Embed Size (px)
Citation preview
Laboratorniacute diagnostika autoprotilaacutetek u tyreopatiiacute
Jan Martinek
Odděleniacute Imunologie a alergologie
Zdravotniacute uacutestav Ostrava
Autoimunitniacute onemocněniacute štiacutetneacute žlaacutezy - Uacutevod
bull Autoimunitniacute onemocněniacute štiacutetneacute žlaacutezy (AITD) je důsledek poškozeniacute buněk štiacutetneacute žlaacutezy humoraacutelniacutem a předevšiacutem buněčnyacutem mechanismem
bull Poškozeniacute buněk nastaacutevaacute tehdy když se autoreaktivniacute T-lymfocyty anebo autoprotilaacutetky vaacutežiacute na membraacuteny tyreoidaacutelniacutech buněk a tiacutem je započat imunopatologickyacute proces
bull U AITD se uplatňujiacute tři hlavniacute tyreoidaacutelniacute autoantigeny - tyreoperoxidaacuteza (TPO) tyreoglobulin (Tg) a TSH receptor
Gravesova-Basedovaacute nemoc
bull Gravesova nemoc (GD) je autoimunitniacute onemocněniacute zprostředkovaneacute autoprotilaacutetkami a charakterizovaneacute tyreotoxikoacutezou strumou a orbitopatiiacute
bull Cirkulujiacuteciacutemi autoprotilaacutetky napodobujiacute působeniacute TSH vaacutežou se a aktivujiacute TSHr což vede ke zvyacutešeneacute synteacuteze a uvolněniacute hormonů štiacutetneacute žlaacutezy (hypertyreoacuteza) a hypertrofie folikulaacuterniacutech buněk štiacutetneacute žlaacutezy (vole)
bull Ačkoli je definovaacutena jako autoimunitniacute onemocněniacute orgaacutenově specifickeacute přiacuteznaky GD jsou multiorgaacutenoveacute a to buď autoimunitniacutem procesem nebo jako komplikaciacute tyreotoxikoacutezy
Scheacutema ndash Hormony štiacutetneacute žlaacutezy
Upraveno dle httpsgravesdiseaseprojectwordpresscom
Genetika + GD
bull Etiologie GD neniacute staacutele znaacutema multifaktoriaacutelniacute onemocněniacute komplexniacute interakciacute mezi genetickou predispoziciacute a environmentaacutelniacutemi faktory kteraacute vede ke ztraacutetě imunitiniacute tolerance k tyreoidaacutelniacutem antigenům a inicilizaci autoimunitniacute reakci
bull Vliv prostřediacute (kouřeniacute infekce stres leacuteky nedostatek mikronutrientů přiacutejem iodu)
bull Immune regulatory genes (HLA-DR CTLA4 CD40 PTPN22 a Thyroid specific genes (thyroglobulin TSHR) ale jejich vliv je malyacute 1)
bull Předpoklaacutedaacute se že GD neniacute dědičneacute onemocněniacute ale často se objevuje spolu s autoimunitniacute tyroiditidou v raacutemci rodinnyacutech přiacuteslušniacuteků
1)Tomer Y Huber A The etiology of autoimmune thyroid disease a story of genes and environment J Autoimmun 2009 May-Jun32(3ndash4)231ndash9
TSH receptor
bull Receptor pro TSH je členem superrodiny receptorů se sedmi transmembraacutenovyacutemi domeacutenami ktereacute jsou spojeneacute s G- proteiny Gen receptoru pro TSH o molekuloveacute hmotnosti 60 kb umiacutestěnyacute na dlouheacutem rameacutenku chromozomu 14q31
bull Maacute dvě podjednotky extracelulaacuterniacute A a transmembraacutenovou B
bull Aktivace G-proteinů komplexem hormon-receptor maacute za naacutesledek stimulaci produkce cAMP pomociacute adenylaacutetcyklaacutezy
Protilaacutetky bull Je popsaacuteno několik variant a-TSHr stimulujiacuteciacute blokujiacuteciacute a
neutraacutelniacute bull a-TSHr podobně jako TSH se primaacuterně vaacuteže na N-terminaacutelniacute
čaacutest extracelulaacuterniacute domeacuteny TSHr a aktivuje draacutehu transdukce signaacutelu cAMP ndash předevšiacutem STIMULUJIacuteCIacute protilaacutetky vedouciacute ke stimulaci tvorby tyroidniacutech hormonů a proliferaci tyrocytů
bull Jineacute typy protilaacutetek mohou TSHr antagonizovat nebo blokovat uacutečinek TSH a tiacutem způsobit hypotyreoacutezu u některyacutech pacientů s různyacutemi typy autoimunitniacute tyroiditidy zejmeacutena Hashimotovou tyreoiditidou 1)
bull Neutraacutelniacute (nově nazyacutevaneacute i apoptickeacute) a-TSHr jsou namiacuteřeny proti clevage region a můžou indukovat signaacutelniacute draacutehy odlišneacute od draacutehy cAMP a indukujiacute apoptoacutezu tyrocytů 2)
1) (Kahaly GJ Diana T TSH receptor antibody functionality and nomenclature Front Endocrinol (2017) 2)Danilo Villalta Federica DrsquoAurizio Mirella Da Re Debora Ricci Francesco Latrofa Renato Tozzoli Diagnostic accuracy of a new fluoroenzyme immunoassay for the detection of TSH receptor autoantibodies in Gravesrsquo disease
MOMENKLATURA dle Kahaly GJ Diana T TSH receptor antibody functionality and nomenclature Front
Endocrinol (2017) 828103389fendo201700028
Stimulujiacuteciacute ndash N-terminaacutel region Neutralniacute ndash Cleavage region Blokujiacuteciacute ndash C-terminaacutel region
Upraveno dle Balucan FS Morshed SA Davies TF Thyroid autoantibodies in pregnancy their role regulation and clinical relevance J Thyroid Res (2013) 2013
Protilaacutetky
bull Přiacutetomnost a-TSHr vylučuje dalšiacute tyreotoxikosy
bull Koncentrace protilaacutetek nesloužiacute pouze k určeniacute diagnosy ale i k predikci vyacutevoje onemocněniacute 1)2)
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TSHr v těhotenstviacute je rizikovyacutem faktorem pro dysfunkci štiacutetneacute žlaacutezy novorozence v důsledku transplacentaacuterniacuteho přenosu mateřskyacutech protilaacutetek
1) Jang SY Shin DY Lee EJ Lee SY Yoon JS Relevance of TSH-receptor anti- body levels in predicting disease course in Gravesrsquo orbitopathy comparison of the third-generation TBII assay and Mc4-TSI bioassay Eye (Lond) (2013) 27964ndash71 2) Bartalena L Burch HB Burman KD Kahaly GJ A 2013 European survey of clinical practice patterns in the management of Gravesrsquo disease Clin Endocrinol (2016) 84115ndash20
Protilaacutetky
bull a-TSHr je patogenetickyacute znak GD detekovatelnyacute prakticky u všech pacientů s GD Protilaacutetky jsou zodpovědneacute za patologickeacute funkce nemoci (stimulace růstu a funkce štiacutetneacute žlaacutezy orbitopatie dermatologickeacute potiacuteže)1)
bull a-TSHr se uacutečastniacute patogeneze u hypotyreodismu i u atrofickeacute formy Hashimotoveacute tyreoitidy 2)
bull TSHr je exprimovaacuten v řadě extra-tyroidniacutech buněk včetně fibroblastů adipocytů a kostniacutech buněk kde je znaacutemo že moduluje funkci ciacutelovyacutech buněk
1)Michalek K Morshed SA Latif R Davies TF TSH receptor autoantibodies Autoimmun Rev (2009) 9113ndash6 doi101016jautrev200903012 2) Giuliani C Monaco F Adult primary hypothyroidism In Monaco F editor Thyroid Diseases Boca Raton FL CRC Press (2012) p 171ndash94
Protilaacutetky
bull Titr a-TSHr taky klesajiacute po tyroidektomii (čaacutestečneacute či celkoveacute) kvůli odstraněniacute zdroje antigenu
bull Naopak naacuterůst titrů a-TSHr pozorujeme po leacutečbě radioiodine I131 (asi dle uvolněniacute antigenů a zpracovaacuteniacute antigenů antigen-presentujiacuteciacutemi buňkami)
Protilaacutetky + typ bull Bylo prokaacutezaacuteno že nedostatečnaacute korelace mezi
koncentracemi a-TSHr a klinickyacutem stavem pacienta je většinou způsobena tiacutem že protilaacutetky a-TSHr v oběhu jsou heterogenniacute
bull Přechod z TSAbs na TBAbs je zodpovědnyacute za vyacutevoj hypotyreoacutezy u maleacuteho procenta pacientů s Gravesovou nemociacute a naopak
bull Skutečnost že heterogenniacute protilaacutetky a-TSHr mohou koexistovat u jednoho pacienta a měnit se v průběhu času je jedniacutem z důvodů proč bylo těžkeacute vyvinout diagnosticky přesneacute testy na stanoveniacute protilaacutetek a-TSHr
bull Klinickeacute projevy pacientů s Gravesovou chorobou kteřiacute vykazujiacute přiacutetomnost protilaacutetek TSAb i TBAbTSBAb budou zaacutevisleacute spiacuteše na relativniacute koncentraci a afinitě predominantniacute protilaacutetky
Protilaacutetky - sledovaacuteniacute
bull Sledovaacuteniacute hladin TSAb přidaacutevaacute dalšiacute rozměr k hodnoceniacute aktivity GD s potenciaacutelem předpovědět recidivu nebo remisii u jednotlivyacutech pacientů
bull Vysokaacute perzistentniacute hladina TSAb je spojena s aktivniacutemi a zaacutevažnyacutemi systeacutemovyacutemi projevy a se špatnou odezvou na terapii Naopak niacutezkeacute hladiny TSAb jsou nachaacutezeny u pacientů v remisi
Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Diagnostika
bull a-TSHr lze měřit v podstatě dvěma typy testů
ndash Biologickyacutem testem (biotestem bioassay) ktereacute detekujiacute produkci cAMP v buněčnyacutech kulturaacutech inkubovanyacutech se seacuterami pacientů Tyto testy identifikujiacute pouze stimulačniacute a-TSHr Biotesty prokazujiacute nejen přiacutetomnost Ab ale takeacute jejich funkčniacute aktivitu a uacutečinnost Historicky sloužily biotesty k vyacutezkumu ke studiu patofyziologie GD
ndash Protilaacutetkoveacute testy (vazebneacute receptoroveacute) Naopak receptoroveacute metody rutinně použiacutevaneacute v klinickyacutech laboratořiacutech udaacutevajiacute pouze přiacutetomnost nebo nepřiacutetomnost a-TSHr a jejich koncentrace ale neuvaacutedějiacute jejich funkčniacute aktivitu 2)
bull Tento zaacutekladniacute rozdiacutel v uspořaacutedaacuteniacute metody vysvětluje proč biotesty a protilaacutetkoveacute testy vykazujiacute nižšiacute korelaci (r = 031 ndash 065) 1)
1)Gupta MK Thyrotropin-receptor antibodies in thyroid diseases advances in detection techniques and clinical application Clin Chem Acta 20002931-29 2) Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Biotesty
bull Biotesty mohou detekovat funkčniacute změny u heterogenniacutech a-TSHr
bull Skutečnost že heterogenniacute protilaacutetky a-TSHr mohou koexistovat u jednoho pacienta a měnit se v průběhu času je jedniacutem z důvodů proč bylo těžkeacute vyvinout diagnosticky přesneacute testy na stanoveniacute protilaacutetek a-TSHr
bull Biotesty mohou zlepšit peacuteči o pacienta ve smyslu bdquopersonalisovaneacute mediciacutenyldquo
bull Biotesty jsou nabiacutezeny referenčniacutemi laboratořeni je jistyacute předpoklady že by se mohly viacutece rozšiacuteřit
Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Biotesty
bull Během posledniacutech 60 let se biologickaacute analyacuteza a-TSHr vyvinula těžkopaacutednyacutech a časově naacuteročnyacutech postupů na geneticky upraveneacute testy založeneacute na buňkaacutech ktereacute jsou charakterizovaacuteny dobrou proveditelnostiacute a rychlyacutemi provozniacutemi časy a ktereacute jsou takeacute k dispozici jako komerčniacute sady
bull Komerčně dostupnyacute biotest je Thyretain fa Quidel kteryacute detekuje stimulačniacute aktivitu a-TSHr pomociacute chimeacuterickeacuteho TSHR a genu pro cAMP (signalizace luciferaacutezou) Je schvaacutelen FDA pro použitiacute v klinickyacutech laboratořiacutech
HISTORIE
Historickyacute vyacutevoj metod pro měřeniacute a-TSHr ndash dle Giuliani etal 2016
Cesidio Giuliani1 Motoyasu Saji2 Ines Bucci1 and Giorgio Napolitano Bioassays for TSH Receptor Autoantibodies from FRTL-5 Cells to TSH ReceptorndashLHCG Receptor Chimeras The Contribution of Leonard D Kohn Front Endocrinol (Lausanne) 2016 7 103
LATS
bull V r 1956 Adams a Purves zjistili že seacutera pacientů s tyreotoxikosou indukujiacute abnormaacutelniacute prodlouženou odpověď v TSH testu (s morčetem)1)2)
bull Nazvali jej ldquoabnormal thyroid stimulatorrdquo posleacuteze ldquolong-acting thyroid stimulatorrdquo (LATS) 2)3) bylo jasneacute že je odlišnyacute od TSH a neniacute produkovaacuten hypofyacutezou
bull V roce 1964 byla LATS identifikovaacutena jako protein podobnyacute protilaacutetkaacutem (4) a dalšiacute studie jednoznačně potvrdily že se jednaacute o IgG (56)
bull Prvniacute testy k detekci LATS měly niacutezkou senzitivitu (60-70) 7) bull Vyacuteznamneacute zlepšeniacute v testech nastalo v r 1975 a to s vyacutevojem
radioligandoveacuteho receptoroveacuteho testu Test hodnotil inhibici seacutera od pacientů s GD vaacutezaacutenyacutemi radioaktivně značeneacuteho TSH na lidskeacute tyroidniacute membraacuteny (8 Test byl nicmeacuteně staacutele zatiacutežen niacutezkou přesnostiacute
bull Dalšiacute zlepšeniacute přineslo nahrazeniacute tyroidaacutelniacute membraacuteny čaacutestečně vyčištěneacuteho TSHr - liquid phase first-generation immunoassay použiacutevanaacute dalšiacutech 20 let 910) specifita 99 senzitivita 80 11)
1)Adams DD Purves HD Abnormal responses in the assay of thyrotropin Proc Univ Otago Med Sch (1956) 3411ndash5 2)Adams DD The presence of an abnormal thyroid-stimulating hormone in the serum of some thyrotoxic patients J Clin Endocrinol Metab (1958) 18699ndash712 doi101210jcem-18-7-699 3) Adams DD Bioassay of long-acting thyroid stimulator (LATS) the dose-re- sponse relationship J Clin Endocrinol Metab (1961) 21799ndash805 4) Kriss JP Pleshakov V Chien JR Isolation and identification of the long-acting thyroid stimulator and its relation to hyperthyroidism and circumscribed pretibial myxedema J Clin Endocrinol Metab (1964) 241005ndash28 doi101210 jcem-24-10-1005 5) Kriss JP Inactivation of long-acting thyroid stimulator (LATS) by anti- kappa and anti-lamba antisera J Clin Endocrinol Metab (1968) 281440ndash4 doi101210jcem-28-10-1440 6) Volpeacute R The immunologic basis of Gravesrsquos disease N Engl J Med (1972) 287463ndash4 doi101056NEJM197208312870910 7) McKenzie JM Review pathogenesis of Gravesrsquo disease role of the long-acting thyroid stimulator J Clin Endocrinol Metab (1965) 25424ndash31 8) Mehdi SQ Nussey SS A radio-ligand receptor assay for the long-acting thy- roid stimulator Inhibition by the long-acting thyroid stimulator of the binding of radioiodinated thyroid stimulating hormone to human thyroid membranes Biochem J (1975) 145105ndash11 doi101042bj1450105 9)Shewring G Rees Smith B An improved radioreceptor assay for TSH receptor antibodies Clin Endocrinol (1982) 17409ndash17 doi101111j1365-22651982 tb01607x 10)Southgate K Creagh FM Teece M Kingswood C Rees Smith B A receptor assay for the measurement of TSH receptor antibodies in unextracted serum Clin Endocrinol (1984) 20539ndash48 doi101111j1365-22651984tb00102x 11)Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003
FRTL-5 bull Souběžně s vyacutevojem radioligandovyacutech receptorovyacutech testů dochaacutezelo k vyacutevoji
bdquobiotestůldquo Změna v in vivo na in vitro jako je použitiacute primaacuterniacutech buněčnyacutech kultur 1)
bull Dalšiacute zlepšeniacute přišlo s použitiacutem FRTL-5 buněk ndash netransformovanyacutech buněčnyacutech liniiacute krysiacutech thyroid epithelial buněk v kontinuaacutelniacute kultuře 2) Test byl založen na schopnosti purifikovanyacutech IgG indukovat produkci cAMP Naacutesledně bylo umožněno využiacutet pacientskeacute seacutera 3)
bull Tento test nesloužil jen pro diagnostiku ale měl zaacutesadniacute vyacuteznam v pochopeniacute patfyz vlastnostiacute a-TSHr
bull Kohn etal 4)5)6) vyvinuli monoklonaacutelniacute protilaacutetku k hodnoceniacute jejiacutech funkčniacutech vlastnostiacute
bull Použitiacute buněk FRTL-5 takeacute umožnilo dalšiacute studium funkčniacute heterogenity a-TSHr (samostatneacute posouzeniacute uacutečinků jednotlivyacutech IgG na dvě odlišneacute buněčneacute aktivity aktivity produkce cAMP a buněčneacuteho růstu) 7)
1)Toccafondi RS Aterini S Medici MA Rotella CM Tanini A Zonefrati R Thyroid-stimulating antibody (TSAb) detected in sera of Gravesrsquo patients using human thyroid cell cultures Clin Exp Immunol (1980) 40532ndash9 2) Ambesi-Impiombato FS Parks LAM Coon HG Culture of hormone-depen- dent functional epithelial cells from rat thyroids Proc Natl Acad Sci U S A (1980) 773455ndash9 doi101073pnas7763455 3) Vitti P Chiovato L Lopez G Lombardi A Santini F Mammoli C et al Measurement of TSAb directly in serum using FRTL-5 cells J Endocrinol Invest (1988) 11313ndash7 doi101007BF03350157 4) Yavin E Yavin Z Schneider MD Kohn LD Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor implications for receptor structure and the action of autoantibodies in Gravesrsquo disease Proc Natl Acad Sci U S A (1981) 783180ndash4 doi101073pnas7853180 5) Valente WA Vitti P Yavin Z Yavin E Rotella CM Grollman EF et al Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor stimulating and blocking antibodies derived from the lymphocytes of patients with Gravesrsquo disease Proc Natl Acad Sci U S A (1982) 796680ndash4 doi101073pnas79216680 6) Valente WA Yavin Z Yavin E Grollman EF Schneider M Rotella CM et al Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor the identification of blocking and stimulating antibodies J Endocrinol Invest (1982) 5293ndash301 doi101007BF03350517 7) Valente WA Vitti P Rotella CM Vaughan MM Aloj SM Grollman EF et al Antibodies that promote thyroid growth A distinct population of thyroid-stimulating autoantibodies N Engl J Med (1983) 3091028ndash34 doi101056NEJM198310273091705
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 1
bull Hlavniacute průlom přišel s naklonovaacuteniacutem TSHr v r 1989 1-3) ndash využitiacute lidskeacuteho TSHr pro RIA i bioassays 45) ndash senzitivita 96 pro RIA
bull Pomociacute mutačniacutech technik byly připraveny chimerickeacute TSHr
bull V 90 leacutetech byly vyvinuty monoklonaacutelniacute protilaacutetky proti C-terminus region rh-TSHr 67)
1)Parmentier M Libert F Maenhaut C Lefort Gerard C Perret J Van Sande J et al Molecular cloning of the thyrotropin receptor Science (1989) 2461620ndash2 doi101126science2556796 2)Nagayama Y Kaufman KD Seto P Rapoport B Molecular cloning sequence and functional expression of the cDNA for the human thyrotropin receptor Biochem Biophys Res Commun (1989) 1651184ndash90 doi1010160006- 291X(89)92727-7 3) Akamizu T Ikuyama S Saji M Kosugi S Kozak C McBride OW et al Cloning chromosomal assignment and regulation of the rat thyrotropin receptor expression of the gene is regulated by thyrotropin agents that increase cAMP levels and thyroid autoantibodies Proc Natl Acad Sci U S A (1990) 875677ndash81 doi101073pnas87155677 4)Ludgate M Perret J Parmentier M Gerard C Libert F Dumont JE et al Use of recombinant human thyrotropin receptor (TSH-R) expressed in mammalian cell lines to assay TSH-R autoantibodies Mol Cell Endocrinol (1991) 73R13ndash8 doi1010160303-7207(90)90050-I 5) Filetti S Foti D Costante G Rapoport B Recombinant human thyrotropin (TSH) receptor in a radioreceptor assay for the measurement of TSH receptor autoantibodies J Clin Endocrinol Metab (1991) 721096ndash101 doi101210 jcem-72-5-1096 6) Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 7)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 2
