conditionnement et les effets secondaires de la

chimiothérapie peuvent alors être greffés. La greffe a lieu en chambre stérile afin d’éviter

tout risque d’infection. À ce moment-là, deux risques sont encore possibles : le rejet de la

greffe (devenu très rare grâce au conditionnement) et la maladie du greffon contre l’hôte

(GVHD) où les cellules immunitaires présentes dans le greffon vont s’attaquer aux cellules

saines du patient (prévenu par l’utilisation d’immunosuppresseurs post greffe) (36).

Comme nous venons de le voir, la drépanocytose est une maladie génétique possédant une

forte morbi-mortalité. Le seul traitement à ce jour est l’allogreffe de cellules souches

hématopoïétiques provenant de la moelle osseuse. Malheureusement, ce traitement ne peut

être administré à tous les patients, en raison d’effets secondaires très importants et du

manque de donneurs compatibles. Afin d’améliorer la prise en charge des patients, un

nouveau traitement est à l’étude : la greffe de cellules souches hématopoïétiques

autologues (provenant du patient lui-même). Cette méthode nécessite la correction des

cellules ex vivo avant de les réinjecter au patient ; correction rendue possible grâce à un

nouvel outil thérapeutique : la thérapie génique.

35

II. La thérapie génique

36

A. Généralité

Pour pouvoir fabriquer les protéines nécessaires à son fonctionnement, la cellule met en

place un processus faisant intervenir différents constituants. Le premier impliqué est contenu

dans le noyau cellulaire: l’ADN. Les gènes sont des fragments d’ADN comportant toutes les

informations utiles pour la production des protéines. Une modification des gènes, appelée

mutation, peut conduire à l’apparition de protéines anomales (en structure et/ou en quantité)

à l’origine de maladie génétique.

La thérapie génique, contrairement à l’injection de protéines recombinantes, est un

traitement curatif des maladies génétiques. Cette méthode vise à corriger les mutations de

l’ADN ou à modifier l’expression du gène impliqué. Pour ce faire, des acides nucléiques

(ADN ou ARN) sont délivrés dans les cellules porteuses de l’anomalie.

La thérapie génique, modifiant le génome cellulaire, ne peut être pratiquée sur toutes les

cellules de l’organisme. En effet, son utilisation sur les cellules germinales (nécessaire à la

reproduction) humaines est interdite en raison du risque de transmission de la modification

aux générations futures (Partie IV de l’Annexe I de la Directive 2003/63/EC relative aux

médicaments à usage humain). Seules les cellules somatiques peuvent être traitées. Il

existe différents types de cellules somatiques allant des cellules matures aux cellules

multipotentes capables de régénérer un tissu entier (exemple des cellules souches

hématopoïétiques). Les cellules capables de se multiplier (auto-renouvellement) et de se

différencier en au moins un type cellulaire mature sont appelées cellules souches. Pour

optimiser les effets de la thérapie génique, ce sont elles qui seront traitées.

37

B. Les objectifs de la thérapie génique

La thérapie génique a pour objectif de produire les protéines fonctionnelles en modifiant le

génome. Pour ce faire, différentes méthodes peuvent être employées comme la

modification, l’inhibition ou l’ajout d’un nouveau gène.

1. La modification d’un gène

La modification des gènes consiste à utiliser une séquence d’ADN ou d’ARN afin de corriger

une anomalie génétique. Plusieurs techniques peuvent être utilisées : CRISPR (clustered

short palindromic repeats), TALEN (transcription activator-like effector nucleases) et ZFN

(zinc finger nuclease) sont les plus courantes. Toutes fonctionnent sur le même principe :

l’ADN double brin est coupé au niveau du gène muté, puis le gène est corrigé ou remplacé

par recombinaison homologue à l’aide d’une séquence témoin.

a. La méthode ZFN

Les enzymes en doigt de zinc (ZFN) sont des enzymes de restriction qui coupent l’ADN

dans un locus spécifique. La ZFN est formée de deux molécules : une se fixant dans le sens

5’ 3’ et l’autre dans le sens 3’ 5’. Chacune possède deux parties : un domaine de

liaison à l’ADN et un domaine de clivage de l’ADN (une nucléase). Grâce à leurs actions

synergiques, l’enzyme est capable de couper la double chaine d’ADN à un endroit précis et

peut activer les mécanismes cellulaires de réparation homologue de l’ADN (Figure 9).

Malheureusement, en l’absence de séquence d’ADN témoin, seul la recombinaison non

homologue peut avoir lieu, ce qui conduit généralement à la suppression de nucléotides. Il

existe également, avec cette méthode, une forte cytotoxicité en raison de la présence de

séquence similaire à la séquence cible dans le génome (37).

38

Figure 9: Présentation du fonctionnement des ZFN.

Les molécules pénètrent dans le noyau (nucleus) de la cellule, puis se fixent sur le gène de

part et d’autre du point de coupure. La double hélice d’ADN est ensuite coupée (cleavage)

(DSB : coupure double brin) par les nucléase (N). Le plasmide comprenant le gène témoin non

muté est reconnu grâce aux séquences homologues (HA). La cassure est ensuite réparée par

homologie (HDR) (38).

b. La méthode TALEN

La méthode TALEN fonctionne comme la méthode ZNF, seule la molécule de liaison à

l’ADN diffère. Ici, le domaine se liant à l’ADN est composé de minimum 11 unités de

répétition (39) composées de 24 acides aminés chacune. Toutes les unités ne diffèrent entre

elles que par deux résidus : ceux en positon 12 et 13. C’est cette différence qui détermine le

nucléotide qui peut être reconnu par chaque unité. De plus, pour que le TALEN soit efficace,

le premier nucléotide reconnu doit obligatoirement être une thymine.

39

c. La méthode CRISPR

Cette méthode fonctionne comme les précédentes. Deux molécules sont nécessaires à son

utilisation :

CRISPR qui comporte la séquence d’ARN utilisée pour la liaison avec l’ADN

et Cas 9 qui est l’endonucléase permettant la coupure double brin de l’ADN.

Le domaine de liaison à l’ADN appelé « target » est généralement composé d’une vingtaine

de nucléotides et doit obligatoirement se trouver à côté d’une région spécifique appelée

PAM pour Protospacer Adjacent Motif. La région PAM est nécessaire pour la réalisation de

la coupure double brin et sa séquence est dépendante du variant cas 9 choisi (40).

Après s’être fixé à la séquence cible du génome, le complexe CRISPR-CAS va couper la

double chaine d’ADN. Cette coupure va être détectée par la cellule qui va tenter de la

réparer. Pour ce faire, la cellule à deux possibilités (Figure 10) :

Faire une réparation par homologie de séquence. Pour ce faire, la cellule utilise une

séquence d’ADN témoin homologue à la séquence coupée pour réparer la cassure.

Avec cette méthode, il est possible de corriger une mutation en administrant à la

cellule une version corrigée du gène. Ainsi, en réparant la cassure, la cellule copiera

la séquence témoin et corrigera la mutation ponctuelle présente sur le gène.

Faire une réparation non homologue. Dans cette situation, la cellule va se contenter

de refusionner les deux séquences d’ADN. Cette fusion n’étant pas parfaite, va

entrainer l’apparition d’insertions ou de délétions de nucléotides. Ces modifications

seront à l’origine de la production d’une protéine inactive. De plus, en ajoutant ou

retirant des nucléotides, la réparation provoque un décalage dans la lecture de la

séquence ce qui peut provoquer l’apparition d’un codon STOP prématurément et

donc inactiver le gène.

40

Figure 10: Méthodes de réparation de l'ADN suite à une coupure double brin induite par la

méthode CRISPR.

2. La modulation de l’expression d’un gène

Il est possible de modifier l’expression d’un gène sans modifier sa séquence. Un gène est

considéré comme inhibé quand la cellule n’est plus capable de synthétiser la protéine qu’il

code. Pour ce faire, différentes méthodes peuvent être utilisées comme l’inhibition de l’ARN

messager ou de sa traduction en protéine.

a. ARN interférent

Micro-ARN :

Ce sont des ARN endogènes, non codants, de 20 à 25 nucléotides capables de se lier à

l’ARN messager afin de le détruire par clivage. Si la complémentarité entre les séquences

du micro-ARN et de l’ARN messager n’est pas totale, le micro ARN ne pourra pas dégrader

l’ARN messager, mais restera fixé dessus et inhibera sa traduction en protéine (41).

Les petits ARN interférents (siARN) :

Les siARN sont de petits fragments d’ARN synthétiques doubles brins de 20 à 23

nucléotides. Ils sont capables d’induire le clivage de l’ARN messager en s’y liant par

41

homologie de séquence. Les siARN ne peuvent directement être synthétisés par la cellule

(42). À la différence des micro-ARN, les siARN dégradent toujours les ARN messager sur

lesquels ils se fixent.

Les ARN en épingle à cheveux (shARN) :

Les shARN sont de petits fragments d’ARN synthétiques en forme d’épingle à cheveux.

Cette molécule est formée de deux séquences d'ARN de 19 à 22 paires de bases reliées

par une boucle de 4 à 11 nucléotides. Tous comme les précédents, les shARN sont

capables d’induire le clivage de l’ARN messager en s’y liant par homologie de séquence.

Elles peuvent également intégrer le génome cellulaire pour être transcrites en siARN et

dégrader l’ARN messager (43).

b. Ribozymes et déoxyribozymes

Les ribozymes et les déoxiribozymes sont des acides nucléiques (respectivement ARN et

ADN) capables de couper spécifiquement certains ARN messager. À la différence des ARN

interférents, ces molécules n’ont pas besoin des enzymes de la cellule pour fonctionner.

Elles sont composées de deux parties (Figure 11) : une séquence de liaison à l’ARN et une

boucle catalytique nécessaire pour couper l’ARN messager. Deux nucléotides doivent

obligatoirement être présents dans la boucle catalytique pour qu’elle soit active : la guanine

en position 5 et adénine en position 14 (44).

Figure 11: Structure d'une molécule de ribozyme (45).

En vert : la séquence complémentaire à l’ARN messager à couper, en rouge les nucléotides

nécessaires à l’activité de la molécule et en noir la boucle catalytique. Légende : X :

nucléotide, A : Adénine, G : guanine, U : uracile, C : Cytosine.

42

3. L’ajout d’un gène

L’ajout de gêne consiste à insérer un nouveau gène (appelé transgène) dans le génome ou

dans le noyau de la cellule cible. L’expression du transgène par la cellule, va lui permettre

de produire une protéine « médicament ». Cette dernière devra posséder les mêmes

propriétés que la protéine qui faisait défaut à la cellule. Cette méthode est donc celle

privilégiée pour le traitement des maladies causées par l’absence ou la très faible

expression d’une protéine.

Quand le transgène ne s’insère pas dans le génome, il se comporte comme un épisome. Sa

réplication est alors indépendante du cycle cellulaire et il peut être perdu lors des divisions

cellulaires.

L’intégration du transgène dans le génome cellulaire peut avoir différents effets selon sa

localisation :

1. Dans l’hétérochromatine, le transgène ne sera pas exprimé.

2. Dans l’euchromatine, entre les gènes, le transgène sera exprimé normalement sans

impacter les autres gènes.

3. Dans une région régulatrice, l’expression du transgène et celle des gènes

environnants peuvent être dérégulées.

4. Dans la région transcrite d’un gène peut conduire à la synthèse d’une protéine mutée

non fonctionnelle.

Il est crucial de pouvoir contrôler les sites d’insertion du transgène avant de l’utiliser en

clinique, car les situations 3 et 4 peuvent conduire à l’apparition de tumeur. Pour ce faire,

différentes méthodes de transduction cellulaire ont été mises en place.

43

C. Les modalités d’administration

Il existe deux méthodes pour transduire les cellules cibles : la méthode in vivo et ex vivo

(Figure 12). Ces méthodes diffèrent principalement par le lieu où se déroule la transduction

cellulaire.

Figure 12: Comparaison des stratégies de thérapie génique : in vivo, où les cellules sont

directement modifiées dans l’organisme et ex vivo avec des cellules modifiées avant injection

au patient.

1. La thérapie génique ex vivo

Cette méthode est très répandue dans les protocoles de thérapie génique, car elle peut être

suivie et contrôlée durant tout le procédé de production. Elle consiste à mobiliser les cellules

d’intérêts, à les prélever, à les mettre en contact avec le transgène puis à les réinjecter au

patient. Cette méthode permet de s’assurer que seules les cellules cibles (que l’on a isolé au

préalable) sont transduites, qu’elles ont bien intégré le transgène dans leur génome et

qu’elles l’expriment. Pour ce faire, la méthode est généralement couplée à une

immunosélection des cellules afin d’obtenir une population cellulaire homogène, à une

quantification du nombre de copies de gène intégrées et à un dosage de la protéine

thérapeutique.

IN VIVO

Injection par voie systémique ou

locale

Prélèvement des cellules souches du

patients

Vecteur thérapeutique

EX VIVO

Correction des cellules in vitro

Réinjection des cellules corrigées

ADN liposomal

ADN nu

Vecteur viral

44

Il existe trois contraintes principales à cette technique :

La difficulté à extraire les cellules cibles.

La différenciation des cellules cibles lors du procédé de fabrication.

Le nombre limité de cellules réimplantables après la correction.

Les cellules utilisées devront donc être choisies en prenant en compte ces contraintes et

devront être manipulées en un minimum de temps afin de conserver leurs propriétés. Cette

technique pourra être mise en place que si les cellules peuvent être manipulées ex-vivo.

2. La thérapie génique in vivo

Quand les cellules cibles ne peuvent être prélevées, cultivées, réimplantées ou si elles sont

disséminées dans tout l’organisme, la thérapie génique ex vivo ne peut être pratiquée. Dans

ces conditions, les thérapies géniques in vivo ou in situ seront mises en œuvre. Ces

techniques de transduction consistent à injecter le vecteur contenant le transgène

directement dans le corps de l’individu. Il peut être injecté dans la circulation sanguine (in

vivo) ou directement dans le tissu à traiter (in situ).

Les vecteurs utilisés in vivo doivent cibler spécifiquement les cellules que l’on souhaite

corriger et les infecter sans qu’il y ait eu de pré activation de celles-ci au préalable. Cette

méthode possède 2 limites principales: l’accès du vecteur aux cellules cibles (pas toujours

accessible dans les organes) et la spécificité du vecteur pour un type cellulaire précis. En

effet, un même transgène peut avoir des effets opposés en fonction de sa cible. Prenons le

cas d’un gène d’apoptose, il sera bénéfique pour le patient s’il touche les cellules

cancéreuses, mais délétère s’il est administré aux cellules saines.

La thérapie génique in situ est soumise au même problème de spécificité que la thérapie

génique in vivo à la différence que le vecteur est directement injecté dans les tissus, à

proximité des cellules cibles. Le fait que le vecteur ne soit pas injecté dans la circulation

générale protège les organes à distance de la zone d’injection, mais rend sa diffusion plus

difficile ; limitant son action à une petite zone très localisée. Cette méthode nécessite donc

plusieurs injections espacées dans l’espace afin de toucher un maximum de cellules et dans

le temps en raison du faible taux d’intégration du transgène.

Cette technique semble être un compromis entre les deux précédentes en se rapprochant

de la spécificité de la méthode ex vivo tout en se passant de prélèvement cellulaire. Cette

technique présente néanmoins des limites. Elle est moins stable dans le temps et ne peut

45

être employée que dans le cas de pathologies très localisées (exemples : tumeur solide non

métastatique, maladies oculaires, mucoviscidose).

Tableau III: Résumé des avantages et des limites des méthodes de thérapie génique

Avantages Limites

Thérapie ex vivo

Les cellules traitées sont isolées et caractérisées.

Contrôles qualité possibles avant réinjection.

Prélèvement des cellules souches.

Différenciation des cellules lors du processus.

Une faible proportion des cellules souches réinjectées réussissent à s’implanter en conservant leurs propriétés (ex : les CSH qui doivent réintégrer la moelle osseuse)

Thérapie in vivo

Pas de mobilisation cellulaire.

Conservation de la structure de l’organe cible (exemple : neurone).

Peut traiter des cellules disséminées dans tout l’organisme.

Vecteur non spécifique à 100%.

Accès difficile aux cellules par le vecteur.

Pas de contrôle du site d’insertion.

Thérapie in situ

Pas de mobilisation cellulaire.

Conservation de la structure de l’organe cible.

Action restreinte à une zone précise.

Vecteur non spécifique à 100%.

Pas de contrôle du site d’insertion.

Action restreinte à une zone précise.

Comme nous venons de le voir, il existe différentes méthodes pour transduire les cellules

(Tableau III), mais la technique de transduction ne se limite pas au choix de la méthode. Le

choix du vecteur transportant le gène médicament dans la cellule cible est également

primordial pour la sécurité du patient.

46

D. Les principaux vecteurs de transduction cellulaire

Un vecteur est une structure capable de transporter le transgène dans les cellules cibles,

pour y être exprimé.

Le vecteur de transduction cellulaire idéal doit pouvoir répondre à différents critères (46,47) :

Il doit pouvoir contenir une séquence relativement longue d’ADN ou d’ARN.

Il doit être spécifique aux cellules cibles.

Il doit protéger le transgène des nucléases.

Le transgène doit être intégré dans le génome hôte de toutes les cellules, même

quiescentes.

Il ne doit pas être oncogène, immunogène ou cytotoxique.

Il doit pouvoir exprimer ses effets thérapeutiques dès la première administration.

À ce jour, différentes méthodes de transfert des gènes ont été développées, mais aucune ne

répond à 100% à tous les critères. Il est donc important de connaître les différents vecteurs

à notre disposition afin de choisir celui qui correspond le mieux à nos attentes.

Cette partie va présenter les principales méthodes de transduction cellulaire qui pourraient

être retrouvées lors des essais cliniques (partie III). Elle ne se veut pas exhaustive.

1. Les vecteurs viraux

Les vecteurs viraux sont historiquement les plus utilisés dans les protocoles de transduction

cellulaire, car ils ont naturellement les capacités de transport d’ADN et d’internalisation

cellulaire. Il existe différents types de vecteurs viraux : les intégratifs et les non intégratifs.

Les vecteurs intégratifs sont les seuls à permettre une expression du transgène toute la vie

de la cellule, indépendamment du nombre de divisions cellulaires.

Les vecteurs viraux de thérapie génique sont des structures issues de virus inactivés. Afin

de rendre leur utilisation sûr pour le patient, tous les gènes nécessaires à la prolifération du

virus ont été délétés. Les gènes codant pour les protéines de surface ont également été

modifiés afin de les rendre non immunogènes et spécifiques à un type cellulaire donné. Ces

modifications importantes du génome viral permettent de conserver uniquement la structure

virale nécessaire à l’internalisation cellulaire tout en évitant leur dégradation par le système

immunitaire (48).

47

Pour fabriquer un vecteur viral idéal, trois étapes doivent être maitrisées :

La production, qui doit fournir un produit le plus pur et concentré possible.

