1

Pràctica 1: EXPRESSIÓ DEL CDNA DE LA MALAT DESHIDROGENASA CITOSÒLICA DE PORC EN E. coli. - Introducció: En aquesta pràctica el que es pretén és quantificar (absorbància a 280 nm) i valorar de forma qualitativa (electroforesi) quina es la diferència en la expressió de la malat deshidrogenasa en dos soques d’E. Coli que es diferencien pel fet que una només expressa els seus propis nivells i l’altra la sobreexpressa d’un vector. - Materials i Mètodes: L’única variació que hem fet sobre el que està especificat el guió és que la dilució final de la cubeta a la qual hem determinat l’absorbància 280/260 no ha estat 1/500 sinó 1/20. En la electroforesi ens vam oblidar de escalfar les mostres i les bandes del gel no es van separar suficientment, amb la qual cosa hem emprat el gel del grup anterior. - Resultats:

Mostra Absorbància 260 Absorbància 280 Abs280/Abs260 F Sobreexpressió MDH 0,788 0,650 0,825 0,632 Sobreexpressió MDH 0,819 0,672 0,821 0,632

Control 0,776 0,623 0,803 0,607 Determinació de la concentració de proteïna pel mètode de Warburg-Christian

280Pr ( / ) . .

exp ( / ) 0,650.0,632.20 8, 216 /exp ( / ) 0,672.0,632.20 8, 494 /

( / ) 0,623.0,607.20 7,563 /

nmoteïna mg ml DO F Dilució

Sobre MDH mg ml mg ml

Sobre MDH mg ml mg ml

Control MDH mg ml mg ml

== == =

= =

2

Mostra Abs Inicial Abs Final Activitat (pendent) Linealitat MDH 1 0,834 0,577 -0,387 99,8% MDH 1 0,902 0,761 -0,211 100% MDH 2 0,832 0,588 -0,366 99,8% MDH 2 0,900 0,755 -0,217 100% Control 0,949 0,871 -0,118 100% Control 0,941 0,865 -0,113 100%

( )

( )

( )

340

1 51 1

1 51 1

1 51 1

1.

.

10,387 min . 6, 22.10 / min 1

6220 .1

10, 211min . 3,39.10 / min 1

6220 .1

10,366 min . 5,88.10 / min 2

6220 .1

nm

NADH

Absv

t E l

v M MDHM cm cm

v M MDHM cm cm

v M MDHM cm cm

v

− −− −

− −− −

− −− −

� �∆= − � �∆ � �

� �= − − =� �� �

� �= − − =� �� �

� �= − − =� �� �

= − ( )

( )

( )

1 51 1

1 51 1

1 51 1

10, 217 min . 3, 49.10 / min 2

6220 .1

10,118min . 1,90.10 / min

6220 .1

10,113min . 1,82.10 / min

6220 .1

M MDHM cm cm

v M ControlM cm cm

v M ControlM cm cm

− −− −

− −− −

− −− −

� �− =� �� �

� �= − − =� �� �

� �= − − =� �� �

Tanmateix, cal tenir en compte que a l’hora de donar les activitats en Unitats Internacionals i en Katals del cultiu s’ha dissolt 100 vegades en el cas del cultiu que sobreexpressa l’enzim i 10 en l’altre que no ho fa.

6

3

6

10 1.. .

min min . min . 1. 101. 1min

. .min 6010

M IU mols mols mols lv

ml ml l mol mlmols mol

Katalsegmols

µ µ

µµ

� � � ��� � � �

� � � �

=

Mostra Velocitat (M/min) IU/ml (�mols/ml.min) �kat/ml (�mols/ml.seg) Act. Esp. (IU/mg prot) MDH 1 6,22.10-5 6,22 0,104 0,757 MDH 1 3,39.10-5 3,39 0,056 0,413 MDH 2 5,88.10-5 5,88 0,098 0,693 MDH 2 3,49.10-5 3,49 0,058 0,411 Control 1,90.10-5 0,19 0,003 0,0251 Control 1,82.10-5 0,18 0,003 0,0240 Activitat específica mitja dels cultius que sobreexpressen la MDH 0,568 IU/mg Activitat específica mitja dels cultius que no sobreexpressen la MDH 0,245 IU/mg

