L’ UTILITE DE LA MÉTAGÉNOMIQUE POUR L’ÉTUDE DES … · 2009-05-19 · L’ UTILITE DE LA MÉTAGÉNOMIQUE POUR L’ÉTUDE DES POPULATIONS MICROBIENNES ACTIVES DU FROMAGE Metagenomics

L’ UTILITE DE LA MÉTAGÉNOMIQUE

POUR L’ÉTUDE DES POPULATIONS

MICROBIENNES ACTIVES DU FROMAGE

Metagenomics to Study Active Microbial

Populations in Cheese

BASSIROU NDOYE, Ph.D.BASSIROU NDOYE, Ph.D.DENIS ROY, Ph.D.DENIS ROY, Ph.D. Titulaire de la ChaireTitulaire de la Chaire: :

Denis ROY, Ph. DDenis ROY, Ph. D

inaf-stela.ulaval.ca

PLANPLAN

2

IntroductionIntroductionÉÉtude de la communauttude de la communautéé microbienne du fromagemicrobienne du fromage

Extraction dExtraction d’’ADN et dADN et d’’ARNARN

Analyse mAnalyse méétagtagéénomiquenomique

MMéétatranscriptomiquetatranscriptomique

ÉÉtude la diversittude la diversitéé microbienne du fromage : mmicrobienne du fromage : mééthodes basthodes baséées sur les sur l’’ADNADN

Quelques exemples de travaux rQuelques exemples de travaux rééalisaliséés dans la chaires dans la chaire

RemerciementsRemerciements

inaf-stela.ulaval.ca 3

INTRODUCTIONINTRODUCTIONÉÉtude de la communauttude de la communautéé microbienne du fromage : notion dmicrobienne du fromage : notion d’é’écosystcosystèème me microbien (ou niche microbien (ou niche éécologique)cologique)

MMééthodes de culture : dthodes de culture : déépendante (microbiologique) et indpendante (microbiologique) et indéépendante pendante (mol(molééculaire)culaire)Analyse mAnalyse méétagtagéénomique : gnomique : géénomique comparative et mnomique comparative et méétatranscriptomiquetatranscriptomiqueGGéénomique comparative: nomique comparative: ‐‐ Technique basTechnique baséée sur la PCRe sur la PCR‐‐ Technique basTechnique baséée sur la se sur la sééquencequence‐‐ Technique basTechnique baséée sur le sur l’’hybridation hybridation in situ in situ MMéétatranscriptomique: technique bastatranscriptomique: technique baséée sur le sur l’’analyse fonctionnelle de analyse fonctionnelle de ggèènes (RTnes (RT‐‐QQ‐‐PCR, SSH, SCOTS, etc.)PCR, SSH, SCOTS, etc.)

4

Écosystème microbien d’un fromage

Écosystème microbien d’un fromage

Extraction d’acides nucléiques ARNmADNg

Diversitémicrobienne

Diversitémicrobienne

Activitémicrobienne

Activitémicrobienne

Qui est là?

Qui fait fait quoi?quoi?

ADN/ADNc

MÉTAGÉNOMIQUEMÉTAGÉNOMIQUE

Génomique comparative MétatranscriptomiqueHybridation Séquence PCR Expression fonctionnelle

FISHFISH ADNr16SADNr16SDGGE

T-RFLPARISA

DGGET-RFLPARISA

ARNr16SARNr16S Q-RT-PCR

Q-RT-PCR

SSH SCOTS

SSH SCOTS

Activitémétabolique

Activitémétabolique

CommunautémicrobienneCommunautémicrobienne

StructureStructure DynamiqueDynamique

espèces métaboliquement actives, viables mais non cultivables (VNC), non cultivables….

espèces métaboliquement actives, viables mais non cultivables (VNC), non cultivables….