La voie d’internalisation, en adaptant les molécules à la surface du vecteur avec les

récepteurs à la surface des cellules cibles.

Le(s) site(s) d’insertion du transgène dans le génome cible.

En pratique, les sites d’insertion du transgène sont rarement connus avec certitudes, car ils

dépendent du transgène, des séquences spécifiques de nucléotides entourant les sites

d'insertion, de l’étape du cycle cellulaire dans laquelle se trouve la cellule et de la structure

physique de l'ADN (49).

Intéressons-nous aux principaux vecteurs viraux et étudions leurs avantages et limites

respectifs.

a. Adénovirus

Les adénovirus sont des virus nus de la famille des adenoviridae. Leur génome est constitué

d’une molécule d’ADN double brin linéaire de 36 kilobases (kb) délimitées par des

séquences répétées inversées (inverted terminal repeats, ITR) (50). Ils présentent une

capside virale icosaédrique formée de bases du penton (aux sommets) et d’hexon (Figure

13).

Figure 13: Structure d'un adénovirus (50).

Des vecteurs issus de ces virus sont utilisés dans les protocoles de thérapie génique, car ils

sont faciles à produire et ont la capacité d’infecter un grand nombre de type cellulaire. Ces

48

vecteurs peuvent contenir un transgène de maximum 8 kb dans des cellules quiescentes

comme celles en division cellulaire.

Pour infecter les cellules, le vecteur se fixe par son domaine Knob au récepteur CAR

(coxsackievirus and adenovirus receptors) présent à la surface cellulaire (Figure 14). Une

fois la première liaison vecteur/cellule réalisée, des intégrines viennent se fixer sur les

groupements arginine–glycine–aspartate (RDG) présents sur les bases pentoniques de la

capside virale afin d’endocyter le vecteur (51). La membrane des endosomes est stabilisée

grâce à un manteau de clathrines présent sur la face cytoplasmique (52). La capside virale

est libérée dans le cytosol cellulaire après rupture de l’endosome par acidification de son

contenu. Le vecteur va migrer le long des microtubules jusqu’au noyau cellulaire où il

libérera son contenu génétique. Bien que le transgène soit importé dans le noyau cellulaire,

il ne sera pas intégré dans le génome et donc sera perdu lors des divisions cellulaires.

En plus d’être non intégratif, ce type de vecteur présente un autre inconvénient majeur qui

est sa grande immunogénicité cellulaire.

Figure 14: Schéma de transduction cellulaire des adénovirus

49

b. Les virus adéno-associés

Les virus adéno-associés (AAV) sont des virus nus, capsulés, de la famille des parvovirus

humains. Pour pouvoir se répliquer, les AAV nécessitent un virus « helper » (adénovirus ou

herpès simplex virus). Leur génome est constitué d’une molécule d’ADN simple brin support

de deux gènes obligatoirement présents : « rep » nécessaire à la réplication virale et à

l’intégration cellulaire et « cap » pour l’encapsidation. Ce type de vecteur peut transporter un

transgène de maximum 4,7kb.

Les vecteurs de cette famille ont la capacité d’infecter de nombreux types cellulaires en

étant peu immunogènes (53). Le schéma de transduction cellulaire des AAV est similaire à

celui des adénovirus. Le vecteur pénètre dans le cytosol cellulaire sous forme d’endosome.

Puis, après rupture, il est transporté jusqu’au noyau cellulaire où son ADN sera introduit.

L’ADN simple brin sera ensuite transformé en ADN double brin par la machinerie cellulaire

avant d’être intégré au génome cellulaire.

Les vecteurs AAV peuvent transduire à la fois les cellules quiescentes et en division, mais ils

doivent être utilisés à forte dose pour exprimer un effet thérapeutique car ils possèdent un

faible taux d’inclusion cellulaire (54). Ils sont intégratifs avec un site préférentiel d’intégration

appelé AAVS1 sur le chromosome 19 (55). L’existence d’un tel site permet de limiter

l’apparition de mutations insertionnelles dans le génome cible.

c. Rétroviridae

Cette famille de vecteur viral comprend 7 groupes : les alpha-rétrovirus, les bêta-rétrovirus,

les delta-rétrovirus, les gamma-rétrovirus, les epsilon-rétrovirus, les lenti-rétrovirus et les

spuma virus. Tous sont porteurs de 2 molécules d’ARN simple brin linéaire comprenant 3

gènes indispensables à leurs fonctions : « gag » qui code pour les protéines de structure,

« env » pour les glycoprotéines d’enveloppe et « pol » pour une reverse transcriptase et une

intégrase (Figure 15).

50

Figure 15: Structure d'un rétrovirus, exemple du lentivirus VIH-1 (56).

gp120 et gp41 sont les protéines d'enveloppe de ce sous-type cellulaire.

Pour infecter les cellules, les vecteurs rétroviraux se fixent à leurs récepteurs présents à la

surface cellulaire (Figure 16). Une fois la liaison vecteur/cellule réalisée, la membrane

cellulaire va fusionner avec l’enveloppe du vecteur et la nucléocapside va être libérée dans

le cytosol. La nucléocapside va disparaître en même temps que la reverse transcriptase va

convertir l’ARN en ADN double brin. Le transgène, une fois transformé en ADN va pénétrer

dans le noyau cellulaire par les pores (uniquement pour les lentivirus, les autres rétrovirus

doivent attendre une mitose pour être intégrés). Dans le noyau, l’intégrase va intégrer le

transgène au génome cellulaire.

Figure 16: Schéma de transduction cellulaire des rétrovirus.

51

Historiquement, les premiers rétrovirus utilisés en thérapie génique appartiennent au groupe

des gamma-rétrovirus. Ce sont des vecteurs intégratifs, capables de transduire uniquement

les cellules en division et pouvant transporter un transgène de maximum 8 kb. Ces vecteurs

sont très immunogènes et mutagènes (57). L’apparition de leucémies, chez des patients

ayant reçu des cellules souches traitées par ce type de vecteur, a mis un frein à leur

développement et a conduit les scientifiques à favoriser un autre groupe de rétrovirus : les

lentivirus.

Les vecteurs lentiviraux utilisés en thérapie génique sont dérivés du VIH-1 (Virus de

l’Immunodéficience Humaine de type 1) dont le génome sauvage comprend différents gènes

(Figure 17). Afin de sécuriser l’utilisation des vecteurs lentiviraux et de bloquer la réplication

virale, les deux gènes de régulation (Tat et Rev) essentiels à la réplication virale et les

quatre gènes codants pour les protéines accessoires (Nef, Vif, Vpu et Vpr) sont éliminés

(58). De plus, les vecteurs lentiviraux actuels (de 3ème génération) possèdent une délétion de

400 nucléotides dans la région U3 du promoteur viral LTR en 3’. Cette mutation auto-

inactivante (SIN) permet de produire des vecteurs en grande quantité sans modifier le taux

d’expression du transgène, mais en inhibant la réplication virale (59).

Figure 17: Représentation de la structure génomique provirale du VIH-1.

En bleu: l’amorce sens, en rouge et en vert: des amorces anti-sens, les encadrés représentent

la localisation des exons pour chaque gène (60).

Les vecteurs lentiviraux ainsi produits permettent de transduire à la fois les cellules

quiescentes et celles en division avec un risque moins important qu’avec les gamma-

rétrovirus de mutagenèse. Le transgène intégré a une taille maximale plus importante allant

jusqu’à 10 kb.

d. Herpès simplex virus

L’herpès simplex virus (HSV) est un virus enveloppé, capsulé dont le patrimoine génétique

est contenu dans une molécule d’ADN double brin de 150 kb. Il a la capacité d’infecter les

cellules quiescentes et en division cellulaire, avec une affinité pour les cellules du système

nerveux central et périphérique (55).

52

Son génome viral est composé de deux parties délimitées par des séquences terminales

répétées : une dite « long » (L) et une « short » (S). La partie L code les protéines de

structure et de réplication virale. La partie S code des protéines impliquées dans l’interaction

vecteur/cellule. Afin de sécuriser l’utilisation de ce vecteur, il est possible de remplacer

l’intégralité du génome viral par un plasmide (ADN circulaire) de 150 kb contenant une

origine de réplication virale et un signal de clivage et d’encapsidation d’HSV en plus du

transgène (61). La taille importante du transgène permet également de transduire plusieurs

gènes ou copies de gène avec le même vecteur.

Pour infecter les cellules, les vecteurs issus de HSV se fixent à un récepteur présent à la

surface cellulaire : l’héparane sulfate (Figure 18). Une fois la liaison vecteur/cellule réalisée,

la membrane cellulaire fusionne avec l’enveloppe du vecteur et la capside est libérée dans

le cytosol. La capside virale migre ensuite jusque dans le noyau cellulaire. Une fois dans le

noyau, elle libère le transgène. Ce dernier est de forme circulaire et peut immédiatement

être exprimé par la cellule sans être intégré dans génome cellulaire.

Figure 18: Schéma de transduction cellulaire des vecteurs dérivés d'HSV

53

Comme nous venons de le voir, les vecteurs viraux possèdent de nombreux avantages pour

le transfert de gène par thérapie génique. Ils peuvent être utilisés dans les protocoles de

transfection in vivo comme ex vivo. Cependant, leur utilisation est sujette à certaines limites :

La taille limitée des transgènes.

Les réactions immunitaires secondaires à leurs utilisations.

Les risques mutagènes secondaires à leurs intégrations génomiques.

Les difficultés de production.

Ces problèmes ont conduit les chercheurs à développer d’autres types de vecteurs afin de

sécuriser les protocoles de transfert de gène : les vecteurs synthétiques.

2. Les vecteurs synthétiques

Les vecteurs synthétiques sont des vecteurs non viraux issus de procédés chimiques et

utilisables pour le transfert de gène in vivo et ex vivo. Ils sont généralement composés de

molécules cationiques qui forment des complexes et des interactions électrostatiques avec

les molécules d’ADN chargées négativement.

Pour protéger l’ADN et éviter qu’il se dégrade une fois injecté dans la circulation générale,

les vecteurs synthétiques doivent être chimiquement et thermodynamiquement stables. Leur

production doit également permettre d’obtenir une taille de particule et un potentiel

électrostatique homogènes afin d’optimiser la diffusion des particules dans les tissus et les

taux de transduction cellulaire (62).

À la différence des vecteurs viraux, les synthétiques sont très peu immunogènes, mais ont

également un faible taux de transfection cellulaire. Cette faible transduction cellulaire

s’explique par leur voie d’internalisation cellulaire.

Les vecteurs se lient principalement aux cellules grâce à leur potentiel électrostatique. Le

potentiel né de la différence de charge entre le vecteur (chargé positivement) et les

glycosaminoglycanes (chargés négativement) présents à la surface de la membrane

cellulaire (63). Ce procédé conduit à différents mécanismes d’internalisation des vecteurs

dont les principaux sont l’endocytose (64). La cellule peut, grâce à son contenu

enzymatique, transformer l’endosome en lysosome et dégrader le vecteur avant que ce

dernier n’ait pu s’exprimer.

54

Afin de mieux connaître cette famille de vecteur, seuls les deux représentants principaux

que sont les lipides et les polymères cationiques seront détaillés.

a. Lipides cationiques

Les lipides cationiques sont des molécules amphiphiles constituées de 3 domaines (Figure

19) :

Une tête hydrophile, cationique qui fait des liaisons électrostatiques avec les

groupements phosphates de l’ADN.

Un espaceur au centre qui stabilise les molécules lipidiques, protège les vecteurs de

la biodégradation et contrôle la libération de l’ADN dans les cellules.

Une ou plusieurs chaines hydrophobes qui donnent la forme du complexe et

interagissent avec les membranes cellulaires

Figure 19: Structure générale d'un lipide cationique

En milieu aqueux, les chaines hydrophobes s’associent entre elles et forment des particules

capables de transporter différents types de protéines ou d’acides nucléiques. La structure de

ces particules peut varier en fonction de la température, de la concentration et du type de

lipides utilisés lors du procédé de production (Figure 20).

55

Figure 20: Exemple de particules lipidiques formées dans un solvant aqueux (65).

a :micelle, b : bicouche lipidique, c : liposome, d : phase lamellaire, e : phase hexagonale,

f :phase éponge, g : cubosome.

Les liposomes et les micelles sont les structures les plus couramment utilisées pour

transporter l’ADN, car ils peuvent en contenir une grande quantité et ils sont très faciles à

produire. En effet, la méthode la plus simple de préparation des lipoplexes (structure

lipidique contenant de l’ADN) ne nécessite que deux étapes (66) :

1. évaporer le solvant organique contenant les lipides pour les extraire

2. dissoudre les lipides dans un solvant aqueux pour former les complexes.

Les liposomes (comme les autres lipoplexes) sont peu toxiques et ne présentent aucun effet

hématologique (67). À forte dose, une génotoxicité secondaire à leur séquestration peut

apparaître dans les poumons, le foie et la rate sans forcément qu’il y ait une cytotoxicité

associée. Les cytotoxicités qui peuvent être retrouvées avec ces vecteurs sont secondaires

à la production de cytokines inflammatoire et d’espèce réactive de l’oxygène par les cellules

lors de l’internalisation du vecteur. Parmi les deux structures principalement utilisées, les

liposomes semblent être plus toxiques, car à la différence des micelles, une génotoxicité

pulmonaire et splénique apparaît même avec de faibles doses. L’ajout de certains composés

56

chimiques (comme le polyéthylène glycol) lors de la fabrication des lipoplexes permet de

réduire ces toxicités et de stabiliser les complexes (68).

La seconde limite pour l’utilisation clinique des lipoplexe (en plus de la toxicité) est son faible

taux de transduction cellulaire. Ce résultat est dû à la dégradation de l’ADN par les enzymes

cellulaire et à une forte clairance hépatique (69). Afin de mieux protéger l’ADN et d’en

faciliter l’externalisation dans le cytosol, des lipides neutres tels que le Dioléyl-Phosphatidyl-

Ethanolamine (DOPE) ou le cholestérol peuvent être ajoutés lors de la production du

lipoplexe (70). Les cubosomes peuvent également être une solution, car ils sont plus stables

et ils protègent plus des dégradations enzymatiques que les liposomes (71), mais leur

toxicité cellulaire est actuellement peu documentée.

b. Polymères cationiques

Polymère cationique sont principalement composés de macromolécules riches en amines et

imines (exemple : Polyéthylèneimines : PEI), en lysine (poly-L-Lysine : PLL) ou en arginines

(Figure 21). Ils sont capables de fixer et de compacter de grandes molécules d’ADN grâce à

des liaisons électrostatiques pour former les polyplexes. Contrairement aux lipides

cationiques vus précédemment, les polyplexes sont solubles dans l’eau. Cette propriété,

ainsi que leur charge globale positive, leur permet de pénétrer dans les cellules.

Figure 21: Structure des principaux polymères cationiques.

A : une molécule de PLL, B : des molécules de PEI sous forme branchée, C : une molécules

de PEI sous forme linéaire

57

Les PLL sont les premiers polyplexes à avoir été développés. Ils sont aujourd’hui peu

utilisés en cliniques, car ils ont beaucoup de difficulté à libérer l’ADN dans les cellules. Pour

remédier à ce problème, les PEI ont été développés. Leur structure entraine grâce à leur

groupement amine une augmentation de la pression osmotique à l’intérieur des endosomes

puis leur rupture et enfin la libération de l'ADN dans le cytosol (72).

La toxicité des polyplexes est faible et est fonction de leur structure et des doses utilisées.

Les polyplexes à base de PEI linéaire ayant une masse moléculaire de 22kDa sont moins

toxiques que ceux ayant une taille élevée et une structure branchée (73). La limite pour

l’utilisation clinique de ces molécules résulte dans leurs faibles capacités à libérer l’ADN

dans le cytosol.

Comme nous venons de le voir, les méthodes chimiques de transduction cellulaire sont

généralement peu efficaces et ne sont pas sans risque pour le patient. Une troisième

stratégie existe pour transduire les cellules : les méthodes physiques.

3. Les méthodes physiques

a. ADN nu

La méthode physique la plus simple pour faire internaliser un transgène dans des cellules in

vivo et ex vivo est l’utilisation de molécule d’ADN nu. Ces molécules sont généralement des

plasmides, car ils sont plus stables que les molécules d’ADN linéaires. Ils sont injectés

directement au contact des cellules cibles. Leur charge nette permet aux plasmides de

pénétrer dans les cellules par endocytose.

Bien que cette méthode ne soit pas immunogène, elle est peu utilisée en raison de son

faible taux de transduction. Ceci peut s’expliquer par plusieurs causes :

la dégradation de l’ADN par les désoxyribonucléases circulantes

la faible diffusion des molécules au niveau du site d’injection

une faible pénétration et expression du transgène

la non-intégration du transgène dans le génome de l’hôte.

Afin de pallier ces problèmes, la micro-injection fut mise au point. Cette méthode consiste à

injecter de l’ADN par pression hydrostatique dans les cellules. L’injection se fait cellule par

cellule à l’aide d’un micromanipulateur (microscope optique), d’un micro-injecteur et d’une

58

aiguille de 0,7 à 1 micromètre de diamètre. Le coût de cette technique et le temps

nécessaire à sa réalisation font que la micro-injection n’est pas utilisée en clinique humaine,

mais pour la création de nouveaux organismes génétiquement modifiés.

b. Le canon à ADN

Cette technique de biotechnologie utilise des particules de 1 à 5 micromètres de diamètre,

composées d’or ou de tungstène, recouverts d’ADN plasmidique. Les billes sont envoyées à

haute vitesse directement dans les cellules à l’aide d’un gaz propulseur inerte comme

l’hélium.

Cette méthode, comme la micro-injection, à l’avantage de faire pénétrer le plasmide

directement dans les cellules, évitant ainsi la dégradation de l’ADN par les

désoxyribonucléases sanguines et les enzymes de dégradation des endosomes. Malgré des

réactions immunes secondaires, le canon à ADN est principalement utilisé (in vivo et ex

vivo) pour la vaccination (46).

c. L’électroporation

L’électroporation permet de rendre la membrane cytoplasmique transitoirement poreuse à

l’aide d’impulsions électriques de courtes périodes. Pour que l’ADN puisse pénétrer les

cellules, il doit être à leur contact lors du choc électrique et l’intensité de ce dernier doit être

de minimum 1 Volt (74).

Les résultats de l’électroporation varient en fonction de différents paramètres tels que la

nature de la molécule médicament, du générateur, de l’électrode, et du champ électrique.

Ainsi, pour un petit plasmide contenant le gène de la Green Fluorescence Protein, 6 chocs

de 50 ms à 91 Volts/cm sont nécessaires ex vivo alors que pour la bléomycine, il faut 8

chocs de 0.099 ms à 1,300 Volts/cm (75).

Pour pouvoir être utilisées in vivo, les cellules cibles doivent être situées à proximité de

l’électrode de stimulation. Si les cellules sont trop diffuses, les chocs électriques devront être

plus importants pour pouvoir toutes les perméabiliser et des lésions tissulaires apparaîtront.