bull Druhaacute generace imunotestů (ELISA) ndash solid-phase ndash se staly standardem pro dg a-TSHr diacuteky přesnosti (988 senzitivita a 996 specifita) a non-RIA 123)
bull Použitiacutem rh-TSHr nebo vepřovyacute TSHr ziacuteskaacuteme stejnou analytickou přesnost3)
1)Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 2)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071 3)Kamijo K TSH-receptor antibody measurement in patients with various thyrotoxicosis and Hashimotorsquos thyroiditis a comparison of two two-step assays coated plate ELISA using porcine TSH-receptor and coated tube radio- assay using human recombinant TSH-receptor Endocr J (2003) 50113ndash6 doi101507endocrj50113
Monoclonal a-TSHr stimulujiacuteciacute
bull Na přelomu mileacutenia byly studovaacuteny stimulujiacuteciacute protilaacutetky a-TSHr 123)
bull Tato data jsou zaacutesadniacute pro pochopeniacute vztahů struktury a funkciacute TSHRr a jejiacute role v patogenezi Gravesovy choroby
bull To vše vedlo k izolaci a charakterizaci lidskeacute monoklonaacutelniacute protilaacutetky a-TSHr stimulujiacuteciacute ndash M22 4)
1)Ando T Latif R Pritsker A Moran T Nagayama Y Davies TF A monoclonal thyroid-stimulating antibody J Clin Invest (2002) 1101667ndash74 doi101172 JCI0216991 2)Costagliola S Franssen JDF Bonomi M Urizar E Willnich M Bergmann A et al Generation of a mouse monoclonal TSH receptor antibody with stimu- lating activity Biochem Biophys Res Commun (2002) 299891ndash6 doi101016 S0006-291X(02)02762-6 3)Sanders J Jeffreys J Depraetere H Richards T Evans M Kiddie A et al Thyroid-stimulating monoclonal antibodies Thyroid (2002) 121043ndash50 doi101089105072502321085135 4) Sanders J Evans M Premawardhana LDKE Depraetere H Jeffreys J Richards T et al Human monoclonal stimulating autoantibody Lancet (2003) 362126ndash8 doi101016S0140-6736(03)13866-4
Třetiacute generace testů ndash M22
bull V r2004 byl vyvinut test použitiacutem M22 ve formaacutetu ELISA 1) senzitivita 974 a specifita 992 (např Medipan)
bull Test byl vhodnyacute i pro automatizaci 23)
bull Dostupnost a znalost jak stimulujiacuteciacutech tak blokujiacuteciacutech protilaacutetek byla důležitaacute k pochopeniacute krystalickeacute struktury TSHr a jejiacutech interakciacute s a-TSHr 4) poukaacutezalo to na širokeacute překryvy epitopů mezi stimulujiacuteciacutemi a blokujiacuteciacutemi protilaacutetkami 4)
bull Roche nativniacute vepřovyacute TSH s M22
1)Rees Smith B Bolton J Young S Collyer A Weeden A Bradbury J et al A new assay for thyrotropin receptor autoantibodies Thyroid (2004) 14830ndash5 doi1010891050725042451248 2) Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003 3) Zophel K Roggenbuck D von Landenberg P Wunderlich G Gruning T Kotzerke J et al TSH receptor antibody (TRAb) assays based on the human monoclonal autoantibody M22 are more sensitive than bovine TSH based assays Horm Metab Res (2010) 4265ndash9 doi101055s-0029-1241196 4) Furmaniak J Sanders J Nunez Miguel R Rees Smith B Mechanisms of action of TSHR autoantibodies Horm Metab Res (2015) 47735ndash52 doi10105 5s-0035-1559648
Mc4 bioassay
bull Souběžně s testy 3-generace Kohn vyvinul test využiacutevajiacuteciacute bdquoMc4 chimeacuteruldquo založenou na metodaacutech chemiluminiscence 1)
bull Ciacutelem bylo měřit pouze stimulujiacuteciacute protilaacutetky a tiacutem dosaacutehnout jasneacuteho cutoff mezi pacienty s GD a kontrolami
bull Porovnaacuteniacute senzitivity a specifity v tabulce 2) bull Mc4 testy mohou byacutet využity jako testy prvniacute
volby pro pacienty s GD
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Mc4 bioassay
bull Testy s M22 diacuteky podobně specifitě a senzitivitě ale lepšiacute bdquoproveditelnostildquo jsou zatiacutem preferovanějšiacute
bull Daacutele jsou lepšiacute pro prognoacutezu GD než testy s M22 a leacutepe korelujiacute s aktivitou a zaacutevažnostiacute GD orbitopatiiacute 2)
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Bridge Assay
bull Novaacute technologie využitiacute chimeacuterickyacutech receptorů Mc4 a N-terminaacutelniacute TSHr fůsovanyacute s alkalickou fosfataacutezou 1) senzitivita 998 a specifita 995
bull TSI ndash Siemens tato metoda je založena na sendvičoveacutem kompetetivniacute formaacutetu kteryacute se lišiacute od klasickeacuteho kompetetivniacute formaacutetu komerčniacutech IMA druheacute a třetiacute generace 2)
1)Frank CU Braeth S Dietrich JW Wanjura D Loos U Bridge technology with TSH receptor chimera for sensitive direct detection of TSH receptor antibodies causing Gravesrsquo disease analytical and clinical evaluation Horm Metab Res (2015) 47880ndash8 doi101055s-0035-1554662 2)Tozzoli R DrsquoAurizio F Villalta D Giovanella L (2017) Evalu- ation of the first fully automated immunoassay method for the measurement of stimulating TSH receptor autoantibodies in Gravesrsquo disease Clin Chem Lab Med 5558ndash64
Mezinaacuterodniacute standard
bull Prvniacute mezinaacuterodniacute standard připraven v r 1995 WHO označeniacute 90672 Připraven ECBS zdroj pacientskaacute plasma
bull V r 2006 nahrazen lidskou monoklonaacutelniacute protilaacutetkou M22 (NIBSC 08240) odkazuje na detekci S-TRAb 1)
1) Diana T1 Kanitz M Lehmann M Li Y Olivo PD Kahaly GJ Standardization of a bioassay for thyrotropin receptor stimulating autoantibodies Thyroid 2015 Feb25(2)169-75
EHK ndash SEKK AT217
EHK ndash SEKK AT217
SEKK - Dotazniacutek
EHK ndash SEKK AT113
EHK ndash SEKK AT113
Hashimotova tyreoiditida (HT)
bull HT 1) a SLE 2) byly prvniacute dvě autoimunitniacute onemocněniacute kde se prokaacutezala genetickaacute asociace (geny MHC třiacutedy II) 70 leacuteta
bull Nicmeacuteně nebyl nalezen gen kteryacute by spouštěl HT nalezeny pouze geny ktereacute přispiacutevajiacute k fenotypu onemocněniacute 3)
1)VladutiuAO RoseNR Autoimmunemurine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type Science 19711741137ndash9 2)Grumet FC Coukell A Bodmer JG Bodmer WF McDevitt HO Histocompatibility (HL-A) antigens associated with systemic lupus erythematosus A possible genetic predisposition to disease N Engl J Med 1971285193ndash6 3) Simmonds MJ Gough SC The search for the genetic contribution to autoimmune thyroid disease the never ending story Brief Funct Genomics 20111077ndash90
Hashimotova tyreoiditida
bull Do 50 let raritniacute onemocněniacute nyniacute nejběžnějšiacute s prevalenciacute 81000 biochemickyacute naacutelez + autoprotilaacutetky 461000
bull Ženymuži 81
a-TPO
bull Přiacutetomnost protilaacutetek TPOAb obvykle předchaacuteziacute vzniku tyreoidaacutelniacute dysfunkce
bull Patogenetickaacute role protilaacutetek TgAb zůstaacutevaacute nejasnaacute
a-TPO
bull Autoprotilaacutetky TPOAb byly nejdřiacuteve popsaacuteny jako antimikrozomaacutelniacute autoprotilaacutetky (AMA) neboť bylo zjištěno že reagujiacute s neupravenyacutemi membraacutenami tyreoidaacutelniacutech buněk
bull Mikrozomaacutelniacute antigen byl později popsaacuten jako TPO
bull Dřiacuteve se využiacutevaly ke stanoveniacute TPO metody imunofluorescenčniacute metody a aglutinačniacute testy s pasivniacutem barveniacutem erytrocytů
a-TPO jako rizikovyacute faktor
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TPO je znaacutemyacutem rizikovyacutem faktorem pro vznik tyreoidaacutelniacute dysfunkce pokud jsou pacienti leacutečeni lithiem amiodaronem interleukinem-2 nebo alfa-interferonem
a-TG
bull Tg vykazuje vysokou heterogenitu způsobenou rozdiacutely v posttranslačniacutech modifikaciacutech (glykosylace jodizace sulfatace atd) Během synteacutezy tyreoidaacutelniacuteho hormonu a jeho uvolněniacute je Tg polymerizovaacuten a degradovaacuten
bull Vlivem toho je imunologickaacute struktura Tg mimořaacutedně komplexniacute Charakteristika standardů pro Tg se může lišit v zaacutevislosti na vstupniacute lidskeacute tyreoidaacutelniacute tkaacuteni a použiteacutem purifikačniacutem procesu To vysvětluje proč jsou testy na TgAb a takeacute Tg tak obtiacutežně standardizovatelneacute
Titr protilaacutetek
bull Titr protilaacutetek literaacuterně koreluje s počtem autoreaktivniacutech lymfocytů ktereacute infiltrujiacute štiacutetnou žlaacutezu a sonografickyacutem obrazem 1)
bull a-TG nižšiacute senzitivita (60-80 u HT) a menšiacute specifita (pozitivniacute ve většiacute čaacutesti zdravyacutech kontrol) než a-TPO
bull a-TG a a-TPO představujiacute dva různeacute aspekty autoimunniacute odpovědi na štiacutetnou žlaacutezu a-TG by mohly odraacutežet počaacutetečniacute (vrozenyacute) typ imunitniacute odpovědi zatiacutemco a-TPO by mohly charakterizovat pozdějšiacute adaptivniacute imunitniacute odpovědi 2)
1)Pandit AA VijayWardeMMenon PS Correlation of number of intrathyroid lympho- cytes with antimicrosomal antibody titer in Hashimotos thyroiditis Diagn Cytopathol 20032863ndash5 2) Rose NR Autoimmune escalation through the crystal ball Clin Exp Immunol 20071479
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
Autoimunitniacute onemocněniacute štiacutetneacute žlaacutezy - Uacutevod
bull Autoimunitniacute onemocněniacute štiacutetneacute žlaacutezy (AITD) je důsledek poškozeniacute buněk štiacutetneacute žlaacutezy humoraacutelniacutem a předevšiacutem buněčnyacutem mechanismem
bull Poškozeniacute buněk nastaacutevaacute tehdy když se autoreaktivniacute T-lymfocyty anebo autoprotilaacutetky vaacutežiacute na membraacuteny tyreoidaacutelniacutech buněk a tiacutem je započat imunopatologickyacute proces
bull U AITD se uplatňujiacute tři hlavniacute tyreoidaacutelniacute autoantigeny - tyreoperoxidaacuteza (TPO) tyreoglobulin (Tg) a TSH receptor
Gravesova-Basedovaacute nemoc
bull Gravesova nemoc (GD) je autoimunitniacute onemocněniacute zprostředkovaneacute autoprotilaacutetkami a charakterizovaneacute tyreotoxikoacutezou strumou a orbitopatiiacute
bull Cirkulujiacuteciacutemi autoprotilaacutetky napodobujiacute působeniacute TSH vaacutežou se a aktivujiacute TSHr což vede ke zvyacutešeneacute synteacuteze a uvolněniacute hormonů štiacutetneacute žlaacutezy (hypertyreoacuteza) a hypertrofie folikulaacuterniacutech buněk štiacutetneacute žlaacutezy (vole)
bull Ačkoli je definovaacutena jako autoimunitniacute onemocněniacute orgaacutenově specifickeacute přiacuteznaky GD jsou multiorgaacutenoveacute a to buď autoimunitniacutem procesem nebo jako komplikaciacute tyreotoxikoacutezy
Scheacutema ndash Hormony štiacutetneacute žlaacutezy
Upraveno dle httpsgravesdiseaseprojectwordpresscom
Genetika + GD
bull Etiologie GD neniacute staacutele znaacutema multifaktoriaacutelniacute onemocněniacute komplexniacute interakciacute mezi genetickou predispoziciacute a environmentaacutelniacutemi faktory kteraacute vede ke ztraacutetě imunitiniacute tolerance k tyreoidaacutelniacutem antigenům a inicilizaci autoimunitniacute reakci
bull Vliv prostřediacute (kouřeniacute infekce stres leacuteky nedostatek mikronutrientů přiacutejem iodu)
bull Immune regulatory genes (HLA-DR CTLA4 CD40 PTPN22 a Thyroid specific genes (thyroglobulin TSHR) ale jejich vliv je malyacute 1)
bull Předpoklaacutedaacute se že GD neniacute dědičneacute onemocněniacute ale často se objevuje spolu s autoimunitniacute tyroiditidou v raacutemci rodinnyacutech přiacuteslušniacuteků
1)Tomer Y Huber A The etiology of autoimmune thyroid disease a story of genes and environment J Autoimmun 2009 May-Jun32(3ndash4)231ndash9
TSH receptor
bull Receptor pro TSH je členem superrodiny receptorů se sedmi transmembraacutenovyacutemi domeacutenami ktereacute jsou spojeneacute s G- proteiny Gen receptoru pro TSH o molekuloveacute hmotnosti 60 kb umiacutestěnyacute na dlouheacutem rameacutenku chromozomu 14q31
bull Maacute dvě podjednotky extracelulaacuterniacute A a transmembraacutenovou B
bull Aktivace G-proteinů komplexem hormon-receptor maacute za naacutesledek stimulaci produkce cAMP pomociacute adenylaacutetcyklaacutezy
Protilaacutetky bull Je popsaacuteno několik variant a-TSHr stimulujiacuteciacute blokujiacuteciacute a
neutraacutelniacute bull a-TSHr podobně jako TSH se primaacuterně vaacuteže na N-terminaacutelniacute
čaacutest extracelulaacuterniacute domeacuteny TSHr a aktivuje draacutehu transdukce signaacutelu cAMP ndash předevšiacutem STIMULUJIacuteCIacute protilaacutetky vedouciacute ke stimulaci tvorby tyroidniacutech hormonů a proliferaci tyrocytů
bull Jineacute typy protilaacutetek mohou TSHr antagonizovat nebo blokovat uacutečinek TSH a tiacutem způsobit hypotyreoacutezu u některyacutech pacientů s různyacutemi typy autoimunitniacute tyroiditidy zejmeacutena Hashimotovou tyreoiditidou 1)
bull Neutraacutelniacute (nově nazyacutevaneacute i apoptickeacute) a-TSHr jsou namiacuteřeny proti clevage region a můžou indukovat signaacutelniacute draacutehy odlišneacute od draacutehy cAMP a indukujiacute apoptoacutezu tyrocytů 2)
1) (Kahaly GJ Diana T TSH receptor antibody functionality and nomenclature Front Endocrinol (2017) 2)Danilo Villalta Federica DrsquoAurizio Mirella Da Re Debora Ricci Francesco Latrofa Renato Tozzoli Diagnostic accuracy of a new fluoroenzyme immunoassay for the detection of TSH receptor autoantibodies in Gravesrsquo disease
MOMENKLATURA dle Kahaly GJ Diana T TSH receptor antibody functionality and nomenclature Front
Endocrinol (2017) 828103389fendo201700028
Stimulujiacuteciacute ndash N-terminaacutel region Neutralniacute ndash Cleavage region Blokujiacuteciacute ndash C-terminaacutel region
Upraveno dle Balucan FS Morshed SA Davies TF Thyroid autoantibodies in pregnancy their role regulation and clinical relevance J Thyroid Res (2013) 2013
Protilaacutetky
bull Přiacutetomnost a-TSHr vylučuje dalšiacute tyreotoxikosy
bull Koncentrace protilaacutetek nesloužiacute pouze k určeniacute diagnosy ale i k predikci vyacutevoje onemocněniacute 1)2)
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TSHr v těhotenstviacute je rizikovyacutem faktorem pro dysfunkci štiacutetneacute žlaacutezy novorozence v důsledku transplacentaacuterniacuteho přenosu mateřskyacutech protilaacutetek
1) Jang SY Shin DY Lee EJ Lee SY Yoon JS Relevance of TSH-receptor anti- body levels in predicting disease course in Gravesrsquo orbitopathy comparison of the third-generation TBII assay and Mc4-TSI bioassay Eye (Lond) (2013) 27964ndash71 2) Bartalena L Burch HB Burman KD Kahaly GJ A 2013 European survey of clinical practice patterns in the management of Gravesrsquo disease Clin Endocrinol (2016) 84115ndash20
Protilaacutetky
bull a-TSHr je patogenetickyacute znak GD detekovatelnyacute prakticky u všech pacientů s GD Protilaacutetky jsou zodpovědneacute za patologickeacute funkce nemoci (stimulace růstu a funkce štiacutetneacute žlaacutezy orbitopatie dermatologickeacute potiacuteže)1)
bull a-TSHr se uacutečastniacute patogeneze u hypotyreodismu i u atrofickeacute formy Hashimotoveacute tyreoitidy 2)
bull TSHr je exprimovaacuten v řadě extra-tyroidniacutech buněk včetně fibroblastů adipocytů a kostniacutech buněk kde je znaacutemo že moduluje funkci ciacutelovyacutech buněk
1)Michalek K Morshed SA Latif R Davies TF TSH receptor autoantibodies Autoimmun Rev (2009) 9113ndash6 doi101016jautrev200903012 2) Giuliani C Monaco F Adult primary hypothyroidism In Monaco F editor Thyroid Diseases Boca Raton FL CRC Press (2012) p 171ndash94
Protilaacutetky
bull Titr a-TSHr taky klesajiacute po tyroidektomii (čaacutestečneacute či celkoveacute) kvůli odstraněniacute zdroje antigenu
bull Naopak naacuterůst titrů a-TSHr pozorujeme po leacutečbě radioiodine I131 (asi dle uvolněniacute antigenů a zpracovaacuteniacute antigenů antigen-presentujiacuteciacutemi buňkami)
Protilaacutetky + typ bull Bylo prokaacutezaacuteno že nedostatečnaacute korelace mezi
koncentracemi a-TSHr a klinickyacutem stavem pacienta je většinou způsobena tiacutem že protilaacutetky a-TSHr v oběhu jsou heterogenniacute
bull Přechod z TSAbs na TBAbs je zodpovědnyacute za vyacutevoj hypotyreoacutezy u maleacuteho procenta pacientů s Gravesovou nemociacute a naopak
bull Skutečnost že heterogenniacute protilaacutetky a-TSHr mohou koexistovat u jednoho pacienta a měnit se v průběhu času je jedniacutem z důvodů proč bylo těžkeacute vyvinout diagnosticky přesneacute testy na stanoveniacute protilaacutetek a-TSHr
bull Klinickeacute projevy pacientů s Gravesovou chorobou kteřiacute vykazujiacute přiacutetomnost protilaacutetek TSAb i TBAbTSBAb budou zaacutevisleacute spiacuteše na relativniacute koncentraci a afinitě predominantniacute protilaacutetky
Protilaacutetky - sledovaacuteniacute
bull Sledovaacuteniacute hladin TSAb přidaacutevaacute dalšiacute rozměr k hodnoceniacute aktivity GD s potenciaacutelem předpovědět recidivu nebo remisii u jednotlivyacutech pacientů
bull Vysokaacute perzistentniacute hladina TSAb je spojena s aktivniacutemi a zaacutevažnyacutemi systeacutemovyacutemi projevy a se špatnou odezvou na terapii Naopak niacutezkeacute hladiny TSAb jsou nachaacutezeny u pacientů v remisi
Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Diagnostika
bull a-TSHr lze měřit v podstatě dvěma typy testů
ndash Biologickyacutem testem (biotestem bioassay) ktereacute detekujiacute produkci cAMP v buněčnyacutech kulturaacutech inkubovanyacutech se seacuterami pacientů Tyto testy identifikujiacute pouze stimulačniacute a-TSHr Biotesty prokazujiacute nejen přiacutetomnost Ab ale takeacute jejich funkčniacute aktivitu a uacutečinnost Historicky sloužily biotesty k vyacutezkumu ke studiu patofyziologie GD
ndash Protilaacutetkoveacute testy (vazebneacute receptoroveacute) Naopak receptoroveacute metody rutinně použiacutevaneacute v klinickyacutech laboratořiacutech udaacutevajiacute pouze přiacutetomnost nebo nepřiacutetomnost a-TSHr a jejich koncentrace ale neuvaacutedějiacute jejich funkčniacute aktivitu 2)