Explications / prédictionsQualité Innocuité


LL’’extraction de lextraction de l’’ADN ADN àà partir de la matrice alimentaire est bien partir de la matrice alimentaire est bien mamaîîtristriséée par les microbiologistese par les microbiologistes

Celle de lCelle de l’’ARN reste un grand dARN reste un grand dééfi car le fromage constitue un fi car le fromage constitue un éécosystcosystèème riche en nuclme riche en nuclééases et en composants inhibiteurs de ases et en composants inhibiteurs de ll’’amplification PCR amplification PCR

Elle reste aussi une procElle reste aussi une procéédure trdure trèès sensible (Randazzo et al., s sensible (Randazzo et al., 2002)2002)

EXTRACTION DEXTRACTION D’’ADN/ARNADN/ARN


DifficultDifficultéés de ls de l’’extraction de lextraction de l’’ARN : ARN :

-- Concentration en biomasse de 2mg M.S./g de fromage Concentration en biomasse de 2mg M.S./g de fromage (Ulv(Ulvéé et al., 2008)et al., 2008)

-- Contamination de lContamination de l’’ARN par lARN par l’’ADNg ADNg

-- Le fromage est caractLe fromage est caractéérisriséé par un pouvoir tampon par un pouvoir tampon éélevlevéé avec un avec un pH autour de 5pH autour de 5




Deux stratDeux stratéégies dgies d’’extraction dextraction d’’ARN :ARN :

‐‐Une extraction avec prUne extraction avec prééparation prparation prééalable de lalable de l’é’échantillon chantillon par la combinaison de 2 rpar la combinaison de 2 rééactions (Bonaactions (Bonaïïti et al., 2006) :ti et al., 2006) :

Une rapide homogénéisation par une solution alcaline, comme le tampon de citrate frais, suivie d’un broyage mécanique (mélange de billes et broyage: par bead‐beater) à 4°C (Ulvé et al., 2008)*

* J. Appl. Microbiol. 105:1327-1333



-- Extraction de lExtraction de l’’ ARN directement de la matrice fromagARN directement de la matrice fromagèère re sans ssans sééparation prparation prééalable des cellules du fromage alable des cellules du fromage (Monnet et al., 2008) :(Monnet et al., 2008) :

Arrêt des réactions cellulaires au tout début de l’extraction par l’ utilisation de TRIZOL (ou QIAzol)

AvantageAvantage : : limitation du niveau de contamination par l’ADNg

InconvInconvéénientnient : : le ratio quantité de fromage/volume de TRIZOL ne doit jamais excéder 150 mg/ml


TECHNIQUE TECHNIQUE BEADBEATERBEADBEATER AVEC PHAVEC PHÉÉNOL ACIDE NOL ACIDE (ULVE ET AL, 2008)(ULVE ET AL, 2008) Pr. Hocine DabaPatricia Savard

AR

N (n

g/µl

)

AR

N (n

g/µl

)


Concentration d’ARN : 149 ng/μlRatio d’ARNr [23s / 16s] : 2,8Quantité d’ARN intègre (RIN) : 8,2

Cheddar doux : 2140 ng/μlCheddar doux : 2140 ng/μl

Concentration d’ARN : 15 ng/μlRatio d’ARNr [23s / 16s] : 1,5Quantité d’ARN intègre (RIN) : 8,4

Cheddar mi‐fort : 45 ng/μlCheddar mi‐fort : 45 ng/μl

TECHNIQUE TECHNIQUE BEADBEATERBEADBEATER AVEC PHAVEC PHÉÉNOL ACIDE NOL ACIDE (ULVE ET AL, 2008)(ULVE ET AL, 2008)


Flore microbienne du fromage : prFlore microbienne du fromage : préésence de bactsence de bactééries ries mméétaboliquement actives sous trois formestaboliquement actives sous trois formes……;;

-- ViablesViables

-- Non cultivablesNon cultivables

-- Viables mais non cultivables (VNC)Viables mais non cultivables (VNC)

ANALYSE MANALYSE MÉÉTAGTAGÉÉNOMIQUENOMIQUE


ANALYSE MANALYSE MÉÉTAGTAGÉÉNOMIQUENOMIQUE

DifficultDifficultéé de la mesure prde la mesure préécise du nombre de bactcise du nombre de bactééries par les ries par les mmééthodes microbiologiques conventionnellesthodes microbiologiques conventionnelles

