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La variabilità genetica nei batteri
Le due cellule figlie sono geneticamente identiche tra loro e alla cellula madre
La variabilità genetica nei batteri
Nella maggioranza dei casi le mutazioni sono deleterie…..
La variabilità genetica nei batteri
…..ma in qualche caso possono conferire un vantaggio!
Le basi molecolari delle mutazioni
possono risultare per sostituzione di una base nel DNA o per inserzione e delezione di una base (microinserzioni e microdelezioni). Il cambiamento del fenotipo dipende dal punto esatto in cui la mutazione è situata nel gene e da quale prodotto è normalmente codificato dal gene.
Le delezioni possono coinvolgere la perdita di centinaia o migliaia di paia di basi; non revertono se non per ricombinazione.
Le inserzioni si verificano per aggiunta di nuove basi al DNA e inattivano il gene in cui accadono. Molte mutazioni da inserzione sono dovute a sequenze di DNA specifiche, lunghe 700-1400 bp, dette sequenze di inserzione. Le mutazioni da inserzione possono revertere.
Mutazioni puntiformi
Mutazioni che coinvolgono molte paia di basi
Mutazione: è un cambiamento ereditario nella sequenza delle basi nel genoma di un organismo
Effetti della sostituzione di una base
mutazionemissenso
mutazionenonsenso
mutazionesilente
Scivolamento dello schema di lettura (frameshift)
Frequenza di mutazione La frequenza con cui avvengono i diversi tipi di mutazioni è
estremamente variabile. Errori nella replicazione del DNA ricorrono con una frequenza di 10-7 10-11 per coppia di basi per singolo ciclo di replicazione. Per un gene di 1000 basi la frequenza è dell’ordine di 10-4 10-8 per generazione
Retromutazione e Soppressione
Reversione vera (retromutazione)Reversione di secondo sito (soppressione)
mutazione frameshiftmutazione in un secondo geneReversione di mutazione nonsenso
Un revertante è un ceppo in cui viene ripristinato il fenotipo selvatico
Reversione di delezioni e inserzioni
Grosse delezioni possono revertere solo mediante processi che coinvolgono la ricombinazione genetica.Alcune inserzioni (elementi trasponibili) possono revertere per escissione.
La Mutagenesi
Le mutazioni possono essere:
Spontanee Indotte da mutageni
Mutageni chimici Mutageni fisici
Analoghi delle basiAgenti alchilantiAgenti intercalanti
Radiazioni non ionizzanti:UVRadiazioni ionizzanti:
raggi gammaraggi Xraggi cosmici
(frequenza molto bassa)
Analoghi delle basi
Simili nella struttuta a purine e pirimidine del DNA ma difettosi nell’appaiamento
Il più delle volte la replicazione avviene normalmente ma occasionalmente può verificarsi un errore che verrà fissato come mutazione nel successivo ciclo di replicazione
T : A
BrU : A
BrU : G
BrU : A C : G
Agenti alchilanti
Mutageni molto potenti e inducono mutazioni ad alta frequenza rispetto agli analoghi delle basi.
Nitrosoguanidina, Acido nitroso, Idrossilamina sono responsabili di reazioni di metilazione, deaminazione, ecc.
Reagendo sul DNA sono in grado di introdurre cambiamenti anche in assenza di replicazione
Agenti intercalanti
Acridine (arancio di acridina, proflavina): sono molecole planari che si inseriscono tra due basi del DNA, separandole
Questa conformazione anormale può portare a microinserzioni e microdelezioni durante la replicazione
Radiazioni non ionizzanti: raggi UV
Le basi degli acidi nucleici assorbono efficientemente la radiazione ultravioletta. Il picco di assorbimento è a 269 nm
Il suo effetto più conosciuto sul DNA è la formazione di dimeri di pirimidine (due C o T adiacenti vengono legate covalentemente tra loro). Induzione del sistema SOS.
La radiazione UV a 260 nm è l’agente letale più efficiente
La presenza di dimeri aumenta la probabilità che la DNA polimerasi inserisca in questa posizione un nucleotide errato.La radiazione UV è uno strumento molto utile nell’isolamento di mutanti
Radiazioni ionizzanti
Sono radiazioni a lunghezza d’onda corta (raggi X, gamma, raggi cosmici). Più potenti dei raggi UV e altamente penetranti.
