La valutazione del microbiota in ambito veterinario · batterici benefici e quella dei batteri opportunisti e patogeni Istituto Superiore di Sanità, Roma, 17 Maggio 2019 Il microbiota

La valutazione del microbiota

in ambito veterinario

Bianca Castiglioni, IBBA-CNR

CORSO

“Approcci immunologici attuali a problematiche di sanità e benessere animale”

Istituto Superiore di Sanità

Roma, 17 Maggio 2019

Cosa è il Microbiota?

Istituto Superiore di Sanità, Roma, 17 Maggio 2019

Microbiota: una comunità microbica

composta da più microrganismi

simbiotici, commensali e persino patogeni

Microbioma: i genomi e/o i geni dei

microrganismi che costituiscono una

comunità microbica

Cosa è la metagenomica?


La metagenomica è lo studio del DNA genomico

ottenuto da microrganismi che non possono essere

coltivati in laboratorio

L'analisi metagenomica è ...

una tecnica indipendente dalla

cultura

mirata al DNA batterico

basata su una tecnologia di

sequenziamento del DNA ad alto

rendimento


Genomica versus Metagenomica

16S metabarcoding


E’ una tecnica di analisi

metagenomica basata

sulla combinazione di

amplificazione PCR e

sequenziamento di una

porzione del gene che

codifica per 16S rRNA

16S metabarcoding


L’rRNA 16S è ampiamente utilizzato come marcatore filogenetico nella

classificazione e identificazione di Batteri e Archaea

A livello della sequenza del 16S si possono individuare delle regioni conservate uguali nella totalità dei

batteri, delle regioni semiconservate che sono identiche - o molto simili - a livello di phylum., delle

regioni variabili, molto differenti tra batteri dello stesso genere

Profilo tassonomico a livello di phylum


Richness and diversity metrics


La ricchezza è bassa in A e B, con solo quattro OTU presenti. La ricchezza è

maggiore in C e D, con 10 OTU presenti.

La diversità, che rappresenta l'uniformità e il numero di OTU, è maggiore in

B che in A, e maggiore in D che in B.

Richness and diversity


Il punto importante da ricordare quando si parla di ricchezza e

diversità è che una maggiore ricchezza e diversità sono

generalmente associate a una salute migliore in sistemi dove il

microbiota è stato ben caratterizzato, come l'intestino o la pelle

Cho et al., Nat Rev Genet 2012;13(4):260–70


Microbiota

È ormai noto che tutti i mammiferi ospitano

comunità microbiche ampiamente

diversificate

Gli uomini, ad esempio, sulla loro

pelle, intestino, tratti genitali,

urinari e oro-faringei ospitano

un'ampia varietà di comunità

microbiche che, attraverso

intricate interazioni

mutualistiche, si sono evolute

con loro e svolgono ruoli

cruciali nella loro biologia e

salute

Il microbiota degli animali da allevamento


Anche gli animali da allevamento ospitano un'ampia varietà di comunità

microbiche che si sono evolute con loro mediante interazioni complesse e

mutualistiche, che svolgono ruoli cruciali nella loro biologia e salute

Microbiota bovino


I bovini ospitano un'ampia varietà di

comunità microbiche su:

pelle

rumine

intestino

tratti genitali e urinari

orofaringe

mammella

Microbiota del latte


Data la sua importanza per la salute degli animali e le correlazioni con la

qualità e la sicurezza delle produzioni lattiero-casearie, l'interesse per la

comprensione dell'origine e della composizione del microbiota del latte è

cresciuto significativamente negli ultimi anni



Per molto tempo si è ritenuto che la

ghiandola mammaria e il latte in

essa contenuti fossero sterili, e si

pensava che i microrganismi presenti nel

latte fossero il risultato di una

contaminazione esterna

Addis et al., 2016

Più recentemente diversi studi

hanno invece supportato l'ipotesi

che i batteri sono presenti nel

latte non solo come risultato di

una colonizzazione esterna



Lo sviluppo delle cosiddette tecnologie "omiche" di

sequenziamento e i progressi nelle tecniche colturali hanno

rafforzato la consapevolezza che il latte ospita una comunità

microbica diversificata e complessa

Potenziali origini del microbiota intramammario


Nel lavoro di Young et al. (2015) è

stato descritto il trasferimento di

batteri intestinali alla ghiandola

mammaria bovina, supportando cosi

l'esistenza di un “pathway entero-

mammario” endogeno anche nei

ruminanti

I risultati di questo studio

supportano l'insorgenza di un

meccanismo responsabile della

migrazione di alcuni componenti del

microbiota intestinale alla ghiandola

mammaria attraverso la circolazione

dei globuli bianchi

Tuttavia, resta da stabilire quali siano

i tipi di cellule responsabili del

traffico di microbiota dai linfonodi

mesenterici al latte

Entero-mammary pathway in ruminants

Addis et al., 2016

Potenziali origini del microbiota intramammario


Anche se l'origine del

DNA batterico nel

latte è ancora

sconosciuta, si sa che

la sua

composizione può

essere influenzata

da diverse fonti,

come la lettiera,

l'allattamento, la

mungitrice e la pelle

dei mungitori



Nel lavoro di Zhang et al. (2015), gli autori hanno descritto differenze nelle

comunità microbiche del latte associate alla dieta

Influence of feeding on milk microbiota of dairy cows at species level

(LC, low-concentrate diet; HC, high-concentrate diet).



The major phyla and genera in 12 months and

the significant differences between major

genera among 12 month:

Firmicutes, Proteobacteria and Actinobacteria

were the most abundant phyla and exhibited

a counter-balanced relationship.

the highest diversity of bacterial

composition was detected in June, while

the lowest was in December.

The abundances of Propionibacterium and

Pseudoalteromonas were negatively

correlated to total bacterial count, which

meant that they helped to maintain milk

quality.

Variazione del microbiota del latte nel corso di 12 mesi e impatto

delle condizioni meteorologiche

Li et al., Scientific Reports, 2018

Milk microbiome diversity and bacterial group prevalence in a

comparison between healthy Holstein Friesian and Rendena cows

(Cremonesi et al., PLOS One, 2018)

In questo studio, è stato confrontato il microbiota di latte di vacche HF e REN,

allevate nella stessa stalla e nelle medesime condizioni, durante il periodo di

transizione (tre settimane prima e tre settimane dopo il parto), allo scopo di

definire i gruppi batterici prevalenti con un possibile effetto sulla salute della

ghiandola mammaria

La Frisona Italiana (HF) è una razza da latte altamente

produttiva, mentre la Rendena (REN) è una razza

autoctona a duplice attitudine

Nel precedente lavoro di Curone et al.

(2017) era stato descritto come animali di

razza Rendena mostrino una maggiore

resistenza alla malattia rispetto ad animali di

razza Frisona allevati nelle stesse condizioni


I profili tassonomici di entrambe le razze sono dominati dai Firmicutes, per

lo più rappresentati dal genere Streptococcus, sebbene in proporzioni molto

diverse ( HF 27,5%, REN 68,6% )


La specie principale del genere

Streptococcus è rappresentato da

Str. thermophilus, un batterio

lattico (LAB). In particolare nella

razza Rendena rappresenta

oltre il 95% del totale degli

streptococchi presenti

Infine, solo il latte HF ha

mostrato cambiamenti

significativi nella composizione

microbica durante il periodo di

transizione, mentre REN ha

mantenuto un microbiota più

stabile

Queste differenze nel microbioma del latte potrebbero

avere un impatto sulla salute della ghiandola mammaria

Profonde differenze fra le

due razze sono emerse

anche dall'analisi

predittiva metabolica

dai dati del microbioma


Il microbioma mammario (Oikonomou et al., 2014) nelle vacche

da latte è differente tra sani e malati, ma non è chiaro

esattamente come i cambiamenti nel microbioma siano

correlati allo stato di malattia

Microbiota mammario

Lo sviluppo di sistemi per il

monitoraggio routinario

del microbioma mammario

dei bovini e la conseguente

possibilità di manipolarlo

possono diventare un aspetto

chiave della gestione della

mandria


Il microbiota del latte sano

In generale, i

profili tassonomici

dei campioni di

latte sano a livello

di phylum sono

dominati da:

Firmicutes

Proteobacteria

Bacteroidetes

Actinobacteria


Kuehn et al., 2013; Oikonomou et al., 2014; Zhang et al., 2015; Falentin et al., 2016; Derakhshani et al., 2018



Composizione del

microbiota in

varie nicchie della

mammella

Derakhshani et al., J. Dairy Sci.2018



NAS: non-aureus staphylococci

Some NAS species are detrimental to udder

health (resulting in clinical or subclinical

mastitis)

Some NAS species confer protection against

IMI (production of a wide range of

bacteriocins capaple to inhibit the growth of

major mastitis pathogens)

Corynebacterium spp also have

contradictory functionalities with regard to

conferring protection against IMI with major

pathogens

The Milk Microbiota of Healthy and Inflamed Bovine

Mammary Glands From Dryoff Through 150 Days in Milk


DR: dryoff

C1:4–7 DIM

C2: 11-14 DIM

Front. Vet. Sci. (2018) 5:247

Healthy: culture-negative milk with

SCC < 100,000 cells/mL at DR, C1,

and C2

CHRON: culture-negative milk

samples with SCC ≥ 150,000

cells/mL at DR and C1

NEWINF: new culture-negative

inflammation with variable DR milk

sample results and culture-negative

milk samples with SCC ≥ 150,000

cells/mL at C1 and C2

POS: bacterial growth in culture

and SCC ≥ 150,000 cells/mL at DR,

C1, and C2

Insights Into the Bovine Milk Microbiota in Dairy

Farms With Different Incidence Rates of

Subclinical Mastitis


Lo studio suggerisce che la variazione dei tassi di incidenza delle mastiti

subcliniche non è solo determinata dall'eterogeneità e dalla prevalenza dei

patogeni che causano la mastite, ma è anche associata alla presenza di batteri con

potenziali effetti benefici

Front. Microbiol. (2018) 9:2379

Lo sviluppo di mastiti cliniche e le risposte infiammatorie nella mammella

sono associati a:

diminuzione della diversità del microbiota commensale

interruzione dell'equilibrio ottimale tra la percentuale di gruppi

batterici benefici e quella dei batteri opportunisti e patogeni


Il microbiota del latte sano e del latte mastitico

Utilizzare la metagenomica per identificare i

membri influenti del microbiota della ghiandola

mammaria con ruoli centrali nel:

mantenere la salute della mammella

modulare la suscettibilità alla mastite

potrebbe essere un approccio innovativo per

l'isolamento mirato e la caratterizzazione di quelle

specie benefiche presenti nella comunità

microbica nativa della mammella

Salute della mammella e suscettibilità alla mastite

La diversità ottimale del microbiota intramammario, composta da un sano equilibrio tra gruppi batterici commensali e opportunistici, è essenziale per mantenere un equilibrio tra le risposte pro e anti-infiammatorie, e quindi mantenere l'omeostasi mammaria

Il microbiota commensale della mammella può modulare la suscettibilità all'IMI da parte dei patogeni della mastite attraverso: 1) il cross-talk diretto tra microorganismi, 2) la stimolazione indiretta dell'immunità o 3) entrambi