bull Tento zaacutekladniacute rozdiacutel v uspořaacutedaacuteniacute metody vysvětluje proč biotesty a protilaacutetkoveacute testy vykazujiacute nižšiacute korelaci (r = 031 ndash 065) 1)
1)Gupta MK Thyrotropin-receptor antibodies in thyroid diseases advances in detection techniques and clinical application Clin Chem Acta 20002931-29 2) Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Biotesty
bull Biotesty mohou detekovat funkčniacute změny u heterogenniacutech a-TSHr
bull Skutečnost že heterogenniacute protilaacutetky a-TSHr mohou koexistovat u jednoho pacienta a měnit se v průběhu času je jedniacutem z důvodů proč bylo těžkeacute vyvinout diagnosticky přesneacute testy na stanoveniacute protilaacutetek a-TSHr
bull Biotesty mohou zlepšit peacuteči o pacienta ve smyslu bdquopersonalisovaneacute mediciacutenyldquo
bull Biotesty jsou nabiacutezeny referenčniacutemi laboratořeni je jistyacute předpoklady že by se mohly viacutece rozšiacuteřit
Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Biotesty
bull Během posledniacutech 60 let se biologickaacute analyacuteza a-TSHr vyvinula těžkopaacutednyacutech a časově naacuteročnyacutech postupů na geneticky upraveneacute testy založeneacute na buňkaacutech ktereacute jsou charakterizovaacuteny dobrou proveditelnostiacute a rychlyacutemi provozniacutemi časy a ktereacute jsou takeacute k dispozici jako komerčniacute sady
bull Komerčně dostupnyacute biotest je Thyretain fa Quidel kteryacute detekuje stimulačniacute aktivitu a-TSHr pomociacute chimeacuterickeacuteho TSHR a genu pro cAMP (signalizace luciferaacutezou) Je schvaacutelen FDA pro použitiacute v klinickyacutech laboratořiacutech
HISTORIE
Historickyacute vyacutevoj metod pro měřeniacute a-TSHr ndash dle Giuliani etal 2016
Cesidio Giuliani1 Motoyasu Saji2 Ines Bucci1 and Giorgio Napolitano Bioassays for TSH Receptor Autoantibodies from FRTL-5 Cells to TSH ReceptorndashLHCG Receptor Chimeras The Contribution of Leonard D Kohn Front Endocrinol (Lausanne) 2016 7 103
LATS
bull V r 1956 Adams a Purves zjistili že seacutera pacientů s tyreotoxikosou indukujiacute abnormaacutelniacute prodlouženou odpověď v TSH testu (s morčetem)1)2)
bull Nazvali jej ldquoabnormal thyroid stimulatorrdquo posleacuteze ldquolong-acting thyroid stimulatorrdquo (LATS) 2)3) bylo jasneacute že je odlišnyacute od TSH a neniacute produkovaacuten hypofyacutezou
bull V roce 1964 byla LATS identifikovaacutena jako protein podobnyacute protilaacutetkaacutem (4) a dalšiacute studie jednoznačně potvrdily že se jednaacute o IgG (56)
bull Prvniacute testy k detekci LATS měly niacutezkou senzitivitu (60-70) 7) bull Vyacuteznamneacute zlepšeniacute v testech nastalo v r 1975 a to s vyacutevojem
radioligandoveacuteho receptoroveacuteho testu Test hodnotil inhibici seacutera od pacientů s GD vaacutezaacutenyacutemi radioaktivně značeneacuteho TSH na lidskeacute tyroidniacute membraacuteny (8 Test byl nicmeacuteně staacutele zatiacutežen niacutezkou přesnostiacute
bull Dalšiacute zlepšeniacute přineslo nahrazeniacute tyroidaacutelniacute membraacuteny čaacutestečně vyčištěneacuteho TSHr - liquid phase first-generation immunoassay použiacutevanaacute dalšiacutech 20 let 910) specifita 99 senzitivita 80 11)
1)Adams DD Purves HD Abnormal responses in the assay of thyrotropin Proc Univ Otago Med Sch (1956) 3411ndash5 2)Adams DD The presence of an abnormal thyroid-stimulating hormone in the serum of some thyrotoxic patients J Clin Endocrinol Metab (1958) 18699ndash712 doi101210jcem-18-7-699 3) Adams DD Bioassay of long-acting thyroid stimulator (LATS) the dose-re- sponse relationship J Clin Endocrinol Metab (1961) 21799ndash805 4) Kriss JP Pleshakov V Chien JR Isolation and identification of the long-acting thyroid stimulator and its relation to hyperthyroidism and circumscribed pretibial myxedema J Clin Endocrinol Metab (1964) 241005ndash28 doi101210 jcem-24-10-1005 5) Kriss JP Inactivation of long-acting thyroid stimulator (LATS) by anti- kappa and anti-lamba antisera J Clin Endocrinol Metab (1968) 281440ndash4 doi101210jcem-28-10-1440 6) Volpeacute R The immunologic basis of Gravesrsquos disease N Engl J Med (1972) 287463ndash4 doi101056NEJM197208312870910 7) McKenzie JM Review pathogenesis of Gravesrsquo disease role of the long-acting thyroid stimulator J Clin Endocrinol Metab (1965) 25424ndash31 8) Mehdi SQ Nussey SS A radio-ligand receptor assay for the long-acting thy- roid stimulator Inhibition by the long-acting thyroid stimulator of the binding of radioiodinated thyroid stimulating hormone to human thyroid membranes Biochem J (1975) 145105ndash11 doi101042bj1450105 9)Shewring G Rees Smith B An improved radioreceptor assay for TSH receptor antibodies Clin Endocrinol (1982) 17409ndash17 doi101111j1365-22651982 tb01607x 10)Southgate K Creagh FM Teece M Kingswood C Rees Smith B A receptor assay for the measurement of TSH receptor antibodies in unextracted serum Clin Endocrinol (1984) 20539ndash48 doi101111j1365-22651984tb00102x 11)Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003
FRTL-5 bull Souběžně s vyacutevojem radioligandovyacutech receptorovyacutech testů dochaacutezelo k vyacutevoji
bdquobiotestůldquo Změna v in vivo na in vitro jako je použitiacute primaacuterniacutech buněčnyacutech kultur 1)
bull Dalšiacute zlepšeniacute přišlo s použitiacutem FRTL-5 buněk ndash netransformovanyacutech buněčnyacutech liniiacute krysiacutech thyroid epithelial buněk v kontinuaacutelniacute kultuře 2) Test byl založen na schopnosti purifikovanyacutech IgG indukovat produkci cAMP Naacutesledně bylo umožněno využiacutet pacientskeacute seacutera 3)
bull Tento test nesloužil jen pro diagnostiku ale měl zaacutesadniacute vyacuteznam v pochopeniacute patfyz vlastnostiacute a-TSHr
bull Kohn etal 4)5)6) vyvinuli monoklonaacutelniacute protilaacutetku k hodnoceniacute jejiacutech funkčniacutech vlastnostiacute
bull Použitiacute buněk FRTL-5 takeacute umožnilo dalšiacute studium funkčniacute heterogenity a-TSHr (samostatneacute posouzeniacute uacutečinků jednotlivyacutech IgG na dvě odlišneacute buněčneacute aktivity aktivity produkce cAMP a buněčneacuteho růstu) 7)
1)Toccafondi RS Aterini S Medici MA Rotella CM Tanini A Zonefrati R Thyroid-stimulating antibody (TSAb) detected in sera of Gravesrsquo patients using human thyroid cell cultures Clin Exp Immunol (1980) 40532ndash9 2) Ambesi-Impiombato FS Parks LAM Coon HG Culture of hormone-depen- dent functional epithelial cells from rat thyroids Proc Natl Acad Sci U S A (1980) 773455ndash9 doi101073pnas7763455 3) Vitti P Chiovato L Lopez G Lombardi A Santini F Mammoli C et al Measurement of TSAb directly in serum using FRTL-5 cells J Endocrinol Invest (1988) 11313ndash7 doi101007BF03350157 4) Yavin E Yavin Z Schneider MD Kohn LD Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor implications for receptor structure and the action of autoantibodies in Gravesrsquo disease Proc Natl Acad Sci U S A (1981) 783180ndash4 doi101073pnas7853180 5) Valente WA Vitti P Yavin Z Yavin E Rotella CM Grollman EF et al Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor stimulating and blocking antibodies derived from the lymphocytes of patients with Gravesrsquo disease Proc Natl Acad Sci U S A (1982) 796680ndash4 doi101073pnas79216680 6) Valente WA Yavin Z Yavin E Grollman EF Schneider M Rotella CM et al Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor the identification of blocking and stimulating antibodies J Endocrinol Invest (1982) 5293ndash301 doi101007BF03350517 7) Valente WA Vitti P Rotella CM Vaughan MM Aloj SM Grollman EF et al Antibodies that promote thyroid growth A distinct population of thyroid-stimulating autoantibodies N Engl J Med (1983) 3091028ndash34 doi101056NEJM198310273091705
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 1
bull Hlavniacute průlom přišel s naklonovaacuteniacutem TSHr v r 1989 1-3) ndash využitiacute lidskeacuteho TSHr pro RIA i bioassays 45) ndash senzitivita 96 pro RIA
bull Pomociacute mutačniacutech technik byly připraveny chimerickeacute TSHr
bull V 90 leacutetech byly vyvinuty monoklonaacutelniacute protilaacutetky proti C-terminus region rh-TSHr 67)
1)Parmentier M Libert F Maenhaut C Lefort Gerard C Perret J Van Sande J et al Molecular cloning of the thyrotropin receptor Science (1989) 2461620ndash2 doi101126science2556796 2)Nagayama Y Kaufman KD Seto P Rapoport B Molecular cloning sequence and functional expression of the cDNA for the human thyrotropin receptor Biochem Biophys Res Commun (1989) 1651184ndash90 doi1010160006- 291X(89)92727-7 3) Akamizu T Ikuyama S Saji M Kosugi S Kozak C McBride OW et al Cloning chromosomal assignment and regulation of the rat thyrotropin receptor expression of the gene is regulated by thyrotropin agents that increase cAMP levels and thyroid autoantibodies Proc Natl Acad Sci U S A (1990) 875677ndash81 doi101073pnas87155677 4)Ludgate M Perret J Parmentier M Gerard C Libert F Dumont JE et al Use of recombinant human thyrotropin receptor (TSH-R) expressed in mammalian cell lines to assay TSH-R autoantibodies Mol Cell Endocrinol (1991) 73R13ndash8 doi1010160303-7207(90)90050-I 5) Filetti S Foti D Costante G Rapoport B Recombinant human thyrotropin (TSH) receptor in a radioreceptor assay for the measurement of TSH receptor autoantibodies J Clin Endocrinol Metab (1991) 721096ndash101 doi101210 jcem-72-5-1096 6) Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 7)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 2
bull Druhaacute generace imunotestů (ELISA) ndash solid-phase ndash se staly standardem pro dg a-TSHr diacuteky přesnosti (988 senzitivita a 996 specifita) a non-RIA 123)
bull Použitiacutem rh-TSHr nebo vepřovyacute TSHr ziacuteskaacuteme stejnou analytickou přesnost3)
1)Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 2)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071 3)Kamijo K TSH-receptor antibody measurement in patients with various thyrotoxicosis and Hashimotorsquos thyroiditis a comparison of two two-step assays coated plate ELISA using porcine TSH-receptor and coated tube radio- assay using human recombinant TSH-receptor Endocr J (2003) 50113ndash6 doi101507endocrj50113
Monoclonal a-TSHr stimulujiacuteciacute
bull Na přelomu mileacutenia byly studovaacuteny stimulujiacuteciacute protilaacutetky a-TSHr 123)
bull Tato data jsou zaacutesadniacute pro pochopeniacute vztahů struktury a funkciacute TSHRr a jejiacute role v patogenezi Gravesovy choroby
bull To vše vedlo k izolaci a charakterizaci lidskeacute monoklonaacutelniacute protilaacutetky a-TSHr stimulujiacuteciacute ndash M22 4)
1)Ando T Latif R Pritsker A Moran T Nagayama Y Davies TF A monoclonal thyroid-stimulating antibody J Clin Invest (2002) 1101667ndash74 doi101172 JCI0216991 2)Costagliola S Franssen JDF Bonomi M Urizar E Willnich M Bergmann A et al Generation of a mouse monoclonal TSH receptor antibody with stimu- lating activity Biochem Biophys Res Commun (2002) 299891ndash6 doi101016 S0006-291X(02)02762-6 3)Sanders J Jeffreys J Depraetere H Richards T Evans M Kiddie A et al Thyroid-stimulating monoclonal antibodies Thyroid (2002) 121043ndash50 doi101089105072502321085135 4) Sanders J Evans M Premawardhana LDKE Depraetere H Jeffreys J Richards T et al Human monoclonal stimulating autoantibody Lancet (2003) 362126ndash8 doi101016S0140-6736(03)13866-4
Třetiacute generace testů ndash M22
bull V r2004 byl vyvinut test použitiacutem M22 ve formaacutetu ELISA 1) senzitivita 974 a specifita 992 (např Medipan)
bull Test byl vhodnyacute i pro automatizaci 23)
bull Dostupnost a znalost jak stimulujiacuteciacutech tak blokujiacuteciacutech protilaacutetek byla důležitaacute k pochopeniacute krystalickeacute struktury TSHr a jejiacutech interakciacute s a-TSHr 4) poukaacutezalo to na širokeacute překryvy epitopů mezi stimulujiacuteciacutemi a blokujiacuteciacutemi protilaacutetkami 4)
bull Roche nativniacute vepřovyacute TSH s M22
1)Rees Smith B Bolton J Young S Collyer A Weeden A Bradbury J et al A new assay for thyrotropin receptor autoantibodies Thyroid (2004) 14830ndash5 doi1010891050725042451248 2) Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003 3) Zophel K Roggenbuck D von Landenberg P Wunderlich G Gruning T Kotzerke J et al TSH receptor antibody (TRAb) assays based on the human monoclonal autoantibody M22 are more sensitive than bovine TSH based assays Horm Metab Res (2010) 4265ndash9 doi101055s-0029-1241196 4) Furmaniak J Sanders J Nunez Miguel R Rees Smith B Mechanisms of action of TSHR autoantibodies Horm Metab Res (2015) 47735ndash52 doi10105 5s-0035-1559648
Mc4 bioassay
bull Souběžně s testy 3-generace Kohn vyvinul test využiacutevajiacuteciacute bdquoMc4 chimeacuteruldquo založenou na metodaacutech chemiluminiscence 1)
bull Ciacutelem bylo měřit pouze stimulujiacuteciacute protilaacutetky a tiacutem dosaacutehnout jasneacuteho cutoff mezi pacienty s GD a kontrolami
bull Porovnaacuteniacute senzitivity a specifity v tabulce 2) bull Mc4 testy mohou byacutet využity jako testy prvniacute
volby pro pacienty s GD
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Mc4 bioassay
bull Testy s M22 diacuteky podobně specifitě a senzitivitě ale lepšiacute bdquoproveditelnostildquo jsou zatiacutem preferovanějšiacute
bull Daacutele jsou lepšiacute pro prognoacutezu GD než testy s M22 a leacutepe korelujiacute s aktivitou a zaacutevažnostiacute GD orbitopatiiacute 2)
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Bridge Assay
bull Novaacute technologie využitiacute chimeacuterickyacutech receptorů Mc4 a N-terminaacutelniacute TSHr fůsovanyacute s alkalickou fosfataacutezou 1) senzitivita 998 a specifita 995
bull TSI ndash Siemens tato metoda je založena na sendvičoveacutem kompetetivniacute formaacutetu kteryacute se lišiacute od klasickeacuteho kompetetivniacute formaacutetu komerčniacutech IMA druheacute a třetiacute generace 2)
1)Frank CU Braeth S Dietrich JW Wanjura D Loos U Bridge technology with TSH receptor chimera for sensitive direct detection of TSH receptor antibodies causing Gravesrsquo disease analytical and clinical evaluation Horm Metab Res (2015) 47880ndash8 doi101055s-0035-1554662 2)Tozzoli R DrsquoAurizio F Villalta D Giovanella L (2017) Evalu- ation of the first fully automated immunoassay method for the measurement of stimulating TSH receptor autoantibodies in Gravesrsquo disease Clin Chem Lab Med 5558ndash64
Mezinaacuterodniacute standard
bull Prvniacute mezinaacuterodniacute standard připraven v r 1995 WHO označeniacute 90672 Připraven ECBS zdroj pacientskaacute plasma
bull V r 2006 nahrazen lidskou monoklonaacutelniacute protilaacutetkou M22 (NIBSC 08240) odkazuje na detekci S-TRAb 1)
1) Diana T1 Kanitz M Lehmann M Li Y Olivo PD Kahaly GJ Standardization of a bioassay for thyrotropin receptor stimulating autoantibodies Thyroid 2015 Feb25(2)169-75
EHK ndash SEKK AT217
EHK ndash SEKK AT217
SEKK - Dotazniacutek
EHK ndash SEKK AT113
EHK ndash SEKK AT113
Hashimotova tyreoiditida (HT)
bull HT 1) a SLE 2) byly prvniacute dvě autoimunitniacute onemocněniacute kde se prokaacutezala genetickaacute asociace (geny MHC třiacutedy II) 70 leacuteta
bull Nicmeacuteně nebyl nalezen gen kteryacute by spouštěl HT nalezeny pouze geny ktereacute přispiacutevajiacute k fenotypu onemocněniacute 3)
1)VladutiuAO RoseNR Autoimmunemurine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type Science 19711741137ndash9 2)Grumet FC Coukell A Bodmer JG Bodmer WF McDevitt HO Histocompatibility (HL-A) antigens associated with systemic lupus erythematosus A possible genetic predisposition to disease N Engl J Med 1971285193ndash6 3) Simmonds MJ Gough SC The search for the genetic contribution to autoimmune thyroid disease the never ending story Brief Funct Genomics 20111077ndash90
Hashimotova tyreoiditida
bull Do 50 let raritniacute onemocněniacute nyniacute nejběžnějšiacute s prevalenciacute 81000 biochemickyacute naacutelez + autoprotilaacutetky 461000
bull Ženymuži 81
a-TPO
bull Přiacutetomnost protilaacutetek TPOAb obvykle předchaacuteziacute vzniku tyreoidaacutelniacute dysfunkce
bull Patogenetickaacute role protilaacutetek TgAb zůstaacutevaacute nejasnaacute
a-TPO
bull Autoprotilaacutetky TPOAb byly nejdřiacuteve popsaacuteny jako antimikrozomaacutelniacute autoprotilaacutetky (AMA) neboť bylo zjištěno že reagujiacute s neupravenyacutemi membraacutenami tyreoidaacutelniacutech buněk
bull Mikrozomaacutelniacute antigen byl později popsaacuten jako TPO
bull Dřiacuteve se využiacutevaly ke stanoveniacute TPO metody imunofluorescenčniacute metody a aglutinačniacute testy s pasivniacutem barveniacutem erytrocytů
a-TPO jako rizikovyacute faktor
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TPO je znaacutemyacutem rizikovyacutem faktorem pro vznik tyreoidaacutelniacute dysfunkce pokud jsou pacienti leacutečeni lithiem amiodaronem interleukinem-2 nebo alfa-interferonem
a-TG
bull Tg vykazuje vysokou heterogenitu způsobenou rozdiacutely v posttranslačniacutech modifikaciacutech (glykosylace jodizace sulfatace atd) Během synteacutezy tyreoidaacutelniacuteho hormonu a jeho uvolněniacute je Tg polymerizovaacuten a degradovaacuten
bull Vlivem toho je imunologickaacute struktura Tg mimořaacutedně komplexniacute Charakteristika standardů pro Tg se může lišit v zaacutevislosti na vstupniacute lidskeacute tyreoidaacutelniacute tkaacuteni a použiteacutem purifikačniacutem procesu To vysvětluje proč jsou testy na TgAb a takeacute Tg tak obtiacutežně standardizovatelneacute
Titr protilaacutetek
bull Titr protilaacutetek literaacuterně koreluje s počtem autoreaktivniacutech lymfocytů ktereacute infiltrujiacute štiacutetnou žlaacutezu a sonografickyacutem obrazem 1)
bull a-TG nižšiacute senzitivita (60-80 u HT) a menšiacute specifita (pozitivniacute ve většiacute čaacutesti zdravyacutech kontrol) než a-TPO
bull a-TG a a-TPO představujiacute dva různeacute aspekty autoimunniacute odpovědi na štiacutetnou žlaacutezu a-TG by mohly odraacutežet počaacutetečniacute (vrozenyacute) typ imunitniacute odpovědi zatiacutemco a-TPO by mohly charakterizovat pozdějšiacute adaptivniacute imunitniacute odpovědi 2)