Causano la ionizzazione dell’acqua e di altre sostanze con la produzione di radicali liberi come lo ione ossidrile (OH-)
La loro azione mutagena è indiretta in quanto il danno è prodotto dai radicali liberi.
La variabilità genetica nei batteri
Le mutazioni puntiformi non sono sufficienti a spiegare la diversità del mondo microbico
Il genoma di un batterio risulta costituito da un “puzzle” di sequenze provenienti da altri batteri che non sono suoi progenitori ma suoi contemporanei
Indifferenti al mantenimento della loro identità, i batteri sono capaci di acquisire da altri organismi geni che permettono loro:
di diventare resistenti ad antibioticicausare nuove malattieaumentare la loro possibilità di sopravvivenza
Lo scambio di DNA tra i batteri è chiamato:
Trasferimento genico orizzontale
Trasferimento genico orizzontale
Trasferimento genico verticale
Scambio di DNA tra batteri contemporanei
Eredità di un gene
dal progenitore
Significato medico del trasferimento genico
Il trasferimento genico orizzontale tra i batteri sta avendo effetti immediati e pratici sulla salute umana
E’ stato dimostrato il trasferimento di geni:
per la resistenza ad antibiotici
responsabili della patogenicità
per la degradazione di inquinanti (biorisanamento)
Ceppo X resistentealla penicillina
Ceppo Y sensibilealla penicillina
Ceppo Y resistente
geni per la resistenza
Shigella E. coli (ceppo che causa diarrea)
E. coli O157:H7 (causa diarrea emorragica e
danni renali)
geni per la tossina
Trasformazione Trasduzione
Coniugazione
Processo in cui il DNA presente all’esterno del batterio viene internalizzato nella cellula ospite, integrato nel cromosomanella corrispondente regione omologa e stabilmente ereditatocon le divisioni cellulari
Trasformazione
L’esperimento di Griffith (1928)
Pneumococchi da colonie liscie(S= smooth)
Pneumococchi da colonie rugose(R= rough)
cellule vive S cellule vive R
cellulemorte
cellulemorte
cellule vive
L’esperimento di Griffith (1928)
L’esame batteriologico rivela batteri vivi di
tipo S
Trasformazione naturale
Batteri Gram (+)
Streptococcus pneumoniae e S. sanguisBacillus subtilis, B. cereus, B. stearothermophilus
Batteri Gram (-)
Neisseria gonorrheaeHaemophilus influenzae, H. parainfluenzaeAcinetobacter calcoaceticusMoraxella oslensis, M. urethalisPsycrobacter sp.Azotobacter agilisPseudomonas stutzeri
Possibili benefici derivanti dalla trasformazione
Acquisizione di nuove caratteristiche genetiche
Superamento delle difese dell’ospite da parte dei patogeni (N. gonorrhoeae)
Riparo del DNA danneggiato
DNA come fonte di nutrimento
Le fasi del processo di trasformazione naturale
sviluppo della fase di competenza
legame del DNA trasformante alle cellule competenti
ingresso del DNA trasformante
integrazione del DNA (ricombinazione)
espressione del DNA trasformante
Sviluppo della fase di competenza
Nella maggioranza dei batteri la competenza è geneticamente regolata e si manifesta in condizioni ambientali particolari o in una fase specifica della crescita della popolazione
Nei batteri Gram negativi ogni individuo di una popolazione sviluppa la competenza indipendentemente
Nei batteri Gram positivi lo sviluppo della competenza è regolato da uno scambio di messaggi chimici (feromoni) tra le cellule di una popolazione
Batteri G negativi
Neisseria gonorrhoeaeLa competenza è costitutiva. Quasi tutte le cellule di una coltura sono competenti e non c’è nessuna relazione con la fase di crescita
Haemophilus influenzae
La competenza è indotta da condizioni che inibiscono la crescita
Batteri G positivi
Streptococcus pneumoniae
La competenza è controllata da un fattore extracellulare (ferormone) di 17 aa. Quasi tutte le cellule di una coltura in fase esponenziale diventano competenti quando il feromone raggiunge una concentrazione critica (quorum sensing).Il 100% delle cellule possono diventare competenti (per pochi minuti!).Il regulone com
Bacillus subtilis
La concentrazione critica di almeno due feromoni attiva la competenza. Si manifesta in tarda fase esponenziale o inizio di fase stazionaria. Solo il 10% dei batteri diventano competenti.