3

exp 0,568 IU/mgexp 23,02

exp 0,245 IU/mgAct esp Sobre ressió MDH

Grau Sobre ressióAct esp sense Sobre ressió MDH

= = =

La relació entre les dos activitats específiques ens indica que la sobreexpressió de la malat deshidrogenasa en els cultius que han estat transformats amb el vector és de mitjana 23 vegades superior a la expressió que tenen els bacteris en condicions normals.

Interpolació de la banda suposadament de malat deshidrogenasa amb una Rf de 0,46 en el diagrama de Ferguson ens dóna un pes aproximat de 29 KDa.

Diagrama de Ferguson y = 0,9993x + 1,1223R2 = 0,9821

00,5

11,5

22,5

3

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6

-log(Rf)

log(

PM

)

Marcador MDH

4

- Conclusió i Discussió: En l’anàlisi quantitatiu fet a través de la mesura de l’activitat en els diferents cultius hem pogut comprovar com n’és d’elevat el grau de sobreexpressió dels cultius transformats, en concret 23 vegades superior, respecte als que no han incorporat el vector d’expressió. En l’anàlisi qualitatiu fet a través de l’electroforesi amb SDS en gel de poliacrilamida, podem veure com en els carrils on hem carregat l’extracte proteic dels bacteris que sobreexpressaven la malat deshidrogenasa la banda corresponent a aquest enzim esta molt més marcada que la resta d’extractes control. Podem comprovar que es tracta efectivament de la banda corresponent a la malat deshidrogenasa perquè si interpolem el seu Rf en el diagrama de Ferguson corresponent a les bandes de pes molecular conegut del marcador, obtenim que el pes molecular experimental de la banda més destacada és d’aproximadament 29 KDa. Si busquem a la bibliografia el pes de la malat deshidrogenasa veiem que és aproximadament de 70 KDa i que es tracta d’un homodímer, la qual cosa ens confirma que la nostra banda en el gel és efectivament el que buscàvem però que per l’acció de la temperatura i el detergent (SDS) s’han dissociat els dos monòmers d’un pes aproximat de 30-35 KDa tal i com ens indica el diagrama de Ferguson. Cal destacar que la banda inferior que apareix en totes les mostres carregades es tracta de la DNasa i el lisozim emprat per fer la degradació del DNA i de la paret bacteriana en el procés d’extracció i obtenció de les proteïnes, tal i com vam poder comprovar en fer-les córrer en carrils individuals cadascuna d’elles en el nostre propi gel. - Bibliografia: http://www.worthington-biochem.com/MDH/default.html http://www.pdb.org

5

Pràctica 2: ELECTROFORESI EN GELS DE POLIACRILAMIDA DELS ISOENZIMS DE LA LACTAT DESHIDROGENASA. - Introducció: En aquesta pràctica el que ens proposem és separar per electroforesi els diferents isoenzims de la lactat deshidrogenasa ja que aquest en estar format per quatre monòmers que poden ser de dos tipus diferents M i H que es diferencien per la seva distribució en l’organisme i en el seu punt isoelèctric, i que per combinatòria donen lloc a cinc isoenzims també separables. - Materials i Mètodes: S’ha seguit el que està especificat en el guió de pràctiques. - Resultats:

Reconstitució enzim Temps (minuts) Sense congelar Activitat (IU/ml) 0 5 10 15 20 25 Control 1 Control 2

M4 848,3249 1096,456 1103,956 1457,652 1485,518 1399,219 1427,119 1225,054 M4 - H4 1080,389 1963,547 1661,817 1734,183 1833,315 1979,614 1973,180 1737,383