Pour éviter les brulures, les cellules des organes non accessibles sont prélevées et

manipulées ex vivo. Cette incorporation ex vivo de l’ADN dans le noyau cellulaire à l’aide de

choc électrique s’appelle la nucléofection (76).

59

d. La sonoporation

Tout comme l’électroporation, la sonoporation permet de faire pénétrer le transgène dans

les cellules en perméabilisant les membranes cellulaires. Pour ce faire, de l’ADN

plasmidique est co-injecté dans une microbulle de 1 à 3 micromètres remplie de gaz inerte

ou d’air et délimitée par une couche composée de protéines, lipides ou polymères. Si des

anticorps spécifiques à une sous-population cellulaire sont ajoutés à la surface des

microbulles, il devient alors possible de la cibler précisément.

La réaction des microbulles aux ultrasons est différente en fonction de la fréquence utilisée.

À basse fréquence, les microbulles entrent en résonance et oscillent

(expansion/rétrécissement) de façon stable. Ce phénomène s’appelle la cavitation stable. À

haute fréquence, les microbulles oscillent de plus en plus vite jusqu’à leur implosion. C’est la

cavitation inertielle. (77)

Lors de la cavitation stable, la microbulle peut entrer de différentes façons dans la cellule :

La microbulle présente à la surface de la cellule, déstabilise et rompt la membrane

cellulaire en faisant varier sa taille. (Figure 22 A).

La microbulle est attirée par les ultrasons et perfore la membrane cellulaire présente

sur son chemin (Figure 22 B).

La microbulle, en oscillant, crée un courant dans le milieu extracellulaire. Ce courant

produit un stress mécanique à la surface cellulaire et conduit à la formation de pores

membranaires (Figure 22 C).

Lors de la cavitation inertielle, la microbulle peut entrer de deux façons dans la cellule :

L’onde de choc créée par l’implosion de la microbulle génère un stress mécanique

important et une rupture de la membrane cellulaire (Figure 22 D).

Si elle est asymétrique, l’implosion de la microbulle à la surface de la cellule crée un

courant liquide en direction de la membrane cellulaire. Ce courant permet la

formation d’un pore dans la membrane cellulaire et la pénétration de la microbulle

dans le compartiment intracellulaire (Figure 22 E).

60

Figure 22: Effets de la cavitation stable (A à C) et inertielle (D et E) sur la membrane cellulaire

lors de l'internalisation de la microbulle (77).

e. La magnétofection

Des nanoparticules magnétiques formées de cristaux de magnétite (Fe3O4) ou de

maghémite (Fe2O3) sont reliées à des molécules d’ADN ou à un vecteur (viral ou non). Le

complexe ainsi formé est injecté par voie intra veineuse puis guidé jusqu’au site d’intérêt par

un aimant. Une fois le complexe au contact des cellules, il est internalisé par endocytose. Le

transgène une fois libéré dans le cytosol migre jusqu’au noyau cellulaire pour être exprimé

(78).

L’utilisation des particules magnétiques in vivo est possible, car les métaux utilisés ne

présentent pas de toxicité humaine spécifique et le champ magnétique n’impacte pas le

cycle cellulaire (79).

En conclusion, différents outils sont disponibles pour traiter les patients par thérapie

génique. Le choix de la méthode utilisée pour faire parvenir le transgène dans les cellules

est primordial pour obtenir une réponse optimale. Ce choix doit se faire en tenant compte

des propriétés des vecteurs (Tableau IV) et des besoins du patient.

Maintenant que nous connaissons les différentes techniques de thérapie génique,

intéressons-nous à leurs applications cliniques dans le traitement de la drépanocytose.

61

Tableau IV : Résumé des avantages et inconvénients des vecteurs et méthodes de thérapie

génique

Vecteurs Avantages Inconvénients

adénovirus

facile à produire non intégratif

transduit les cellules quiescentes très immunogène

capacité de transport de 36kb

AAV

intégratif capacité de transport de 4,7kb

transduit les cellules quiescentes faible taux de transduction

immunogène (faible)

rétrovirus

intégratif mutagène

capacité de transport de 8kb

très immunogène

lentivirus

transduit les cellules quiescentes capacité de transport de 10kb

intégratif peu mutagène

immunogène

HSV capacité de transport de 150kb non intégratif

transduit les cellules quiescentes immunogène

lipide cationique

facile à produire toxicité

capacité de transport élevé faible taux de transduction

non immunogène non intégratif

polymère cationique

facile à produire faible taux de transduction

capacité de transport élevé non intégratif

toxicité (faible)

ADN nu

non toxique faible taux de transduction

facile à produire dégradé par les désoxyribonucléases

capacité de transport élevé faible diffusion tissulaire

non intégratif

canon à ADN

peut pénétrer les cellules quiescentes immunogène


que pour les organes superfitiels

électroporation

action localisée cytotoxicité


immunogène

sonoporation peut cibler une population cellulaire non intégratif

capacité de transport élevée immunogène

magnétofection

action localisée immunogène (faible)

peut-être couplée aux méthodes chimique et virales

non intégratif (sauf si couplée avec un vecteur viral intégratif)

62

III. Les essais cliniques de

thérapies géniques pour le

traitement de la drépanocytose

63

A. Introduction sur les essais cliniques de thérapie génique

Comme nous l’avons vu précédemment, la thérapie génique est une approche

thérapeutique dont le but est de prévenir ou traiter une pathologie en modifiant

génétiquement les cellules d’un patient. Cette technique se base sur le transfert d’acides

nucléiques qui apporte, corrige ou inactive le gène cible. Le premier essai clinique de

thérapie génique a été réalisé en 1990 aux États-Unis chez des patients atteints de cancer.

Depuis, 2463 autorisations d’essais cliniques de thérapie génique ont été délivrées (chiffre

d’avril 2017) (80).

Ces essais cliniques sont historiquement réalisés pour traiter les patients atteints de cancers

(64,6%), de maladies monogéniques (10,5%), infectieuses (7,4%) et cardiovasculaires

(7,4%) (Figure 23). Ils se déroulent majoritairement en Amérique du Nord et en Europe. La

France est la 5ème nation mondiale et la 3ème nation européenne la plus innovante en

thérapie génique avec 57 essais cliniques approuvés en avril 2017, bien loin derrière les

États-Unis d’Amérique qui représentent à eux seuls 63% des essais cliniques mondiaux

avec 1550 autorisations (80).

Figure 23: Répartition des essais cliniques de thérapie géniques dans le monde (n) en fonction

de la nature de la pathologie.

De 1990 à avril 2017 d’après John Willey and Sons Ltd, The Journal of Gene Medicine (2017).

64

En analysant les 57 essais cliniques de thérapie génique réalisés en France dans le champ

des produits biologiques, nous pouvons remarquer que 50 ont eu lieu de 2011 à 2016

(Tableau V). Ces données montrent un intérêt nouveau des chercheurs et des autorités

françaises pour ce domaine. L’analyse du nombre d’établissements français de thérapie

génique, tissulaire et banque de tissus ayant une autorisation d’exploitation de l’ANSM

montre également que ce secteur est en plein développement ; les effectifs sont passés de

29 en 2012 à 53 en 2016 (Tableau VI).

Tableau V: Nombre d'essais clinique dans le champs des produits biologiques de 2011 à 2016.

(Source : ANSM, Rapport d’activité 2016)

Essais cliniques dans le champ des produits biologiques

2011 2012 2013 2014 2015 2016

Thérapie cellulaire 17 29 18 8 15 15

Thérapie génique 6 11 8 5 9 11

Tissus 1 2 2 1 3 3

Produits sanguins labiles 2 1 1

Tableau VI: Nombre d'unité de thérapie génique/cellulaire, banque de tissus et établissement

MTI-PP (Médicament de Thérapie Innovante Préparé Ponctuellement) en France de 2012 à

2016.

(Source : ANSM, Rapport d’activité 2016)

Toutes ces données montrent que la thérapie génique représente un réel espoir pour le

traitement des maladies rares ; que ce soit en France et dans le monde. Afin de répondre à

cette attente des patients, nous allons nous intéresser la réglementation nécessaire à la

mise en place de ces essais clinique en France puis nous étudieront les étapes clefs à

maitriser pour que le produit soit le plus sûr et efficace possible et enfin, nous finiront par

présenter les résultats obtenus lors des essais visant à traiter la drépanocytose.

65

B. La réglementation spécifique aux essais cliniques

1. Définition d’un essai clinique

Les essais cliniques sont (Article R1121-1 du code de la santé publique) des recherches

organisées et pratiquées sur des personnes volontaires saines ou malades, en vue du

développement des connaissances biologiques ou médicales qui visent à évaluer :

Les mécanismes de fonctionnement de l'organisme humain, normal ou pathologique.

L'efficacité et la sécurité de la réalisation d'actes ou de l'utilisation ou de

l'administration de produits dans un but de diagnostic, de traitement ou de prévention

d'états pathologiques.

Pour pouvoir être initié, un essai clinique doit réunir au moins deux acteurs : un promoteur et

un investigateur.

a. Le promoteur

Le promoteur est une personne physique ou morale qui prend l'initiative d'une recherche

biomédicale sur l'être humain, qui en assure la gestion et qui vérifie que son financement est

prévu (Décision du 24 novembre 2006 fixant les règles de bonnes pratiques cliniques pour

les recherches biomédicales portant sur des médicaments à usage humain, paru au journal

officiel le 30 novembre 2006).

Il a la responsabilité de veiller au respect des protocoles de l’essai clinique et de garantir le

financement et la qualité de la recherche. Pour cela, le promoteur est en lien avec le Comité

de Protection des Personnes (CPP) et l’Agence Nationale de Sécurité du Médicament

(ANSM), qui doivent donner leur accord pour pouvoir débuter l’essai et à qui le promoteur

doit rendre des comptes en déclarant tous les effets indésirables graves qui sont survenus

et en fournissant un rapport final (81).

b. L’investigateur

Après avoir obtenu l’avis du CPP et l’autorisation de l’ANSM, l’essai clinique est dirigé et

surveillé par un investigateur. Pour les essais cliniques de médicaments, l’investigateur doit

être un médecin justifiant d'une expérience appropriée (81).

L’investigateur doit être présent sur le site de l’étude et est responsable d’inclure les patients

en respectant « les dispositions législatives en vigueur, notamment les articles L. 1122-1 à

L. 1122-2 du code de la santé publique, concernant l'information de la personne qui se prête

66

à une recherche biomédicale et le recueil de son consentement, ou le consentement ou

l'autorisation de toute autre personne dans les cas prévus aux articles L. 1122-1-1 à L.

1122-2 du code de la santé publique. »(82).

L’investigateur à également le devoir de faire remonter au promoteur « tout fait nouveau

intéressant la recherche ou le médicament expérimental susceptible de porter atteinte à la

sécurité des personnes qui s'y prêtent ainsi que toute modification prise dans ce cadre,

permettant ainsi au promoteur de respecter les dispositions législatives et réglementaires en

vigueur » (82).

2. Statut réglementaire des médicaments de thérapie génique

a. Définition des médicaments de thérapie innovante

La fabrication de produit cellulaire ou tissulaire est soumise à des normes et règlements

différents s’il s’agit d’une préparation cellulaire et tissulaire, un médicament de thérapie

innovante préparé ponctuellement (MTI-PP) ou non (MTI).

Un MTI-PP est définit par l’AMSM comme étant « un MTI qui, de par ses caractéristiques et

sa destination, est préparé de façon ponctuelle à l’attention d’un malade déterminé. ». De

plus, le règlement européen 1394/2007 modifiant la directive 2001/83/CE précise que le

MTI-PP doit être « préparé de façon ponctuelle, selon des normes de qualité spécifiques, et

utilisé au sein du même État membre, dans un hôpital, sous la responsabilité professionnelle

exclusive d’un médecin, pour exécuter une prescription médicale déterminée pour un produit

spécialement conçu à l’intention d’un malade déterminé. »

Les médicaments de thérapie innovante sont définis comme étant des produits cellulaires

qui répondent à au moins un de ces deux critères :

Des modifications « substantielles » sont réalisées au cours de la production des

cellules.

Les cellules ou les tissus ne sont pas destinés à être utilisés pour la (les) même(s)

fonction(s) essentielle(s) chez le receveur et chez le donneur.

Si le produit ne répond à aucun de ces critères, alors il sera défini comme une préparation

cellulaire et tissulaire (Figure 24).

67

Seules des modifications non substantielles sont décrites dans les textes réglementaires tels

que la centrifugation, la filtration, la séparation, la cryoconservation, le découpage, etc. Une

succession de modifications, chacune non substantielle peut conduire à un procédé qui

modifie les propriétés des cellules ou tissus et constitue au final une modification

substantielle.

La transduction cellulaire étant considérée comme une modification substantielle, le

médicament de thérapie génique répond à la définition du MTI.

Figure 24: différence entre préparation cellulaire, et médicament de thérapie innovante (83).

Le Règlement (CE) n°1394/2007 et l’annexe I, partie IV, de la directive 2001/83/CE, traduit

en code français n°2011-302 du 22/03/2011, décret n° 2012-1236 du 6/11/2012 définissent

4 catégories de MTI :

Le médicament de thérapie génique : dont l’effet thérapeutique, prophylactique ou

diagnostique dépend directement de la séquence d’ADN qu’il contient ou au produit

de l’expression génique de cette séquence. Seule cette catégorie de MTI sera

développée dans ce manuscrit.

Le médicament de thérapie cellulaire somatique qui est un produit composé de

cellules ou de tissus qui ont été manipulés de façon à modifier leurs caractéristiques

biologiques, leurs fonctions physiologiques ou leurs propriétés structurelles. Ce

68

médicament permet de traiter, de prévenir ou de diagnostiquer une maladie à travers

l’action métabolique, immunologique ou pharmacologique de ces cellules ou tissus.

Le médicament issu de l’ingénierie cellulaire ou tissulaire qui est composé de cellules

ou de tissus qui ont été modifiés afin de régénérer, réparer ou remplacer un tissu.

Le médicament combiné de thérapie innovante qui est composé d’un ou plusieurs

dispositifs médicaux contenant des cellules ou des tissus susceptibles d’avoir sur le

corps humain une action qui peut être considérée comme essentielle.

La fabrication et l’utilisation des MTI lors des essais cliniques sont soumises à des normes

particulières que nous allons désormais aborder.

b. Les normes de fabrication

i. Des MTI

Les médicaments de thérapie innovante doivent être fabriqués dans des établissements

pharmaceutiques après accord de l’Agence Européenne des Médicaments. La fabrication

devra se faire conformément « aux Bonnes Pratiques de Fabrication, à la directive

2003/94/EC sur les bonnes pratiques de fabrication applicables aux médicaments à usage

humain et aux guidelines applicables décrites dans EudraLex volume 4 » (site de l’ANSM

(83)).

ii. Des MTI-PP

Les MTI-PP peuvent être fabriqués, après accord de l’ANSM, dans deux types

d’établissements :

Par un établissement pharmaceutique autorisé par l’ANSM. Ils sont autorisés à

fabriquer et libérer des MTI et pourront donc être autorisés aussi à fabriquer et libérer

des MTI-PP. Ils devront cependant travailler même pour les MTI-PP selon le

référentiel des bonnes pratiques de fabrication des médicaments.

Par un établissement non pharmaceutique, autorisé par l’ANSM. Cette nouvelle

réglementation, introduite par l’arrêté du 4 février 2013 permet ainsi aux hôpitaux de

produire et de délivrer des MTI à leurs patients pour lesquels, il n’existe pas d’autre

traitement disponible : c’est l’exemption hospitalière. Ces établissements devront

fabriquer et libérer ces produits conformément aux bonnes pratiques de fabrication

des MTI-PP prévues à l’article L. 5121-5 du code de la santé publique (83).

69

Une autre catégorie de MTI a été défini dans la Loi Touraine et permet aux CHU de produire

des MTI dans le cadre d'essais cliniques : les MTI expérimentaux. Cette nouvelle

réglementation, permet aux hôpitaux de produire et tester des candidats médicaments sur

les patients inclus dans des essais cliniques.

c. La réglementation pour les essais cliniques utilisant des MTI

Les essais cliniques utilisant des MTI de thérapie génique doivent répondre aux exigences

de la directive 2001/20/CE et doivent respecter les Bonnes Pratiques Cliniques définies

dans la directive 2005/28/CE.

De plus, pour pouvoir être utilisés, en France, dans des essais cliniques, les MTI de thérapie

génique doivent faire l’objet d’une déclaration auprès du Haut Conseil des Biotechnologies

(HCB) (loi du 25 Juin 2008, décret 2007/358 du 19 mars 2007). Le HCB définit le degré de

confinement nécessaire lors de la fabrication, de la manipulation, de l’utilisation du produit et

de son élimination. Le HCB donne également les agréments nécessaires pour l’ouverture

des différents sites de production et d’utilisation du médicament (règle de confinement lors

de l’injection et du suivi des patients). Le classement des Organismes Génétiquement

Modifiés par le HCB est valable 5 ans et doit faire l’objet de renouvellements.

Après avoir obtenu la demande d’agrément d’utilisation confinée du MTI par le HCB, le

développement du MTI en essai clinique devra également être accepté par l’ANSM et par le

Comité de Protection des Personne pour être utilisé en France (Annexe 2). Pour pouvoir

prendre sa décision, l’ANSM interagit avec différents acteurs comme le HCB, l’agence de la

biomédecine et divers experts. Une réponse négative ou une non réponse de l’instance rend

impossible la mise en place de l’essai clinique.

d. Les acteurs des essais cliniques

Pour pouvoir utiliser les MTI en toute sécurité lors des essais cliniques, il est nécessaire de

mettre en contact un grand nombre d’intervenant parmi lesquels (84) :

Le médecin référent qui inclut les patients dans l’essai.

Une unité de prélèvement cellulaire (en cas de greffe autologue) autorisée par

l’Agence Régionale de Santé.

Un laboratoire de biologie médical ou un laboratoire de qualification biologique des

dons pour dépister les éventuelles affections transmissibles du donneur.

70

Le centre de production du médicament.

Le répartiteur qui transporte le médicament jusqu’aux établissements de santé.

La Pharmacie à Usage Intérieur qui est responsable de la réception, du stockage

(éventuellement en association avec l’Unité de Thérapie Cellulaire ou Tissulaire) et

de la dispensation du médicament aux patients.

Une équipe médicale formée pour l’administration du produit et la prise en charge

des effets secondaires potentiels.

Un laboratoire de biomonitoring qui suit l’évolution de la maladie et l’état de santé du

patient lors de l’essai clinique.

e. La traçabilité

L’article 9 de la directive 2006/86/CE réglemente la traçabilité des médicaments de thérapie

innovante. Elle prévoit que les établissements doivent disposer de systèmes précis et

efficaces pour identifier et étiqueter de manière unique les cellules/tissus reçus et distribués.