La trasformazione naturale in Streptococcus pneumoniae
Il fattore di competenza attiva la produzione di altre proteine (>12) che permettono l’adsorbimento del DNA sulla superficie batterica. I frammenti di DNA sono generalmente lunghi 15-20 Kb.
Il DNA a doppia elica viene frammentato in piccoli frammenti per azione di nucleasi
Un’elica del DNA viene degradata da una nucleasi mentre l’elica complementare entra nella cellula associata a proteine che la proteggono dalla degradazione
Può entrare DNA di qualsiasi origine ma solo quello omologo viene integrato e produrre cambiamenti ereditari nella cellula ricevente
Una cellula competente è in grado di legare fino a 1000 volte più DNA di una cellula non competente
Batterio Gram positivo
La trasformazione naturale in Haemophilus influenzae
Non vengono prodotti fattori di competenza
E’ trasformabile solo da DNA appartenente a specie correlate
Il DNA attraversa la membana esterna come doppia elica in vescicole di membrana
Il DNA trasformante deve contenere una sequenza specifica di 11 bp. Questa sequenza è ripetuta diverse centinaia di volte nel proprio genoma
Dallo spazio periplasmico entra nel citoplasma come singola elica
ingresso
DNA trasformante
cromosoma
D-loop
endonucleasi
DNA ligasi
SS-DNA
Pol III exo
RecA
La trasformazione artificiale
La maggior parte dei batteri possono essere trasformati artificialmente
Vengono utilizzati shock chimici e termici (CaCl2) o elettrici (elettroporazione)
Il DNA viene introdotto integro nella cellula
DNA lineare a doppia elica
DNA plasmidico
integrazione mediante ricombinazione omologa replicazione del plasmide
Lederberg& Tatum1946
filtro poroso
pressione o aspirazionecotone
ceppo A ceppo B
La coniugazione richiede un contatto cellula-cellula: quando le colture sono separate da un filtro poroso permeabile alle macromolecole ma non ai batteri, la ricombinazione non avviene!
Pili sessuali: presenti in numero di 1-10 per cellula, sono spessi 9-10 nm
Coniugazione
donatore ricevente
FF+
F-
ponte coniugativo
OriT
OriT
F+
F+F+
F-
Viene trasferito un filamento singolo di F. Nel ricevente viene sintetizzato il filamento complementare
Una copia del cromosoma con F rimane nella cellula donatrice dopo la replicazione della singola elica restante
Il DNA può essere divisoin 4 regioni:1. Regione tra (35 Kb)2. Regione della replicazione (inc, rep)3. Elementi trasponibili4. Regione silente
IS3
IS3
IS2
inc, reporiT
A
LE
B
CF
HG S D I
F
J
K
94 Kb
Regione tra:•Sintesi ed assemblaggio dell’F pilus (13 geni)•Mating-pair stabilization (2 geni)•Metabolismo del DNA coniugativo (5 geni)•Regolazione del trasferimento (3 geni)•Esclusione di superficie (2 geni)
donatore ricevente
Hfr F-OriT
OriT
Interruzione dell’accoppiamento
Hfr F-
Viene trasferito un filamento singolo di F insieme a una copia di parte del cromosoma del donatore. Nel ricevente viene sintetizzato il filamento complementare
Una copia del cromosoma con F integrato rimane nella cellula donatrice dopo la replicazione della singola elica restante
donatore
ricevente
Ricombinazione dopo coniugazione con Hfr
esogenote
endogenote
OriT
a
b
c
d
e 1
2
34
5
a b c d e
a
b
c
d
e
1
2
3
b c d e a
c d e a b
OriT
Modello di CampbellF
IS3
IS3
IS2
inc, reporiT
A
L
E
B
C
F
HG
S D I
F
J
K
94 Kb
Gradiente di trasferimento
La formazione di un F’produce una delezionenel cromosoma
In seguito ad incrocio:
F’ x F-
si produce un diploideparziale o merizigote
Si ottiene in seguito a un errato processo di escissione di F
Il fattore F’ e la F-duzione
Il fattore F può trovarsi nella cellula come:1. F+
2. Hfr3. F’
da un incrocio…… i riceventi……
F+ x F-
rimangono F- ma possono acquisire nuovi caratteri
Hfr x F-
diventano F+
F’ x F- diventano F’ e diploidi parziali per uno o più geni
Ricapitolando……
Salmonella:Sono stati isolati diversi plasmidi coniugativi in ceppi naturali di Salmonella sp., ma per gli studi di genetica viene utilizzato l’F di Escherichia coli
Pseudomonas:Molti plasmidi coniugativi e mobilizzabili sono stati descritti e molto studiati in ceppi di Pseudomonas. Il plasmide FP2 di P. aeruginosa può mobilizzare anche il cromosoma:
mobilizzazione unidirezionalea partire da un solo sito cromosomale
Coniugazione in altri batteri Gram negativi
1. Mediante plasmidi coniugativi simili al fattore F
(Streptomyces)
• Mediata da FEROMONI (Streptococcus)
responsabili di aggregazione cellulare
• Coniugazione traspositiva (Bacillus,
Staphilococcus,
Streptococcus)In Streptomyces coelicolor il plasmide SCP1
interagisce con il cromosoma batterico in diversi
siti.