H4 240,0976 1117,355 1257,754 1501,052 1429,786 1692,916 1890,648 1941,047 Activitat (�kat/ml)

M4 14,13875 18,27426 18,39926 24,29420 24,75864 23,32032 23,78532 20,41757 M4 - H4 18,00649 32,72578 27,69695 28,90304 30,55525 32,99356 32,88634 28,95638

H4 4,001627 18,62259 20,96257 25,01753 23,82976 28,21527 31,51080 32,35079 % de recuperació de l’Activitat (Isoenzim)

M4 63,97252 82,68337 83,24914 100 100 100 M4 - H4 58,23224 105,8348 89,57250 93,47198 98,81571 100

H4 12,53147 58,32168 65,65035 78,34965 74,62937 88,36364

Les activitats han estat multiplicades pel factor de dilució que és de 33.333 ja que les dissolucions fetes eren de 15/1000 i 5/2500.

Recuperació Enzimàtica

0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 15 20 25 30

Temps (min)

% R

ecup

erac

ió A

ct

M4

M4H4

H4

6

Càlcul del punt isoelèctric i la càrrega de cadascuna de les dos formes de l’enzim

LDH-H (LDHB_BOVIN) (-6,5) Ala (A) 19 Gly (G) 24 Pro (P) 11 Arg (R) 9 (+) His (H) 7 (0) Ser (S) 26 Asn (N) 17 Ile (I) 25 Thr (T) 14 Asp (D) 17 (-) Leu (L) 36 Trp (W) 6 Cys (C) 5 (-1/2) Lys (K) 26 (+) Tyr (Y) 7 Gln (Q) 11 Met (M) 10 Val (V) 37 Glu (E) 22 (-) Phe (F) 5 pI=6,20

LDH-M (LDHA_RABIT) (-0,5)

Ala (A) 21 Gly (G) 26 Pro (P) 10 Arg (R) 10 (+) His (H) 11 (0) Ser (S) 24 Asn (N) 13 Ile (I) 21 Thr (T) 13 Asp (D) 17 (-) Leu (L) 38 Trp (W) 6 Cys (C) 5 (-1/2) Lys (K) 27 (+) Tyr (Y) 7 Gln (Q) 12 Met (M) 10 Val (V) 36 Glu (E) 18 (-) Phe (F) 7 pI=8,17

7

- Conclusions i Discussió: En primer lloc, podem observar com en congelar les diferents mostres d’enzim obtenim una progressiva recuperació de l’activitat d’aquests al llarg del temps respecte de l’activitat de les mostres inicials que no hem congelat. La mostra congelada que només conté la lactat deshidrogenasa de múscul és la que recupera la més i més ràpidament la seva activitat, la mostra que només conté l’isoenzim de cor per contra és la que recupera menys i de forma més lenta la seva activitat, i així doncs la recuperació final i velocitat de recuperació de la mostra que conté una barreja d’aquests també és intermèdia. Teòricament, aquesta recuperació de l’activitat no és mai del 100% per molt que s’esperi; tan mateix, en el nostre cas potser per la imprecisió i l’error que hi ha en mostres d’enzim tant petites com les que hem fet servir per determinar l’activitat de les mostres control ha fet que menystinguéssim aquest valor, fent que després de la congelació de les mostres es dóna una fictícia recuperació de l’activitat del prop del 100% o més. Aquest fet és fruit de que en congelar juntament amb agents caòtrops com l’hidroclorur de guanidini, el iodur o la urea; aquests tendeixen a trencar els ponts d’hidrogen que forma l’aigua amb si mateixa i els propis de la proteïna. A baixes concentracions d’aquests només s’aconsegueix que se separin els monòmers que formen aquest tetràmer, però tan mateix si afegíssim més quantitat d’aquests agents aconseguiríem desnaturalitzar la proteïna. El fet que no es muntin totes les unitats enzimàtiques funcionals possibles fa que disminueixi la quantitat d’enzim efectiu i no es recuperi del tot l’activitat. Les mostres d’aquest enzim tetramèric tractades lleugerament amb aquests agents es dissocien en els seus monòmers, donant lloc a que es formin les cinc isoformes de l’enzim en renaturalitzar-lo de nou a temperatura ambient en presencia de les dos formes enzimàtiques. En el cas de les mostres no congelades obtenim les bandes inicials corresponents a les formes de l’enzim que hi hem posat, encara que podem observar que la H4 està una mica contaminada per MH3 tal i com ens indica el carril d’aquesta sola, amb una parell de bandes. En el cas de les congelades, tal i com hem comentat anteriorment, es formen totes les isoformes de l’enzim sempre i quan tinguem les dos formes M i H a la mostra. Pel que fa a l’anàlisi de les mostres fet en el gel d’electroforesi de poliacrilamida a pH de 8,3, aquest ens mostra que les mostres se separen pel seu punt isoelèctric. En el cas de la LDH-M que té un punt isoelèctric (pI=8,17) molt proper al pH del tampó d’equilibrat, tot i continuar movent-se cap al càtode (pol positiu) perquè igual que la LDH-H (pI=6,20) té càrrega negativa, aquest serà l’isoenzim que es mourà menys. Per aquest motiu els complexos tetramèrics que continguin més LDH-M seran els que es mouran menys; essent el M4 el que es mou menys i per tant està més amunt en el gel i el MH3 el que es mou més després del H4.