Ils doivent également être capables de conserver les données (mentionnées dans l’annexes

VI de la directive) sur un support approprié et lisible pendant au moins trente ans. Ces

données doivent permettre d’identifier le donneur, le don, le produit et son application

humaine (82).

Apres avoir étudié la réglementation afférente à la mise en place des essais cliniques de

thérapie génique, nous allons nous intéresser aux étapes clés à maitriser pour leur mise en

place.

71

C. Les étapes clefs pour la mise en place d’essais cliniques de thérapie

génique ex vivo.

À ce jour, tous les protocoles cliniques de thérapie génique, dans le traitement de la

drépanocytose, utilisent des cellules souches hématopoïétiques autologues modifiées ex

vivo à l’aide d’un vecteur lentiviral (partie III.C). Pour obtenir les autorisations nécessaires à

au déroulement de l’essai clinique et pour pouvoir le conduire dans différents centres, les

promoteurs doivent maitriser 3 étapes clefs (85) :

L’obtention des cellules

La transduction cellulaire

La réimplantation des cellules

Ces trois étapes ainsi que les différents protocoles disponibles pour les optimiser seront

développés dans cette partie.

1. Obtention des cellules

L’obtention des cellules souches hématopoïétiques est la première étape pour pouvoir traiter

un patient drépanocytaire par thérapie génique ex vivo. Pour ce faire, il existe 3 techniques

de prélèvement : le prélèvement de moelle osseuse, la mobilisation cellulaire et le

prélèvement de sang de cordon ombilical.

a. Prélèvement de Moelle Osseuse

Le prélèvement de moelle osseuse est la méthode historique pour le prélèvement de

cellules souches hématopoïétiques. Elle fut mise en place dès le milieu des années 1980

pour prélever les cellules des donneurs lors des greffes de cellules allogéniques et reste à

ce jour la technique la plus utilisée chez les patients drépanocytaires lors des essais

cliniques. Cette préférence s’explique par une moins bonne tolérance des patients

drépanocytaires au G-CSF (médicament utilisé lors de la mobilisation cellulaire) associée à

un nombre important de cellules prélevées (à la différence des prélèvements de sang

ombilical) (86).

Pour pouvoir être réalisé, le prélèvement de moelle osseuse nécessite une anesthésie

générale des patients. Les effets secondaires propres à ce mode de prélèvement sont donc

ceux induits par l’anesthésie. De plus, les patients drépanocytaires sont plus à risque de

développer des effets indésirables graves lors de l’anesthésie (33). Les risques majeurs des

72

patients drépanocytaires anesthésiés sont la survenue d’un syndrome thoracique aigu ou

d’une crise vaso-occlusive. Ces effets indésirables sont secondaires à la désoxygénation du

sang lors de l’anesthésie (généralement à base de protoxyde d’azote) et peuvent, s’ils ne

sont pas bien pris en charge, mettre le pronostic vital du patient en jeu.

La prise en charge des effets secondaires consiste en des mesures préventives avec de la

kinésie respiratoire, des transfusions sanguines pour faire diminuer le plus possible le taux

d’HbS et une prévention de l’hypothermie (responsable de vasoconstriction) (87).

b. Mobilisation cellulaire

La mobilisation cellulaire consiste à stimuler la prolifération des cellules souches

hématopoïétiques présentes dans la moelle osseuse afin de les faire sortir dans le sang

périphérique et de les récupérer par aphérèse.

L’aphérèse est une technique de prélèvement de sous-populations cellulaires à partir de

sang. Le sang du patient est prélevé en continu, centrifugé dans l’appareil de cytaphérèse

puis réinjecté au patient. Les cellules possédant une densité entre 1,050 et 1,070 sont

isolées par l’appareil et placées dans une poche ; les autres cellules (plasma, plaquettes,

globules rouges, réticulocytes…) sont réinjectées au patient tout au long du prélèvement.

Pour pouvoir isoler un grand nombre de cellules souches du sang, différents facteurs de

croissance peuvent être utilisés.

Le Granulocyte Colony Stimulating Factor (G-CSF) est le facteur de croissance de la

lignée granulocytaire le plus utilisé pour mobiliser les cellules souches hématopoïétiques

(85). Il est bien toléré chez les patients non porteurs du gène de la drépanocytose et

provoque peu d’effet secondaire. Cette bonne tolérance au traitement a permis d’étendre

son utilisation aux patients drépanocytaires. Malheureusement, en 2001, une patiente de 47

ans souffrant de drépanocytose type SC, sans antécédent de crise vaso-occlusive ou de

syndrome thoracique aigu, est morte suite à l’administration de G-CSF (88).

Chez cette patiente, le traitement par G-CSF a provoqué une hyperleucocytose et une

augmentation de l’adhérence granulocytaire aux vaisseaux sanguins. Ces effets

secondaires ont engendré un phénomène inflammatoire généralisé suivi de crises vaso-

occlusives et de dysfonctionnement d’organes (splénomégalie, une insuffisance respiratoire

et des lésions hépatiques) conduisant à la mort de la patiente. En 2009, un bilan a été

réalisé sur l’utilisation du G-CSF chez les patients drépanocytaires homozygotes (ayant reçu

73

le facteur de croissance entre 1998 et 2008). En raison des risques précédemment décrits, il

fut recommandé d’éviter la mobilisation cellulaire par G-CSF, même chez les patients sans

antécédent de crise drépanocytaire, et de pratiquer le prélèvement de moelle osseuse (89).

Le plérixafor est un antagoniste réversible et sélectif du récepteur de chimiokine CXCR4. Il

est commercialisé depuis 2009 et est utilisé en seconde intention, en association avec le G-

CSF, pour la mobilisation des cellules souches hématopoïétiques chez les patients atteints

de lymphome ou de myélome multiple. En 2014, la haute autorité de santé a évalué son

service médical rendu comme étant important.

Un essai clinique a été réalisé de 2007 à 2010 chez des patients atteints de thalassémie

bêta afin de tester l’utilisation du plérixafor seul (sans G-CSF) (90). Il est ressorti de cette

étude que le plérixafor était aussi efficace et moins toxique que le G-SCF. Les seuls effets

secondaires rapportés étant des nausées, des diarrhées, et des érythèmes au site

d’injection. Un autre essai clinique est actuellement en cours chez des patients

drépanocytaires (clinical trial NCT02193191). Aucun résultat n’est publié à ce jour, mais

l’étude préclinique chez la souris tant à confirmer ceux obtenus chez les patients

thalassémiques (91).

c. Cellules de sang de cordon ombilical

Le recueil des Cellules Souches Hématopoïétiques présentent dans le sang de cordon

ombilical est la seule méthode non invasive pour l’obtention des cellules souches, mais cette

source cellulaire possède des limites. La première limite est la quantité de cellules obtenues.

Seuls les prélèvements de plus de 1,8.106 cellules CD34+ sont utilisables en clinique ; dose

minimale nécessaire au traitement d’un enfant de 10kg (92). Les quantités prélevées sont

donc, à la différence des autres sources cellulaires, non compatibles avec la prise en charge

d’un adolescent ou d’un adulte par thérapie génique autologue.

La seconde limite à cette méthode réside dans la conservation des cellules souches dans

des banques de cellules. Les cellules, collectées à la naissance du patient devront être

conservées plusieurs années avant d’être utilisées. En effet, des interrogations éthiques font

que les cellules ne pourront pas être réinjectées aux enfants ayant leurs deux gènes mutés

dès la naissance. Le choix de retarder le traitement des nouveau-nés a deux origines

médicales :

74

Le cycle de production de l’hémoglobine est tel qu’à la naissance, les bébés

possèdent de l’hémoglobine fœtale qui les protège de la drépanocytose lors de leurs

premières années de vie

La greffe de cellules souches hématopoïétiques nécessite une myéloablation des

patients, conditionnement possédant de nombreux effets secondaires (voir point 3).

Les critères moraux refusant de traiter un enfant avant qu’il déclare la maladie et le nombre

limité de cellules récoltées excluent actuellement les CSH de sang de cordon des protocoles

cliniques, préférant ainsi les cellules médullaires.

Une fois l’étape du prélèvement cellulaire réalisée chez le patient (par prélèvement de

moelle osseuse, aphérèse ou prélèvement de sang de cordon), la seconde étape clef pour

la réalisation d’un essai clinique de thérapie génique est la transduction cellulaire.

2. Transduction cellulaire

Indépendamment du procédé de thérapie génique choisi, la sureté du produit fini est un

paramètre primordial à prendre en compte. L’étape de transduction cellulaire est celle qui

influence le plus ce paramètre. Pour pouvoir assurer la non-dangerosité de cette étape clef,

deux facteurs doivent être contrôlés: le nombre de copies de gène intégré et la répartition

des sites d’intégration dans le génome cellulaire.

a. Nombre de copies de gène

Le nombre de copies de gène intégré (VCN) est le contrôle de sécurité le plus rapide à

réaliser. Il est effectué par PCR quantitative à l’aide d’un gène de référence (gène connu

pour être présent en quantité stable dans toutes les cellules). Généralement, pour les

cellules humaines, ce gène est celui de l’albumine. Ainsi, le calcul des VCN consiste à faire :

. . La multiplication par 2 est due à la diploïdie du

génome humain et donc à la présence de 2 gènes codants pour l’albumine par cellule (1

copie par chromosome).

Ce test donne le nombre de transgènes intégrés dans le génome cellulaire indépendamment

de leurs sites d’intégration (qui resteront inconnus). Il permet d’évaluer le risque de non-

expression du gène (gene silencing), quand ce dernier est présent en très faible quantité, et

de cancérogénicité, quand il est présent en trop grand nombre (93).

75

Le calcul de la VCN est un contrôle qualité de base qui peut être réalisé sur tous les lots

cellulaires produits, mais reste un indicateur partiel quant au risque oncogénique. La

recherche des sites d’intégration est un test complémentaire à ce dernier et permet une

meilleure sécurisation des lots.

b. Étude du ou des sites d’intégration

L’étude des sites d’intégration propre aux vecteurs intégratifs utilisés est primordiale pour

pouvoir anticiper le comportement des cellules une fois réimplantées. En effet, si le

transgène s’intègre dans l’hétérochromatine présente à l’extrémité des chromosomes et au

niveau des centromères, il ne sera pas exprimé par la cellule (94). Si au contraire, il est

intégré dans l’euchromatine, mais à proximité d’un promoteur cellulaire, il sera surexprimé.

De plus, si son intégration se fait à proximité ou dans une région codante, le gène associé à

cette région pourra être dérégulé (sur ou sous-exprimé). Cette dérégulation, quand elle

touche un oncogène ou un gène suppresseur de tumeur, est à l’origine de cancer (95). C’est

pour toutes ces raisons, qu’un séquençage, et généralement réalisé.

Afin de détecter tous les sites d’intégration à risque, le séquençage cellulaire peut être

réalisé après une étape de culture cellulaire (ex vivo ou chez l’animal). Lors de cette étape,

les cellules, possédant une mutation oncogène, proliféreront plus que celles ne l’ayant pas.

Cette sélection positive permet de détecter une sous-population minoritaire à fort risque

oncogénique et sécurise d’autant plus le procédé (85).

3. Greffe cellulaire

La dernière étape clef pour le traitement des patients par thérapie génique ex vivo est le

taux de cellules génétiquement modifiées greffées au patient. Pour obtenir des résultats, 10

à 30% des cellules souches hématopoïétiques doivent porter le transgène (85). Cette

proportion relativement faible de cellules nécessaires au traitement des patients peut être

expliquée par plusieurs raisons comme l’avantage sélectif des cellules traitées par rapport

aux cellules porteuses de la maladie lors de l’hématopoïèse ou la durée de vie plus

importante des hématies non falciformes (96). En effet, l’étude parue dans le journal Blood

(96) a montré qu’en remplaçant seulement 25% des CSH présentes dans la Moelle Osseuse

du patient par des cellules possédant des gènes fonctionnels de l’Hb, on pouvait corriger

75% de l’ARN produit. Cette production importante en ARN et en protéine permet au patient

de voir sa production Hb S chuter de 78% à 30% de l’hémoglobine totale (Tableau VII). De

même, les patients dont 50% des gènes de l’hémoglobine sont fonctionnels ont >90%

76

d’ARN corrigé et conserve 100 jours après la greffe une concentration basale en Hb S à

30%.

Tableau VII: Présentation des résultats obtenus chez 4 patients atteints de drépanocytoses

ayant subi une greffe de CSH allogéniques (96)

Patients Taux d’HbS

avant greffe

% ADN corrigé à

30 j post greffe

% ARN corrigé à

30 j post greffe

Taux d’HbS post

greffe (à 100 jours)

Patient 1 78% 25% 75% 29.8%

Patient 2 96.6% 50% >90% 33.4%

Patient 3 40.1% 50% >90% 32.4%

Patient 4 76.4% 85% >90% 3.8%

Il a été montré que le niveau de myéloablation présent chez les patients lors de la greffe

cellulaire était proportionnellement corrélé au taux de cellules souches implantées et à

l’efficacité de la greffe (97). Cette étape est donc nécessaire pour le traitement du patient,

même si l’utilisation des cellules du patient ne présente pas de risque de rejet de greffe ou

de GVHD (98).

Le choix des molécules de chimiothérapie et les doses utilisées doivent être déterminés en

fonction de la clinique du patient et de sa capacité à supporter le traitement. Dans le cas de

greffe autologue, les protocoles utilisant des doses réduites de chimiothérapie associées ou

non à de la radiothérapie devront être privilégiés (99). Ce conditionnement, plus faible,

permet d’inclure des patients qui étaient jusque-là exclus des protocoles de greffe cellulaire

en raison des risques liés à l’utilisation de ces molécules (100).

Après avoir vu les étapes clefs à maitriser avant de débuter un essai clinique de thérapie

génique, nous allons désormais nous focaliser sur les essais cliniques de thérapie génique

qui visent à traiter une maladie monogénique particulière : la drépanocytose.

77

D. Les essais cliniques de thérapie génique en cours pour le traitement de

la drépanocytose

Pour rappel, la drépanocytose est une maladie génétique secondaire à la substitution sur le

gène de la chaine bêta de l’Hb d’un acide nucléique en position 17 (annexe 3). Cette

substitution conduit à la fabrication d’une protéine mutée possédant en position 6, de l'acide

glutamique (hydrophile) à la place de la valine (hydrophobe). Cette protéine, quand elle est

intégrée dans les érythrocytes, modifie leurs propriétés physiques et biochimiques.

Quand la pression partielle en oxygène diminue dans les capillaires sanguins, les hématies

libèrent l’oxygène qu’elles contiennent. Cette libération conduit à un rapprochement entre les

groupements hydrophobes présents sur la chaine bêta de l’hémoglobine (la phénylalanine

en position 85 et la leucine en 88) et la valine présente en position 6 sur la chaine bêta S de

l’hémoglobine voisine (Figure 25). Ce rapprochement des tétramères d’hémoglobine

engendre la formation de polymère d’hémoglobine dans les hématies. Les polymères

augmentent la rigidité des érythrocytes, leur donnent une forme caractéristique de faucilles

et diminuent leur affinité pour l’oxygène.

L’objectif de la thérapie génique dans le traitement de la drépanocytose est donc de

diminuer la formation des polymères d’hémoglobine dans les hématies. Pour y parvenir,

différentes méthodes sont actuellement à l’étude sur l’Homme (Tableau VIII). Ces 5 essais

cliniques utilisent la même stratégie : inhiber la polymérisation de l’HbS. Pour réaliser cet

objectif, ils utilisent tous un vecteur lentiviral.

Les vecteurs lentiviraux ont été privilégiés aux autres méthodes de transduction cellulaire,

car ils conjuguent deux avantages majeurs : ils sont stablement exprimés dans les cellules

cibles (même après différenciation en progéniteurs cellulaires ou en cellules matures) et

sont très peu oncogènes (98). Ceux utilisés lors des essais cliniques sont tous construits sur

le même modèle (Figure 26). La partie du vecteur qui sera intégrée au génome cellulaire est

délimitée par les régions hautement répétées (LTR) possédant une délétion auto-

inactivante. Cette délétion permet de sécuriser la transduction cellulaire et d’éviter les

interactions entre le transgène et les gènes voisins. La région qui régule l’expression du

transgène est quant à elle constituée des sites hypersensibles (HS) et du promoteur

proximal du gène de l’hémoglobine bêta. Enfin, une queue polyA vient se placer juste après

le transgène afin de stabiliser l’ARN messager produit lors de la transcription..

78

Figure 25: Induction de la polymérisation de l'hémoglobine S.

Les groupements hydrophobes présents sur les molécules de désoxy-hémoglobine

interagissent entre eux et conduisent à la formation de polymère d’hémoglobine dans les

hématies. A gauche de la figure : structure des molécules d’hémoglobine, au centre : structure

macromoléculaire, à droite structure cellulaire de l’hématie. (101)

Figure 26: Partie intégrée dans le génome cellulaire du vecteur lentiviral utilisé pour le

traitement de la drépanocytose par thérapie génique (98).

La cassette intégré est délimitée par les régions hautement répétées (LTR : long terminal

repeats) possédant une délétion auto-inactivante (Δ). La région régulatrice de l’expression du

transgène est constituée de sites hypersensible (HS) et du promoteur proximal du gène de

l’hémoglobine beta (β-p). La queue polyA (pA) a pour rôle de stabiliser l’ARN messager

produit.

79

Tableau VIII: Présentation des essais cliniques de thérapie génique dans le traitement de la drépanocytose en cours de réalisation.

(Source : ClinicalTrials.gov, mots clefs : Sickle Cell Disease et gene therapy). CSH : cellules souches hématopoïétiques, shARN : ARN en épingle

à cheveux.

Numéro de l’essais clinique

Type de thérapie génique

Cellules transduites

gène vecteur pays stade début

inclusion fin

prévisionelle

NCT02151526 Ex vivo CSH BB305 lentivirus France I/II juil-13 févr-19

NCT02140554 Ex vivo CSH BB305 lentivirus USA I août-14 août-20

NCT02247843 Ex vivo CSH beta AS3-FB lentivirus USA I juil-14 juin-19

NCT02186418 Ex vivo CSH gamma globuline lentivirus USA I/II juil-14 août-32

NCT03282656 Ex vivo CSH shARN spécifique à BCL11A lentivirus USA I nov-17 déc-19

80

Bien que le vecteur lentiviral soit toujours construit sur le même modèle, les scientifiques ont

développé différents transgènes pour lutter contre la drépanocytose. Il y en a actuellement 4

qui sont utilisés en clinique. Ils peuvent être classés en deux groupes : ceux qui produisent

de l’hémoglobine bêta fonctionnelle et ceux qui font augmenter les taux d’hémoglobine

fœtale.

Nous allons désormais étudier les spécificités propres à chaque transgène et discuter des

résultats obtenus ou attendus.

