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Laboratório de Desenvolvimentode Processos Biotecnológicos
Aluno: Leandro Junqueira Benedini Orientadora: Profa Dra. Maria Helena Andrade Santana
Influência de Peptonas Vegetais no Cultivo de Streptococcus zooepidemicus para a
Produção de Ácido Hialurônico
Defesa de dissertação de mestrado
Área de concentração: Desenvolvimento de Processos BiotecnológicosÁrea de concentração: Desenvolvimento de Processos Biotecnológicos
Sumário
Introdução
Artigo 1: Influência de Peptonas Vegetais Sobre a Produção Microbiana e Pureza do Ácido Hialurônico.
Artigo 2: Efeitos da Peptona de Soja sobre Preparação de Placas Petri e Produção de Ácido Hialurônico.
Ácido HialurônicoÁcido Hialurônico
- Face hidrofóbicaH
Ácidos D-Glicurônico e N-acetilglicosamina
Estrutura altamente hidratada
Moléculas pequenas difundem no domínio aquoso
Moléculas grandes são excluídas
Propriedades Físico-Químicas
Propriedades viscoelásticas
Fonte Massa molar (Da)
Fluido sinovial 1,0 - 8,0 × 106
Cordão umbilical 3,6 - 4,5 × 106
Crista de galo 12 - 14 × 106
Humor vítreo bovino 0,38-2,08 × 106
(Adam e Ghosh, 2001; Iqbal et al., 1997.)
(Kogan et al., 2007 e Pires, 2009)
Ácido HialurônicoÁcido HialurônicoFontes de obtenção
Azari et. Al (2011),
Ácido HialurônicoÁcido HialurônicoAplicações
Oftalmologia;
Ortopedia;
Proteses;
Cura de feridas;
Dermatologia.
Liberação controlada de fármacos
Complexo processo de purificação
Riscos de infecções virais Riscos de reações alérgicas
Recursos animais
Ácido HialurônicoÁcido HialurônicoOs recursos animais e microbianos
Produção microbiana Início em 1980 Microorganismos do gênero Streptococcus Mesma estrutura química Massa molar: 2,4-3,4 × 106 Da Melhor qualidade do produto
Microorganismos gram-positivos e anaeróbicos
Bactérias láticas nutricionalmente fastidiosas
Requerem meio de cultivo rico para crescimento
Produção de AHAH sintasesCápsula de proteçãoOcultação de sistemas
imunológicos
Streptococcus Streptococcus zooepidemicuszooepidemicus
Chong et. al (2005)
HAS,hyaluronate synthase; NOX, NADH oxidase; LDH, lactate dehydrogenase; PFL,pyruvate formate lyase; PDH, pyruvate dehydrogenase; ADH, alcohol dehydrogenase; AK, acetate kinase
Caminhos metabólicos deStreptococcus zooepidemicus: De
glicose a AH
(a) Metabolismos homolático e (b) misto
(a)
(b)
BiopolímeroExtracelular
Condições operacionaisCondições operacionaispH
Entre 6,5 e 7,5 (Akasaka, 1998)Choques de pH: Maior produção de
células e AH (Pires, 2009)
AeraçãoMaior crescimento (Chong e Nielsen,
2003)AH com maior massa molar (Akasaka et
al., 1989)Maior concentração de AH (Chong &
Nielsen, 2003)
c
AgitaçãoRelação com
transferência de oxigênioTensão mecânica: Danos à
cadeia polimérica
c
Fontes de energiaFontes de energiaFontes de carbono
Produção dependente de AH (Pires, 2009)Maior produção de AH (1,21 g.L-1) em cultivo
com 25 g.L-1 glicose (Pires, 2009)
Fontes de nitrogênioHidrolisados de caseína, aminoácidos, peptonas
e extrato de leveduras (Batistote, 2006 e Pires, 2009)
Responsáveis por crescimento microbiano e produção de metabólitos de interesse
Preparação de inóculosPreparação de inóculos
Adição de células
Inó
culo
líqu
ido
, 12 h
Inó
culo
líqu
ido
, 12 h
I II
III
Streptococcus equi subsp. zooepidemicus ATCC 39920,.
Remoção de células
Componentes das placas Petri: BHI (Brain Heart Infusion) Sangue de carneiro
Fermentações em bateladaFermentações em batelada
- Fontes de carbono
- Fontes de nitrogênio
- Controle de pH
- Alimentação de oxigênio
- Maior turbulência
-Fontes de carbono
- Fontes de nitrogênio
- Sem controle de pH
- Sem alimentação de oxigênio
- Menor turbulência
Recuperação de Ácido Recuperação de Ácido HialurônicoHialurônico
Extrato de leveduras (EL)Fonte microbianaGrande quantidade de
aminoácidos essenciaisMeio com muitas
proteínas
Peptonas vegetais (PVs)Fonte vegetalQuantidade relevante de
aminoácidos essenciaisMuitos peptídeos
As impurezas no AH recuperadoAs impurezas no AH recuperado
Fonte: Organotechnie
Table 1 – Total and free amino acids contents in soy (SP) wheat (WP) and potato (PP) peptones. Data from the manufacturer Organotechnie (France). Pg 34.
Table 1 – Total and free amino acids contents in soy (SP) wheat (WP) and potato (PP) peptones. Data from the manufacturer Organotechnie (France). Pg 34.
Substituição de extrat0 de leveduras por PVs em fermentaçõesProdução de AHProteínas ou peptídeosassociados
Substitução de BHI e sangue de carneiro por PS em placas Petri.Adaptação celularProdução de AH
Objetivos:Objetivos:
Artigo 1
Influência de Peptonas Vegetais Sobre a Produção Microbiana e Pureza do Ácido Hialurônico.