Due differenze con F:
trasferimento bidirezionale
tutti i ricombinanti ottenuti sono fertili
Coniugazione in altri batteri Gram positivi
I plasmidi
Elementi genetici circolari, extracromosomali, capaci di replicazione autonoma (replicone)
Le dimensioni variano da 1 Kb a >1000 Kb e il loro numero varia da 1 a diverse centinaia di copie per cellula ospite
La loro informazione genetica non è essenziale per la cellula ospite ma può conferire un vantaggio selettivo in particolari condizioni
Alcuni plasmidi si mantengono stabilmente all’interno della cellula, altri hanno la capacità di diffondersi attraverso la coniugazione
Alcuni plasmidi possono esistere sia allo stato libero sia integrato nel cromosoma dell’ospite (episomi)
Plasmidi coniugativi e mobilizzabiliIS3
IS3
IS2
inc, reporiT
AL
E
BC
FHG SD I
F
J
K94 Kb
F+F-
Plasmidi coniugativi e mobilizzabili
C
M
M
M
C
M
C
Plasmidi R
Plasmidi col
Plasmidi di virulenza
Plasmidi metabolici
Codificano per enzimi capaci di distruggere o modificare gli antibiotici come ampicillina, cloramfenicolo, tetraciclina, kanamicina ecc. Alcuni plasmidi portano un’unica resistenza, altri fino a otto.Possono essere anche coniugativi e diffondersi rapidamente.
Conferiscono un vantaggio al batterio portatore nei confronti di batteri della stessa specie o specie affini.Codificano per le batteriocine (colicine, subtilisine, ecc.) capaci di permeabilizzare le membrane o degradare gli acidi nucleici.
Portatori di tossine; rendono il ceppo batterico più patogeno.Il ceppo di E. coli responsabile della “diarrea del viaggiatore” è portatore di un plasmide codificante per una enterotossina.
Codificano per enzimi capaci di degradare composti aromatici, pesticidi, zuccheri ecc. In alcuni ceppi di Rhizobium portano i geni necessari per la nodulazione nelle leguminose.
Plasmidi di virulenza e malattie
Molti batteri risultano patogeni a causa dei loro plasmidi
Il plasmide porta geni per le tossine
“ rende il batterio più capace di infettare l’ospite
“ rende il batterio più resistente alle difese dell’ospite
Ceppi enterotossici di E. coli provocano la diarrea del viaggiatore
Tossina termolabile (LT)
Tossina termostabile (ST)sono portate da plasmidi, a volte anche da un solo plasmide
I ceppi enterotossici di E. coli devono essere anche capaci di colonizzare l’intestino
Speciali fimbrie adesive sono codificate da geni di un altro plasmide
Altri batteri patogeni portano plasmidi di virulenza
Tossina tetanica di Clostridium tetaniAntratossina di Bacillus anthracis
Incompatibilità fra plasmidi
L’incompatibilità si osserva quando un plasmide entra in una cellula dove è già presente un plasmide simile.
Il nuovo plasmide non può essere mantenuto e viene perso nei successivi cicli di divisione batterica.