1. Apporter un gène fonctionnel de la chaine bêta de l’hémoglobine

Comme nous venons de le voir, le but de cette méthode est d’éviter la polymérisation de

l’HbS en restaurant partiellement la production d’HbA lors de l’érythropoïèse. Pour ce faire,

le premier vecteur utilisé en clinique portait le transgène HPV569.

a. Le vecteur HPV569

i. La construction du vecteur

Le premier essai clinique réalisé dans le monde et ayant permis de traiter un patient atteint

d’hémoglobinopathie eut lieu en France de 2006 à 2011 (102,103). Trois patients ont reçu le

traitement : Un souffrait de thalassémie majeure isolée (n°1002) et Deux de thalassémie

majeure associée à une production d’Hb mutée (HbE) (n°1003 et 1004). Lors de cet essai

clinique, les CSH des patients ont été prélevées par mobilisation cellulaire (par G-CSF +

plérixafor) puis transduites à l’aide d’un vecteur lentiviral contenant la construction HPV569

(Figure 27). Cette construction est semblable à celle précédemment décrite (Figure 26) à

une différence prête : les régions hautement répétées ne possèdent pas de délétions auto-

inactivantes mais un isolateur cHS4. L’isolateur cHS4, tout comme la délétion auto-

inactivante précédemment citée, est une séquence d’ADN placée de part et d’autre du gène.

Cette séquence permet d’isoler le gène et d’empêcher le promoteur greffé d’amplifier un

gène à proximité, autre que celui d’intérêt. Cette séquence protège donc le patient d’une

suractivation de ses autres gènes.

Le gène de l’hémoglobine bêta sauvage n’a pas été utilisé dans le vecteur HPV569. Il fut

montré lors des essais précliniques réalisés sur la souris que ce gène ne permettait pas

l’inhibition de la polymérisation de l’HbS, contrairement à celui de la chaine gamma de l’Hb.

Parmi les 10 acides aminés qui diffèrent entre ces deux chaines, celui en position 87 semble

jouer un rôle crucial dans l’interaction avec l’HbS (104). La substitution de la thréonine

81

présente sur le gène bêta en position 87 par une glutamine permet de conférer à l’HbA les

mêmes propriétés protectrices que l’HbF. Le transgène contenu dans le vecteur HPV569 est

donc le gène de l’hémoglobine bêta muté en position 87 (HbA T87Q).

Figure 27: Vecteur lentiviral HPV569 (103).

La cassette intégrée est délimitée par les régions cHS4 qui sont des isolateurs. La région

régulatrice de l’expression du transgène est constituée de sites hypersensibles (HS) et du

promoteur proximal du gène de l’hémoglobine beta (β-p). Le transgène est constitué du gène

de l’hémoglobine béta muté en position 87. Le vecteur contient également un élément de

reverse transcription (RRE), un site de début (SD) et de fin (SA) épissage et un site

d’amplification (E).

ii. Protocole de greffe cellulaire

En fin de transduction cellulaire, les cellules contiennent en moyenne 0,3 à 1,6 transgènes

par cellule. Avant de les injecter par voie intraveineuse aux patients, ceux-ci devront subir un

conditionnement. Le busulfan est utilisé à la dose de 3,2 mg/kg/jour pendant 4 jours pour

éliminer toutes les cellules souches présentes dans la moelle osseuse et faciliter la prise de

la greffe. 0,93.106 à 4,3.106 cellules/kg sont injectées aux patients une fois ces derniers

prêts à être traités (Tableau IX).

iii. Résultats

Les résultats obtenus chez les 3 patients traités lors de cet essai clinique sont très différents

d’un patient à l’autre (102). Ces différences peuvent avoir plusieurs origines telles que la

dose cellulaire utilisée (suite à une difficulté à mobiliser les cellules des patients

drépanocytaires), le nombre de copies de gène intégré (VCN), ou la mutation à l’origine de

la maladie (Tableau IX).

82

Tableau IX: Présentation des résultats obtenus en cliniques avec le vecteur HPV569

Patient Age Génotype Dose en cellules reçues

VCN Résultats

1002 29 β+/ β0 0,93.106/kg 1,3 Rejet de greffe

1003 18 βE/ β0 3,9.106/kg 0,6 Anémies après 7 ans sans traitement. Aucun traitement chronique à ce jour

1004 22 βE/ β0 4,3.106/kg 0,3 Le patient est toujours traité par transfusions sanguines. Taux d’HbA = 5% de Hb totale.

Le premier patient traité (1002) souffrait de thalassémie bêta génotype β+/β0. Il a reçu une

faible dose de CSH (0,93.106 cellules/kg) alors qu’il est généralement recommandé

d’injecter 2 à 2.5.106 cellules/kg (105). Les raisons de ce choix n’ont pas été expliquées. Le

patient a rejeté le greffon probablement pour cette raison.

Le patient 1004 souffrait de thalassémie bêta génotype βE/β0. Il a reçu une dose de CSH de

4,3.106 cellules/kg. La greffe a bien pris et le patient est sorti d’aplasie médullaire au bout de

22 jours. Malheureusement, avec une quantité produite d’HbA T87Q égale à 5% de Hb

totale, le patient n’est pas guéri et continu à recevoir des transfusions sanguines

régulièrement. Ce faible taux d’Hb produite est peut-être dû au faible taux de transduction

cellulaire obtenu, avec seulement 30% des cellules transduites (VCN=0,3).

Le patient 1003 souffrait de thalassémie bêta génotype βE/β0. Il a reçu une dose de CSH

égale à 3,9.106 cellules/kg avec une VCN à 0,6. La transduction cellulaire semble donc avoir

produit une grande quantité de cellules portant le gène HbA T87Q. La greffe cellulaire s’est

bien passée et le patient est sorti d’aplasie médullaire en 27 jours. Pendant 7 ans, le patient

n’a reçu aucun traitement et produit 30% d’HbA T87Q. Il déclara ensuite une anémie

nécessitant une transfusion sanguine, mais ne bénéficie toujours pas à ce jour de

programme régulier de transfusion sanguine.

En conclusion, cet essai clinique a permis de prouver que les CSH autologues pouvaient

être utilisées pour traiter les patients atteints d’hémoglobinopathie. Aucun effet secondaire

grave, leucémie, ni lymphome n’ont été mis en évidence (102). Le vecteur HPV569 semble

avoir un effet secondaire sur le génome. La partie terminale cHS4 du vecteur interagit avec

le gène HMGA2 (98). Cette interaction conduit à une surexpression du gène, qui chez la

souris conduit à une augmentation de la production de tous les éléments figurés du sang et

à une splénomégalie (106). Cette interaction a obligé les cliniciens et chercheurs à mettre au

point un nouveau vecteur, en remplaçant la partie cHS4 : le BB305.

83

b. Le vecteur BB305

Le vecteur BB305 est actuellement utilisé dans deux essais cliniques différents. Le premier

essai a débuté en France en juillet 2013 et le second a commencé aux États unis en août

2014. Il vise à traiter à la fois les patients atteints de thalassémie et de drépanocytose. Pour

les patients drépanocytaires, les critères d’inclusion sont : un historique médical incluant de

nombreuses crises drépanocytaires, l’absence de donneur HLA compatible pour une greffe

de CSH allogéniques et l’échec au traitement par hydroxyurée (102). Les CSH des patients

sont prélevées au niveau de la moelle osseuse avant d’être transduites ex vivo et

réinjectées aux patients.

i. Construction du vecteur

Le vecteur lentiviral BB305 possède exactement la même construction que le vecteur

HPV569. Seuls les domaines terminaux sont différents avec le remplacement de la région

cHS4 par une région auto-inactivante (Figure 28).

Figure 28: Vecteur lentiviral BB305 (103).


Le protocole de greffe cellulaire est le même que pour le vecteur HPV569. Les patients sont

donc conditionnés avec du busulfan avant d’être greffés.

iii. Résultats

Les bilans complets des études ne sont pas encore publiés ; seuls des résultats partiels sont

disponibles. Les résultats obtenus chez 7 patients drépanocytaires traités aux États-Unis et

un patient drépanocytaire traité en France pourront être présentés.

84

L’essai clinique américain

Sept patients âgés de 18 à 42 ans et souffrant d’une forme sévère de drépanocytose ont été

traités aux États unis par le vecteur lentiviral BB305 (107). Les patients ont reçu des doses

de cellules souches allant de 1,6 à 5,1.106 cellules/kg et possédant un nombre de

transgènes de 0,3 à 1,3 copies de gène par cellule (Tableau X). Les patients n’ont souffert

d’aucun effet secondaire propre aux cellules souches. Les effets secondaires les plus

graves étaient des douleurs, une anémie et une CVO lors du prélèvement des cellules

souches dans la moelle osseuse.

L’article de Kanter et al. (107) présente peu de résultats à moyen terme, car parmi les 7

patients traités, seuls 4 ont été suivis plus de 3 mois. Chez ces 4 patients, 3 ont refait une

CVO après la greffe cellulaire. De plus, l’analyse des taux d’Hb circulante montre que seuls

2 patients ont un taux HbA T87Q supérieur à 1g/dL. Les auteurs expliquent cet échec relatif

par plusieurs hypothèses : les faibles VCN, une myéloablation inadéquate et la quantité trop

faible de cellules greffées.

Tableau X: Présentation des résultats obtenus chez 7 patients traités à l'aide du vecteur BB305

(107).

VCN : copie de gène par cellule, * : 2 prélèvements $ : 3 prélèvements de CSH de moelle

osseuse.

Patients Cellules

greffées (106/kg) VCN

Taux HbA T87Q à la

dernière visite (g/dL)

Date de la dernière

visite (mois)

1301 2,6 0,5 – 0,6* 0,3 9

1303 2,8 1,3 1,2 12

1304 1,6 0,3-0,5-0,5$ 0,4 6

1306 2,1 0,6 0,5 6

1308 1,9 0,5-0,8* 0,2 3

1309 1,8 0,9 1,0 3

1310 5,1 0,9-0,4* 0,1 3

85

L’essai clinique français.

En France, seuls les résultats relatifs à un patient atteint de drépanocytose et traité en

octobre 2014 ont été publiés à ce jour (108).

Le patient était un enfant de 13 ans souffrant d’une drépanocytose grave pseudotypée βS/βS

associée à une délétion de 3,7 kilo-base dans un des gènes de la chaine alpha de

l’hémoglobine. Le patient souffrait de CVO récurrente, d’ostéonécrose bilatérale de la

hanche et avait déjà fait 2 épisodes de syndrome respiratoire aigu. Le patient avait subi une

cholécystectomie et une splénectomie pendant l’enfance et avait été traité par hydroxyurée

de l’âge de 2 à 9 ans sans succès.

Lors du traitement par thérapie génique, le patient n’a souffert d’aucun effet indésirable

imputable aux CSH. Les effets secondaires sont apparus lors de la myéloablation et sont :

une pancytopénie associée à une infection par Staphylococcus epidermidis (bactérie

commensale de la flore cutanéo-muqueuse).

Le patient reçu une grande quantité de cellules (5,6.106/kg) possédant en moyenne une

copie de gène par cellule (Tableau XI). Après traitement, le patient est progressivement sorti

d’aplasie médullaire. Il fut capable de produire ses propres défenses immunitaires dès le

38ème jour. Au 88ème jour, la production d’hématies était suffisante et les transfusions

sanguines se sont arrêtées. Il fallut attendre le 91ème jour pour que la numération

plaquettaire soit redevenue normale. L’état clinique du patient lui a permis de sortir de

l’hôpital dès le 50ème jour post greffe sans aucun traitement (ni antidouleur).

Tableau XI: Présentation des résultats obtenus chez un patient français traité à l'aide du

vecteur BB305 (108).

VCN : copie de gène par cellule, * : 2 prélèvements de CSH de moelle osseuse.

Age Génome Cellules greffées

(106/kg) VCN

Date de sortie

d’aplasie médullaire

Taux HbA T87Q

à 15 mois

13 ans βS/ βS 5,6 1–1,2* 38 jours

5,7 g/dL

48% de Hb

totale

86

À 12 mois post-greffe, des tests ont été réalisés sur les hématies afin de contrôler leurs

propriétés :

Leur affinité pour l’oxygène fut quantifiée par l’analyseur Hemox qui mesure à l’aide

d’une électrode Clark le taux d’oxygène présent dans le milieu. Lors du dosage, une

réaction de catalyse de l’eau se produit au niveau de la sonde : O2 + 4 e− + 4 H+ → 2

H2O. Les électrons ainsi mobilisés sont quantifiés et la quantité d’oxygène calculée.

Le taux d’hématie falciforme en milieu hypoxie et normoxie. Pour ce faire, les cellules

sont mises en culture dans un milieu contenant différentes concentrations en

oxygène (20, 15, 10, 7, 5, 3 et 0%). Après 20 minutes, les cellules sont comptées à

l’aide d’un microscope et le ratio hématie falscifome / hématie normale est calculé.

Leurs propriétés de déformabilité sont mesurées par ektacytomètrie. Les cellules en

suspension sont placées dans une sorte de rotor qui crée des forces de cisaillement ;

forces qui incitent les cellules à se déformer. L’analyse en continu de l’indice de

diffraction d’un laser permet de connaître la forme des cellules et de quantifier leur

déformabilité en fonction de la vitesse du rotor.

Le bilan de ces tests a révélé que les hématies produites avaient les mêmes propriétés que

celles d’un patient porteur du trait drépanocytaire asymptomatique.

À 15 mois post-greffe, le taux d’Hb était stable autour de 12g/dL (normale : 13 à 18 g/dL)

avec 48% d’HbA T87Q. Les fonctions hépatiques et rénales étaient devenues normales. Le

patient ne souffrait plus d’hémolyse (bilirubine normale) ni de dommage tissulaire (lactate

déshydrogénase et imagerie par résonance magnétique normale).

À ce jour, le patient est considéré comme guéri de la drépanocytose

c. Le vecteur βAS3-FB


Parallèlement aux vecteurs BB305, un second vecteur de thérapie cellulaire fut mis au

point : le βAS3-FB. Ce vecteur a une construction similaire à ceux déjà décrits. Seuls deux

éléments diffèrent : les domaines terminaux et le transgène (Figure 29).

Afin d’éviter les mutations insertionnelles comme retrouvées avec le vecteur HPV569, le

vecteur βAS3-FB possède un petit isolateur FB de 77 paires de bases dans la partie auto-

inactivante terminale. L’efficacité de ce groupement a été vérifiée chez la souris. Le groupe

87

d’animaux traité n’a pas déclaré plus de cancer ou de lymphome que le groupe contrôle.

L’isolateur FB est donc efficace (86).

Figure 29: Vecteur βAS3-FB.

La cassette intégrée est délimitée par les régions FB qui sont des isolateurs. La région

régulatrice de l’expression du transgène est constituée de sites hypersensible (HS) et du

promoteur proximal du gène de l’hémoglobine beta (β-p). Le transgène est constitué du gène

de l’hémoglobine béta muté en position 16, 22 et 87. Le vecteur contient également un élément

de reverse transcription (RRE), un site de début (SD) et de fin (SA) épissage et un site

d’amplification (E).

Le transgène présent dans le vecteur βAS3-FB est comme pour les précédents un gène de

l’HbA muté, mais avec 3 mutations (109). Les 3 mutations font toutes partie des 10 acides

aminés qui diffèrent entre la chaine bêta et gamma de l’Hb. Les mutations sont :

Comme pour les vecteurs précédents : le remplacement de la thréonine par une

glutamine en position 87 (T87Q).

Le remplacement en position 22 de l’acide glutamique par une alanine (E22A). Cette

substitution permet comme pour la T87Q d’inhiber la polymérisation de l’HbS.

Le remplacement en position 16 de la glycine par un acide aspartique (G16D). Cette

mutation permet d’augmenter les liaisons entre les chaines alpha et bêta de

l’hémoglobine et de diminuer par compétition la formation d’HbS (toutes les chaines

alpha sont utilisées pour faire de l’HbA.


L’essai clinique NCT02247843 (110) concerne les patients de plus de 18 ans, atteints de

drépanocytose génotypée βS/βS ou βS/β0, ayant eu plusieurs syndromes drépanocytaires

majeurs, étant en échec thérapeutique. Pour pouvoir inclure les patients, aucun donneur de

moelle osseuse ne doit être compatible.

Le protocole de greffe cellulaire est le même que pour les vecteurs précédents. Les cellules

sont prélevées dans la moelle osseuse puis les patients sont conditionnés avec du busulfan

avant d’être greffés.

88

iii. Résultats

Les résultats de l’essai clinique de phase I ne sont pas encore disponibles. Seules les

données obtenues pendant l’étude préclinique réalisée sur des souris NSG sont disponibles

(109). La souris NSG est l’espèce murine la plus utilisée en thérapie génique, car elle

immunodéficiente (elle ne possède pas de lymphocyte B, T ni de cellules natural killer). Ce

modèle murin permet la réalisation de xénogreffes (greffes réalisées avec des cellules

provenant d’une espèce différente : ici l’Homme) orthotopique (les cellules sont

transplantées au même endroit que pour l’Homme : ici dans le sang) sans risque de rejet de

greffe par le système immun de la souris.

Les données de transduction cellulaire réalisées avec le vecteur βAS3-FB montrent que les

cellules transduites ont intégré en moyenne 0,92 copie de gène. La proportion en nombre de

gènes intégré suit une loi de Poisson avec : 70% des cellules n’ayant pas intégré de gène,

26% en ayant intégré 1 ou 2, 3% entre 3 et 6 et 1% entre 7 et 9. Ces proportions montrent

peu de cellules avec 3 gènes intégrés ou plus, ce qui est compatible avec une utilisation

clinique chez l’Homme. De plus, les tests de clonogénicité et de différenciation cellulaire

effectués in vitro ont été réalisés. Dans ce test, les CSH sont ensemencées dans un milieu

de methylcellulose (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Canada) comportant les

facteurs de croissance cellulaire nécessaires à la prolifération et à la différenciation des

cellules souches hématopoïétiques. Après 14 jours de culture, les différents progéniteurs

hématopoïétiques ont proliféré et ont formé différents types de colonies selon leur stade de

maturation :

Les CFU-GEMM (Colony Forming Unit – Granulocyte Erythroid Megakaryocyte

Macrophage) pour les cellules les moins différenciées.

CFU-GM (Colony Forming Units Ggranulocyte Macrophage) pour les progéniteurs

impliqués dans les voies granulocytaires et monocytaires.

BFU-E (Burst Forming Units Erythroid) pour les progéniteurs érythrocytaires.

Ce test n’a mis en évidence aucune différence entre les cellules transduites ou non

transduites. Enfin, le taux d’HbA fut dosé dans les hématies différenciées in vitro. Les

cellules contiennent en moyenne 18% d’HbA.

Chez la souris, deux tests ont été réalisés afin de connaître les risques associés aux

vecteurs : un test de génotoxicité et une numération des différents progéniteurs présents

dans la moelle osseuse des souris. Le test de génotoxicité, réalisé par rapport à un contrôle

89

positif a conclu à l’absence de risque du vecteur. La numération des progéniteurs cellulaires

présents dans la moelle osseuse des souris greffées et non greffées montre que le vecteur

est peu susceptible d’induire des lymphomes en favorisant une lignée cellulaire par rapport

aux autres.