DDéétection de ltection de l’’ARNm : meilleur indicateur de la viabilitARNm : meilleur indicateur de la viabilitéé des des cellules et de leur activitcellules et de leur activitéé physiologiquephysiologique

RT de lRT de l’’ARNm suivie dARNm suivie d’’une PCR normale ou en temps rune PCR normale ou en temps rééel : el : mmééthode de choix pour mesurer lthode de choix pour mesurer l’’activitactivitéé relative des microrelative des micro--organismes morganismes méétaboliquement actifstaboliquement actifs


ANALYSE MANALYSE MÉÉTAGENOMIQUETAGENOMIQUE

UtilitUtilitéé des mdes mééthodes molthodes molééculaires basculaires baséées sur les sur l’’ARNARN

-- DDéétection du mtection du méétatranscriptome des bacttatranscriptome des bactéériesries

-- Estimation de la viabilitEstimation de la viabilitéé et de let de l’’activitactivitéé du microbiotedu microbiote


TechniquesTechniques AvantagesAvantages InconvInconvéénientsnients

Puces Puces àà ADNADN 1.1. Plus grande efficacitPlus grande efficacitéé;;

2.2. Grande spGrande spéécificitcificitéé;;

3.3. Plus de 2 Plus de 2 ééchantillons peuvent être chantillons peuvent être

analysanalyséés en une exps en une expéériencerience

1.1. En gEn géénnééral, lral, l’’information sur la information sur la

ssééquence est requise quence est requise àà ll’’ avance;avance;

2.2. Faible abondance de gFaible abondance de gèènes et nes et

difficiles difficiles àà ddéétecter;tecter;

3.3. Grandes quantitGrandes quantitéés ds d’é’échantillonschantillons

4.4. Technique trTechnique trèès cos coûûteuseteuse

SH SH (Subtractive (Subtractive

Hybridization)Hybridization)

1.1. CoCoûût faible;t faible;

2.2. Longues sLongues sééquences de gquences de gèènes peuvent nes peuvent

être obtenues dans une librairie;être obtenues dans une librairie;

1.1. Faible sensibilitFaible sensibilitéé;;

2.2. Large quantitLarge quantitéé dd’’ ééchantillons;chantillons;

3.3. Travail important;Travail important;

....Et bien d’autres méthodes comme RDA, DD RT-PCR, SCOTS, etc.

MMÉÉTATRANSCRIPTOMIQUETATRANSCRIPTOMIQUE


Déterminer une méthode de caractérisation des activités fonctionnelles de lactocoques notamment leur impact sur la flaveur du fromage «Cheddar»

Choix de la SSH et de la RT-Q-PCRTechniqueTechnique AvantagesAvantages InconvInconvéénientsnients

SSH SSH (Suppression (Suppression

Subtractive Subtractive

Hybridization)Hybridization)

1.1. Ne nNe néécessite pas de scessite pas de sééparations parations

physiques des molphysiques des moléécules cules

bactbactéériennes;riennes;

2.2. QuantitQuantitéé dd’é’échantillons relativement chantillons relativement

faibles;faibles;

3.3. Grande efficacitGrande efficacitéé, sp, spéécifiquement pour cifiquement pour

ll’’obtention dobtention d’’une faible abondance de une faible abondance de

ggèènes;nes;

4.4. Grande spGrande spéécificitcificitéé

1.1. Seuls 2 Seuls 2 ééchantillons chantillons

peuvent être comparpeuvent être comparéés s

en une seule SSH;en une seule SSH;

2.2. Les rLes réésultats dependent sultats dependent

trop de ltrop de l’’ efficacitefficacitéé de la de la

ligature des adaptateursligature des adaptateurs;;



TechniqueTechnique AvantagesAvantages InconvInconvéénientsnients

RTRT--QQ--PCR PCR (Quantitative Reverse (Quantitative Reverse

Transcription PCR)Transcription PCR)

1.1. PossibilitPossibilitéé de quantifier lde quantifier l’’activitactivitéé

dd’’un taxon spun taxon spéécifique ou des cifique ou des

transcrits;transcrits;