1)Pandit AA VijayWardeMMenon PS Correlation of number of intrathyroid lympho- cytes with antimicrosomal antibody titer in Hashimotos thyroiditis Diagn Cytopathol 20032863ndash5 2) Rose NR Autoimmune escalation through the crystal ball Clin Exp Immunol 20071479
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
Gravesova-Basedovaacute nemoc
bull Gravesova nemoc (GD) je autoimunitniacute onemocněniacute zprostředkovaneacute autoprotilaacutetkami a charakterizovaneacute tyreotoxikoacutezou strumou a orbitopatiiacute
bull Cirkulujiacuteciacutemi autoprotilaacutetky napodobujiacute působeniacute TSH vaacutežou se a aktivujiacute TSHr což vede ke zvyacutešeneacute synteacuteze a uvolněniacute hormonů štiacutetneacute žlaacutezy (hypertyreoacuteza) a hypertrofie folikulaacuterniacutech buněk štiacutetneacute žlaacutezy (vole)
bull Ačkoli je definovaacutena jako autoimunitniacute onemocněniacute orgaacutenově specifickeacute přiacuteznaky GD jsou multiorgaacutenoveacute a to buď autoimunitniacutem procesem nebo jako komplikaciacute tyreotoxikoacutezy
Scheacutema ndash Hormony štiacutetneacute žlaacutezy
Upraveno dle httpsgravesdiseaseprojectwordpresscom
Genetika + GD
bull Etiologie GD neniacute staacutele znaacutema multifaktoriaacutelniacute onemocněniacute komplexniacute interakciacute mezi genetickou predispoziciacute a environmentaacutelniacutemi faktory kteraacute vede ke ztraacutetě imunitiniacute tolerance k tyreoidaacutelniacutem antigenům a inicilizaci autoimunitniacute reakci
bull Vliv prostřediacute (kouřeniacute infekce stres leacuteky nedostatek mikronutrientů přiacutejem iodu)
bull Immune regulatory genes (HLA-DR CTLA4 CD40 PTPN22 a Thyroid specific genes (thyroglobulin TSHR) ale jejich vliv je malyacute 1)
bull Předpoklaacutedaacute se že GD neniacute dědičneacute onemocněniacute ale často se objevuje spolu s autoimunitniacute tyroiditidou v raacutemci rodinnyacutech přiacuteslušniacuteků
1)Tomer Y Huber A The etiology of autoimmune thyroid disease a story of genes and environment J Autoimmun 2009 May-Jun32(3ndash4)231ndash9
TSH receptor
bull Receptor pro TSH je členem superrodiny receptorů se sedmi transmembraacutenovyacutemi domeacutenami ktereacute jsou spojeneacute s G- proteiny Gen receptoru pro TSH o molekuloveacute hmotnosti 60 kb umiacutestěnyacute na dlouheacutem rameacutenku chromozomu 14q31
bull Maacute dvě podjednotky extracelulaacuterniacute A a transmembraacutenovou B
bull Aktivace G-proteinů komplexem hormon-receptor maacute za naacutesledek stimulaci produkce cAMP pomociacute adenylaacutetcyklaacutezy
Protilaacutetky bull Je popsaacuteno několik variant a-TSHr stimulujiacuteciacute blokujiacuteciacute a
neutraacutelniacute bull a-TSHr podobně jako TSH se primaacuterně vaacuteže na N-terminaacutelniacute
čaacutest extracelulaacuterniacute domeacuteny TSHr a aktivuje draacutehu transdukce signaacutelu cAMP ndash předevšiacutem STIMULUJIacuteCIacute protilaacutetky vedouciacute ke stimulaci tvorby tyroidniacutech hormonů a proliferaci tyrocytů
bull Jineacute typy protilaacutetek mohou TSHr antagonizovat nebo blokovat uacutečinek TSH a tiacutem způsobit hypotyreoacutezu u některyacutech pacientů s různyacutemi typy autoimunitniacute tyroiditidy zejmeacutena Hashimotovou tyreoiditidou 1)
bull Neutraacutelniacute (nově nazyacutevaneacute i apoptickeacute) a-TSHr jsou namiacuteřeny proti clevage region a můžou indukovat signaacutelniacute draacutehy odlišneacute od draacutehy cAMP a indukujiacute apoptoacutezu tyrocytů 2)
1) (Kahaly GJ Diana T TSH receptor antibody functionality and nomenclature Front Endocrinol (2017) 2)Danilo Villalta Federica DrsquoAurizio Mirella Da Re Debora Ricci Francesco Latrofa Renato Tozzoli Diagnostic accuracy of a new fluoroenzyme immunoassay for the detection of TSH receptor autoantibodies in Gravesrsquo disease
MOMENKLATURA dle Kahaly GJ Diana T TSH receptor antibody functionality and nomenclature Front
Endocrinol (2017) 828103389fendo201700028
Stimulujiacuteciacute ndash N-terminaacutel region Neutralniacute ndash Cleavage region Blokujiacuteciacute ndash C-terminaacutel region
Upraveno dle Balucan FS Morshed SA Davies TF Thyroid autoantibodies in pregnancy their role regulation and clinical relevance J Thyroid Res (2013) 2013
Protilaacutetky
bull Přiacutetomnost a-TSHr vylučuje dalšiacute tyreotoxikosy
bull Koncentrace protilaacutetek nesloužiacute pouze k určeniacute diagnosy ale i k predikci vyacutevoje onemocněniacute 1)2)
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TSHr v těhotenstviacute je rizikovyacutem faktorem pro dysfunkci štiacutetneacute žlaacutezy novorozence v důsledku transplacentaacuterniacuteho přenosu mateřskyacutech protilaacutetek
1) Jang SY Shin DY Lee EJ Lee SY Yoon JS Relevance of TSH-receptor anti- body levels in predicting disease course in Gravesrsquo orbitopathy comparison of the third-generation TBII assay and Mc4-TSI bioassay Eye (Lond) (2013) 27964ndash71 2) Bartalena L Burch HB Burman KD Kahaly GJ A 2013 European survey of clinical practice patterns in the management of Gravesrsquo disease Clin Endocrinol (2016) 84115ndash20
Protilaacutetky
bull a-TSHr je patogenetickyacute znak GD detekovatelnyacute prakticky u všech pacientů s GD Protilaacutetky jsou zodpovědneacute za patologickeacute funkce nemoci (stimulace růstu a funkce štiacutetneacute žlaacutezy orbitopatie dermatologickeacute potiacuteže)1)
bull a-TSHr se uacutečastniacute patogeneze u hypotyreodismu i u atrofickeacute formy Hashimotoveacute tyreoitidy 2)
bull TSHr je exprimovaacuten v řadě extra-tyroidniacutech buněk včetně fibroblastů adipocytů a kostniacutech buněk kde je znaacutemo že moduluje funkci ciacutelovyacutech buněk
1)Michalek K Morshed SA Latif R Davies TF TSH receptor autoantibodies Autoimmun Rev (2009) 9113ndash6 doi101016jautrev200903012 2) Giuliani C Monaco F Adult primary hypothyroidism In Monaco F editor Thyroid Diseases Boca Raton FL CRC Press (2012) p 171ndash94
Protilaacutetky
bull Titr a-TSHr taky klesajiacute po tyroidektomii (čaacutestečneacute či celkoveacute) kvůli odstraněniacute zdroje antigenu
bull Naopak naacuterůst titrů a-TSHr pozorujeme po leacutečbě radioiodine I131 (asi dle uvolněniacute antigenů a zpracovaacuteniacute antigenů antigen-presentujiacuteciacutemi buňkami)
Protilaacutetky + typ bull Bylo prokaacutezaacuteno že nedostatečnaacute korelace mezi
koncentracemi a-TSHr a klinickyacutem stavem pacienta je většinou způsobena tiacutem že protilaacutetky a-TSHr v oběhu jsou heterogenniacute
bull Přechod z TSAbs na TBAbs je zodpovědnyacute za vyacutevoj hypotyreoacutezy u maleacuteho procenta pacientů s Gravesovou nemociacute a naopak
bull Skutečnost že heterogenniacute protilaacutetky a-TSHr mohou koexistovat u jednoho pacienta a měnit se v průběhu času je jedniacutem z důvodů proč bylo těžkeacute vyvinout diagnosticky přesneacute testy na stanoveniacute protilaacutetek a-TSHr
bull Klinickeacute projevy pacientů s Gravesovou chorobou kteřiacute vykazujiacute přiacutetomnost protilaacutetek TSAb i TBAbTSBAb budou zaacutevisleacute spiacuteše na relativniacute koncentraci a afinitě predominantniacute protilaacutetky
Protilaacutetky - sledovaacuteniacute
bull Sledovaacuteniacute hladin TSAb přidaacutevaacute dalšiacute rozměr k hodnoceniacute aktivity GD s potenciaacutelem předpovědět recidivu nebo remisii u jednotlivyacutech pacientů
bull Vysokaacute perzistentniacute hladina TSAb je spojena s aktivniacutemi a zaacutevažnyacutemi systeacutemovyacutemi projevy a se špatnou odezvou na terapii Naopak niacutezkeacute hladiny TSAb jsou nachaacutezeny u pacientů v remisi
Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Diagnostika
bull a-TSHr lze měřit v podstatě dvěma typy testů
ndash Biologickyacutem testem (biotestem bioassay) ktereacute detekujiacute produkci cAMP v buněčnyacutech kulturaacutech inkubovanyacutech se seacuterami pacientů Tyto testy identifikujiacute pouze stimulačniacute a-TSHr Biotesty prokazujiacute nejen přiacutetomnost Ab ale takeacute jejich funkčniacute aktivitu a uacutečinnost Historicky sloužily biotesty k vyacutezkumu ke studiu patofyziologie GD
ndash Protilaacutetkoveacute testy (vazebneacute receptoroveacute) Naopak receptoroveacute metody rutinně použiacutevaneacute v klinickyacutech laboratořiacutech udaacutevajiacute pouze přiacutetomnost nebo nepřiacutetomnost a-TSHr a jejich koncentrace ale neuvaacutedějiacute jejich funkčniacute aktivitu 2)
bull Tento zaacutekladniacute rozdiacutel v uspořaacutedaacuteniacute metody vysvětluje proč biotesty a protilaacutetkoveacute testy vykazujiacute nižšiacute korelaci (r = 031 ndash 065) 1)
1)Gupta MK Thyrotropin-receptor antibodies in thyroid diseases advances in detection techniques and clinical application Clin Chem Acta 20002931-29 2) Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Biotesty
bull Biotesty mohou detekovat funkčniacute změny u heterogenniacutech a-TSHr
bull Skutečnost že heterogenniacute protilaacutetky a-TSHr mohou koexistovat u jednoho pacienta a měnit se v průběhu času je jedniacutem z důvodů proč bylo těžkeacute vyvinout diagnosticky přesneacute testy na stanoveniacute protilaacutetek a-TSHr
bull Biotesty mohou zlepšit peacuteči o pacienta ve smyslu bdquopersonalisovaneacute mediciacutenyldquo
bull Biotesty jsou nabiacutezeny referenčniacutemi laboratořeni je jistyacute předpoklady že by se mohly viacutece rozšiacuteřit
Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Biotesty
bull Během posledniacutech 60 let se biologickaacute analyacuteza a-TSHr vyvinula těžkopaacutednyacutech a časově naacuteročnyacutech postupů na geneticky upraveneacute testy založeneacute na buňkaacutech ktereacute jsou charakterizovaacuteny dobrou proveditelnostiacute a rychlyacutemi provozniacutemi časy a ktereacute jsou takeacute k dispozici jako komerčniacute sady
bull Komerčně dostupnyacute biotest je Thyretain fa Quidel kteryacute detekuje stimulačniacute aktivitu a-TSHr pomociacute chimeacuterickeacuteho TSHR a genu pro cAMP (signalizace luciferaacutezou) Je schvaacutelen FDA pro použitiacute v klinickyacutech laboratořiacutech
HISTORIE
Historickyacute vyacutevoj metod pro měřeniacute a-TSHr ndash dle Giuliani etal 2016
Cesidio Giuliani1 Motoyasu Saji2 Ines Bucci1 and Giorgio Napolitano Bioassays for TSH Receptor Autoantibodies from FRTL-5 Cells to TSH ReceptorndashLHCG Receptor Chimeras The Contribution of Leonard D Kohn Front Endocrinol (Lausanne) 2016 7 103
LATS
bull V r 1956 Adams a Purves zjistili že seacutera pacientů s tyreotoxikosou indukujiacute abnormaacutelniacute prodlouženou odpověď v TSH testu (s morčetem)1)2)
bull Nazvali jej ldquoabnormal thyroid stimulatorrdquo posleacuteze ldquolong-acting thyroid stimulatorrdquo (LATS) 2)3) bylo jasneacute že je odlišnyacute od TSH a neniacute produkovaacuten hypofyacutezou
bull V roce 1964 byla LATS identifikovaacutena jako protein podobnyacute protilaacutetkaacutem (4) a dalšiacute studie jednoznačně potvrdily že se jednaacute o IgG (56)
bull Prvniacute testy k detekci LATS měly niacutezkou senzitivitu (60-70) 7) bull Vyacuteznamneacute zlepšeniacute v testech nastalo v r 1975 a to s vyacutevojem
radioligandoveacuteho receptoroveacuteho testu Test hodnotil inhibici seacutera od pacientů s GD vaacutezaacutenyacutemi radioaktivně značeneacuteho TSH na lidskeacute tyroidniacute membraacuteny (8 Test byl nicmeacuteně staacutele zatiacutežen niacutezkou přesnostiacute
bull Dalšiacute zlepšeniacute přineslo nahrazeniacute tyroidaacutelniacute membraacuteny čaacutestečně vyčištěneacuteho TSHr - liquid phase first-generation immunoassay použiacutevanaacute dalšiacutech 20 let 910) specifita 99 senzitivita 80 11)
1)Adams DD Purves HD Abnormal responses in the assay of thyrotropin Proc Univ Otago Med Sch (1956) 3411ndash5 2)Adams DD The presence of an abnormal thyroid-stimulating hormone in the serum of some thyrotoxic patients J Clin Endocrinol Metab (1958) 18699ndash712 doi101210jcem-18-7-699 3) Adams DD Bioassay of long-acting thyroid stimulator (LATS) the dose-re- sponse relationship J Clin Endocrinol Metab (1961) 21799ndash805 4) Kriss JP Pleshakov V Chien JR Isolation and identification of the long-acting thyroid stimulator and its relation to hyperthyroidism and circumscribed pretibial myxedema J Clin Endocrinol Metab (1964) 241005ndash28 doi101210 jcem-24-10-1005 5) Kriss JP Inactivation of long-acting thyroid stimulator (LATS) by anti- kappa and anti-lamba antisera J Clin Endocrinol Metab (1968) 281440ndash4 doi101210jcem-28-10-1440 6) Volpeacute R The immunologic basis of Gravesrsquos disease N Engl J Med (1972) 287463ndash4 doi101056NEJM197208312870910 7) McKenzie JM Review pathogenesis of Gravesrsquo disease role of the long-acting thyroid stimulator J Clin Endocrinol Metab (1965) 25424ndash31 8) Mehdi SQ Nussey SS A radio-ligand receptor assay for the long-acting thy- roid stimulator Inhibition by the long-acting thyroid stimulator of the binding of radioiodinated thyroid stimulating hormone to human thyroid membranes Biochem J (1975) 145105ndash11 doi101042bj1450105 9)Shewring G Rees Smith B An improved radioreceptor assay for TSH receptor antibodies Clin Endocrinol (1982) 17409ndash17 doi101111j1365-22651982 tb01607x 10)Southgate K Creagh FM Teece M Kingswood C Rees Smith B A receptor assay for the measurement of TSH receptor antibodies in unextracted serum Clin Endocrinol (1984) 20539ndash48 doi101111j1365-22651984tb00102x 11)Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003
FRTL-5 bull Souběžně s vyacutevojem radioligandovyacutech receptorovyacutech testů dochaacutezelo k vyacutevoji
bdquobiotestůldquo Změna v in vivo na in vitro jako je použitiacute primaacuterniacutech buněčnyacutech kultur 1)
bull Dalšiacute zlepšeniacute přišlo s použitiacutem FRTL-5 buněk ndash netransformovanyacutech buněčnyacutech liniiacute krysiacutech thyroid epithelial buněk v kontinuaacutelniacute kultuře 2) Test byl založen na schopnosti purifikovanyacutech IgG indukovat produkci cAMP Naacutesledně bylo umožněno využiacutet pacientskeacute seacutera 3)
bull Tento test nesloužil jen pro diagnostiku ale měl zaacutesadniacute vyacuteznam v pochopeniacute patfyz vlastnostiacute a-TSHr
bull Kohn etal 4)5)6) vyvinuli monoklonaacutelniacute protilaacutetku k hodnoceniacute jejiacutech funkčniacutech vlastnostiacute
bull Použitiacute buněk FRTL-5 takeacute umožnilo dalšiacute studium funkčniacute heterogenity a-TSHr (samostatneacute posouzeniacute uacutečinků jednotlivyacutech IgG na dvě odlišneacute buněčneacute aktivity aktivity produkce cAMP a buněčneacuteho růstu) 7)
1)Toccafondi RS Aterini S Medici MA Rotella CM Tanini A Zonefrati R Thyroid-stimulating antibody (TSAb) detected in sera of Gravesrsquo patients using human thyroid cell cultures Clin Exp Immunol (1980) 40532ndash9 2) Ambesi-Impiombato FS Parks LAM Coon HG Culture of hormone-depen- dent functional epithelial cells from rat thyroids Proc Natl Acad Sci U S A (1980) 773455ndash9 doi101073pnas7763455 3) Vitti P Chiovato L Lopez G Lombardi A Santini F Mammoli C et al Measurement of TSAb directly in serum using FRTL-5 cells J Endocrinol Invest (1988) 11313ndash7 doi101007BF03350157 4) Yavin E Yavin Z Schneider MD Kohn LD Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor implications for receptor structure and the action of autoantibodies in Gravesrsquo disease Proc Natl Acad Sci U S A (1981) 783180ndash4 doi101073pnas7853180 5) Valente WA Vitti P Yavin Z Yavin E Rotella CM Grollman EF et al Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor stimulating and blocking antibodies derived from the lymphocytes of patients with Gravesrsquo disease Proc Natl Acad Sci U S A (1982) 796680ndash4 doi101073pnas79216680 6) Valente WA Yavin Z Yavin E Grollman EF Schneider M Rotella CM et al Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor the identification of blocking and stimulating antibodies J Endocrinol Invest (1982) 5293ndash301 doi101007BF03350517 7) Valente WA Vitti P Rotella CM Vaughan MM Aloj SM Grollman EF et al Antibodies that promote thyroid growth A distinct population of thyroid-stimulating autoantibodies N Engl J Med (1983) 3091028ndash34 doi101056NEJM198310273091705
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 1
bull Hlavniacute průlom přišel s naklonovaacuteniacutem TSHr v r 1989 1-3) ndash využitiacute lidskeacuteho TSHr pro RIA i bioassays 45) ndash senzitivita 96 pro RIA
bull Pomociacute mutačniacutech technik byly připraveny chimerickeacute TSHr
bull V 90 leacutetech byly vyvinuty monoklonaacutelniacute protilaacutetky proti C-terminus region rh-TSHr 67)
1)Parmentier M Libert F Maenhaut C Lefort Gerard C Perret J Van Sande J et al Molecular cloning of the thyrotropin receptor Science (1989) 2461620ndash2 doi101126science2556796 2)Nagayama Y Kaufman KD Seto P Rapoport B Molecular cloning sequence and functional expression of the cDNA for the human thyrotropin receptor Biochem Biophys Res Commun (1989) 1651184ndash90 doi1010160006- 291X(89)92727-7 3) Akamizu T Ikuyama S Saji M Kosugi S Kozak C McBride OW et al Cloning chromosomal assignment and regulation of the rat thyrotropin receptor expression of the gene is regulated by thyrotropin agents that increase cAMP levels and thyroid autoantibodies Proc Natl Acad Sci U S A (1990) 875677ndash81 doi101073pnas87155677 4)Ludgate M Perret J Parmentier M Gerard C Libert F Dumont JE et al Use of recombinant human thyrotropin receptor (TSH-R) expressed in mammalian cell lines to assay TSH-R autoantibodies Mol Cell Endocrinol (1991) 73R13ndash8 doi1010160303-7207(90)90050-I 5) Filetti S Foti D Costante G Rapoport B Recombinant human thyrotropin (TSH) receptor in a radioreceptor assay for the measurement of TSH receptor autoantibodies J Clin Endocrinol Metab (1991) 721096ndash101 doi101210 jcem-72-5-1096 6) Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 7)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 2
bull Druhaacute generace imunotestů (ELISA) ndash solid-phase ndash se staly standardem pro dg a-TSHr diacuteky přesnosti (988 senzitivita a 996 specifita) a non-RIA 123)
bull Použitiacutem rh-TSHr nebo vepřovyacute TSHr ziacuteskaacuteme stejnou analytickou přesnost3)