En conclusion, le vecteur βAS3-FB semble prometteur, mais les résultats de génotoxicité et

d’efficacité restent à être confirmés chez l’Homme (but de l’essai clinique en cours)

2. Augmenter la production d’HbF

Comme évoqué précédemment, le maintien de la production d’HbF chez l’adulte

drépanocytaire est plus efficace pour le traitement des patients que la correction du gène

bêta de l’HbA (111). Les chaines gamma de l’HbF diminuent efficacement la polymérisation

des chaines bêta S de l’Hb et donc le taux d’hématie falciforme.

Au cours du développement normal d’un individu, les gènes codants pour l’HbF sont inhibés

au profil de ceux codant HbA. Pour restaurer la production d’HbF, deux méthodes sont

actuellement testées en clinique : l’ajout du gène gamma de l’Hb et l’inhibition du gène

BCL11A.

a. Ajout du gène gamma de l’hémoglobine

Le but de cette thérapie est de diluer l’HbS par de l’HbF. Pour être efficace, l’Hb totale

produite par les cellules transduites doit contenir au minimum 30% HbF (85).


Le vecteur letiviral utilisé pour apporter le gène de la chaine gamma de l’hémoglobine

possède exactement la même construction que le vecteur BB305 précédemment décrit. La

seule différence entre les deux vecteurs est la composition du transgène avec le gène bêta

A T87Q pour le BB305 et gamma pour celui-ci (Figure 30).

Figure 30: Vecteur lentiviral contenant le gène de la chaine gamma de l’Hb (103).

90

Afin de permettre une bonne expression du transgène chez les patients adultes, le

promoteur présent dans le vecteur est celui du gène de la chaine bêta de l’Hb et non de la

chaine gamma de l’Hb. Ce choix permet d’assurer une production continue de l’HbF et

minimise les risques d’inactivation du transgène.

Lors des essais chez la souris, il fut rapporté que les cellules contenant une grande quantité

d’ARN messager codant pour la chaine bêta de l’Hb exprimaient très peu le transgène.

Cette différence n’est pas due à l’expression des gènes, mais à la stabilité de leurs ARN

messager. En effet, le gène de la chaine bêta de l’Hb contient dans la partie terminale un

motif plus riche en pyrimidine que celui de la chaine gamma. Ces motifs permettent une

meilleure stabilité de l’ARN messager produit. Afin de produire de l’HbF en grande quantité,

le vecteur lentiviral V5m3 a été mis au point (112). Il contient à la fois le promoteur et la

partie terminale du gène de la chaine bêta de l’Hb.


L’essai clinique NCT02186418 (113) concerne les patients de 18 à 35 ans, atteints de

drépanocytose de stade sévère et étant en échec thérapeutique. Les patients doivent avoir

une fonction rénale, hépatique et cardiaque normale et aucun donneur de moelle osseuse

ne doit être compatible avec eux.


sont prélevées dans la moelle osseuse puis les patients sont conditionnés avant d’être

greffés.

iii. Résultats

Les résultats de l’étude clinique de phase I/II ne sont pas encore disponibles, seules les

données obtenues chez la souris le sont. Deux vecteurs différents ont été testés chez la

souris : le vecteur V5m3 (112,114) décrit précédemment et le vecteur I8Hβ/γW (115). Ce

dernier possède une construction similaire aux V5m3 avec le promoteur et la partie

terminale du gène de la chaine bêta de l’Hb. La différence entre les deux vecteurs se fait au

niveau des parties non codantes du gène (intron) (116).

Les données de transduction cellulaire réalisées avec les deux vecteurs sont similaires. Les

cellules transduites ont intégré en moyenne 1,7 copies de gène pour le vecteur V5m3 et 2

pour le vecteur I8Hβ/γW. Ce taux de transduction cellulaire conduit à la formation d’HbF en

91

grande quantité (48% de l’Hb totale pour le vecteur V5m3 et 40% pour I8Hβ/γW) sur une

longue période (plus de 6 mois) (112,115).

Chez les souris traitées par le vecteur I8Hβ/γW, différents tests ont été réalisés afin de

connaître les effets in vivo de la thérapie génique (115). Les propriétés des hématies ont été

analysées. Le nombre de cellules falciformes en condition normoxique est ainsi passé de

12% à 2,3% et la demi-vie des hématies de 2 à 8 jours. Le traitement a donc permis de

traiter l’anémie hémolytique chronique des souris et a réduit les risques de CVO. La fonction

rénale est restée bonne et la splénomégalie a disparu lors du traitement.

Aucun test de génotoxicité n’a été rapporté pour les deux vecteurs.

En conclusion, les vecteurs contenant le gène de la chaine gamma de l’Hb semblent

prometteurs, mais les tests de génotoxicité doivent être réalisés et leur d’efficacité reste à

être confirmés chez l’Homme. Ces questions font actuellement l’objet d’un essai clinique

(NCT02186318).

b. Inhibition de BCL11A

BCL11A (pour B cell lymphoma-leukemia 11A) est un facteur de transcription en doigt de

zinc nécessaire à la production des lymphocytes T et B. Plus récemment, des études ont

démontré que cette molécule joue également un rôle dans l’érythropoïèse et plus

particulièrement dans l’inhibition de la synthèse de l’HbF.

BCL11A inhibe la formation des chaines gamma de l’Hb en interagissant avec les NuRD

(Nucleosome Remodelling Deacetylation) : des complexes de remodelage associés à deux

histones désacétylases, la protéine de matrice nucléaire Matrin 3, les facteurs de

transcription erythroïdes GATA1 et FOG1 et le facteur de transcription : SOX6 (Figure 31).

Quand le complexe se fixe à proximité du gène de la chaine gamma de l’Hb, elle empêche

les régions contrôle (LCR) d’interagir avec le gène. Ne pouvant se fixer, les LCR se

déplacent sur le gène de la chaine bêta de l’Hb à proximité et l’activent (117).

92

Figure 31: Complexe BCL11 avec ses cofacteurs principaux (117).

Le but l’essai clinique NCT03282656 est donc d’inhiber la production de BCL11A afin

d’empêcher la transition HbF HbA et de conserver un taux élevé d’HbF chez l’adulte.


Différents vecteurs ont été construits pour inhiber la production de BCL11A. Le premier mis

au point fut un vecteur lentiviral codant pour un shARN avec un promoteur spécifique à

l’ARN polymérase III (pol III). L’utilisation de cette construction chez la souris a démontré

que l’inhibition des ARN messager de BCL11A par des shARN permet bien de restaurer la

production d’HbF. Malheureusement, une forte cytotoxicité est apparue, rendant son

utilisation impossible chez l’Homme (118).

Le second vecteur mis au point est un vecteur lentiviral codant pour un shARNmir avec un

promoteur ubiquitaire SFFV. Le promoteur SFFV transcrit l’ADN en ARN messager avec

l’ARN polymérase II (pol II) (118). Le shARNmir présent dans ce vecteur est le shARN du

premier vecteur avec un micro ARN dans sa partie terminale (Figure 32). Le remplacement

du shARN par un shARNmir a deux avantages : le transgène est compatible avec l’utilisation

d’un promoteur pol II et la molécule finale est plus stable.

La grande différence entre les deux premiers vecteurs résulte dans le passage d’un

promoteur spécifique à pol III, qui produit directement un shARN mature à partir de l’ADN, à

un promoteur spécifique à pol II qui produit un shARNmir immature, nécessitant l’intervention

de Drocha et Dicer pour être actif. Ainsi, dans le noyau cellulaire, le Pri-miRNA (ARN

synthétisé à partir de l’ADN) est clivé par Drocha (une ribonucléase de type III) en une

93

molécule plus petite le Pre-miRNA. La nouvelle molécule d’ARN va ensuite être prise en

charge par l’exportine 5 pour quitter le noyau cellulaire. Dans le cytoplasme, Dicer (une

ribonucléase de type III) va cliver le Pre-miRNA pour former le shARN mature.

Cette modification a permis de diviser par 3 le nombre de cellules en apoptose (mort

cellulaire) tout en conservant une forte production d’HbF dans les cellules transduites (40 à

50% de Hb totale) (118). Néanmoins, il fut rapporté avec ce vecteur une diminution de

production des lymphocytes B matures et un blocage du cycle cellulaire lors de la transition

G1/S (119).

Figure 32: Représentation du shARNmir

(118).

En rouge, le shARN et en bleu la partie mir terminale.

Les résultats très prometteurs obtenus avec le second vecteur ont permis de développer un

nouveau vecteur lentiviral de grade clinique. Ce troisième vecteur est composé du même

shARNmir que le second, mais possède une construction identique aux vecteurs lentiviraux

présentés dans les points précédents (Figure 26). Le vecteur comprend donc le promoteur

proximal du gène de l’hémoglobine bêta ainsi que les sites hypersensibles contrôlant son

expression (Figure 33). Cette construction permet d’obtenir une expression du shARNmir

uniquement dans les cellules impliquées dans l’érythropoïèse, permettant ainsi la production

de lymphocyte B mature. C’est ce vecteur qui est actuellement utilisé en clinique.

Figure 33: Vecteur LCR-shARNmir

(119).

La cassette intégrée est délimitée par les régions sinLTR qui sont des régions hautement

répétées contenant une délétion auto-inactivante. La région régulatrice de l’expression du

transgène est constituée de sites hypersensibles (HS) et du promoteur proximal du gène de

l’hémoglobine bêta (β-globin pr). Le transgène est constitué du shARNmir

. Le vecteur contient

également un élément de reverse transcription (RRE), un site de début (SD) et de fin (SA)

épissage, une séquence d’encapsidation (φ) et un site d’intégration (pA).

94


L’essai clinique NCT03282656 concerne les patients de 3 à 35 ans, atteints de

drépanocytose associée à une production d’HbF inférieur à 10% de l’Hb totale. Les patients

doivent avoir des antécédents de syndrome thoracique aigu et d’alloimmunisation suite aux

traitements chroniques par transfusion sanguine. Ils sont également en échec thérapeutique

et il n’existe aucun donneur de moelle osseuse compatible.


sont prélevées dans la moelle osseuse puis les patients sont conditionnés avec du busulfan

avant d’être greffés.

iii. Résultats

L’essai clinique de phase I ayant débuté en novembre 2017, aucun résultat n’est

actuellement disponible. Seules les données obtenues lors de l’étude préclinique réalisée

sur des souris NSG le sont (119).

Les données de transduction cellulaire réalisées avec le vecteur shARNmir montrent que les

cellules transduites ont intégré en moyenne 1,3 copies de gène. Ce taux de transduction

cellulaire conduit à la formation d’HbF en grande quantité (60% de l’Hb totale).

Chez les souris traitées, différents tests ont été réalisés afin de démontrer l’absence de

génotoxicité du traitement. La proportion en cellules matures de types érythrocytaires et

lymphocytaires a été dosée et il fut montré que l’inhibition de BCL11A ne modifie pas la

numération formule sanguine. De plus, les analyses de la quantité en hémoglobine

circulante et de la taille de la rate ont montré que le vecteur shARNmir inhibait l’hémolyse et

augmentait la demi-vie des hématies.

95

E. Autres pistes thérapeutiques envisagées

En plus des essais cliniques actuellement en cours, d’autres pistes thérapeutiques sont à

l’étude. Les plus prometteuses sont : l’induction de l’HbF en inhibant le facteur de

transcription KLF1 et l’édition du génome afin d’induire ou réparer des mutations génétiques.

Le principe général de ces stratégies thérapeutiques sera présenté dans cette partie.

1. Inhibition de KLF1

KLF1 est un facteur de transcription impliqué dans la maturation des érythrocytes et plus

particulièrement dans la transition HbF HbA. KLF1 joue un double rôle lors de la transition

HbF HbA : il active le gène de la chaine bêta de l’hémoglobine en interagissant

directement avec le promoteur du gène et il inhibe l’expression de la chaine gamma de

l’hémoglobine en stimulant la production de BCL11A (120). Ainsi, l’inhibition de KLF1 permet

de restaurer la production de l’HbF dans les cellules (121).

L’inhibition de KLF1 a été réalisée sur des CSH de sang de cordon ombilical à l’aide d’un

vecteur lentiviral contenant un shARN spécifique à l’ARN messager de ce gène (122).

Différentes doses de vecteur ont été utilisées afin de déterminer un seuil minimal d’inhibition.

Il fut montré qu’une inhibition de 40 à 80% de KLF1 permet une augmentation de la

production de la chaine gamma de l’Hb d’un facteur 1,5 à 2, mais qu’une inhibition de KLF1

supérieur à 80% ne provoque plus cette augmentation et induit une anémie (diminution de la

production totale en Hb).

Les causes de ce seuil d’inhibition maximal ne sont pas connues, mais deux hypothèses

sont avancées. La première est que KLF1 est nécessaire à l’expression du promoteur des

gènes de l’Hb. La seconde hypothèse est que seule une diminution modérée de KLF1 peut

être compensée par l’augmentation de KLF2 dans les cellules. KLF2 est un gène présentant

une forte homologie avec KLF1, il régule la production de l’Hb.

À ce jour, KLF1 reste une piste thérapeutique, car c’est un gène spécifique à la lignée

érythrocytaire dont l’hétérozygotie (présence d’un des deux gènes mutés) ne provoque

aucune maladie. De plus, une inhibition partielle de ce gène permet de réguler la production

d’HbF.

Le maintien de l’HbF en inhibant la transition naturelle HbF HbA semble donc être une

piste thérapeutique très prometteuse. Deux gènes ont déjà été décrits (BCL11A et KLF1) et

96

d’autres sont à l’étude afin de connaître leurs potentiels thérapeutiques et les risques

associés à leur dérégulation (comme MYB et HBS1L) (123).

2. Édition du génome

L’édition du génome a pour objectif de réparer la mutation responsable de la synthèse de

l’HbS en utilisant les outils de réparation cellulaire naturellement présents dans la cellule.

Pour ce faire, deux molécules doivent être apportées à la cellule :

Une nucléase capable de couper la double chaine d’ADN au niveau de la mutation.

Les technologies CRISPR, TALEN et ZFN en sont les principaux types.

Une séquence témoin comportant le gène de l’hémoglobine bêta non muté.

Quelle que soit la technologie utilisée, le principe reste le même (Figure 34). La nucléase

effectue une coupure double brin de l’ADN puis la cellule détectant l’anomalie tente de

reconstruire la molécule d’ADN. Pour effectuer cette réparation, la cellule cherche une

séquence homologue dans son génome qu’elle pourra utiliser pour remplacer les

nucléotides perdus lors de la coupure. Une fois la séquence trouvée, la cellule coupe la

partie qui l’intéresse et l’insère à son génome au niveau de la coupure pour reconstituer le

chromosome. Ce mécanisme cellulaire s’appelle la recombinaison homologue.

Lors de la mise au point de la méthode, un gène de sélection fut ajouté à la séquence

témoin (le gène de résistance à la puromycine par exemple). Ce gène permet d’isoler les

cellules ayant intégré la séquence témoin qui contrairement aux autres résistent à la

présence d’une molécule toxique dans le milieu (la puromycine par exemple). Une fois les

cellules extraites, le gène utilisé pour la sélection est éliminé du génome grâce à une

transposase (exemple « piggyBac excision ») pour ne conserver que celui d’intérêt..

97

Figure 34: Principe de la recombinaison homologue (124).

Le chromosome est coupé par la technologie TALEN au niveau du chromosome codant l’HbS

puis la cellule reconnaît la séquence témoin introduite lors de la coupure (doneur plasmid) et

l’utilise pour réparer la coupure. Après réparation, le gène HbS est remplacé par le gène HbA.

Le gène puroΔtk est un gène de résistance à la puromycine, P PGK est le promoteur associé

et les séquences PB sont des sites de coupure de l’ADN.

Différents tests ont été réalisés pour vérifier la faisabilité de cette méthode. Pour ce faire les

nucléases ont été introduites dans les cellules par nucléofection et la séquence témoin par

nucléofection (124,125) ou par transduction cellulaire à l’aide d’un vecteur lentiviral (126). Le

taux de correction est le même pour toutes les méthodes (ZFN et TALEN) et voies

d’administration. Il est seulement de 20 à 40% et les cellules possèdent 1 seul allèle modifié.

De plus, il ne semble pas y avoir de coupure de l’ADN à un autre endroit que celui souhaité

et la recombinaison homologue n’altère pas les propriétés des cellules (clonogéniques et de

différenciacion). Les tests réalisés chez la souris ont montré que la correction du génome

permettait l’augmentation de la production d’HbA mais dans de faibles proportions (5% de

l’Hb totale). Ce résultat s’explique par le faible nombre de cellules greffées (126).

Pour conclure, l’édition du génome est une stratégie prometteuse, qui permet de corriger le

gène responsable de la drépanocytose, mais dont les protocoles ne sont pas encore

suffisamment standardisés pour pouvoir être transposés en clinique.

98

Comme vous venez de le voir, la thérapie génique peut être source d’espoir pour les patients atteints de drépanocytose. Certaines méthodes

ont partiellement fait leurs preuves en clinique alors que d’autres, plus récentes, doivent encore démontrer leurs potentiels chez l’Homme

(Tableau XII).

Tableau XII: Bilan des résultats obtenus avec les différentes thérapies actuellement testées en clinique

Numéro de l’essais clinique

Stade Gène Objectifs Résultats (clinique et pré-clinique)

NCT02151526 I/II

BB305 Restaurer la production HbA Peu d’effet secondaire du traitement chez l’Homme

Résultats cliniques patient dépendant avec la guérison d’un seul patient NCT02140554 I

NCT02247843 I beta AS3-FB Restaurer la production HbA

Uniquement chez l’animal Absence de risque de génotoxicité du vecteur

Transduction efficace des cellules sans altérer leurs propriétés Production par la souris de 18% d’HbA

NCT02186418 I/II gamma globuline Restaurer la production HbF

Uniquement chez l’animal Aucun résultat de génotoxicité

Diminution du taux hémoglobine falsciforme Disparition de la splénomégalie chez les animaux traités

NCT03282656 I shARN spécifique à BCL11A Inhibition de BCL11A et

restauration de la production en HbF

Uniquement chez l’animal Absence de risque de génotoxicité du vecteur

Production par les souris de 60% d’HbF Inhibition de l’hémolyse

99

IV. Conclusion et Perspectives

100

La découverte de la structure de l’ADN et la compréhension de son rôle sur les cellules

datent du milieu du XXème siècle. Cette avancée majeure a permis de révéler les causes de

certaines maladies génétiques jusque-là incomprises comme la drépanocytose. Cette

meilleure compréhension de la maladie et du cycle de l’hématopoïèse a conduit à la création

de nouveaux traitements aux patients avec la greffe de cellules souches hématopoïétiques

dans les années 1980 et l’hydroxyurée en 1995.