8

El revelat del gel el fem a través de la pròpia activitat de l’enzim que per la naturalesa de la pròpia electroforesi, és a dir, sense SDS; no ha estat desnaturalitzat. La revelació consisteix en afegir uns dissolució reveladora que el que fa és aportar lactat que serà oxidat a través de la reducció del poder reductor oxidat

(NAD+) que també li aportem. Finalment visualitzem aquesta reacció pel fet que també hi ha en la dissolució reveladora l’NTB (clorur de p-nitroblue tetrazolium) que és una sal que es torna de color blau en medi reductor, tot indicant-nos on se situen les bandes d’aquest enzim en el gel.

Les proporcions de les 5 isoformes de l’enzim s’ajusten a una proporció binominal pel fet que només hi ha dos possibles subunitats de les quals es pot constituir el holoenzim final. Així doncs podem obtenir la probabilitat de formació de cadascuns de les formes a través de sumar la probabilitat de formació de cadascuna de les possibles formes o un diagrama d’arbre tal com el que es mostra a continuació:

M M4 M4 1 M H M3H M M3H

M H

H M2H2 M M3H

M3H 4

M H M2H2 M M2H2

M

H H

H MH3 M M3H M H M2H2 M M2H2

M2H2 6

M H

H MH3 M M2H2 M H MH3 M MH3

MH3 4 H

H H

H H4 H4 1 - Bibliografia: http://www.expasy.ch/cgi-bin/protparam http://www.expasy.org/sprot/ http://www.pdb.org

9

Pràctica 3: CARACTERITZACIÓ DEL TIPUS D’INHIBICIÓ DE LA CATÀLISI ENZIMÀTICA PER INHIBIDORS REVERSIBLES. AVALUACIÓ DE LA Ki DEL SIST. PIRUVAT-NADH-LACTAT DESHIDROGENASA PER OXALAT. CÀLCUL DE LA IC50. - Introducció: En aquesta pràctica el que pretenem és esbrinar quin tipus d’inhibició reversible provoca la presència del oxalat en reducció del piruvat a lactat a través de l’enzim piruavat-NADH-lactat deshidrogenasa. Així com també totes les constants del sistema com són Km, Vmax i Ki - Materials i Mètodes: S’ha seguit el que està especificat en el guió de pràctiques. - Resultats: Elecció de la dilució d’enzim mínima que ens dóna una activitat lineal:

Dilució del enzim Abs inicial Abs Final �Abs Activitat Linealitat IU/ml �kat/ml

0,239 0,135 -0,104 -0,102 49,10% 167,202 2,787 1/10.000

0,213 0,098 -0,115 -0,115 50,30% 184,887 3,081 0,438 0,11 -0,328 -0,5 95,70% 1054,662 17,578

1/20.000 0,475 0,122 -0,354 -0,591 97,30% 1138,264 18,971 0,606 0,417 -0,19 -0,282 100% 1527,331 25,455

1/50.000 0,585 0,403 -0,182 -0,273 100% 1463,022 24,384 0,631 0,581 -0,051 -0,067 96,90% 819,936 13,665

1/100.000 0,645 0,563 -0,083 -0,124 100% 1334,405 22,240 0,662 0,631 -0,031 -0,046 99,70% 1245,981 20,766

1/250.000 0,664 0,632 -0,032 -0,046 99,20% 1286,174 21,436

A través de l’ajust amb el programa GRAFIT de tots els punts obtinguts de la inhibició de la reacció a diferents concentracions d’inhibidor emprades a un model d’inhibició reversible acompetitiva obtenim:

[ ][ ]1 1 1

1max max '

IKmv V S V Ki

� �= + +� �

� �

Variable Valor Error estàndar

Vm 0,39910 µM/min 0,0250 Km 47,4967 µM 3,9183 Ki’ 28,9006 µM 2,4572

En les representacions de Lineweaver Burk podem obtenir la velocitat màxima a través de fer la inversa del punt de tall en l’eix de les ordenades de la recta sense inhibidor (Vm=1/2,7118=0,369µM/min). La constant de Michaelis la obtenim també de la intersecció d’aquesta mateixa recta amb l’eix de les abscisses a través de la inversa i el canvi de signe (Km=-1/-0,024=41,36µM).

10

Si repetim la mateixa operació per les altres rectes fetes amb inhibidor obtindrem les velocitats màximes i constants de Michaelis aparents, que pel nostre cas no tenen gaire interès.

Lineweaver Burk

-5

0

5

10

15

20

-0,1 -0,08 -0,06 -0,04 -0,02 0 0,02 0,04 0,06 0,08

1/[S](�M)

1/v

I=0 �M I=50 �M I=100 �M I=150 �M

Si fem la representacions secundaries a través de representar totes les interseccions amb l’eix de les ordenades enfront de la concentració d’inhibidor de cada recta, en mirar el punt de tall en l’eix de les ordenades obtenim la Ki’ canviada de signe.

Representació secundària

-2

0

2

4

6

8

10

-100 -50 0 50 100 150 200

[I](�M)

Inte

rsec

ció

[ ] [ ]( )[ ]

[ ] [ ]( )[ ]

[ ][ ]

50

50

'

47,5 28,9 1372,75 28,9

Km S KiAcompetitiu IC

S

S SAcompetitiu IC

S S

+=

+ += =

- Conclusions i Discussió: L’oxalat és un inhibidor acompetitiu de l’enzim quan tenim piruvat tal com hem demostrat en ajustat el seu comportament a les formules teòriques per a aquest tipus d’inhibició. Aquest fet també es pot deduir del fet que l’oxalat és estructuralment més similar al lactat que no al piruvat fent que tal i com hem plantejat la reacció a la cubeta no es doni una inhibició competitiva per competència amb el substrat sinó acompetitiva.

11

Pràctica 4: EXPRESSIÓ RECOMBINANT I PURIFICACIÓ CROMATOGRÀFI-CA DE LA PROTEÏNA VERDA FLUORESCENT (GFP). - Introducció: En aquesta pràctica el que pretenem és en primer lloc aïllar de tots els bacteris transformats amb la llibreria gènica de la medusa (Aequorea victoria) quins expressen la proteïna verda fluorescent (GFP) a través d’il·luminar-los amb llum ultraviolada. Un cop trobades les colònies que l’expressen aïllar-ne una per tal d’obtenir un cultiu que sobreexpressi aquesta proteïna d’interès nostra per a posteriorment aïllar-la per mètodes cromatogràfics. - Materials i Mètodes: S’ha seguit el que està especificat en el guió de pràctiques.