2.2. Les amplifications QLes amplifications Q--RTRT--PCR PCR

peuvent être rpeuvent être rééalisaliséées via 1 ou 2 es via 1 ou 2

éétape (s) de RT pour ltape (s) de RT pour l’’obtention obtention

dd’’ADNc ss ou ds;ADNc ss ou ds;

3.3. LL’’ ADNc obtenu peut être utilisADNc obtenu peut être utiliséé

dans un grand nombre de rdans un grand nombre de rééactions actions

QQ--PCR;PCR;

1.1. Sensible Sensible àà la la

contamination des ARN;contamination des ARN;

2.2. La quantitLa quantitéé dd’’ ADNc ADNc

produite doit reflproduite doit reflééter la ter la

concentration de lconcentration de l’’ARN ARN

de dde déépart ;part ;

3.3. Les amplicons QLes amplicons Q--RTRT--PCR PCR

doivent être courts (entre doivent être courts (entre

50 et 150 pb de long)50 et 150 pb de long)



ÉÉCOLOGIE MICROBIENNECOLOGIE MICROBIENNE


TECHNIQUES DE PROFILAGETECHNIQUES DE PROFILAGE


GGÈÈNES ARN RIBOSOMAUX 16S OU 18SNES ARN RIBOSOMAUX 16S OU 18S


ÉÉTUDES PHYLOGTUDES PHYLOGÉÉNNÉÉTIQUESTIQUES


BANQUE GBANQUE GÉÉNOMIQUENOMIQUE


BANQUE DE CLONES DU GBANQUE DE CLONES DU GÈÈNE DNE D’’ADNr 16S DE ADNr 16S DE LAITS CRU, THERMISLAITS CRU, THERMISÉÉ, CO, CO22 ET MICROFILTRET MICROFILTRÉÉ

ClassNumber of Sequences

Relative abundance (%)

OTUs

Alphaproteobacteria 34 2.4 17

Betaproteobacteria 55 3.9 7

Gammaproteobacteria 570 40.3 19

Bacilli 566 40.0 54Clostridia 86 6.1 52Actinobacteria 76 5.4 29Bacteroidetes 23 1.6 19Acidobacteria 1 0.1 1TM7 2 0.1 2Unclassified 2 0.1 2TOTAL 1415 100 202