Ces traitements ont permis d’améliorer grandement la prise en charge des patients

drépanocytaires qui ont vu leur espérance de vie passer de 23 ans dans le début des

années 1980 à 37,5 dans les années 2000 (127). L’hydroxyurée a joué un rôle majeur dans

l’augmentation de cette espérance de vie. En restaurant partiellement la production d’HbF,

le médicament a permis la réduction des CVO, une meilleure oxygénation des tissus et une

restauration partielle des propriétés physiques des hématies. Malheureusement, ce

traitement s’accompagne d’effets indésirables graves semblables aux chimiothérapies

(modification de la formule sanguine, perte de cheveux, azoospermie) et ses effets à long

terme ne sont pas connus. L’apparition d’une leucémie est possible (128). Les allogreffes de

cellules souches nécessitent, quant à elles, la présence d’un donneur compatible.

Actuellement, on estime que seuls 14% des patients ont cette chance et peuvent bénéficier

d’un don de moelle osseuse allogénique (106) ; seul traitement curatif disponible à ce jour.

En absence d’autre traitement, les patients se tournent vers une discipline nouvelle : la

thérapie génique.

La thérapie génique est une science contemporaine qui vu le jour dans les années 1960-

1970, mais qui fut réellement mise en place qu’à la fin des années 1990 quand le génome

humain fut connu (le projet de séquençage du génome humain eu lieu de 1990 à 2003).

Cette nouvelle approche fut très vite utilisée chez l’Homme. Le premier essai clinique eut

lieu dès 1999 chez des enfants atteints de déficit immunitaire sévère lié au chromosome X.

Dans un premier temps, la guérison des enfants traités et leur sortie de l’hôpital furent

considérées comme une réussite et suscitèrent un réel espoir de guérison chez les patients

souffrant de maladies génétiques. Malheureusement, quelques années plus tard, certains

enfants déclarèrent une leucémie, ce qui mit en évidence les risques associés à ce

traitement. Cet évènement fut à l’origine du renforcement des contrôles précliniques de

sécurités obligatoires avant toute administration de produit de thérapie génique à l’Homme.

Les patients souffrant de drépanocytose ont dû attendre le début des années 2000 pour

pouvoir bénéficier du premier traitement de thérapie génique spécifique à leur maladie. Tout

comme pour le déficit immunitaire sévère lié au chromosome X, ce premier essai fut un

101

succès avec la guérison d’un patient et l’utilisation d’un vecteur présentant peu de risque

d’induire une leucémie. Ce premier résultat raviva l’espoir des patients drépanocytaires de

guérir de leur maladie. Malheureusement, le vecteur utilisé n’était pas suffisamment exprimé

par les cellules et ne put guérir qu’un seul patient.

Actuellement, il existe 5 essais cliniques de thérapie génique dans le monde pour le

traitement de la drépanocytose à l’aide de cellules autologues. Trois d’entre eux (dont le

seul français) ont pour objectifs d’ajouter ex vivo un gène codant pour la chaine bêta de

l’hémoglobine, un autre cherche à ajouter ex vivo un gène codant pour la chaine gamma de

l’hémoglobine et le dernier cherche à restaurer la production d’hémoglobine fœtale en

inhibant BCL11A. Ces essais cliniques tendent à développer un vecteur qui permette à la

cellule de synthétiser de l’Hb fonctionnelle en grande quantité sans pour autant induire de

nouvelles maladies (comme des leucémies). Pour ce faire, ils utilisent tous des vecteurs

lentiviraux de 3ème génération.

Les premiers résultats issus de ces essais chez l’animal semblent très prometteurs. Ils

permettent tous de faire diminuer le taux d’hématie falciformes (1ère cause de mortalité chez

ces patients), d’améliorer l’oxygénation des organes, sans provoquer d’effet secondaire

grave (pas de risque de génotoxicité ni de reprotoxicité). Ces données devront encore être

confirmées chez l’Homme avant de commercialiser un nouveau médicament.

Pour conclure, la prise en charge des patients drépanocytaires s’est significativement

améliorée en un demi-siècle permettant de faire baisser la morbi-mortalité liée à cette

maladie. Néanmoins, un traitement curatif universel (n’ayant pas recours aux cellules d’un

donneur) doit encore être trouvé pour prendre en charge durablement tous les patients. Pour

atteindre cet objectif, différentes techniques sont actuellement à l’étude. Celles issues de la

thérapie génique n’en sont qu’à leur mise en place même si elles ont déjà montré leur

potentiel thérapeutique sur quelques patients. Le défi est maintenant de standardiser les

protocoles afin d’inclure plus de patients et de confirmer les résultats obtenus.

102

Bibliographie

1. Herrick JB. Peculiar elongated and sickle-shaped red blood corpuscles in a

case of severe anemia. 1910. Yale J Biol Med. juin 2001;74(3):179.

2. Emmel VE. A STUDY OF THE ERYTHROCYTES IN A CASE OF SEVERE

ANEMIA WITH ELONGATED AND SICKLE-SHAPED RED BLOOD CORPUSCLES.

Arch Intern Med. 1 oct 1917;XX(4):586-NP.

3. Sherman I. The sickling phenomenon, with special reference to the

differentiation of sickle cell anemia from the sickle cell trait. Johns Hopkins Hosp.

1940;67:309-24.

4. Pauling L, Itano HA, Singer SJ, Wells IC. Sickle Cell Anemia, a Molecular

Disease. science. 25 oct 1949;110(2865):543-8.

5. Neel JV. The inheritance of Sickle Cell Anemia. science. 15 juill

1949;110(2846):64-6.

6. Ingram V. A Specific Chemical Difference between Globins of Normal and

Sickle-cell Anemia Hemoglobins. Nature. 13 oct 1956;178(4537):792-4.

7. Lawn RM, Fritsch EF, Parker RC, Blake G, Maniatis T. The isolation and

characterization of linked δ- and β-globin genes from a cloned library of human DNA.

cell. déc 1978;15(4):1157-74.

8. Rifking RA, Marks PA, Bank A, Terada M, Reuden RC, Maniatis GM, et al.

Regulation of differentiation in normal and transformed erythroid cells. In Vitro.

1978;14(1):155-61.

9. Vermylen C, Cornu G, Philippe M, Ninane J, Borja A, Latinne D, et al. Bone

marrow transplantation in sickle cell anaemia. Arch Dis Child. oct 1991;66(10):1195-

8.

10. Kelly P, Kurtzberg J, Vichinsky E, Lubin B. Umbilical cord blood stem cells:

Application for the treatment of patients with hemoglobinopathies. J Pediatr. 1 mai

1997;130(5):695-703.

11. Piel FB, Hay SI, Gupta S, Weatherall DJ, Williams TN. Global Burden of

Sickle Cell Anaemia in Children under Five, 2010–2050: Modelling Based on

Demographics, Excess Mortality, and Interventions. PLOS Med. 16 juill

2013;10(7):e1001484.

103

12. WHO [En ligne]. WHO | Global epidemiology of haemoglobin disorders and

derived service indicators; [cité le 3 oct 2017]. Disponible:

http://www.who.int/bulletin/volumes/86/6/06-036673/en/

13. WHO [En ligne]. GHO | By category | WHO Regions - Diarrhoeal diseases;

[cité le 6 oct 2017]. Disponible:

http://apps.who.int/gho/data/view.main.CM2002015REG6-CH3?lang=en

14. Williams TN, Obaro SK. Sickle cell disease and malaria morbidity: a tale with

two tails. Trends Parasitol. juill 2011;27(7):315-20.

15. Makani J, Komba AN, Cox SE, Oruo J, Mwamtemi K, Kitundu J, et al. Malaria

in patients with sickle cell anemia: burden, risk factors, and outcome at the outpatient

clinic and during hospitalization. Blood. 14 janv 2010;115(2):215-20.

16. Luzzatto L. Sickle Cell Anaemia and Malaria. Mediterr J Hematol Infect Dis. 3

oct 2012;4(1).

17. Grosse SD, Odame I, Atrash HK, Amendah DD, Piel FB, Williams TN. Sickle

Cell Disease in Africa. Am J Prev Med. déc 2011;41(6):S398-405.

18. Terynessie P. Schéma de l’hémoglobine [En ligne]. La Thérapie génique et la

bêta-thalassémie. 2012 [cité le 26 sept 2017]. Disponible:

https://therapiegeniqueetbetathalassemie.wordpress.com/2012/03/01/schema-de-

lhemoglobine/

19. Joly P, Pondarre C, Badens C. Beta-thalassemias: molecular,

epidemiological, diagnostical and clinical aspects. Ann Biol Clin (Paris). 1 nov

2014;72(6):639-68.

20. Torres L de S, Okumura JV, Silva DGH da, Bonini-Domingos CR. Hemoglobin

D-Punjab: origin, distribution and laboratory diagnosis. Rev Bras Hematol E

Hemoter. 2015;37(2):120-6.

21. American Society of Aerospace Medicine. Clinical Practice Guideline for

Sickle Cell Disease/Trait [En ligne]. Aerospace Medical Association; [cité le 12 oct

2017]. Disponible:

http://www.asams.org/guidelines/Completed/NEW%20Sickle%20cell%20anemia.htm

22. Bender MA, Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, Wallace SE, Bean LJ, et al.

Sickle Cell Disease. Dans: GeneReviews®, rédacteur. University of Washington,

Seattle; 1993.

104

23. Francis CK, Bleakley DW. The risk of sudden death in sickle cell trait:

Noninvasive assessment of cardiac response to exercise. Cathet Cardiovasc Diagn.

1 janv 1980;6(1):73-80.

24. Etyang AO, Wandabwa CK, Kapesa S, Muthumbi E, Odipo E, Wamukoya M,

et al. Blood Pressure and Arterial Stiffness in Kenyan Adolescents with the Sickle

Cell Trait. Am J Epidemiol. 12 janv 2017;

25. Rees DC, Williams TN, Gladwin MT. Sickle-cell disease. Lancet Lond Engl. 11

déc 2010;376(9757):2018-31.

26. McCavit T, Desai P. Management of Acute Complications of Sickle Cell

Disease. A pocket Guide for the clinician. american society of hematology; 2014.

27. Bakanay SM, Dainer E, Clair B, Adekile A, Daitch L, Wells L, et al. Mortality in

sickle cell patients on hydroxyurea therapy. Blood. 15 janv 2005;105(2):545-7.

28. Charbonney E, Terrattaz M, Vuilleumier N, Lambert J-F. Drépanocytose :

syndromes thoracique aigu et de détresse respiratoire. De la pathophysiologie au

traitement. Rev Med Suisse. 2006;2.

29. Chulamokha L, Scholand SJ, Riggio JM, Ballas SK, Horn D, DeSimone JA.

Bloodstream infections in hospitalized adults with sickle cell disease: a retrospective

analysis. Am J Hematol. oct 2006;81(10):723-8.

30. Chinegwundoh FI, Smith S, Anie KA. Treatments for priapism in boys and

men with sickle cell disease. Cochrane Database Syst Rev. 19 sept

2017;9:CD004198.

31. Kassim AA, Pruthi S, Day M, Rodeghier M, Gindville MC, Brodsky MA, et al.

Silent cerebral infarcts and cerebral aneurysms are prevalent in adults with sickle

cell anemia. Blood. 21 avr 2016;127(16):2038-40.

32. DeBaun MR, Kirkham FJ. Central nervous system complications and

management in sickle cell disease. Blood. 18 févr 2016;127(7):829-38.

33. HAS. Syndromes drépanocytaire majeurs de l’adulte. Protocole national de

diagnostic et de soins pour une maladie rare [En ligne]. janv 2010. Disponible:

https://www.has-sante.fr/portail/upload/docs/application/pdf/2010-

04/ald_10_guide_drepano_adulte_web.pdf

105

34. HAS. Prise en charge de la drépanocytose chez l’enfant et l’adolescent.

Recommandation pour la pratique clinique [En ligne]. 2005 [cité le 19 oct 2017].

Disponible: https://www.has-

sante.fr/portail/upload/docs/application/pdf/Drepanocytose_reco.pdf

35. Phillips K, Healy L, Smith L, Keenan R. Hydroxyurea therapy in UK children

with sickle cell anaemia: A single-centre experience. Pediatr Blood Cancer. févr

2018;65(2).

36. Ballas SK. Sickle cell disease: Classification of clinical complications and

approaches to preventive and therapeutic management. Clin Hemorheol Microcirc.

2018;68(2-3):105-28.

37. Jabalameli HR, Zahednasab H, Karimi-Moghaddam A, Jabalameli MR. Zinc

finger nuclease technology: Advances and obstacles in modelling and treating

genetic disorders. Gene. 1 mars 2015;558(1):1-5.

38. Geurts AM, Moreno C. Zinc-finger nucleases: new strategies to target the rat

genome. Clin Sci. 1 oct 2010;119(8):303-11.

39. Boch J, Scholze H, Schornack S, Landgraf A, Hahn S, Kay S, et al. Breaking

the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type III Effectors. Science. 11 déc

2009;326(5959):1509-12.

40. Hsu PD, Lander ES, Zhang F. Development and Applications of CRISPR-

Cas9 for Genome Engineering. Cell. 5 juin 2014;157(6):1262-78.

41. Bartel DP. MicroRNA Target Recognition and Regulatory Functions. Cell. 23

janv 2009;136(2):215.

42. Chen B, Xu W, Pan R, Chen P. Design and characterization of a new peptide

vector for short interfering RNA delivery. J Nanobiotechnology [En ligne]. 2015 [cité

le 27 oct 2017];13. Disponible: https://www-ncbi-nlm-nih-

gov.gate2.inist.fr/pmc/articles/PMC4459685/

43. Moore CB, Guthrie EH, Huang MT-H, Taxman DJ. Short Hairpin RNA

(shRNA): Design, Delivery, and Assessment of Gene Knockdown. Methods Mol Biol

Clifton NJ. 2010;629:141.

44. Fujita S, Koguma T, Ohkawa J, Mori K, Kohda T, Kise H, et al. Discrimination

of a single base change in a ribozyme using the gene for dihydrofolate reductase as

a selective marker in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 21 janv

1997;94(2):391.

106

45. Perreault JP, Wu TF, Cousineau B, Ogilvie KK, Cedergren R. Mixed

deoxyribo- and ribo-oligonucleotides with catalytic activity. Nature. 5 avr

1990;344(6266):565-7.

46. Manjila SB, Baby JN, Bijin EN, Constantine I, Pramod K, Valsalakumari J.

Novel gene delivery systems. Int J Pharm Investig. mars 2013;3(1):1.

47. Pérez-Luz S, Díaz-Nido J. Prospects for the Use of Artificial Chromosomes

and Minichromosome-Like Episomes in Gene Therapy. J Biomed Biotechnol.

2010;2010.

48. Kotterman MA, Chalberg TW, Schaffer DV. Viral Vectors for Gene Therapy:

Translational and Clinical Outlook. Annu Rev Biomed Eng. 2015;17:63-89.

49. Hackett CS, Geurts AM, Hackett PB. Predicting preferential DNA vector

insertion sites: implications for functional genomics and gene therapy. Genome Biol.

2007;8(Suppl 1):S12.

50. Huang S, Kamihira M. Development of hybrid viral vectors for gene therapy.

Biotechnol Adv. avr 2013;31(2):208-23.

51. Zochowska M, Paca A, Schoehn G, Andrieu J-P, Chroboczek J, Dublet B, et

al. Adenovirus Dodecahedron, as a Drug Delivery Vector. PLoS ONE. 2009;4(5).

52. Meier O, Greber UF. Adenovirus endocytosis. J Gene Med. 1 juin

2003;5(6):451-62.

53. Rossi A, Salvetti A. Intégration des vecteurs AAV et mutagenèse

insertionnelle. médecine/sciences. 32(2):167-74.

54. Li H, Malani N, Hamilton SR, Schlachterman A, Bussadori G, Edmonson SE,

et al. Assessing the potential for AAV vector genotoxicity in a murine model. Blood.

24 mars 2011;117(12):3311.

55. Chira S, Jackson CS, Oprea I, Ozturk F, Pepper MS, Diaconu I, et al.

Progresses towards safe and efficient gene therapy vectors. Oncotarget. 13 oct

2015;6(31):30675-703.

56. Perez-Anes A. Dendrimères phosphorés catanioniques inhibiteurs du VIH :

propriétés physico-chimiques et activité antivirale [doctorat]. Toulouse 3; 2010.

57. Nayerossadat N, Maedeh T, Ali PA. Viral and nonviral delivery systems for

gene delivery. Adv Biomed Res. 2012;1.

107

58. Richter SN, Frasson I, Palù G. Strategies for inhibiting function of HIV-1

accessory proteins: a necessary route to AIDS therapy? Curr Med Chem.

2009;16(3):267-86.

59. Zufferey R, Dull T, Mandel RJ, Bukovsky A, Quiroz D, Naldini L, et al. Self-

inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J Virol. déc

1998;72(12):9873-80.

60. Emery A, Zhou S, Pollom E, Swanstrom R. Characterizing HIV-1 Splicing by

Using Next-Generation Sequencing. J Virol. 15 mars 2017;91(6).

61. Thomas J, Cuchet D, Potel C, Epstein A. Les vecteurs amplicons dérivés du

virus HSV1: un système souple et puissant pour le transfert de gènes. virologie.

2007;11(5):339-50.

62. Delgado D, Gascón AR, del Pozo-Rodríguez A, Echevarría E, Ruiz de

Garibay AP, Rodríguez JM, et al. Dextran–protamine–solid lipid nanoparticles as a

non-viral vector for gene therapy: In vitro characterization and in vivo transfection

after intravenous administration to mice. Int J Pharm. 4 avr 2012;425(1):35-43.

63. Garibay APR de. Endocytosis in gene therapy with non-viral vectors. Wien

Med Wochenschr. 1 mai 2016;166(7-8):227-35.

64. Pérez-Martínez FC, Guerra J, Posadas I, Ceña V. Barriers to Non-Viral

Vector-Mediated Gene Delivery in the Nervous System. Pharm Res. août

2011;28(8):1843.

65. Lipowsky R, Sackmann E. Structure and dynamics of membranes. Vol. 1.

North Holland; 1995. 1052 p.

66. Bangham AD, Standish MM, Watkins JC. Diffusion of univalent ions across

the lamellae of swollen phospholipids. J Mol Biol. août 1965;13(1):238-52.

67. Knudsen KB, Northeved H, Kumar EK P, Permin A, Gjetting T, Andresen TL,

et al. In vivo toxicity of cationic micelles and liposomes. Nanomedicine Nanotechnol

Biol Med. 1 févr 2015;11(2):467-77.

68. Miele E, Spinelli GP, Miele E, Di Fabrizio E, Ferretti E, Tomao S, et al.

Nanoparticle-based delivery of small interfering RNA: challenges for cancer therapy.

Int J Nanomedicine. 2012;7:3637-57.

69. Sarker SR, Aoshima Y, Hokama R, Inoue T, Sou K, Takeoka S. Arginine-

based cationic liposomes for efficient in vitro plasmid DNA delivery with low

cytotoxicity. Int J Nanomedicine. 2013;8:1361-75.