1)Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 2)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071 3)Kamijo K TSH-receptor antibody measurement in patients with various thyrotoxicosis and Hashimotorsquos thyroiditis a comparison of two two-step assays coated plate ELISA using porcine TSH-receptor and coated tube radio- assay using human recombinant TSH-receptor Endocr J (2003) 50113ndash6 doi101507endocrj50113
Monoclonal a-TSHr stimulujiacuteciacute
bull Na přelomu mileacutenia byly studovaacuteny stimulujiacuteciacute protilaacutetky a-TSHr 123)
bull Tato data jsou zaacutesadniacute pro pochopeniacute vztahů struktury a funkciacute TSHRr a jejiacute role v patogenezi Gravesovy choroby
bull To vše vedlo k izolaci a charakterizaci lidskeacute monoklonaacutelniacute protilaacutetky a-TSHr stimulujiacuteciacute ndash M22 4)
1)Ando T Latif R Pritsker A Moran T Nagayama Y Davies TF A monoclonal thyroid-stimulating antibody J Clin Invest (2002) 1101667ndash74 doi101172 JCI0216991 2)Costagliola S Franssen JDF Bonomi M Urizar E Willnich M Bergmann A et al Generation of a mouse monoclonal TSH receptor antibody with stimu- lating activity Biochem Biophys Res Commun (2002) 299891ndash6 doi101016 S0006-291X(02)02762-6 3)Sanders J Jeffreys J Depraetere H Richards T Evans M Kiddie A et al Thyroid-stimulating monoclonal antibodies Thyroid (2002) 121043ndash50 doi101089105072502321085135 4) Sanders J Evans M Premawardhana LDKE Depraetere H Jeffreys J Richards T et al Human monoclonal stimulating autoantibody Lancet (2003) 362126ndash8 doi101016S0140-6736(03)13866-4
Třetiacute generace testů ndash M22
bull V r2004 byl vyvinut test použitiacutem M22 ve formaacutetu ELISA 1) senzitivita 974 a specifita 992 (např Medipan)
bull Test byl vhodnyacute i pro automatizaci 23)
bull Dostupnost a znalost jak stimulujiacuteciacutech tak blokujiacuteciacutech protilaacutetek byla důležitaacute k pochopeniacute krystalickeacute struktury TSHr a jejiacutech interakciacute s a-TSHr 4) poukaacutezalo to na širokeacute překryvy epitopů mezi stimulujiacuteciacutemi a blokujiacuteciacutemi protilaacutetkami 4)
bull Roche nativniacute vepřovyacute TSH s M22
1)Rees Smith B Bolton J Young S Collyer A Weeden A Bradbury J et al A new assay for thyrotropin receptor autoantibodies Thyroid (2004) 14830ndash5 doi1010891050725042451248 2) Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003 3) Zophel K Roggenbuck D von Landenberg P Wunderlich G Gruning T Kotzerke J et al TSH receptor antibody (TRAb) assays based on the human monoclonal autoantibody M22 are more sensitive than bovine TSH based assays Horm Metab Res (2010) 4265ndash9 doi101055s-0029-1241196 4) Furmaniak J Sanders J Nunez Miguel R Rees Smith B Mechanisms of action of TSHR autoantibodies Horm Metab Res (2015) 47735ndash52 doi10105 5s-0035-1559648
Mc4 bioassay
bull Souběžně s testy 3-generace Kohn vyvinul test využiacutevajiacuteciacute bdquoMc4 chimeacuteruldquo založenou na metodaacutech chemiluminiscence 1)
bull Ciacutelem bylo měřit pouze stimulujiacuteciacute protilaacutetky a tiacutem dosaacutehnout jasneacuteho cutoff mezi pacienty s GD a kontrolami
bull Porovnaacuteniacute senzitivity a specifity v tabulce 2) bull Mc4 testy mohou byacutet využity jako testy prvniacute
volby pro pacienty s GD
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Mc4 bioassay
bull Testy s M22 diacuteky podobně specifitě a senzitivitě ale lepšiacute bdquoproveditelnostildquo jsou zatiacutem preferovanějšiacute
bull Daacutele jsou lepšiacute pro prognoacutezu GD než testy s M22 a leacutepe korelujiacute s aktivitou a zaacutevažnostiacute GD orbitopatiiacute 2)
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Bridge Assay
bull Novaacute technologie využitiacute chimeacuterickyacutech receptorů Mc4 a N-terminaacutelniacute TSHr fůsovanyacute s alkalickou fosfataacutezou 1) senzitivita 998 a specifita 995
bull TSI ndash Siemens tato metoda je založena na sendvičoveacutem kompetetivniacute formaacutetu kteryacute se lišiacute od klasickeacuteho kompetetivniacute formaacutetu komerčniacutech IMA druheacute a třetiacute generace 2)
1)Frank CU Braeth S Dietrich JW Wanjura D Loos U Bridge technology with TSH receptor chimera for sensitive direct detection of TSH receptor antibodies causing Gravesrsquo disease analytical and clinical evaluation Horm Metab Res (2015) 47880ndash8 doi101055s-0035-1554662 2)Tozzoli R DrsquoAurizio F Villalta D Giovanella L (2017) Evalu- ation of the first fully automated immunoassay method for the measurement of stimulating TSH receptor autoantibodies in Gravesrsquo disease Clin Chem Lab Med 5558ndash64
Mezinaacuterodniacute standard
bull Prvniacute mezinaacuterodniacute standard připraven v r 1995 WHO označeniacute 90672 Připraven ECBS zdroj pacientskaacute plasma
bull V r 2006 nahrazen lidskou monoklonaacutelniacute protilaacutetkou M22 (NIBSC 08240) odkazuje na detekci S-TRAb 1)
1) Diana T1 Kanitz M Lehmann M Li Y Olivo PD Kahaly GJ Standardization of a bioassay for thyrotropin receptor stimulating autoantibodies Thyroid 2015 Feb25(2)169-75
EHK ndash SEKK AT217
EHK ndash SEKK AT217
SEKK - Dotazniacutek
EHK ndash SEKK AT113
EHK ndash SEKK AT113
Hashimotova tyreoiditida (HT)
bull HT 1) a SLE 2) byly prvniacute dvě autoimunitniacute onemocněniacute kde se prokaacutezala genetickaacute asociace (geny MHC třiacutedy II) 70 leacuteta
bull Nicmeacuteně nebyl nalezen gen kteryacute by spouštěl HT nalezeny pouze geny ktereacute přispiacutevajiacute k fenotypu onemocněniacute 3)
1)VladutiuAO RoseNR Autoimmunemurine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type Science 19711741137ndash9 2)Grumet FC Coukell A Bodmer JG Bodmer WF McDevitt HO Histocompatibility (HL-A) antigens associated with systemic lupus erythematosus A possible genetic predisposition to disease N Engl J Med 1971285193ndash6 3) Simmonds MJ Gough SC The search for the genetic contribution to autoimmune thyroid disease the never ending story Brief Funct Genomics 20111077ndash90
Hashimotova tyreoiditida
bull Do 50 let raritniacute onemocněniacute nyniacute nejběžnějšiacute s prevalenciacute 81000 biochemickyacute naacutelez + autoprotilaacutetky 461000
bull Ženymuži 81
a-TPO
bull Přiacutetomnost protilaacutetek TPOAb obvykle předchaacuteziacute vzniku tyreoidaacutelniacute dysfunkce
bull Patogenetickaacute role protilaacutetek TgAb zůstaacutevaacute nejasnaacute
a-TPO
bull Autoprotilaacutetky TPOAb byly nejdřiacuteve popsaacuteny jako antimikrozomaacutelniacute autoprotilaacutetky (AMA) neboť bylo zjištěno že reagujiacute s neupravenyacutemi membraacutenami tyreoidaacutelniacutech buněk
bull Mikrozomaacutelniacute antigen byl později popsaacuten jako TPO
bull Dřiacuteve se využiacutevaly ke stanoveniacute TPO metody imunofluorescenčniacute metody a aglutinačniacute testy s pasivniacutem barveniacutem erytrocytů
a-TPO jako rizikovyacute faktor
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TPO je znaacutemyacutem rizikovyacutem faktorem pro vznik tyreoidaacutelniacute dysfunkce pokud jsou pacienti leacutečeni lithiem amiodaronem interleukinem-2 nebo alfa-interferonem
a-TG
bull Tg vykazuje vysokou heterogenitu způsobenou rozdiacutely v posttranslačniacutech modifikaciacutech (glykosylace jodizace sulfatace atd) Během synteacutezy tyreoidaacutelniacuteho hormonu a jeho uvolněniacute je Tg polymerizovaacuten a degradovaacuten
bull Vlivem toho je imunologickaacute struktura Tg mimořaacutedně komplexniacute Charakteristika standardů pro Tg se může lišit v zaacutevislosti na vstupniacute lidskeacute tyreoidaacutelniacute tkaacuteni a použiteacutem purifikačniacutem procesu To vysvětluje proč jsou testy na TgAb a takeacute Tg tak obtiacutežně standardizovatelneacute
Titr protilaacutetek
bull Titr protilaacutetek literaacuterně koreluje s počtem autoreaktivniacutech lymfocytů ktereacute infiltrujiacute štiacutetnou žlaacutezu a sonografickyacutem obrazem 1)
bull a-TG nižšiacute senzitivita (60-80 u HT) a menšiacute specifita (pozitivniacute ve většiacute čaacutesti zdravyacutech kontrol) než a-TPO
bull a-TG a a-TPO představujiacute dva různeacute aspekty autoimunniacute odpovědi na štiacutetnou žlaacutezu a-TG by mohly odraacutežet počaacutetečniacute (vrozenyacute) typ imunitniacute odpovědi zatiacutemco a-TPO by mohly charakterizovat pozdějšiacute adaptivniacute imunitniacute odpovědi 2)
1)Pandit AA VijayWardeMMenon PS Correlation of number of intrathyroid lympho- cytes with antimicrosomal antibody titer in Hashimotos thyroiditis Diagn Cytopathol 20032863ndash5 2) Rose NR Autoimmune escalation through the crystal ball Clin Exp Immunol 20071479
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
Scheacutema ndash Hormony štiacutetneacute žlaacutezy
Upraveno dle httpsgravesdiseaseprojectwordpresscom
Genetika + GD
bull Etiologie GD neniacute staacutele znaacutema multifaktoriaacutelniacute onemocněniacute komplexniacute interakciacute mezi genetickou predispoziciacute a environmentaacutelniacutemi faktory kteraacute vede ke ztraacutetě imunitiniacute tolerance k tyreoidaacutelniacutem antigenům a inicilizaci autoimunitniacute reakci
bull Vliv prostřediacute (kouřeniacute infekce stres leacuteky nedostatek mikronutrientů přiacutejem iodu)
bull Immune regulatory genes (HLA-DR CTLA4 CD40 PTPN22 a Thyroid specific genes (thyroglobulin TSHR) ale jejich vliv je malyacute 1)
bull Předpoklaacutedaacute se že GD neniacute dědičneacute onemocněniacute ale často se objevuje spolu s autoimunitniacute tyroiditidou v raacutemci rodinnyacutech přiacuteslušniacuteků
1)Tomer Y Huber A The etiology of autoimmune thyroid disease a story of genes and environment J Autoimmun 2009 May-Jun32(3ndash4)231ndash9
TSH receptor
bull Receptor pro TSH je členem superrodiny receptorů se sedmi transmembraacutenovyacutemi domeacutenami ktereacute jsou spojeneacute s G- proteiny Gen receptoru pro TSH o molekuloveacute hmotnosti 60 kb umiacutestěnyacute na dlouheacutem rameacutenku chromozomu 14q31
bull Maacute dvě podjednotky extracelulaacuterniacute A a transmembraacutenovou B
bull Aktivace G-proteinů komplexem hormon-receptor maacute za naacutesledek stimulaci produkce cAMP pomociacute adenylaacutetcyklaacutezy
Protilaacutetky bull Je popsaacuteno několik variant a-TSHr stimulujiacuteciacute blokujiacuteciacute a
neutraacutelniacute bull a-TSHr podobně jako TSH se primaacuterně vaacuteže na N-terminaacutelniacute
čaacutest extracelulaacuterniacute domeacuteny TSHr a aktivuje draacutehu transdukce signaacutelu cAMP ndash předevšiacutem STIMULUJIacuteCIacute protilaacutetky vedouciacute ke stimulaci tvorby tyroidniacutech hormonů a proliferaci tyrocytů
bull Jineacute typy protilaacutetek mohou TSHr antagonizovat nebo blokovat uacutečinek TSH a tiacutem způsobit hypotyreoacutezu u některyacutech pacientů s různyacutemi typy autoimunitniacute tyroiditidy zejmeacutena Hashimotovou tyreoiditidou 1)
bull Neutraacutelniacute (nově nazyacutevaneacute i apoptickeacute) a-TSHr jsou namiacuteřeny proti clevage region a můžou indukovat signaacutelniacute draacutehy odlišneacute od draacutehy cAMP a indukujiacute apoptoacutezu tyrocytů 2)
1) (Kahaly GJ Diana T TSH receptor antibody functionality and nomenclature Front Endocrinol (2017) 2)Danilo Villalta Federica DrsquoAurizio Mirella Da Re Debora Ricci Francesco Latrofa Renato Tozzoli Diagnostic accuracy of a new fluoroenzyme immunoassay for the detection of TSH receptor autoantibodies in Gravesrsquo disease
MOMENKLATURA dle Kahaly GJ Diana T TSH receptor antibody functionality and nomenclature Front
Endocrinol (2017) 828103389fendo201700028
Stimulujiacuteciacute ndash N-terminaacutel region Neutralniacute ndash Cleavage region Blokujiacuteciacute ndash C-terminaacutel region
Upraveno dle Balucan FS Morshed SA Davies TF Thyroid autoantibodies in pregnancy their role regulation and clinical relevance J Thyroid Res (2013) 2013
Protilaacutetky
bull Přiacutetomnost a-TSHr vylučuje dalšiacute tyreotoxikosy
bull Koncentrace protilaacutetek nesloužiacute pouze k určeniacute diagnosy ale i k predikci vyacutevoje onemocněniacute 1)2)
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TSHr v těhotenstviacute je rizikovyacutem faktorem pro dysfunkci štiacutetneacute žlaacutezy novorozence v důsledku transplacentaacuterniacuteho přenosu mateřskyacutech protilaacutetek
1) Jang SY Shin DY Lee EJ Lee SY Yoon JS Relevance of TSH-receptor anti- body levels in predicting disease course in Gravesrsquo orbitopathy comparison of the third-generation TBII assay and Mc4-TSI bioassay Eye (Lond) (2013) 27964ndash71 2) Bartalena L Burch HB Burman KD Kahaly GJ A 2013 European survey of clinical practice patterns in the management of Gravesrsquo disease Clin Endocrinol (2016) 84115ndash20
Protilaacutetky
bull a-TSHr je patogenetickyacute znak GD detekovatelnyacute prakticky u všech pacientů s GD Protilaacutetky jsou zodpovědneacute za patologickeacute funkce nemoci (stimulace růstu a funkce štiacutetneacute žlaacutezy orbitopatie dermatologickeacute potiacuteže)1)
bull a-TSHr se uacutečastniacute patogeneze u hypotyreodismu i u atrofickeacute formy Hashimotoveacute tyreoitidy 2)
bull TSHr je exprimovaacuten v řadě extra-tyroidniacutech buněk včetně fibroblastů adipocytů a kostniacutech buněk kde je znaacutemo že moduluje funkci ciacutelovyacutech buněk
1)Michalek K Morshed SA Latif R Davies TF TSH receptor autoantibodies Autoimmun Rev (2009) 9113ndash6 doi101016jautrev200903012 2) Giuliani C Monaco F Adult primary hypothyroidism In Monaco F editor Thyroid Diseases Boca Raton FL CRC Press (2012) p 171ndash94
Protilaacutetky
bull Titr a-TSHr taky klesajiacute po tyroidektomii (čaacutestečneacute či celkoveacute) kvůli odstraněniacute zdroje antigenu
bull Naopak naacuterůst titrů a-TSHr pozorujeme po leacutečbě radioiodine I131 (asi dle uvolněniacute antigenů a zpracovaacuteniacute antigenů antigen-presentujiacuteciacutemi buňkami)
Protilaacutetky + typ bull Bylo prokaacutezaacuteno že nedostatečnaacute korelace mezi
koncentracemi a-TSHr a klinickyacutem stavem pacienta je většinou způsobena tiacutem že protilaacutetky a-TSHr v oběhu jsou heterogenniacute
bull Přechod z TSAbs na TBAbs je zodpovědnyacute za vyacutevoj hypotyreoacutezy u maleacuteho procenta pacientů s Gravesovou nemociacute a naopak
bull Skutečnost že heterogenniacute protilaacutetky a-TSHr mohou koexistovat u jednoho pacienta a měnit se v průběhu času je jedniacutem z důvodů proč bylo těžkeacute vyvinout diagnosticky přesneacute testy na stanoveniacute protilaacutetek a-TSHr
bull Klinickeacute projevy pacientů s Gravesovou chorobou kteřiacute vykazujiacute přiacutetomnost protilaacutetek TSAb i TBAbTSBAb budou zaacutevisleacute spiacuteše na relativniacute koncentraci a afinitě predominantniacute protilaacutetky
Protilaacutetky - sledovaacuteniacute
bull Sledovaacuteniacute hladin TSAb přidaacutevaacute dalšiacute rozměr k hodnoceniacute aktivity GD s potenciaacutelem předpovědět recidivu nebo remisii u jednotlivyacutech pacientů
bull Vysokaacute perzistentniacute hladina TSAb je spojena s aktivniacutemi a zaacutevažnyacutemi systeacutemovyacutemi projevy a se špatnou odezvou na terapii Naopak niacutezkeacute hladiny TSAb jsou nachaacutezeny u pacientů v remisi
Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Diagnostika
bull a-TSHr lze měřit v podstatě dvěma typy testů
ndash Biologickyacutem testem (biotestem bioassay) ktereacute detekujiacute produkci cAMP v buněčnyacutech kulturaacutech inkubovanyacutech se seacuterami pacientů Tyto testy identifikujiacute pouze stimulačniacute a-TSHr Biotesty prokazujiacute nejen přiacutetomnost Ab ale takeacute jejich funkčniacute aktivitu a uacutečinnost Historicky sloužily biotesty k vyacutezkumu ke studiu patofyziologie GD
ndash Protilaacutetkoveacute testy (vazebneacute receptoroveacute) Naopak receptoroveacute metody rutinně použiacutevaneacute v klinickyacutech laboratořiacutech udaacutevajiacute pouze přiacutetomnost nebo nepřiacutetomnost a-TSHr a jejich koncentrace ale neuvaacutedějiacute jejich funkčniacute aktivitu 2)
bull Tento zaacutekladniacute rozdiacutel v uspořaacutedaacuteniacute metody vysvětluje proč biotesty a protilaacutetkoveacute testy vykazujiacute nižšiacute korelaci (r = 031 ndash 065) 1)
1)Gupta MK Thyrotropin-receptor antibodies in thyroid diseases advances in detection techniques and clinical application Clin Chem Acta 20002931-29 2) Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Biotesty
bull Biotesty mohou detekovat funkčniacute změny u heterogenniacutech a-TSHr
bull Skutečnost že heterogenniacute protilaacutetky a-TSHr mohou koexistovat u jednoho pacienta a měnit se v průběhu času je jedniacutem z důvodů proč bylo těžkeacute vyvinout diagnosticky přesneacute testy na stanoveniacute protilaacutetek a-TSHr
bull Biotesty mohou zlepšit peacuteči o pacienta ve smyslu bdquopersonalisovaneacute mediciacutenyldquo
bull Biotesty jsou nabiacutezeny referenčniacutemi laboratořeni je jistyacute předpoklady že by se mohly viacutece rozšiacuteřit
Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Biotesty
bull Během posledniacutech 60 let se biologickaacute analyacuteza a-TSHr vyvinula těžkopaacutednyacutech a časově naacuteročnyacutech postupů na geneticky upraveneacute testy založeneacute na buňkaacutech ktereacute jsou charakterizovaacuteny dobrou proveditelnostiacute a rychlyacutemi provozniacutemi časy a ktereacute jsou takeacute k dispozici jako komerčniacute sady
bull Komerčně dostupnyacute biotest je Thyretain fa Quidel kteryacute detekuje stimulačniacute aktivitu a-TSHr pomociacute chimeacuterickeacuteho TSHR a genu pro cAMP (signalizace luciferaacutezou) Je schvaacutelen FDA pro použitiacute v klinickyacutech laboratořiacutech
HISTORIE
Historickyacute vyacutevoj metod pro měřeniacute a-TSHr ndash dle Giuliani etal 2016
Cesidio Giuliani1 Motoyasu Saji2 Ines Bucci1 and Giorgio Napolitano Bioassays for TSH Receptor Autoantibodies from FRTL-5 Cells to TSH ReceptorndashLHCG Receptor Chimeras The Contribution of Leonard D Kohn Front Endocrinol (Lausanne) 2016 7 103
LATS