Éric A. Rasolofo


ABONDANCE RELATIVE (% DU TOTAL) DE CLONES DU GÈNE D’ADNr 16S ISOLÉ DES LAITS TRAITÉS

23

Day 3 Day 7Class Genus

UT CO2 TH MF UT CO2 TH MF

Streptococcus 4.8 9.3 7.2 5.2 0.0 8.2 4.0 1.7

Lactococcus 3.0 1.7 1.1 0.6 0.0 3.8 0.6 1.1

Lactobacillus 3.6 0.0 2.8 0.0 0.0 1.1 2.9 0.0

Trichococcus 3.0 4.1 0.0 0.0 0.5 6.6 1.2 0.0

Facklamia 5.4 3.5 6.7 0.6 0.5 0.5 1.7 0.6

Aerococcus 1.8 6.4 4.4 0.6 0.0 1.6 4.6 1.1

Staphylococcus 32.7 32.0 32.2 3.5 1.6 12.6 41.0 1.1

Bacilli

Other Bacilli 8.3 9.3 16.1 4.6 1.1 1.6 5.2 2.8

Delftia 0.0 0.0 0.0 9.2 0.0 0.0 12.7 1.1

Stenotrophomonas 0.0 0.6 0.0 19.1 0.0 0.0 1.7 13.5

Pseudomonas 2.4 0.6 0.0 24.3 94.2 56.6 0.6 55.6

Acinetobacter 6.5 4.7 5.6 4.0 1.1 2.7 4.0 0.0Proteobacteria

Other Proteobacteria

5.4 4.1 3.9 21.4 0.0 1.1 3.5 6.7

24

Corynebacterium variabile

Streptococcus uberis

Aerococcus viridans

Staphylococcus aureus

Acinetobacter calcoaceticusPseudomonas fluorescens


PCR quantitative en temps réel

26

Untreated milk

Day

1 3 7

Log 10

Cell m

L-1

0

2

4

6

8

Thermized milk

Day

1 3 7

Log 10

Cell mL-1

0

1

2

3

4

5

6

7

CO2 Milks

Day

1 3 7

Log 10

Cell mL-1

0

1

2

3

4

5

6

7

Staphylococcus aureus Aerococcus viridans Pseudomonas fluorescens Acinetobacter calcoaceticus Corynebacterium variabile Streptococcus uberis Total Bacteria

**

* *

Lait cru

Lait thermisé

Lait CO2

Bactéries totales

Streptococcus uberis

Corynebacterium variabile

Aerococcus viridans

Staphylococcus aureus

Acinetobacter calcoaceticus

Pseudomonas fluorescens


Jour 1 Jour 3 Jour 7Micro-organismes

Traitements

Log10

CFU/mLLog10

CFU/mLLog10

CFU/mL

Psychrotrophic UT 3,6 3,9 6,9TH 1,9 1,6 1,7CO2 3,5 3,4 4,5

Staphylococci UT 3,4 3,6 3,5TH 2,8 2,8 2,2CO2 3,2 3,4 3,0

Coagulase+ UT 2,9 3,2 2,2Staphylococci TH 0,0 0,2 0,0

CO2 2,8 3,0 2,6

ÉÉVOLUTION DES MICROVOLUTION DES MICRO--ORGANISMES DANS DU LAIT ORGANISMES DANS DU LAIT CRU (UT), THERMISCRU (UT), THERMISÉÉ (TH) ET CO(TH) ET CO22 PENDANT 7 JOURS PENDANT 7 JOURS DD’’ENTREPOSAGE ENTREPOSAGE ÀÀ 44°°CC


ARN : matrice d'amplification

.

RT PCR QUANTITATIVE EN TEMPS RRT PCR QUANTITATIVE EN TEMPS RÉÉEL (QEL (Q--RTRT--PCR)PCR)


L.l.cremorisL.l. lactisLb. curvatusLb. delbrueckiiLb. paracasei

ABONDANCE VS ACTIVITABONDANCE VS ACTIVITÉÉ

Nbde clones (%)

Nbde copies du gène

ARNr16S par μL (en log)

Banques de clones : Abondance vs Activité qRT‐PCR : quantification des populations actives

Émilie Desfossés-Foucault


28 S18 S

T-RFLP - ARISA

ADN ribosomal

Région amplifiée pour le T-RFLP Région amplifiée pour l’ARISA

ITS 1 et ITS 2 varient en

séquence et en longueur

ITS 1 et ITS 2 varient en

séquence et en longueur

Régions V1 àV10 varient en séquence

Régions V1 àV10 varient en séquence

Marianne Arteau

32

M

A)A) Analyse en composantes principales; centre (Analyse en composantes principales; centre ( ), cro), croûûte (te ( ) ) B)B) Projection des variables sur les axes 1 et 2Projection des variables sur les axes 1 et 2

CAS 1

Centre

Croûte

33

A)A) Analyse en composantes principales; centre (Analyse en composantes principales; centre ( ), cro), croûûte (te ( ) ) B)B) Projection des variables sur les axes 1 et 2Projection des variables sur les axes 1 et 2

CAS 2

Centre

Croûte

34

CroCroûûte du fromage traditionnel (te du fromage traditionnel ( ), cro), croûûte du fromage stabiliste du fromage stabiliséé (( ), centre du ), centre du fromage traditionnel (fromage traditionnel ( ), centre du fromage stabilis), centre du fromage stabiliséé (( ) )

Centre

CroûteTRAD

STAB

35

Comparaison des Camembert traditionnels de 1Comparaison des Camembert traditionnels de 1 kg (TRAD) et de 150kg (TRAD) et de 150 g (TRAD150g) g (TRAD150g) CroCroûûte du fromage de 1 kg (te du fromage de 1 kg ( ), cro), croûûte du fromage de 150 g (te du fromage de 150 g ( ), centre des fromage de ), centre des fromage de 1 kg et de 150 g (1 kg et de 150 g ( ))