- Resultats: Després de realitzar la cromatografia en una columna d’interacció hidrofòbica, ens quedem amb el tub que tingui major fluorescència que en el nostre cas és el tub 5. A través de la interpolació en el diagrama de Ferguson de l’Rf (0,5437) de la banda més marcada que veiem en la electroforesi SDS-PAGE, ens dóna un pes experimental de la GFP de 24,6 KDa.

Diagrama de Ferguson y = 0,9993x + 1,1223R2 = 0,9821

00,5

11,5

22,5

3

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6

-log(Rf)

log(

PM

)

Marcador GFP

12

- Conclusió i Discussió: Podem veure qualitativament com n’ha estat d’efectiva la purificació d’un sol pas que hem realitzat amb la columna d’interacció hidrofòbica ja que moltes de les bandes més tènues que apareixen en l’extracte proteic cru del cultiu que sobreexpressa la GFP sense purificar desapareixen en aquest pas. També podem veure com de diferent i alterada està l’expressió de proteïnes en la mostra control d’un cultiu d’E. coli que no expressa la GFP i si la sobreexpressa. Si comparem el nostre resultat obtingut en el càlcul del pes molecular de la GFP experimental (24,6 KDa) amb el pes teòric que trobem a la bibliografia per la GFP (26,2 KDa) podem considerar que efectivament la banda que observem al mig és la nostra proteïna d’interès. Les altres bandes que apareixen en el carril que hi ha la GFP purificada són les corresponents a lisozim i DNasa tal i com hem demostrat a la pràctica 1, i que són més difícils d’eliminar per la columna pel fet que es troben en gran quantitat en haver-les emprat per preparar l’extracte del cultiu. - Bibliografia: http://www.expasy.org/uniprot/Q9MZ06

13

Pràctica 5: DETERMINACIÓ DEL GRUP SANGUÍNI HUMÀ (RHESUS) PER AMPLIFICACIÓ I ANÀLISI DEL DNA. - Introducció: En aquesta pràctica el que volem és determinar el Rh de la sang no pas a partir d’una mostra de sang sinó ampliant el gen que es troba en el DNA i que codifica per la proteïna que llavors s’expressa en la sang. Aquest procés es duu a terme a través d’una PCR que amplia de forma selectiva el tall del genoma que ens interessa a partir dels primers estratègicament seleccionats. - Materials i Mètodes: S’ha seguit el que està especificat en el guió de pràctiques. - Resultats:

Banda Teòrica

Pes Teòric

Pes Experimental

Gen CcEe 1200 bp 1255,524 bp Gen D 600 bp 303,1937 bp Híbrid 900 bp 858,2247 bp

Diagrama de Ferguson y = -2,2138x + 4,0291R2 = 0,9595

00,5

11,5

22,5

33,5

4

0 0,2 0,4 0,6 0,8

-log(Rf)

log(

PM

)

Gen CcEe Marcador Gen D Hibrid

- Conclusions i Discussió: És la presència del gen D el que ens diu si el Rh és + o -, tal i com es pot comprovar el control de Rh- només presenta la banda en el gen CcEe, en canvi el control de Rh+ i tota la resta de mostres presenten els dos gens. La banda més difusa que veiem al mig correspon a un pes molecular de 900 bp que és justament el mig entre els dos gens i que per tant ens diu que es tracta del producte de la hibridació de cadenes de DNA que provenen de cadascun dels dos gens. En la interpolació dels Rf corresponents a cada banda podem confirmar que efectivament són el que ens pensem. En el gen D la desviació respecte el valor experimental obtingut és molt forta pel fet que el seu Rf està fora de la recta patró feta.