108

70. Farhood H, Serbina N, Huang L. The role of dioleoyl

phosphatidylethanolamine in cationic liposome mediated gene transfer. Biochim

Biophys Acta. 4 mai 1995;1235(2):289-95.

71. Wakaskar RR. General overview of lipid-polymer hybrid nanoparticles,

dendrimers, micelles, liposomes, spongosomes and cubosomes. J Drug Target. 18

août 2017;1-8.

72. Abdallah B, Hassan A, Benoist C, Goula D, Behr JP, Demeneix BA. A

powerful nonviral vector for in vivo gene transfer into the adult mammalian brain:

polyethylenimine. Hum Gene Ther. 20 oct 1996;7(16):1947-54.

73. Haladjova E, Halacheva S, Posheva V, Peycheva E, Moskova-Doumanova V,

Topouzova-Hristova T, et al. Comblike Polyethylenimine-Based Polyplexes:

Balancing Toxicity, Cell Internalization, and Transfection Efficiency via Polymer

Chain Topology. Langmuir. 15 sept 2015;31(36):10017-25.

74. Wu M, Zhao D, Wei Z, Zhong W, Yan H, Wang X, et al. Method for electric

parametric characterization and optimization of electroporation on a chip. Anal

Chem. 7 mai 2013;85(9):4483-91.

75. Takei Y, Nemoto T, Mu P, Fujishima T, Ishimoto T, Hayakawa Y, et al. In vivo

silencing of a molecular target by short interfering RNA electroporation: tumor

vascularization correlates to delivery efficiency. Mol Cancer Ther. 1 janv

2008;7(1):211-21.

76. Gresch O, Engel FB, Nesic D, Tran TT, England HM, Hickman ES, et al. New

non-viral method for gene transfer into primary cells. Methods San Diego Calif. juin

2004;33(2):151-63.

77. Lentacker I, De Cock I, Deckers R, De Smedt SC, Moonen CTW.

Understanding ultrasound induced sonoporation: definitions and underlying

mechanisms. Adv Drug Deliv Rev. juin 2014;72:49-64.

78. Li J, Zou S, Gao J, Liang J, Zhou H, Liang L, et al. Block copolymer

conjugated Au-coated Fe3O4 nanoparticles as vectors for enhancing colloidal

stability and cellular uptake. J Nanobiotechnology. 2017;15.

79. Prijic S, Prosen L, Cemazar M, Scancar J, Romih R, Lavrencak J, et al.

Surface modified magnetic nanoparticles for immuno-gene therapy of murine

mammary adenocarcinoma. Biomaterials. juin 2012;33(17):4379-91.

109

80. [En ligne]. Wiley J. The Journal of Gene Medicine; [cité le 13 nov 2017].

Disponible: www.wiley.co.uk/genmed/clinical

81. [En ligne]. ANSM. Qu’est-ce qu’un essai clinique ?; 5 août 2018. Disponible:

https://www.ansm.sante.fr/Activites/Essais-cliniques/Qu-est-ce-qu-un-essai-

clinique/(offset)/1

82. Décision du 24 novembre 2006 fixant les règles de bonnes pratiques cliniques

pour les recherches biomédicales portant sur des médicaments à usage humain.

83. ANSM. Médicaments de thérapie innovante, Médicaments de thérapie

innovante préparé ponctuellement et préparations : Synthèse du cadre réglementaire

applicable pour la fabrication, le développement et la mise sur le marché de ces

produits. [En ligne]. mars 2012. Disponible: https://www.ansm.sante.fr/L-

ANSM/Medicaments-de-therapie-innovante-et-preparations-cellulaires-a-finalite-

therapeutique/Le-contexte-reglementaire-des-medicaments-de-therapie-

innovante/(offset)/0

84. Yakoub-Agha I, Ferrand C, Chalandon Y, Ballot C, Castilla Llorente C,

Deschamps M, et al. Prérequis nécessaires pour la mise en place de protocoles de

recherche clinique évaluant des thérapies cellulaires et géniques par lymphocytes T

dotés de récepteur chimérique à l’antigène (CAR T-cells) : recommandations de la

Société francophone de greffe de moelle et de thérapie cellulaire (SFGM-TC). Bull

Cancer (Paris). 1 déc 2017;104(12, Supplement):S43-58.

85. Hoban MD, Orkin SH, Bauer DE. Genetic treatment of a molecular disorder:

gene therapy approaches to sickle cell disease. Blood. 18 févr 2016;127(7):839.

86. Urbinati F, Wherley J, Geiger S, Fernandez BC, Kaufman ML, Cooper A, et al.

Preclinical studies for a phase 1 clinical trial of autologous hematopoietic stem cell

gene therapy for sickle cell disease. Cytotherapy. sept 2017;19(9):1096-112.

87. [En ligne]. APHP. Recommandation pour la période péri- opératoire chez un

patient drépanocytaire adulte; déc 2007 [cité le 23 nov 2017]. Disponible:

http://urgencesmondor.aphp.fr/IMG/pdf/drepano_perioperatoire.pdf

88. Adler BK, Salzman DE, Carabasi MH, Vaughan WP, Reddy VVB, Prchal JT.

Fatal sickle cell crisis after granulocyte colony-stimulating factor administration.

Blood. 15 mai 2001;97(10):3313-4.

110

89. Fitzhugh CD, Hsieh MM, Bolan CD, Saenz C, Tisdale JF. Granulocyte colony-

stimulating factor (G-CSF) administration in individuals with sickle cell disease: time

for a moratorium? Cytotherapy. 2009;11(4):464-71.

90. Yannaki E, Papayannopoulou T, Jonlin E, Zervou F, Karponi G, Xagorari A, et

al. Hematopoietic Stem Cell Mobilization for Gene Therapy of Adult Patients With

Severe β-Thalassemia: Results of Clinical Trials Using G-CSF or Plerixafor in

Splenectomized and Nonsplenectomized Subjects. Mol Ther. janv 2012;20(1):230.

91. Choi E, Branch C, Cui M-H, Yazdanbakhsh K, Mohandas N, Billett HH, et al.

No evidence for cell activation or brain vaso-occlusion with plerixafor mobilization in

sickle cell mice. Blood Cells Mol Dis. mars 2016;57:67.

92. Panterne B, Richard M-J, Sabatini C, Pouthier F, Mouillot L, Bardey D, et al.

Contrôle de qualité des greffons de sang placentaire décongelés : résultats d’une

étude multicentrique. Transfus Clin Biol. 1 avr 2010;17(2):41-6.

93. Charrier S, Ferrand M, Zerbato M, Précigout G, Viornery A, Bucher-Laurent S,

et al. Quantification of lentiviral vector copy numbers in individual hematopoietic

colony-forming cells shows vector dose-dependent effects on the frequency and

level of transduction. Gene Ther. mai 2011;18(5):479-87.

94. Antoniou MN, Skipper KA, Anakok O. Optimizing Retroviral Gene Expression

for Effective Therapies. Hum Gene Ther. 21 mars 2013;24(4):363-74.

95. Corrigan-Curay J, O’Reilly M, Kohn DB, Cannon PM, Bao G, Bushman FD, et

al. Genome Editing Technologies: Defining a Path to Clinic: Genomic Editing:

Establishing Preclinical Toxicology Standards, Bethesda, Maryland 10 June 2014.

Mol Ther. mai 2015;23(5):796.

96. Wu CJ, Krishnamurti L, Kutok JL, Biernacki M, Rogers S, Zhang W, et al.

Evidence for ineffective erythropoiesis in severe sickle cell disease. Blood. 15 nov

2005;106(10):3639.

97. Kohn DB. Eliminating SCID row: new approaches to SCID. Hematol Am Soc

Hematol Educ Program. 5 déc 2014;2014(1):475-80.

98. Bauer DE, Brendel C, Fitzhugh CD. Curative approaches for sickle cell

disease: A review of allogeneic and autologous strategies. Blood Cells Mol Dis. sept

2017;67:155-68.

99. Gyurkocza B, Sandmaier BM. Conditioning regimens for hematopoietic cell

transplantation: one size does not fit all. Blood. 17 juill 2014;124(3):344.

111

100. Ricci A, Freed J, Talano J, Cairo MS, Small T. Allogeneic cellular and

autologous stem cell therapy for sickle cell disease: ‘whom, when and how’. Bone

Marrow Transplant. 19 déc 2011;47(12):1489.

101. Bunn HF. Pathogenesis and Treatment of Sickle Cell Disease. N Engl J Med.

11 sept 1997;337(11):762-9.

102. Negre O, Eggimann A-V, Beuzard Y, Ribeil J-A, Bourget P, Borwornpinyo S,

et al. Gene Therapy of the β-Hemoglobinopathies by Lentiviral Transfer of the

β(A(T87Q))-Globin Gene. Hum Gene Ther. févr 2016;27(2):148-65.

103. Cavazzana M, Antoniani C, Miccio A. Gene Therapy for β-

Hemoglobinopathies. Mol Ther J Am Soc Gene Ther. 3 mai 2017;25(5):1142-54.

104. Pawliuk R, Westerman KA, Fabry ME, Payen E, Tighe R, Bouhassira EE, et

al. Correction of Sickle Cell Disease in Transgenic Mouse Models by Gene Therapy.

Science. 14 déc 2001;294(5550):2368-71.

105. Remberger M, Törlén J, Ringdén O, Engström M, Watz E, Uhlin M, et al.

Effect of Total Nucleated and CD34+ Cell Dose on Outcome after Allogeneic

Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 1 mai

2015;21(5):889-93.

106. Cottle RN, Lee CM, Bao G. TREATING HEMOGLOBINOPATHIES USING

GENE CORRECTION APPROACHES: PROMISES AND CHALLENGES. Hum

Genet. sept 2016;135(9):993.

107. Kanter J, Walters MC, Hsieh MM, Krishnamurti L, Kwiatkowski J, Kamble RT,

et al. Interim Results from a Phase 1/2 Clinical Study of Lentiglobin Gene Therapy

for Severe Sickle Cell Disease. Blood. 2 déc 2016;128(22):1176-1176.

108. Ribeil J-A, Hacein-Bey-Abina S, Payen E, Magnani A, Semeraro M, Magrin E,

et al. Gene Therapy in a Patient with Sickle Cell Disease. N Engl J Med. 02

2017;376(9):848-55.

109. Romero Z, Urbinati F, Geiger S, Cooper AR, Wherley J, Kaufman ML, et al. β-

globin gene transfer to human bone marrow for sickle cell disease. J Clin Invest. 1

juill 2013;

110. [En ligne]. Stem Cell Gene Therapy for Sickle Cell Disease - Tabular View -

ClinicalTrials.gov; [cité le 1 déc 2017]. Disponible:

https://clinicaltrials.gov/ct2/show/record/NCT02247843

112

111. Sunshine HR, Hofrichter J, Eaton WA. Requirement for therapeutic inhibition

of sickle haemoglobin gelation. Nature. 21 sept 1978;275(5677):238-40.

112. Pestina TI, Hargrove PW, Jay D, Gray JT, Boyd KM, Persons DA. Correction

of murine sickle cell disease using gamma-globin lentiviral vectors to mediate high-

level expression of fetal hemoglobin. Mol Ther J Am Soc Gene Ther. févr

2009;17(2):245-52.

113. [En ligne]. Gene Transfer for Patients With Sickle Cell Disease - Tabular View

- ClinicalTrials.gov; [cité le 4 déc 2017]. Disponible:

https://clinicaltrials.gov/ct2/show/record/NCT02186418

114. Wilber A, Hargrove PW, Kim Y-S, Riberdy JM, Sankaran VG, Papanikolaou E,

et al. Therapeutic levels of fetal hemoglobin in erythroid progeny of β-thalassemic

CD34+ cells after lentiviral vector-mediated gene transfer. Blood. 10 mars

2011;117(10):2817.

115. Perumbeti A, Higashimoto T, Urbinati F, Franco R, Meiselman HJ, Witte D, et

al. A novel human gamma-globin gene vector for genetic correction of sickle cell

anemia in a humanized sickle mouse model: critical determinants for successful

correction. Blood. 6 août 2009;114(6):1174.

116. Perumbeti A, Higashimoto T, Urbinati F, Franco R, Meiselman HJ, Witte D, et

al. Supplemental Methods and Figures of A novel human gamma-globin gene vector

for genetic correction of sickle cell anemia in a humanized sickle mouse model:

critical determinants for successful correction. Blood [En ligne]. 2009 [cité le 4 déc

2017]; Disponible: http://www.bloodjournal.org/content/suppl/2009/07/13/blood-2009-

01-201863.DC1

117. Cao A, Moi P, Galanello R. Recent advances in β-thalassemias. Pediatr Rep

[En ligne]. 16 juin 2011 [cité le 4 déc 2017];3(2). Disponible: https://www-ncbi-nlm-

nih-gov.gate2.inist.fr/pmc/articles/PMC3133499/

118. Guda S, Brendel C, Renella R, Du P, Bauer DE, Canver MC, et al. miRNA-

embedded shRNAs for Lineage-specific BCL11A Knockdown and Hemoglobin F

Induction. Mol Ther. sept 2015;23(9):1465.

119. Brendel C, Guda S, Renella R, Bauer DE, Canver MC, Kim Y-J, et al.

Lineage-specific BCL11A knockdown circumvents toxicities and reverses sickle

phenotype. J Clin Invest. 3 oct 2016;126(10):3868.

113

120. Zhou D, Liu K, Sun C-W, Pawlik KM, Townes TM. KLF1 regulates BCL11A

expression and gamma- to beta-globin gene switching. Nat Genet. sept

2010;42(9):742-4.

121. Borg J, Papadopoulos P, Georgitsi M, Gutiérrez L, Grech G, Fanis P, et al.

Haploinsufficiency for the erythroid transcription factor KLF1 causes hereditary

persistence of fetal hemoglobin. Nat Genet. sept 2010;42(9):801-5.

122. Vinjamur DS, Alhashem YN, Mohamad SF, Amin P, Williams DC, Lloyd JA.

Krüppel-Like Transcription Factor KLF1 Is Required for Optimal γ- and β-Globin

Expression in Human Fetal Erythroblasts. PloS One. 2016;11(2):e0146802.

123. Paikari A, Sheehan VA. Fetal haemoglobin induction in sickle cell disease. Br

J Haematol. 16 nov 2017;

124. Sun N, Zhao H. Seamless correction of the sickle cell disease mutation of the

HBB gene in human induced pluripotent stem cells using TALENs. Biotechnol

Bioeng. mai 2014;111(5):1048-53.

125. Zou J, Mali P, Huang X, Dowey SN, Cheng L. Site-specific gene correction of

a point mutation in human iPS cells derived from an adult patient with sickle cell

disease. Blood. 27 oct 2011;118(17):4599.

126. Hoban MD, Cost GJ, Mendel MC, Romero Z, Kaufman ML, Joglekar AV, et al.

Correction of the sickle cell disease mutation in human hematopoietic

stem/progenitor cells. Blood. 23 avr 2015;125(17):2597-604.

127. Gomes E, Castetbon K, Goulet V. MORTALITÉ LIÉE À LA

DRÉPANOCYTOSE EN FRANCE : ÂGE DE DÉCÈS ET CAUSES ASSOCIÉES

(1979-2010). Bull Épidéniologique Hebd InVS. 10 mars 2015;(8):142-50.

128. Montalembert M de. Traitement de la drépanocytose par l’hydroxyurée.

Hématologie. 14 mars 2002;8(1):28-34.

114

Annexe 1 : brochure de dépistage néonatal de AFDPHE (Association Française pour le Dépistage et la Prévention des Handicaps de l'Enfant)

115

Annexe 2 : Procédure d’instruction des dossiers de thérapie génique.

Schéma issu du Guide « Gestion d’une étude clinique de thérapie génique de la promotion à l’investigation » du Groupement Interrégional de Recherche Clinique et d’Innovation Sud-Ouest Outre-Mer

116

Annexe 3 : Séquence nucléotidique, avec les acides aminés correspondants, de la chaine bêta de l'hémoglobine. En noir sont représentés les nucléotides, en bleu les acides aminés, en vert les codons START (ATG) et STOP (TAA) et en rouge l’acide aminé dont la mutation est responsable de la drépanocytose (source : Université de Lille)

N° d’identification :

TITRE

La thérapie génique: quel espoir pour les patients atteints de

drépanocytose ?

Thèse soutenue le 28/09/2018

Par Flavien BIZOT

RESUME :

La drépanocytose est une hémoglobinopathie, autosomique récessive touchant la production de l’hémoglobine

impliquée dans le fonctionnement des hématies. Cette maladie est caractérisée par la présence d’hématies

falciformes possédant une faible affinité pour l’oxygène. Cette altération des hématies va entre autres impacter

l’oxygénation des organes et provoquer des crises vaso-occlusives sévères en cas d’activité physique intense et

prolongée et va conduire à une mort prématurée des patients. À ce jour, aucun traitement universel n’est

proposé à ces patients.

La thérapie génique représente, à l’heure actuelle, un enjeu majeur dans la prise en charge des patients. Apparu

dans la seconde moitié du XXème siècle, suite à la découverte de la structure de l’ADN, cette nouvelle thérapie

a déjà permis la mise sur le marché de nouveaux traitements (immunothérapies, vaccins recombinants,

hormones de croissance…). Pour pouvoir traiter efficacement les patients atteints de drépanocytose, la thérapie

génique doit s’attaquer à l’essence même de la maladie en modifiant le génome cellulaire.

Afin de prendre en charge le plus efficacement possible les patients atteints de drépanocytose, le personnel

soignant teste actuellement différents protocoles cliniques de thérapie génique. Ces protocoles visent à extraire

les cellules souches du patient porteur de la maladie, de les corriger (par ajout de gène) et de les réimplanter aux

patients. Ce gène peut être celui de la chaine bêta de l’hémoglobine A (qui est muté chez ces patients), celui

d’une autre chaine de l’hémoglobine (chaine gamma) ou un gène codant pour une molécule qui in fine

permettra de réguler la production d’hémoglobine (inhibition de BCL11A). Les premiers résultats obtenus lors

de ces essais ont permis la guérison d’un patient, ce qui a redonné espoir aux malades. Néanmoins, la thérapie

génique doit encore faire ses preuves à grande échelle et sur le long terme avant d’être réellement considérée

comme une thérapie efficace.

MOTS CLES : Thérapie génique, drépanocytose, cellules souches hématopoïétiques, greffe cellulaire, gène.

Directeur de thèse Intitulé du laboratoire Nature

Loïc REPPEL

Unité de Thérapie Cellulaire et

Banque de Tissus CHRU Nancy

UMR 7365 CNRS-Université de

Lorraine « Ingénierie Moléculaire et

Physiopathologie Articulaire »

Expérimentale □

Bibliographique X

Thème □

Thèmes 1 – Sciences fondamentales

3 – Médicament

(5) - Biologie

2 – Hygiène/Environnement

4 – Alimentation – Nutrition

(6) – Pratique professionnelle

Documents

La thérapie génique: quel espoir pour les patients