bull V r 1956 Adams a Purves zjistili že seacutera pacientů s tyreotoxikosou indukujiacute abnormaacutelniacute prodlouženou odpověď v TSH testu (s morčetem)1)2)
bull Nazvali jej ldquoabnormal thyroid stimulatorrdquo posleacuteze ldquolong-acting thyroid stimulatorrdquo (LATS) 2)3) bylo jasneacute že je odlišnyacute od TSH a neniacute produkovaacuten hypofyacutezou
bull V roce 1964 byla LATS identifikovaacutena jako protein podobnyacute protilaacutetkaacutem (4) a dalšiacute studie jednoznačně potvrdily že se jednaacute o IgG (56)
bull Prvniacute testy k detekci LATS měly niacutezkou senzitivitu (60-70) 7) bull Vyacuteznamneacute zlepšeniacute v testech nastalo v r 1975 a to s vyacutevojem
radioligandoveacuteho receptoroveacuteho testu Test hodnotil inhibici seacutera od pacientů s GD vaacutezaacutenyacutemi radioaktivně značeneacuteho TSH na lidskeacute tyroidniacute membraacuteny (8 Test byl nicmeacuteně staacutele zatiacutežen niacutezkou přesnostiacute
bull Dalšiacute zlepšeniacute přineslo nahrazeniacute tyroidaacutelniacute membraacuteny čaacutestečně vyčištěneacuteho TSHr - liquid phase first-generation immunoassay použiacutevanaacute dalšiacutech 20 let 910) specifita 99 senzitivita 80 11)
1)Adams DD Purves HD Abnormal responses in the assay of thyrotropin Proc Univ Otago Med Sch (1956) 3411ndash5 2)Adams DD The presence of an abnormal thyroid-stimulating hormone in the serum of some thyrotoxic patients J Clin Endocrinol Metab (1958) 18699ndash712 doi101210jcem-18-7-699 3) Adams DD Bioassay of long-acting thyroid stimulator (LATS) the dose-re- sponse relationship J Clin Endocrinol Metab (1961) 21799ndash805 4) Kriss JP Pleshakov V Chien JR Isolation and identification of the long-acting thyroid stimulator and its relation to hyperthyroidism and circumscribed pretibial myxedema J Clin Endocrinol Metab (1964) 241005ndash28 doi101210 jcem-24-10-1005 5) Kriss JP Inactivation of long-acting thyroid stimulator (LATS) by anti- kappa and anti-lamba antisera J Clin Endocrinol Metab (1968) 281440ndash4 doi101210jcem-28-10-1440 6) Volpeacute R The immunologic basis of Gravesrsquos disease N Engl J Med (1972) 287463ndash4 doi101056NEJM197208312870910 7) McKenzie JM Review pathogenesis of Gravesrsquo disease role of the long-acting thyroid stimulator J Clin Endocrinol Metab (1965) 25424ndash31 8) Mehdi SQ Nussey SS A radio-ligand receptor assay for the long-acting thy- roid stimulator Inhibition by the long-acting thyroid stimulator of the binding of radioiodinated thyroid stimulating hormone to human thyroid membranes Biochem J (1975) 145105ndash11 doi101042bj1450105 9)Shewring G Rees Smith B An improved radioreceptor assay for TSH receptor antibodies Clin Endocrinol (1982) 17409ndash17 doi101111j1365-22651982 tb01607x 10)Southgate K Creagh FM Teece M Kingswood C Rees Smith B A receptor assay for the measurement of TSH receptor antibodies in unextracted serum Clin Endocrinol (1984) 20539ndash48 doi101111j1365-22651984tb00102x 11)Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003
FRTL-5 bull Souběžně s vyacutevojem radioligandovyacutech receptorovyacutech testů dochaacutezelo k vyacutevoji
bdquobiotestůldquo Změna v in vivo na in vitro jako je použitiacute primaacuterniacutech buněčnyacutech kultur 1)
bull Dalšiacute zlepšeniacute přišlo s použitiacutem FRTL-5 buněk ndash netransformovanyacutech buněčnyacutech liniiacute krysiacutech thyroid epithelial buněk v kontinuaacutelniacute kultuře 2) Test byl založen na schopnosti purifikovanyacutech IgG indukovat produkci cAMP Naacutesledně bylo umožněno využiacutet pacientskeacute seacutera 3)
bull Tento test nesloužil jen pro diagnostiku ale měl zaacutesadniacute vyacuteznam v pochopeniacute patfyz vlastnostiacute a-TSHr
bull Kohn etal 4)5)6) vyvinuli monoklonaacutelniacute protilaacutetku k hodnoceniacute jejiacutech funkčniacutech vlastnostiacute
bull Použitiacute buněk FRTL-5 takeacute umožnilo dalšiacute studium funkčniacute heterogenity a-TSHr (samostatneacute posouzeniacute uacutečinků jednotlivyacutech IgG na dvě odlišneacute buněčneacute aktivity aktivity produkce cAMP a buněčneacuteho růstu) 7)
1)Toccafondi RS Aterini S Medici MA Rotella CM Tanini A Zonefrati R Thyroid-stimulating antibody (TSAb) detected in sera of Gravesrsquo patients using human thyroid cell cultures Clin Exp Immunol (1980) 40532ndash9 2) Ambesi-Impiombato FS Parks LAM Coon HG Culture of hormone-depen- dent functional epithelial cells from rat thyroids Proc Natl Acad Sci U S A (1980) 773455ndash9 doi101073pnas7763455 3) Vitti P Chiovato L Lopez G Lombardi A Santini F Mammoli C et al Measurement of TSAb directly in serum using FRTL-5 cells J Endocrinol Invest (1988) 11313ndash7 doi101007BF03350157 4) Yavin E Yavin Z Schneider MD Kohn LD Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor implications for receptor structure and the action of autoantibodies in Gravesrsquo disease Proc Natl Acad Sci U S A (1981) 783180ndash4 doi101073pnas7853180 5) Valente WA Vitti P Yavin Z Yavin E Rotella CM Grollman EF et al Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor stimulating and blocking antibodies derived from the lymphocytes of patients with Gravesrsquo disease Proc Natl Acad Sci U S A (1982) 796680ndash4 doi101073pnas79216680 6) Valente WA Yavin Z Yavin E Grollman EF Schneider M Rotella CM et al Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor the identification of blocking and stimulating antibodies J Endocrinol Invest (1982) 5293ndash301 doi101007BF03350517 7) Valente WA Vitti P Rotella CM Vaughan MM Aloj SM Grollman EF et al Antibodies that promote thyroid growth A distinct population of thyroid-stimulating autoantibodies N Engl J Med (1983) 3091028ndash34 doi101056NEJM198310273091705
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 1
bull Hlavniacute průlom přišel s naklonovaacuteniacutem TSHr v r 1989 1-3) ndash využitiacute lidskeacuteho TSHr pro RIA i bioassays 45) ndash senzitivita 96 pro RIA
bull Pomociacute mutačniacutech technik byly připraveny chimerickeacute TSHr
bull V 90 leacutetech byly vyvinuty monoklonaacutelniacute protilaacutetky proti C-terminus region rh-TSHr 67)
1)Parmentier M Libert F Maenhaut C Lefort Gerard C Perret J Van Sande J et al Molecular cloning of the thyrotropin receptor Science (1989) 2461620ndash2 doi101126science2556796 2)Nagayama Y Kaufman KD Seto P Rapoport B Molecular cloning sequence and functional expression of the cDNA for the human thyrotropin receptor Biochem Biophys Res Commun (1989) 1651184ndash90 doi1010160006- 291X(89)92727-7 3) Akamizu T Ikuyama S Saji M Kosugi S Kozak C McBride OW et al Cloning chromosomal assignment and regulation of the rat thyrotropin receptor expression of the gene is regulated by thyrotropin agents that increase cAMP levels and thyroid autoantibodies Proc Natl Acad Sci U S A (1990) 875677ndash81 doi101073pnas87155677 4)Ludgate M Perret J Parmentier M Gerard C Libert F Dumont JE et al Use of recombinant human thyrotropin receptor (TSH-R) expressed in mammalian cell lines to assay TSH-R autoantibodies Mol Cell Endocrinol (1991) 73R13ndash8 doi1010160303-7207(90)90050-I 5) Filetti S Foti D Costante G Rapoport B Recombinant human thyrotropin (TSH) receptor in a radioreceptor assay for the measurement of TSH receptor autoantibodies J Clin Endocrinol Metab (1991) 721096ndash101 doi101210 jcem-72-5-1096 6) Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 7)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 2
bull Druhaacute generace imunotestů (ELISA) ndash solid-phase ndash se staly standardem pro dg a-TSHr diacuteky přesnosti (988 senzitivita a 996 specifita) a non-RIA 123)
bull Použitiacutem rh-TSHr nebo vepřovyacute TSHr ziacuteskaacuteme stejnou analytickou přesnost3)
1)Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 2)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071 3)Kamijo K TSH-receptor antibody measurement in patients with various thyrotoxicosis and Hashimotorsquos thyroiditis a comparison of two two-step assays coated plate ELISA using porcine TSH-receptor and coated tube radio- assay using human recombinant TSH-receptor Endocr J (2003) 50113ndash6 doi101507endocrj50113
Monoclonal a-TSHr stimulujiacuteciacute
bull Na přelomu mileacutenia byly studovaacuteny stimulujiacuteciacute protilaacutetky a-TSHr 123)
bull Tato data jsou zaacutesadniacute pro pochopeniacute vztahů struktury a funkciacute TSHRr a jejiacute role v patogenezi Gravesovy choroby
bull To vše vedlo k izolaci a charakterizaci lidskeacute monoklonaacutelniacute protilaacutetky a-TSHr stimulujiacuteciacute ndash M22 4)
1)Ando T Latif R Pritsker A Moran T Nagayama Y Davies TF A monoclonal thyroid-stimulating antibody J Clin Invest (2002) 1101667ndash74 doi101172 JCI0216991 2)Costagliola S Franssen JDF Bonomi M Urizar E Willnich M Bergmann A et al Generation of a mouse monoclonal TSH receptor antibody with stimu- lating activity Biochem Biophys Res Commun (2002) 299891ndash6 doi101016 S0006-291X(02)02762-6 3)Sanders J Jeffreys J Depraetere H Richards T Evans M Kiddie A et al Thyroid-stimulating monoclonal antibodies Thyroid (2002) 121043ndash50 doi101089105072502321085135 4) Sanders J Evans M Premawardhana LDKE Depraetere H Jeffreys J Richards T et al Human monoclonal stimulating autoantibody Lancet (2003) 362126ndash8 doi101016S0140-6736(03)13866-4
Třetiacute generace testů ndash M22
bull V r2004 byl vyvinut test použitiacutem M22 ve formaacutetu ELISA 1) senzitivita 974 a specifita 992 (např Medipan)
bull Test byl vhodnyacute i pro automatizaci 23)
bull Dostupnost a znalost jak stimulujiacuteciacutech tak blokujiacuteciacutech protilaacutetek byla důležitaacute k pochopeniacute krystalickeacute struktury TSHr a jejiacutech interakciacute s a-TSHr 4) poukaacutezalo to na širokeacute překryvy epitopů mezi stimulujiacuteciacutemi a blokujiacuteciacutemi protilaacutetkami 4)
bull Roche nativniacute vepřovyacute TSH s M22
1)Rees Smith B Bolton J Young S Collyer A Weeden A Bradbury J et al A new assay for thyrotropin receptor autoantibodies Thyroid (2004) 14830ndash5 doi1010891050725042451248 2) Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003 3) Zophel K Roggenbuck D von Landenberg P Wunderlich G Gruning T Kotzerke J et al TSH receptor antibody (TRAb) assays based on the human monoclonal autoantibody M22 are more sensitive than bovine TSH based assays Horm Metab Res (2010) 4265ndash9 doi101055s-0029-1241196 4) Furmaniak J Sanders J Nunez Miguel R Rees Smith B Mechanisms of action of TSHR autoantibodies Horm Metab Res (2015) 47735ndash52 doi10105 5s-0035-1559648
Mc4 bioassay
bull Souběžně s testy 3-generace Kohn vyvinul test využiacutevajiacuteciacute bdquoMc4 chimeacuteruldquo založenou na metodaacutech chemiluminiscence 1)
bull Ciacutelem bylo měřit pouze stimulujiacuteciacute protilaacutetky a tiacutem dosaacutehnout jasneacuteho cutoff mezi pacienty s GD a kontrolami
bull Porovnaacuteniacute senzitivity a specifity v tabulce 2) bull Mc4 testy mohou byacutet využity jako testy prvniacute
volby pro pacienty s GD
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Mc4 bioassay
bull Testy s M22 diacuteky podobně specifitě a senzitivitě ale lepšiacute bdquoproveditelnostildquo jsou zatiacutem preferovanějšiacute
bull Daacutele jsou lepšiacute pro prognoacutezu GD než testy s M22 a leacutepe korelujiacute s aktivitou a zaacutevažnostiacute GD orbitopatiiacute 2)
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Bridge Assay
bull Novaacute technologie využitiacute chimeacuterickyacutech receptorů Mc4 a N-terminaacutelniacute TSHr fůsovanyacute s alkalickou fosfataacutezou 1) senzitivita 998 a specifita 995
bull TSI ndash Siemens tato metoda je založena na sendvičoveacutem kompetetivniacute formaacutetu kteryacute se lišiacute od klasickeacuteho kompetetivniacute formaacutetu komerčniacutech IMA druheacute a třetiacute generace 2)
1)Frank CU Braeth S Dietrich JW Wanjura D Loos U Bridge technology with TSH receptor chimera for sensitive direct detection of TSH receptor antibodies causing Gravesrsquo disease analytical and clinical evaluation Horm Metab Res (2015) 47880ndash8 doi101055s-0035-1554662 2)Tozzoli R DrsquoAurizio F Villalta D Giovanella L (2017) Evalu- ation of the first fully automated immunoassay method for the measurement of stimulating TSH receptor autoantibodies in Gravesrsquo disease Clin Chem Lab Med 5558ndash64
Mezinaacuterodniacute standard
bull Prvniacute mezinaacuterodniacute standard připraven v r 1995 WHO označeniacute 90672 Připraven ECBS zdroj pacientskaacute plasma
bull V r 2006 nahrazen lidskou monoklonaacutelniacute protilaacutetkou M22 (NIBSC 08240) odkazuje na detekci S-TRAb 1)
1) Diana T1 Kanitz M Lehmann M Li Y Olivo PD Kahaly GJ Standardization of a bioassay for thyrotropin receptor stimulating autoantibodies Thyroid 2015 Feb25(2)169-75
EHK ndash SEKK AT217
EHK ndash SEKK AT217
SEKK - Dotazniacutek
EHK ndash SEKK AT113
EHK ndash SEKK AT113
Hashimotova tyreoiditida (HT)
bull HT 1) a SLE 2) byly prvniacute dvě autoimunitniacute onemocněniacute kde se prokaacutezala genetickaacute asociace (geny MHC třiacutedy II) 70 leacuteta
bull Nicmeacuteně nebyl nalezen gen kteryacute by spouštěl HT nalezeny pouze geny ktereacute přispiacutevajiacute k fenotypu onemocněniacute 3)
1)VladutiuAO RoseNR Autoimmunemurine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type Science 19711741137ndash9 2)Grumet FC Coukell A Bodmer JG Bodmer WF McDevitt HO Histocompatibility (HL-A) antigens associated with systemic lupus erythematosus A possible genetic predisposition to disease N Engl J Med 1971285193ndash6 3) Simmonds MJ Gough SC The search for the genetic contribution to autoimmune thyroid disease the never ending story Brief Funct Genomics 20111077ndash90
Hashimotova tyreoiditida
bull Do 50 let raritniacute onemocněniacute nyniacute nejběžnějšiacute s prevalenciacute 81000 biochemickyacute naacutelez + autoprotilaacutetky 461000
bull Ženymuži 81
a-TPO
bull Přiacutetomnost protilaacutetek TPOAb obvykle předchaacuteziacute vzniku tyreoidaacutelniacute dysfunkce
bull Patogenetickaacute role protilaacutetek TgAb zůstaacutevaacute nejasnaacute
a-TPO
bull Autoprotilaacutetky TPOAb byly nejdřiacuteve popsaacuteny jako antimikrozomaacutelniacute autoprotilaacutetky (AMA) neboť bylo zjištěno že reagujiacute s neupravenyacutemi membraacutenami tyreoidaacutelniacutech buněk
bull Mikrozomaacutelniacute antigen byl později popsaacuten jako TPO
bull Dřiacuteve se využiacutevaly ke stanoveniacute TPO metody imunofluorescenčniacute metody a aglutinačniacute testy s pasivniacutem barveniacutem erytrocytů
a-TPO jako rizikovyacute faktor
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TPO je znaacutemyacutem rizikovyacutem faktorem pro vznik tyreoidaacutelniacute dysfunkce pokud jsou pacienti leacutečeni lithiem amiodaronem interleukinem-2 nebo alfa-interferonem
a-TG
bull Tg vykazuje vysokou heterogenitu způsobenou rozdiacutely v posttranslačniacutech modifikaciacutech (glykosylace jodizace sulfatace atd) Během synteacutezy tyreoidaacutelniacuteho hormonu a jeho uvolněniacute je Tg polymerizovaacuten a degradovaacuten
bull Vlivem toho je imunologickaacute struktura Tg mimořaacutedně komplexniacute Charakteristika standardů pro Tg se může lišit v zaacutevislosti na vstupniacute lidskeacute tyreoidaacutelniacute tkaacuteni a použiteacutem purifikačniacutem procesu To vysvětluje proč jsou testy na TgAb a takeacute Tg tak obtiacutežně standardizovatelneacute
Titr protilaacutetek
bull Titr protilaacutetek literaacuterně koreluje s počtem autoreaktivniacutech lymfocytů ktereacute infiltrujiacute štiacutetnou žlaacutezu a sonografickyacutem obrazem 1)
bull a-TG nižšiacute senzitivita (60-80 u HT) a menšiacute specifita (pozitivniacute ve většiacute čaacutesti zdravyacutech kontrol) než a-TPO
bull a-TG a a-TPO představujiacute dva různeacute aspekty autoimunniacute odpovědi na štiacutetnou žlaacutezu a-TG by mohly odraacutežet počaacutetečniacute (vrozenyacute) typ imunitniacute odpovědi zatiacutemco a-TPO by mohly charakterizovat pozdějšiacute adaptivniacute imunitniacute odpovědi 2)
1)Pandit AA VijayWardeMMenon PS Correlation of number of intrathyroid lympho- cytes with antimicrosomal antibody titer in Hashimotos thyroiditis Diagn Cytopathol 20032863ndash5 2) Rose NR Autoimmune escalation through the crystal ball Clin Exp Immunol 20071479
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
Genetika + GD
bull Etiologie GD neniacute staacutele znaacutema multifaktoriaacutelniacute onemocněniacute komplexniacute interakciacute mezi genetickou predispoziciacute a environmentaacutelniacutemi faktory kteraacute vede ke ztraacutetě imunitiniacute tolerance k tyreoidaacutelniacutem antigenům a inicilizaci autoimunitniacute reakci
bull Vliv prostřediacute (kouřeniacute infekce stres leacuteky nedostatek mikronutrientů přiacutejem iodu)
bull Immune regulatory genes (HLA-DR CTLA4 CD40 PTPN22 a Thyroid specific genes (thyroglobulin TSHR) ale jejich vliv je malyacute 1)
bull Předpoklaacutedaacute se že GD neniacute dědičneacute onemocněniacute ale často se objevuje spolu s autoimunitniacute tyroiditidou v raacutemci rodinnyacutech přiacuteslušniacuteků
1)Tomer Y Huber A The etiology of autoimmune thyroid disease a story of genes and environment J Autoimmun 2009 May-Jun32(3ndash4)231ndash9
TSH receptor
bull Receptor pro TSH je členem superrodiny receptorů se sedmi transmembraacutenovyacutemi domeacutenami ktereacute jsou spojeneacute s G- proteiny Gen receptoru pro TSH o molekuloveacute hmotnosti 60 kb umiacutestěnyacute na dlouheacutem rameacutenku chromozomu 14q31
bull Maacute dvě podjednotky extracelulaacuterniacute A a transmembraacutenovou B
bull Aktivace G-proteinů komplexem hormon-receptor maacute za naacutesledek stimulaci produkce cAMP pomociacute adenylaacutetcyklaacutezy
Protilaacutetky bull Je popsaacuteno několik variant a-TSHr stimulujiacuteciacute blokujiacuteciacute a
neutraacutelniacute bull a-TSHr podobně jako TSH se primaacuterně vaacuteže na N-terminaacutelniacute