ObjetivosSubstituição de extrato de leveduras por
peptonas vegetaisPeptona de soja (SP)Peptona de batata (PP)Peptona de trigo (WP)Mistura de PVs (MPV)
Quantificação de proteínas ou peptídeos retidos em AH produzido
Estudo cinético de fermentações.
Procedimento experimentalQuantificação de nitrogênio e glicose nas peptonas:
Método de KjeldahlKit de determinação de glicose Laborlab.
Table 2 - Total nitrogen (TN), total protein and peptides (TPP) and glucose (G) in the vegetable peptones and in the yeast extract in the fermentation media at the starting of the fermentations
Table 2 - Total nitrogen (TN), total protein and peptides (TPP) and glucose (G) in the vegetable peptones and in the yeast extract in the fermentation media at the starting of the fermentations
Métodos e AnálisesCrescimento celular
Método gravimétrico
Purificação de AHPrecipitação com
etanolRessuspensão em
NaCl
Quantificação de AHMétodo do carbazol
modificado
Quantificação de proteínas ou petídeosMétodo de Lowry
Ácidos orgânicosHPLC
Massa molarHPLC
Table 3 - Performance of the vegetable peptones and yeast extract on the production of HA from Streptococcus zooepidemicus (ATCC 39920) during 24h fermentation and its purity after three precipitations with ethanol.
Table 3 - Performance of the vegetable peptones and yeast extract on the production of HA from Streptococcus zooepidemicus (ATCC 39920) during 24h fermentation and its purity after three precipitations with ethanol.
HA – Hyaluronic acid; YP/X - HA production per cell growth; YP/S - HA production per glucose consumption; YX/S - Cell growth per glucose consumption; YLactate/S - Lactate production per glucose consumption; YAcetate/S - Acetate production per glucose consumption; FE – Free essential amino acids; TE – Total essential amino acids; TPP - Total proteins and peptides; MW – Average molecular weight.
Figure 1 – Kinetic profiles of (a) cell growth (b) nitrogen (c) glucose (d) HA concentration (e) HA molar weight and (f) lactate concentration along cultivations of Streptococcus zooepidemicus in SP (♦) and WP (■) media.
Figure 1 – Kinetic profiles of (a) cell growth (b) nitrogen (c) glucose (d) HA concentration (e) HA molar weight and (f) lactate concentration along cultivations of Streptococcus zooepidemicus in SP (♦) and WP (■) media.
ConclusõesSP é a peptona vegetal mais promissora
Fermentação com SP: 0,28 g.L-1 de AHFermentação com YE: 0,21 g.L-1 de AH
Fermentações com SP produzem AH com menor quantidade de proteínas e peptídeos (TPP) e com mesma massa molarFermentação com SP: 1,4 g.g-1
Fermentação com YE: 4,1 g.g-1
Tempo recomendável para fermentação: 5 horas.
Artigo 2
Efeitos da Peptona de Soja sobre Preparação de Placas Petri e Produção de
Ácido Hialurônico.
Objetivos
Utilização de SP em placas Petri
Definição de composição mais apropriada.
Validação com fermentações
Procedimento experimentalPreparação de placas Petri
BHI e sangue de carneiroSP e sangue de carneiroSP
Meios de cultivo SP e glicoseRelação glicose/N = 7.8
Métodos e AnálisesCrescimento celular
Método gravimétrico
Purificação de AHPrecipitação com
etanolRessuspensão em
NaCl
Quantificação de AHMétodo do carbazol
modificado
Ácidos orgânicosHPLC
Massa molarHPLC
Table 1 - Performance of the fermentations with substitutions of the animal nutrient sources, Brain Heart Infusion and sheep blood, by soy protein in the first seed culture medium Streptococus zooepidemicus (ATCC 39920) in Petri plates.
Table 1 - Performance of the fermentations with substitutions of the animal nutrient sources, Brain Heart Infusion and sheep blood, by soy protein in the first seed culture medium Streptococus zooepidemicus (ATCC 39920) in Petri plates.
Conclusões
A substituição de sangue de carneiro e BHI por SP em inóculos sólidos levou a produção similar de AHSem substituição: 0,29 g.L-1
Com substituição: 0,30 g.L-1
A utilização de SP em inóculos sólidos levou a produção de AH com massas molares semelhantes
SugestõesPlanejamento experimental para estimativa da
ótima relação C6H12O6/N.
Planejamento experimental em reatores, para estimar a ótima rotação e vazão de alimentação de oxigênio do fermentador.
Utilização de peptona de soja em fermentações com choque ácido.
Desenvolvimento de novos métodos para purificação do AH.
Bibliografia ARMSTRONG, D.C. The molecular weight properties of hyaluronic acid produced Streptococcus
zooepidemicus. Queensland: University of Queensland, 1997. (PhD. Thesis).
BLANK, L.M., MCLAUGHLIN, R.L., NIELSEN, L.K. Stable production of hyaluronic acid in Streptococcus zooepidemicus chemostats operated at high dilution rate. Biotechnol. Bioeng., v.90
CHONG, B.F.; BLANK, L.M.; MCLAUGHLIN, R.; NIELSEN, L.K. Microbial hyaluronic acid production. Appl. Microbiol. Biotechnol., v.66, n.4, p.341-351, 2005.
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IZAWA, N.; HANAMIZU, T.; SONE, T.; CHIBA, K. (2010) Effects of fermentation conditions and soybean
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PIRES, A., MACEDO, A.C., EGUCHI, S.Y., SANTANA, M.H.A. Microbial production of hyaluronic acid from
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