I batteri commensali possono resistere alla colonizzazione di agenti patogeni esogeni

e inibire la crescita eccessiva degli opportunisti indigeni attraverso diversi meccanismi:

competizione metabolica delle risorse nutritive

produzione di peptidi inibitori (i.e. batteriocine) che alterano le condizioni

dell'ecosistema per sfavorire la crescita del patogeno (i.e. abbassando il pH)

competizione sui siti di attacco sulla superficie delle cellule epiteliali e

regolazione delle risposte pro e antinfiammatorie dell'ospite

Un recupero solo parziale dei batteri commensali in seguito a IMI e terapia

antibiotica può facilitare sia lo sviluppo di nuove IMI che la recidiva di infezioni

persistenti

La terapia antibiotica alla messa in asciutta

La somministrazione intramammaria di

antibiotici alla fine della lattazione è una

componente chiave dei programmi di controllo

della mastite

Sia che venga somministrato a tutto

l’allevamento o solo ai quarti degli animali con

IMI (terapia selettiva), il trattamento alla

messa in asciutta continua ad essere uno dei

motivi principali per l'uso di antibiotici negli

allevamenti da latte


E’ necessaria una valutazione degli effetti delle attuali strategie di impiego di

antibiotici ai fini profilattici nella modulazione del microbiota del latte


Effetti della somministrazione intramammaria di

antibiotici sulla composizione del microbiota

Sebbene numerosi studi abbiano

indagato l'efficacia di vari prodotti

antimicrobici

nell'eliminazione/controllo dei

principali patogeni della mastite, vi

sono solo scarse conoscenze

riguardo agli effetti dell'uso

terapeutico e profilattico degli

antibiotici sulla composizione

complessiva del microbiota della

mammella

Non è chiaro se gli antibiotici possano avere un'influenza

duratura sulla composizione del microbiota della

mammella




Inoltre, resta da chiarire fino a che punto

le vie di somministrazione (sistemica

o intramammaria) delle varie classi di

antibiotici possano influenzare la

composizione del microbiota della

mammella

Ovviamente, la caratterizzazione del microbiota

della mammella basata sul DNA non è un

approccio valido per trarre conclusioni riguardo

alla vitalità dei vari gruppi batterici presenti o

alla persistenza delle loro infezioni

Tuttavia, gli studi attuali sottolineano la necessità

di una valutazione approfondita dell'efficacia

delle attuali strategie di terapia alla messa in

asciutta nella modulazione della composizione

del microbiota commensale della mammella




Conclusioni

Il microbiota del latte rappresenta la comunità di batteri presenti nel latte

I progressi tecnologici hanno permesso ai ricercatori di identificare il DNA dei batteri presenti nel latte

La ricerca sul microbiota del latte è ancora agli inizi e la metodologia può/deve essere migliorata

L'origine del microbioma del latte è sconosciuta, ma sono state suggerite diverse fonti

Il crescente interesse nello sviluppo di nuove terapie per il trattamento delle mastiti bovine richiede la necessità di comprendere meglio i vari fattori in grado di influenzare l'omeostasi mammaria


Conclusioni

Lo stato fisiologico dell’animale, le caratteristiche anatomiche della mammella, i tratti genetici associati alla risposta immunitaria e i fattori ambientali possono alterare la composizione del microbiota della mammella

Non si sa ancora abbastanza sul microbiota del latte per prendere decisioni di trattamento in base alla sua composizione; in particolare non si sa ancora se esistono profili del microbiota mammario in grado di conferire resistenza ai patogeni della mastite

La ricerca deve concentrare i suoi sforzi nel cercare di identificare i potenziali meccanismi mediante i quali i microbioti commensali dei vari compartimenti della mammella interagiscono tra loro, con i patogeni della mastite e con il sistema immunitario


Prospettive


In futuro la valutazione del microbiota del latte

potrebbe essere utilizzata per la messa a punto di sistemi

mirati di controllo:

della mastite

della sicurezza e qualità dei prodotti caseari

Collaborazioni



Grazie per

l’attenzione

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