čaacutest extracelulaacuterniacute domeacuteny TSHr a aktivuje draacutehu transdukce signaacutelu cAMP ndash předevšiacutem STIMULUJIacuteCIacute protilaacutetky vedouciacute ke stimulaci tvorby tyroidniacutech hormonů a proliferaci tyrocytů
bull Jineacute typy protilaacutetek mohou TSHr antagonizovat nebo blokovat uacutečinek TSH a tiacutem způsobit hypotyreoacutezu u některyacutech pacientů s různyacutemi typy autoimunitniacute tyroiditidy zejmeacutena Hashimotovou tyreoiditidou 1)
bull Neutraacutelniacute (nově nazyacutevaneacute i apoptickeacute) a-TSHr jsou namiacuteřeny proti clevage region a můžou indukovat signaacutelniacute draacutehy odlišneacute od draacutehy cAMP a indukujiacute apoptoacutezu tyrocytů 2)
1) (Kahaly GJ Diana T TSH receptor antibody functionality and nomenclature Front Endocrinol (2017) 2)Danilo Villalta Federica DrsquoAurizio Mirella Da Re Debora Ricci Francesco Latrofa Renato Tozzoli Diagnostic accuracy of a new fluoroenzyme immunoassay for the detection of TSH receptor autoantibodies in Gravesrsquo disease
MOMENKLATURA dle Kahaly GJ Diana T TSH receptor antibody functionality and nomenclature Front
Endocrinol (2017) 828103389fendo201700028
Stimulujiacuteciacute ndash N-terminaacutel region Neutralniacute ndash Cleavage region Blokujiacuteciacute ndash C-terminaacutel region
Upraveno dle Balucan FS Morshed SA Davies TF Thyroid autoantibodies in pregnancy their role regulation and clinical relevance J Thyroid Res (2013) 2013
Protilaacutetky
bull Přiacutetomnost a-TSHr vylučuje dalšiacute tyreotoxikosy
bull Koncentrace protilaacutetek nesloužiacute pouze k určeniacute diagnosy ale i k predikci vyacutevoje onemocněniacute 1)2)
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TSHr v těhotenstviacute je rizikovyacutem faktorem pro dysfunkci štiacutetneacute žlaacutezy novorozence v důsledku transplacentaacuterniacuteho přenosu mateřskyacutech protilaacutetek
1) Jang SY Shin DY Lee EJ Lee SY Yoon JS Relevance of TSH-receptor anti- body levels in predicting disease course in Gravesrsquo orbitopathy comparison of the third-generation TBII assay and Mc4-TSI bioassay Eye (Lond) (2013) 27964ndash71 2) Bartalena L Burch HB Burman KD Kahaly GJ A 2013 European survey of clinical practice patterns in the management of Gravesrsquo disease Clin Endocrinol (2016) 84115ndash20
Protilaacutetky
bull a-TSHr je patogenetickyacute znak GD detekovatelnyacute prakticky u všech pacientů s GD Protilaacutetky jsou zodpovědneacute za patologickeacute funkce nemoci (stimulace růstu a funkce štiacutetneacute žlaacutezy orbitopatie dermatologickeacute potiacuteže)1)
bull a-TSHr se uacutečastniacute patogeneze u hypotyreodismu i u atrofickeacute formy Hashimotoveacute tyreoitidy 2)
bull TSHr je exprimovaacuten v řadě extra-tyroidniacutech buněk včetně fibroblastů adipocytů a kostniacutech buněk kde je znaacutemo že moduluje funkci ciacutelovyacutech buněk
1)Michalek K Morshed SA Latif R Davies TF TSH receptor autoantibodies Autoimmun Rev (2009) 9113ndash6 doi101016jautrev200903012 2) Giuliani C Monaco F Adult primary hypothyroidism In Monaco F editor Thyroid Diseases Boca Raton FL CRC Press (2012) p 171ndash94
Protilaacutetky
bull Titr a-TSHr taky klesajiacute po tyroidektomii (čaacutestečneacute či celkoveacute) kvůli odstraněniacute zdroje antigenu
bull Naopak naacuterůst titrů a-TSHr pozorujeme po leacutečbě radioiodine I131 (asi dle uvolněniacute antigenů a zpracovaacuteniacute antigenů antigen-presentujiacuteciacutemi buňkami)
Protilaacutetky + typ bull Bylo prokaacutezaacuteno že nedostatečnaacute korelace mezi
koncentracemi a-TSHr a klinickyacutem stavem pacienta je většinou způsobena tiacutem že protilaacutetky a-TSHr v oběhu jsou heterogenniacute
bull Přechod z TSAbs na TBAbs je zodpovědnyacute za vyacutevoj hypotyreoacutezy u maleacuteho procenta pacientů s Gravesovou nemociacute a naopak
bull Skutečnost že heterogenniacute protilaacutetky a-TSHr mohou koexistovat u jednoho pacienta a měnit se v průběhu času je jedniacutem z důvodů proč bylo těžkeacute vyvinout diagnosticky přesneacute testy na stanoveniacute protilaacutetek a-TSHr
bull Klinickeacute projevy pacientů s Gravesovou chorobou kteřiacute vykazujiacute přiacutetomnost protilaacutetek TSAb i TBAbTSBAb budou zaacutevisleacute spiacuteše na relativniacute koncentraci a afinitě predominantniacute protilaacutetky
Protilaacutetky - sledovaacuteniacute
bull Sledovaacuteniacute hladin TSAb přidaacutevaacute dalšiacute rozměr k hodnoceniacute aktivity GD s potenciaacutelem předpovědět recidivu nebo remisii u jednotlivyacutech pacientů
bull Vysokaacute perzistentniacute hladina TSAb je spojena s aktivniacutemi a zaacutevažnyacutemi systeacutemovyacutemi projevy a se špatnou odezvou na terapii Naopak niacutezkeacute hladiny TSAb jsou nachaacutezeny u pacientů v remisi
Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Diagnostika
bull a-TSHr lze měřit v podstatě dvěma typy testů
ndash Biologickyacutem testem (biotestem bioassay) ktereacute detekujiacute produkci cAMP v buněčnyacutech kulturaacutech inkubovanyacutech se seacuterami pacientů Tyto testy identifikujiacute pouze stimulačniacute a-TSHr Biotesty prokazujiacute nejen přiacutetomnost Ab ale takeacute jejich funkčniacute aktivitu a uacutečinnost Historicky sloužily biotesty k vyacutezkumu ke studiu patofyziologie GD
ndash Protilaacutetkoveacute testy (vazebneacute receptoroveacute) Naopak receptoroveacute metody rutinně použiacutevaneacute v klinickyacutech laboratořiacutech udaacutevajiacute pouze přiacutetomnost nebo nepřiacutetomnost a-TSHr a jejich koncentrace ale neuvaacutedějiacute jejich funkčniacute aktivitu 2)
bull Tento zaacutekladniacute rozdiacutel v uspořaacutedaacuteniacute metody vysvětluje proč biotesty a protilaacutetkoveacute testy vykazujiacute nižšiacute korelaci (r = 031 ndash 065) 1)
1)Gupta MK Thyrotropin-receptor antibodies in thyroid diseases advances in detection techniques and clinical application Clin Chem Acta 20002931-29 2) Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Biotesty
bull Biotesty mohou detekovat funkčniacute změny u heterogenniacutech a-TSHr
bull Skutečnost že heterogenniacute protilaacutetky a-TSHr mohou koexistovat u jednoho pacienta a měnit se v průběhu času je jedniacutem z důvodů proč bylo těžkeacute vyvinout diagnosticky přesneacute testy na stanoveniacute protilaacutetek a-TSHr
bull Biotesty mohou zlepšit peacuteči o pacienta ve smyslu bdquopersonalisovaneacute mediciacutenyldquo
bull Biotesty jsou nabiacutezeny referenčniacutemi laboratořeni je jistyacute předpoklady že by se mohly viacutece rozšiacuteřit
Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Biotesty
bull Během posledniacutech 60 let se biologickaacute analyacuteza a-TSHr vyvinula těžkopaacutednyacutech a časově naacuteročnyacutech postupů na geneticky upraveneacute testy založeneacute na buňkaacutech ktereacute jsou charakterizovaacuteny dobrou proveditelnostiacute a rychlyacutemi provozniacutemi časy a ktereacute jsou takeacute k dispozici jako komerčniacute sady
bull Komerčně dostupnyacute biotest je Thyretain fa Quidel kteryacute detekuje stimulačniacute aktivitu a-TSHr pomociacute chimeacuterickeacuteho TSHR a genu pro cAMP (signalizace luciferaacutezou) Je schvaacutelen FDA pro použitiacute v klinickyacutech laboratořiacutech
HISTORIE
Historickyacute vyacutevoj metod pro měřeniacute a-TSHr ndash dle Giuliani etal 2016
Cesidio Giuliani1 Motoyasu Saji2 Ines Bucci1 and Giorgio Napolitano Bioassays for TSH Receptor Autoantibodies from FRTL-5 Cells to TSH ReceptorndashLHCG Receptor Chimeras The Contribution of Leonard D Kohn Front Endocrinol (Lausanne) 2016 7 103
LATS
bull V r 1956 Adams a Purves zjistili že seacutera pacientů s tyreotoxikosou indukujiacute abnormaacutelniacute prodlouženou odpověď v TSH testu (s morčetem)1)2)
bull Nazvali jej ldquoabnormal thyroid stimulatorrdquo posleacuteze ldquolong-acting thyroid stimulatorrdquo (LATS) 2)3) bylo jasneacute že je odlišnyacute od TSH a neniacute produkovaacuten hypofyacutezou
bull V roce 1964 byla LATS identifikovaacutena jako protein podobnyacute protilaacutetkaacutem (4) a dalšiacute studie jednoznačně potvrdily že se jednaacute o IgG (56)
bull Prvniacute testy k detekci LATS měly niacutezkou senzitivitu (60-70) 7) bull Vyacuteznamneacute zlepšeniacute v testech nastalo v r 1975 a to s vyacutevojem
radioligandoveacuteho receptoroveacuteho testu Test hodnotil inhibici seacutera od pacientů s GD vaacutezaacutenyacutemi radioaktivně značeneacuteho TSH na lidskeacute tyroidniacute membraacuteny (8 Test byl nicmeacuteně staacutele zatiacutežen niacutezkou přesnostiacute
bull Dalšiacute zlepšeniacute přineslo nahrazeniacute tyroidaacutelniacute membraacuteny čaacutestečně vyčištěneacuteho TSHr - liquid phase first-generation immunoassay použiacutevanaacute dalšiacutech 20 let 910) specifita 99 senzitivita 80 11)
1)Adams DD Purves HD Abnormal responses in the assay of thyrotropin Proc Univ Otago Med Sch (1956) 3411ndash5 2)Adams DD The presence of an abnormal thyroid-stimulating hormone in the serum of some thyrotoxic patients J Clin Endocrinol Metab (1958) 18699ndash712 doi101210jcem-18-7-699 3) Adams DD Bioassay of long-acting thyroid stimulator (LATS) the dose-re- sponse relationship J Clin Endocrinol Metab (1961) 21799ndash805 4) Kriss JP Pleshakov V Chien JR Isolation and identification of the long-acting thyroid stimulator and its relation to hyperthyroidism and circumscribed pretibial myxedema J Clin Endocrinol Metab (1964) 241005ndash28 doi101210 jcem-24-10-1005 5) Kriss JP Inactivation of long-acting thyroid stimulator (LATS) by anti- kappa and anti-lamba antisera J Clin Endocrinol Metab (1968) 281440ndash4 doi101210jcem-28-10-1440 6) Volpeacute R The immunologic basis of Gravesrsquos disease N Engl J Med (1972) 287463ndash4 doi101056NEJM197208312870910 7) McKenzie JM Review pathogenesis of Gravesrsquo disease role of the long-acting thyroid stimulator J Clin Endocrinol Metab (1965) 25424ndash31 8) Mehdi SQ Nussey SS A radio-ligand receptor assay for the long-acting thy- roid stimulator Inhibition by the long-acting thyroid stimulator of the binding of radioiodinated thyroid stimulating hormone to human thyroid membranes Biochem J (1975) 145105ndash11 doi101042bj1450105 9)Shewring G Rees Smith B An improved radioreceptor assay for TSH receptor antibodies Clin Endocrinol (1982) 17409ndash17 doi101111j1365-22651982 tb01607x 10)Southgate K Creagh FM Teece M Kingswood C Rees Smith B A receptor assay for the measurement of TSH receptor antibodies in unextracted serum Clin Endocrinol (1984) 20539ndash48 doi101111j1365-22651984tb00102x 11)Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003
FRTL-5 bull Souběžně s vyacutevojem radioligandovyacutech receptorovyacutech testů dochaacutezelo k vyacutevoji
bdquobiotestůldquo Změna v in vivo na in vitro jako je použitiacute primaacuterniacutech buněčnyacutech kultur 1)
bull Dalšiacute zlepšeniacute přišlo s použitiacutem FRTL-5 buněk ndash netransformovanyacutech buněčnyacutech liniiacute krysiacutech thyroid epithelial buněk v kontinuaacutelniacute kultuře 2) Test byl založen na schopnosti purifikovanyacutech IgG indukovat produkci cAMP Naacutesledně bylo umožněno využiacutet pacientskeacute seacutera 3)
bull Tento test nesloužil jen pro diagnostiku ale měl zaacutesadniacute vyacuteznam v pochopeniacute patfyz vlastnostiacute a-TSHr
bull Kohn etal 4)5)6) vyvinuli monoklonaacutelniacute protilaacutetku k hodnoceniacute jejiacutech funkčniacutech vlastnostiacute
bull Použitiacute buněk FRTL-5 takeacute umožnilo dalšiacute studium funkčniacute heterogenity a-TSHr (samostatneacute posouzeniacute uacutečinků jednotlivyacutech IgG na dvě odlišneacute buněčneacute aktivity aktivity produkce cAMP a buněčneacuteho růstu) 7)
1)Toccafondi RS Aterini S Medici MA Rotella CM Tanini A Zonefrati R Thyroid-stimulating antibody (TSAb) detected in sera of Gravesrsquo patients using human thyroid cell cultures Clin Exp Immunol (1980) 40532ndash9 2) Ambesi-Impiombato FS Parks LAM Coon HG Culture of hormone-depen- dent functional epithelial cells from rat thyroids Proc Natl Acad Sci U S A (1980) 773455ndash9 doi101073pnas7763455 3) Vitti P Chiovato L Lopez G Lombardi A Santini F Mammoli C et al Measurement of TSAb directly in serum using FRTL-5 cells J Endocrinol Invest (1988) 11313ndash7 doi101007BF03350157 4) Yavin E Yavin Z Schneider MD Kohn LD Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor implications for receptor structure and the action of autoantibodies in Gravesrsquo disease Proc Natl Acad Sci U S A (1981) 783180ndash4 doi101073pnas7853180 5) Valente WA Vitti P Yavin Z Yavin E Rotella CM Grollman EF et al Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor stimulating and blocking antibodies derived from the lymphocytes of patients with Gravesrsquo disease Proc Natl Acad Sci U S A (1982) 796680ndash4 doi101073pnas79216680 6) Valente WA Yavin Z Yavin E Grollman EF Schneider M Rotella CM et al Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor the identification of blocking and stimulating antibodies J Endocrinol Invest (1982) 5293ndash301 doi101007BF03350517 7) Valente WA Vitti P Rotella CM Vaughan MM Aloj SM Grollman EF et al Antibodies that promote thyroid growth A distinct population of thyroid-stimulating autoantibodies N Engl J Med (1983) 3091028ndash34 doi101056NEJM198310273091705
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 1
bull Hlavniacute průlom přišel s naklonovaacuteniacutem TSHr v r 1989 1-3) ndash využitiacute lidskeacuteho TSHr pro RIA i bioassays 45) ndash senzitivita 96 pro RIA
bull Pomociacute mutačniacutech technik byly připraveny chimerickeacute TSHr
bull V 90 leacutetech byly vyvinuty monoklonaacutelniacute protilaacutetky proti C-terminus region rh-TSHr 67)
1)Parmentier M Libert F Maenhaut C Lefort Gerard C Perret J Van Sande J et al Molecular cloning of the thyrotropin receptor Science (1989) 2461620ndash2 doi101126science2556796 2)Nagayama Y Kaufman KD Seto P Rapoport B Molecular cloning sequence and functional expression of the cDNA for the human thyrotropin receptor Biochem Biophys Res Commun (1989) 1651184ndash90 doi1010160006- 291X(89)92727-7 3) Akamizu T Ikuyama S Saji M Kosugi S Kozak C McBride OW et al Cloning chromosomal assignment and regulation of the rat thyrotropin receptor expression of the gene is regulated by thyrotropin agents that increase cAMP levels and thyroid autoantibodies Proc Natl Acad Sci U S A (1990) 875677ndash81 doi101073pnas87155677 4)Ludgate M Perret J Parmentier M Gerard C Libert F Dumont JE et al Use of recombinant human thyrotropin receptor (TSH-R) expressed in mammalian cell lines to assay TSH-R autoantibodies Mol Cell Endocrinol (1991) 73R13ndash8 doi1010160303-7207(90)90050-I 5) Filetti S Foti D Costante G Rapoport B Recombinant human thyrotropin (TSH) receptor in a radioreceptor assay for the measurement of TSH receptor autoantibodies J Clin Endocrinol Metab (1991) 721096ndash101 doi101210 jcem-72-5-1096 6) Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 7)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 2
bull Druhaacute generace imunotestů (ELISA) ndash solid-phase ndash se staly standardem pro dg a-TSHr diacuteky přesnosti (988 senzitivita a 996 specifita) a non-RIA 123)
bull Použitiacutem rh-TSHr nebo vepřovyacute TSHr ziacuteskaacuteme stejnou analytickou přesnost3)
1)Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 2)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071 3)Kamijo K TSH-receptor antibody measurement in patients with various thyrotoxicosis and Hashimotorsquos thyroiditis a comparison of two two-step assays coated plate ELISA using porcine TSH-receptor and coated tube radio- assay using human recombinant TSH-receptor Endocr J (2003) 50113ndash6 doi101507endocrj50113
Monoclonal a-TSHr stimulujiacuteciacute
bull Na přelomu mileacutenia byly studovaacuteny stimulujiacuteciacute protilaacutetky a-TSHr 123)
bull Tato data jsou zaacutesadniacute pro pochopeniacute vztahů struktury a funkciacute TSHRr a jejiacute role v patogenezi Gravesovy choroby
bull To vše vedlo k izolaci a charakterizaci lidskeacute monoklonaacutelniacute protilaacutetky a-TSHr stimulujiacuteciacute ndash M22 4)
1)Ando T Latif R Pritsker A Moran T Nagayama Y Davies TF A monoclonal thyroid-stimulating antibody J Clin Invest (2002) 1101667ndash74 doi101172 JCI0216991 2)Costagliola S Franssen JDF Bonomi M Urizar E Willnich M Bergmann A et al Generation of a mouse monoclonal TSH receptor antibody with stimu- lating activity Biochem Biophys Res Commun (2002) 299891ndash6 doi101016 S0006-291X(02)02762-6 3)Sanders J Jeffreys J Depraetere H Richards T Evans M Kiddie A et al Thyroid-stimulating monoclonal antibodies Thyroid (2002) 121043ndash50 doi101089105072502321085135 4) Sanders J Evans M Premawardhana LDKE Depraetere H Jeffreys J Richards T et al Human monoclonal stimulating autoantibody Lancet (2003) 362126ndash8 doi101016S0140-6736(03)13866-4
Třetiacute generace testů ndash M22
bull V r2004 byl vyvinut test použitiacutem M22 ve formaacutetu ELISA 1) senzitivita 974 a specifita 992 (např Medipan)
bull Test byl vhodnyacute i pro automatizaci 23)
bull Dostupnost a znalost jak stimulujiacuteciacutech tak blokujiacuteciacutech protilaacutetek byla důležitaacute k pochopeniacute krystalickeacute struktury TSHr a jejiacutech interakciacute s a-TSHr 4) poukaacutezalo to na širokeacute překryvy epitopů mezi stimulujiacuteciacutemi a blokujiacuteciacutemi protilaacutetkami 4)
bull Roche nativniacute vepřovyacute TSH s M22
1)Rees Smith B Bolton J Young S Collyer A Weeden A Bradbury J et al A new assay for thyrotropin receptor autoantibodies Thyroid (2004) 14830ndash5 doi1010891050725042451248 2) Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003 3) Zophel K Roggenbuck D von Landenberg P Wunderlich G Gruning T Kotzerke J et al TSH receptor antibody (TRAb) assays based on the human monoclonal autoantibody M22 are more sensitive than bovine TSH based assays Horm Metab Res (2010) 4265ndash9 doi101055s-0029-1241196 4) Furmaniak J Sanders J Nunez Miguel R Rees Smith B Mechanisms of action of TSHR autoantibodies Horm Metab Res (2015) 47735ndash52 doi10105 5s-0035-1559648