Centre

Croûte

1 kg

150 g

36

Comparaison des fromages en fonction du lieu de fabrication, ExpComparaison des fromages en fonction du lieu de fabrication, Expéérimental (crorimental (croûûtete : : ΔΔ, , centrecentre : : ) ou chez le producteur (cro) ou chez le producteur (croûûtete : : , centre, centre : : ))

Centre

Croûte

Exp

Comm


RemerciementsLaboratoire de génomique microbienne INAF-STELA


Remerciements

Partenaires de la Chaire de recherche industrielle CRSNG – industrie laitière en technologie et typicitéfromagère :• Novalait : Danielle Rivard, Élise Gosselin• Producteurs laitiers du Canada : Steve Couture• Saputo : Luc Savoie, • Agropur : Michel Pouliot, Gaétan Trudeau• Parmalat : Michel Doré• Damafro : Michel Bonnet• FPLQ : Gilbert Rioux• Université Laval : Éric Lamiot


Remerciements

Collaborateurs administratifs :• FSAA : Louise Tremblay• Département de sciences des aliments et de nutrition : Johanne Talbot, Diane Robert

• Centre STELA-INAF : Andrée Lagacé, Hélène Fortier, Renée Michaud

Collaborateurs Scientifiques :• CRDA : Daniel St-Gelais, Caroline Lapointe,

Gaétan Bélanger• Centre STELA : Gisèle LaPointe, Sylvie

Turgeon, Steve Labrie


CT

VALEUR DU CYCLE SEUILVALEUR DU CYCLE SEUIL


Fluo

resc

enc

e

Nombre de cycles

Polymérase

109 CFU/ml108 CFU/ml107 CFU/ml106 CFU/ml

Ct1 Ct2 Ct3 Ct4

Principe de la PCRq (SYBR Green I)Principe de la PCRq (SYBR Green I)


SEQUENCESEQUENCE--PREDICTED AND EXPERIMENTALLY PREDICTED AND EXPERIMENTALLY DERIVED FRAGMENT LENGTHS OF FUNGAL DERIVED FRAGMENT LENGTHS OF FUNGAL ISOLATESISOLATES

T‐RFLPA:MspI

T‐RFLPB:RsaI

T‐RFLPD:HhaI

T‐RFLPF:TaqαI

ARISASpecies Isolates

Exp Th Exp Th Exp Th Exp Th Exp Th

Cl. cladosporioides AO 228 231 75 79 227 230 130 134 538 541

D. hansenii ATCC 60978 335 334 76 80 384 385 213 215 631 628

D. hansenii J 335 334 76 80 385 385 213 215 631 628

D. hansenii AK 335 335 76 80 382 386 213 216 631 628

G. candidum ATCC 34614 129 133 508 511 372 375 203 205 359 365

G. candidum E 129 133 508 512 374 376 203 206 359 361

G. candidum Q 129 133 509 512 373 376 203 206 359 360

M. racemosus* ATCC 60726 339 339 470 474 523 390 251 254 628 625

P. camembertii L 230 232 76 28 229 231 268 270 572 575

P. caseicola ATCC 10387 230 233 N.D. 29 229 232 267 271 571 575

P. chrysogenum ATCC 10002 229 233 N.D. 29 228 232 268 271 570 578

P. commune AL 229 233 76 29 229 232 268 271 572 575

P. roquefortii ATCC 10110 230 233 N.D. 29 229 232 267 271 569 573

Pi. fermentans ATCC 10651 224 228 455 460 121 125 205 208 427 434

S. cerevisiae AN 336 332 467 468 383 383 133 136 843 837

Y. lipolytica ATCC 9773 288 290 422 425 340 341 180 182 347 349

Y. lipolytica W 288 290 422 425 340 341 180 182 346 347

* Values for M. racemosus were found using GenBank N.D.: Not Detected

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