Il fenomeno è controllato dai geni coinvolti nella regolazione della replicazione plasmidica
Plasmidi che condividono lo stesso sistema di replicazione appartengono allo stesso gruppo di incompatibilità (Inc) e sono tra loro incompatibili
Perchè un batterio possa contenere diversi tipi di plasmidi, questi non devono essere strettamente correlati
sok
Sistema host cell killing del plasmide R1
hoc mRNA: emivita 20 min
sok mRNA: emivita < 1-2 min
128 bp
SDhok
Il sistema hok/sok di alcuni plasmidi a basso numero di copie assicura il mantenimento del plasmide all’interno di una popolazione batterica
Il sistema veleno-antidoto del plasmide F
ccdA ccdB
72 AA 101 AA
veleno (proteina stabile)interagisce con la DNA girasi
antidoto (facilmente degradabile) blocca l’attività di CcdB
Modalità si scambio genetico fra batteri mediato da un virus
Trasduzione
Trasduzione generalizzata Trasduzione specializzataQualsiasi marcatore genetico può essere trasferito da un donatore a un ricevente
Solo marcatori specifici possono essere trasferiti
P22, P1 per Gram(-)
PBS1 per Gram (+)
per E. coli
SP per B. subtilis
Anche se non tutti i fagi trasducono e non tutti i batteri possono essere trasdotti, il fenomeno è sufficientemente diffuso da far supporre che svolga un ruolo importante nel trasferimento genico in natura
filtro poroso
S.typhimurium infettato da P22
Lederberg e Zinder1951
testa
collare
coda
guaina elicoidale
piastra basale
fibre caudali
Batteriofagi virulenti
ciclo litico
Batteriofagi temperati
ciclo litico ciclo lisogenico
induzioneprofago
DNA batterico
DNA virale
Il processo di infezione virale
I fagi capaci di dare trasduzione generalizzata devono possedere un meccanismo di impacchettamento del DNA che permetta il riconoscimento accidentale del DNA dell’ospite
Trasduzione generalizzata
Il fago trasducente (1/103 della popolazione virale) può infettare un altro batterio ma non iniziare un normale ciclo di infezione in quanto il DNA virale è assente (particella difettiva)
x xa+
a-
fago trasducente
La quantità di DNA batterico trasportata dipende dalle dimensioni del capside. Il fago P1 di E. coli trasporta 99 Kb (2% del cromosoma batterico)
Nuovi alleli, o anche nuovi geni, possono essere integrati nel cromosoma ospite. Dal 70 al 90% del DNA trasdotto non viene integrato, ma può esprimersi per un numero limitato di generazioni, dando dei diploidi parziali (trasduzione abortiva)
attP
attB
Trasduzione specializzata
Escissione corretta
Escissione errata (evento raro). Si genera una particella trasducente per il gene gal. Il fago è difettivo
dgal
Lisato a bassa frequenza di trasduzione (lisato LFT)
Trasduzione per ricombinazione
Hanno un sito di integrazione ibrido, non funzionale
Le particelle trasducenti difettive possono aver perso alcuni geni essenziali per la propria riproduzione
Trasduttanti stabili possono derivare dalla ricombinazione tra il cromosoma del fago e quello del batterio in seguito a due crossing-over su entrambi i lati del sito gal
Trasduzione in un batterio lisogeno
I fagi dgal possono integrarsi in un batterio lisogeno in quanto il sito att ibrido è identico a quelli generati dal profago
Il fago normale fornisce anche i geni persi dal fago difettivo e viene chiamato fago helper, perché aiuta il fago difettivo a integrarsi e riprodursi
I trasduttanti sono instabili perché il profago può essere indotto all’escissione
Lisato ad alta frequenza di trasduzione (lisato HFT)
Caratteristiche comuni ai tre meccanismi di trasferimento genico
1. Solo una porzione del cromosoma è trasferita
2. Il trasferimento è sempre polarizzato DONATORE RICEVENTE
3. Il prodotto del trasferimento non è un vero zigote: per questo viene chiamato MERIZIGOTE
4. Il DNA trasferito (ESOGENOTE) può essere trasmesso alla progenie solo se viene incorporato nel genoma della cellula ricevente (ENDOGENOTE) CASO PARTICOLARE: trasferimento di un replicone (PLASMIDE)
I processi di trasferimento genico hanno un ruolo importante nella variabilità genetica delle popolazioni
batteriche in quanto assicurano la diffusione di materiale genetico e quindi l’acquisizione di nuovi caratteri