Mc4 bioassay
bull Souběžně s testy 3-generace Kohn vyvinul test využiacutevajiacuteciacute bdquoMc4 chimeacuteruldquo založenou na metodaacutech chemiluminiscence 1)
bull Ciacutelem bylo měřit pouze stimulujiacuteciacute protilaacutetky a tiacutem dosaacutehnout jasneacuteho cutoff mezi pacienty s GD a kontrolami
bull Porovnaacuteniacute senzitivity a specifity v tabulce 2) bull Mc4 testy mohou byacutet využity jako testy prvniacute
volby pro pacienty s GD
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Mc4 bioassay
bull Testy s M22 diacuteky podobně specifitě a senzitivitě ale lepšiacute bdquoproveditelnostildquo jsou zatiacutem preferovanějšiacute
bull Daacutele jsou lepšiacute pro prognoacutezu GD než testy s M22 a leacutepe korelujiacute s aktivitou a zaacutevažnostiacute GD orbitopatiiacute 2)
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Bridge Assay
bull Novaacute technologie využitiacute chimeacuterickyacutech receptorů Mc4 a N-terminaacutelniacute TSHr fůsovanyacute s alkalickou fosfataacutezou 1) senzitivita 998 a specifita 995
bull TSI ndash Siemens tato metoda je založena na sendvičoveacutem kompetetivniacute formaacutetu kteryacute se lišiacute od klasickeacuteho kompetetivniacute formaacutetu komerčniacutech IMA druheacute a třetiacute generace 2)
1)Frank CU Braeth S Dietrich JW Wanjura D Loos U Bridge technology with TSH receptor chimera for sensitive direct detection of TSH receptor antibodies causing Gravesrsquo disease analytical and clinical evaluation Horm Metab Res (2015) 47880ndash8 doi101055s-0035-1554662 2)Tozzoli R DrsquoAurizio F Villalta D Giovanella L (2017) Evalu- ation of the first fully automated immunoassay method for the measurement of stimulating TSH receptor autoantibodies in Gravesrsquo disease Clin Chem Lab Med 5558ndash64
Mezinaacuterodniacute standard
bull Prvniacute mezinaacuterodniacute standard připraven v r 1995 WHO označeniacute 90672 Připraven ECBS zdroj pacientskaacute plasma
bull V r 2006 nahrazen lidskou monoklonaacutelniacute protilaacutetkou M22 (NIBSC 08240) odkazuje na detekci S-TRAb 1)
1) Diana T1 Kanitz M Lehmann M Li Y Olivo PD Kahaly GJ Standardization of a bioassay for thyrotropin receptor stimulating autoantibodies Thyroid 2015 Feb25(2)169-75
EHK ndash SEKK AT217
EHK ndash SEKK AT217
SEKK - Dotazniacutek
EHK ndash SEKK AT113
EHK ndash SEKK AT113
Hashimotova tyreoiditida (HT)
bull HT 1) a SLE 2) byly prvniacute dvě autoimunitniacute onemocněniacute kde se prokaacutezala genetickaacute asociace (geny MHC třiacutedy II) 70 leacuteta
bull Nicmeacuteně nebyl nalezen gen kteryacute by spouštěl HT nalezeny pouze geny ktereacute přispiacutevajiacute k fenotypu onemocněniacute 3)
1)VladutiuAO RoseNR Autoimmunemurine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type Science 19711741137ndash9 2)Grumet FC Coukell A Bodmer JG Bodmer WF McDevitt HO Histocompatibility (HL-A) antigens associated with systemic lupus erythematosus A possible genetic predisposition to disease N Engl J Med 1971285193ndash6 3) Simmonds MJ Gough SC The search for the genetic contribution to autoimmune thyroid disease the never ending story Brief Funct Genomics 20111077ndash90
Hashimotova tyreoiditida
bull Do 50 let raritniacute onemocněniacute nyniacute nejběžnějšiacute s prevalenciacute 81000 biochemickyacute naacutelez + autoprotilaacutetky 461000
bull Ženymuži 81
a-TPO
bull Přiacutetomnost protilaacutetek TPOAb obvykle předchaacuteziacute vzniku tyreoidaacutelniacute dysfunkce
bull Patogenetickaacute role protilaacutetek TgAb zůstaacutevaacute nejasnaacute
a-TPO
bull Autoprotilaacutetky TPOAb byly nejdřiacuteve popsaacuteny jako antimikrozomaacutelniacute autoprotilaacutetky (AMA) neboť bylo zjištěno že reagujiacute s neupravenyacutemi membraacutenami tyreoidaacutelniacutech buněk
bull Mikrozomaacutelniacute antigen byl později popsaacuten jako TPO
bull Dřiacuteve se využiacutevaly ke stanoveniacute TPO metody imunofluorescenčniacute metody a aglutinačniacute testy s pasivniacutem barveniacutem erytrocytů
a-TPO jako rizikovyacute faktor
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TPO je znaacutemyacutem rizikovyacutem faktorem pro vznik tyreoidaacutelniacute dysfunkce pokud jsou pacienti leacutečeni lithiem amiodaronem interleukinem-2 nebo alfa-interferonem
a-TG
bull Tg vykazuje vysokou heterogenitu způsobenou rozdiacutely v posttranslačniacutech modifikaciacutech (glykosylace jodizace sulfatace atd) Během synteacutezy tyreoidaacutelniacuteho hormonu a jeho uvolněniacute je Tg polymerizovaacuten a degradovaacuten
bull Vlivem toho je imunologickaacute struktura Tg mimořaacutedně komplexniacute Charakteristika standardů pro Tg se může lišit v zaacutevislosti na vstupniacute lidskeacute tyreoidaacutelniacute tkaacuteni a použiteacutem purifikačniacutem procesu To vysvětluje proč jsou testy na TgAb a takeacute Tg tak obtiacutežně standardizovatelneacute
Titr protilaacutetek
bull Titr protilaacutetek literaacuterně koreluje s počtem autoreaktivniacutech lymfocytů ktereacute infiltrujiacute štiacutetnou žlaacutezu a sonografickyacutem obrazem 1)
bull a-TG nižšiacute senzitivita (60-80 u HT) a menšiacute specifita (pozitivniacute ve většiacute čaacutesti zdravyacutech kontrol) než a-TPO
bull a-TG a a-TPO představujiacute dva různeacute aspekty autoimunniacute odpovědi na štiacutetnou žlaacutezu a-TG by mohly odraacutežet počaacutetečniacute (vrozenyacute) typ imunitniacute odpovědi zatiacutemco a-TPO by mohly charakterizovat pozdějšiacute adaptivniacute imunitniacute odpovědi 2)
1)Pandit AA VijayWardeMMenon PS Correlation of number of intrathyroid lympho- cytes with antimicrosomal antibody titer in Hashimotos thyroiditis Diagn Cytopathol 20032863ndash5 2) Rose NR Autoimmune escalation through the crystal ball Clin Exp Immunol 20071479
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
TSH receptor
bull Receptor pro TSH je členem superrodiny receptorů se sedmi transmembraacutenovyacutemi domeacutenami ktereacute jsou spojeneacute s G- proteiny Gen receptoru pro TSH o molekuloveacute hmotnosti 60 kb umiacutestěnyacute na dlouheacutem rameacutenku chromozomu 14q31
bull Maacute dvě podjednotky extracelulaacuterniacute A a transmembraacutenovou B
bull Aktivace G-proteinů komplexem hormon-receptor maacute za naacutesledek stimulaci produkce cAMP pomociacute adenylaacutetcyklaacutezy
Protilaacutetky bull Je popsaacuteno několik variant a-TSHr stimulujiacuteciacute blokujiacuteciacute a
neutraacutelniacute bull a-TSHr podobně jako TSH se primaacuterně vaacuteže na N-terminaacutelniacute
čaacutest extracelulaacuterniacute domeacuteny TSHr a aktivuje draacutehu transdukce signaacutelu cAMP ndash předevšiacutem STIMULUJIacuteCIacute protilaacutetky vedouciacute ke stimulaci tvorby tyroidniacutech hormonů a proliferaci tyrocytů
bull Jineacute typy protilaacutetek mohou TSHr antagonizovat nebo blokovat uacutečinek TSH a tiacutem způsobit hypotyreoacutezu u některyacutech pacientů s různyacutemi typy autoimunitniacute tyroiditidy zejmeacutena Hashimotovou tyreoiditidou 1)
bull Neutraacutelniacute (nově nazyacutevaneacute i apoptickeacute) a-TSHr jsou namiacuteřeny proti clevage region a můžou indukovat signaacutelniacute draacutehy odlišneacute od draacutehy cAMP a indukujiacute apoptoacutezu tyrocytů 2)
1) (Kahaly GJ Diana T TSH receptor antibody functionality and nomenclature Front Endocrinol (2017) 2)Danilo Villalta Federica DrsquoAurizio Mirella Da Re Debora Ricci Francesco Latrofa Renato Tozzoli Diagnostic accuracy of a new fluoroenzyme immunoassay for the detection of TSH receptor autoantibodies in Gravesrsquo disease
MOMENKLATURA dle Kahaly GJ Diana T TSH receptor antibody functionality and nomenclature Front
Endocrinol (2017) 828103389fendo201700028
Stimulujiacuteciacute ndash N-terminaacutel region Neutralniacute ndash Cleavage region Blokujiacuteciacute ndash C-terminaacutel region
Upraveno dle Balucan FS Morshed SA Davies TF Thyroid autoantibodies in pregnancy their role regulation and clinical relevance J Thyroid Res (2013) 2013
Protilaacutetky
bull Přiacutetomnost a-TSHr vylučuje dalšiacute tyreotoxikosy
bull Koncentrace protilaacutetek nesloužiacute pouze k určeniacute diagnosy ale i k predikci vyacutevoje onemocněniacute 1)2)
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TSHr v těhotenstviacute je rizikovyacutem faktorem pro dysfunkci štiacutetneacute žlaacutezy novorozence v důsledku transplacentaacuterniacuteho přenosu mateřskyacutech protilaacutetek
1) Jang SY Shin DY Lee EJ Lee SY Yoon JS Relevance of TSH-receptor anti- body levels in predicting disease course in Gravesrsquo orbitopathy comparison of the third-generation TBII assay and Mc4-TSI bioassay Eye (Lond) (2013) 27964ndash71 2) Bartalena L Burch HB Burman KD Kahaly GJ A 2013 European survey of clinical practice patterns in the management of Gravesrsquo disease Clin Endocrinol (2016) 84115ndash20
Protilaacutetky
bull a-TSHr je patogenetickyacute znak GD detekovatelnyacute prakticky u všech pacientů s GD Protilaacutetky jsou zodpovědneacute za patologickeacute funkce nemoci (stimulace růstu a funkce štiacutetneacute žlaacutezy orbitopatie dermatologickeacute potiacuteže)1)
bull a-TSHr se uacutečastniacute patogeneze u hypotyreodismu i u atrofickeacute formy Hashimotoveacute tyreoitidy 2)
bull TSHr je exprimovaacuten v řadě extra-tyroidniacutech buněk včetně fibroblastů adipocytů a kostniacutech buněk kde je znaacutemo že moduluje funkci ciacutelovyacutech buněk
1)Michalek K Morshed SA Latif R Davies TF TSH receptor autoantibodies Autoimmun Rev (2009) 9113ndash6 doi101016jautrev200903012 2) Giuliani C Monaco F Adult primary hypothyroidism In Monaco F editor Thyroid Diseases Boca Raton FL CRC Press (2012) p 171ndash94
Protilaacutetky
bull Titr a-TSHr taky klesajiacute po tyroidektomii (čaacutestečneacute či celkoveacute) kvůli odstraněniacute zdroje antigenu
bull Naopak naacuterůst titrů a-TSHr pozorujeme po leacutečbě radioiodine I131 (asi dle uvolněniacute antigenů a zpracovaacuteniacute antigenů antigen-presentujiacuteciacutemi buňkami)
Protilaacutetky + typ bull Bylo prokaacutezaacuteno že nedostatečnaacute korelace mezi
koncentracemi a-TSHr a klinickyacutem stavem pacienta je většinou způsobena tiacutem že protilaacutetky a-TSHr v oběhu jsou heterogenniacute
bull Přechod z TSAbs na TBAbs je zodpovědnyacute za vyacutevoj hypotyreoacutezy u maleacuteho procenta pacientů s Gravesovou nemociacute a naopak
bull Skutečnost že heterogenniacute protilaacutetky a-TSHr mohou koexistovat u jednoho pacienta a měnit se v průběhu času je jedniacutem z důvodů proč bylo těžkeacute vyvinout diagnosticky přesneacute testy na stanoveniacute protilaacutetek a-TSHr
bull Klinickeacute projevy pacientů s Gravesovou chorobou kteřiacute vykazujiacute přiacutetomnost protilaacutetek TSAb i TBAbTSBAb budou zaacutevisleacute spiacuteše na relativniacute koncentraci a afinitě predominantniacute protilaacutetky
Protilaacutetky - sledovaacuteniacute
bull Sledovaacuteniacute hladin TSAb přidaacutevaacute dalšiacute rozměr k hodnoceniacute aktivity GD s potenciaacutelem předpovědět recidivu nebo remisii u jednotlivyacutech pacientů
bull Vysokaacute perzistentniacute hladina TSAb je spojena s aktivniacutemi a zaacutevažnyacutemi systeacutemovyacutemi projevy a se špatnou odezvou na terapii Naopak niacutezkeacute hladiny TSAb jsou nachaacutezeny u pacientů v remisi
Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Diagnostika
bull a-TSHr lze měřit v podstatě dvěma typy testů
ndash Biologickyacutem testem (biotestem bioassay) ktereacute detekujiacute produkci cAMP v buněčnyacutech kulturaacutech inkubovanyacutech se seacuterami pacientů Tyto testy identifikujiacute pouze stimulačniacute a-TSHr Biotesty prokazujiacute nejen přiacutetomnost Ab ale takeacute jejich funkčniacute aktivitu a uacutečinnost Historicky sloužily biotesty k vyacutezkumu ke studiu patofyziologie GD
ndash Protilaacutetkoveacute testy (vazebneacute receptoroveacute) Naopak receptoroveacute metody rutinně použiacutevaneacute v klinickyacutech laboratořiacutech udaacutevajiacute pouze přiacutetomnost nebo nepřiacutetomnost a-TSHr a jejich koncentrace ale neuvaacutedějiacute jejich funkčniacute aktivitu 2)
bull Tento zaacutekladniacute rozdiacutel v uspořaacutedaacuteniacute metody vysvětluje proč biotesty a protilaacutetkoveacute testy vykazujiacute nižšiacute korelaci (r = 031 ndash 065) 1)
1)Gupta MK Thyrotropin-receptor antibodies in thyroid diseases advances in detection techniques and clinical application Clin Chem Acta 20002931-29 2) Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Biotesty
bull Biotesty mohou detekovat funkčniacute změny u heterogenniacutech a-TSHr
bull Skutečnost že heterogenniacute protilaacutetky a-TSHr mohou koexistovat u jednoho pacienta a měnit se v průběhu času je jedniacutem z důvodů proč bylo těžkeacute vyvinout diagnosticky přesneacute testy na stanoveniacute protilaacutetek a-TSHr
bull Biotesty mohou zlepšit peacuteči o pacienta ve smyslu bdquopersonalisovaneacute mediciacutenyldquo
bull Biotesty jsou nabiacutezeny referenčniacutemi laboratořeni je jistyacute předpoklady že by se mohly viacutece rozšiacuteřit
Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Biotesty
bull Během posledniacutech 60 let se biologickaacute analyacuteza a-TSHr vyvinula těžkopaacutednyacutech a časově naacuteročnyacutech postupů na geneticky upraveneacute testy založeneacute na buňkaacutech ktereacute jsou charakterizovaacuteny dobrou proveditelnostiacute a rychlyacutemi provozniacutemi časy a ktereacute jsou takeacute k dispozici jako komerčniacute sady
bull Komerčně dostupnyacute biotest je Thyretain fa Quidel kteryacute detekuje stimulačniacute aktivitu a-TSHr pomociacute chimeacuterickeacuteho TSHR a genu pro cAMP (signalizace luciferaacutezou) Je schvaacutelen FDA pro použitiacute v klinickyacutech laboratořiacutech
HISTORIE
Historickyacute vyacutevoj metod pro měřeniacute a-TSHr ndash dle Giuliani etal 2016
Cesidio Giuliani1 Motoyasu Saji2 Ines Bucci1 and Giorgio Napolitano Bioassays for TSH Receptor Autoantibodies from FRTL-5 Cells to TSH ReceptorndashLHCG Receptor Chimeras The Contribution of Leonard D Kohn Front Endocrinol (Lausanne) 2016 7 103
LATS
bull V r 1956 Adams a Purves zjistili že seacutera pacientů s tyreotoxikosou indukujiacute abnormaacutelniacute prodlouženou odpověď v TSH testu (s morčetem)1)2)
bull Nazvali jej ldquoabnormal thyroid stimulatorrdquo posleacuteze ldquolong-acting thyroid stimulatorrdquo (LATS) 2)3) bylo jasneacute že je odlišnyacute od TSH a neniacute produkovaacuten hypofyacutezou
bull V roce 1964 byla LATS identifikovaacutena jako protein podobnyacute protilaacutetkaacutem (4) a dalšiacute studie jednoznačně potvrdily že se jednaacute o IgG (56)
bull Prvniacute testy k detekci LATS měly niacutezkou senzitivitu (60-70) 7) bull Vyacuteznamneacute zlepšeniacute v testech nastalo v r 1975 a to s vyacutevojem
radioligandoveacuteho receptoroveacuteho testu Test hodnotil inhibici seacutera od pacientů s GD vaacutezaacutenyacutemi radioaktivně značeneacuteho TSH na lidskeacute tyroidniacute membraacuteny (8 Test byl nicmeacuteně staacutele zatiacutežen niacutezkou přesnostiacute
bull Dalšiacute zlepšeniacute přineslo nahrazeniacute tyroidaacutelniacute membraacuteny čaacutestečně vyčištěneacuteho TSHr - liquid phase first-generation immunoassay použiacutevanaacute dalšiacutech 20 let 910) specifita 99 senzitivita 80 11)
1)Adams DD Purves HD Abnormal responses in the assay of thyrotropin Proc Univ Otago Med Sch (1956) 3411ndash5 2)Adams DD The presence of an abnormal thyroid-stimulating hormone in the serum of some thyrotoxic patients J Clin Endocrinol Metab (1958) 18699ndash712 doi101210jcem-18-7-699 3) Adams DD Bioassay of long-acting thyroid stimulator (LATS) the dose-re- sponse relationship J Clin Endocrinol Metab (1961) 21799ndash805 4) Kriss JP Pleshakov V Chien JR Isolation and identification of the long-acting thyroid stimulator and its relation to hyperthyroidism and circumscribed pretibial myxedema J Clin Endocrinol Metab (1964) 241005ndash28 doi101210 jcem-24-10-1005 5) Kriss JP Inactivation of long-acting thyroid stimulator (LATS) by anti- kappa and anti-lamba antisera J Clin Endocrinol Metab (1968) 281440ndash4 doi101210jcem-28-10-1440 6) Volpeacute R The immunologic basis of Gravesrsquos disease N Engl J Med (1972) 287463ndash4 doi101056NEJM197208312870910 7) McKenzie JM Review pathogenesis of Gravesrsquo disease role of the long-acting thyroid stimulator J Clin Endocrinol Metab (1965) 25424ndash31 8) Mehdi SQ Nussey SS A radio-ligand receptor assay for the long-acting thy- roid stimulator Inhibition by the long-acting thyroid stimulator of the binding of radioiodinated thyroid stimulating hormone to human thyroid membranes Biochem J (1975) 145105ndash11 doi101042bj1450105 9)Shewring G Rees Smith B An improved radioreceptor assay for TSH receptor antibodies Clin Endocrinol (1982) 17409ndash17 doi101111j1365-22651982 tb01607x 10)Southgate K Creagh FM Teece M Kingswood C Rees Smith B A receptor assay for the measurement of TSH receptor antibodies in unextracted serum Clin Endocrinol (1984) 20539ndash48 doi101111j1365-22651984tb00102x 11)Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003
FRTL-5 bull Souběžně s vyacutevojem radioligandovyacutech receptorovyacutech testů dochaacutezelo k vyacutevoji
bdquobiotestůldquo Změna v in vivo na in vitro jako je použitiacute primaacuterniacutech buněčnyacutech kultur 1)
bull Dalšiacute zlepšeniacute přišlo s použitiacutem FRTL-5 buněk ndash netransformovanyacutech buněčnyacutech liniiacute krysiacutech thyroid epithelial buněk v kontinuaacutelniacute kultuře 2) Test byl založen na schopnosti purifikovanyacutech IgG indukovat produkci cAMP Naacutesledně bylo umožněno využiacutet pacientskeacute seacutera 3)
bull Tento test nesloužil jen pro diagnostiku ale měl zaacutesadniacute vyacuteznam v pochopeniacute patfyz vlastnostiacute a-TSHr
bull Kohn etal 4)5)6) vyvinuli monoklonaacutelniacute protilaacutetku k hodnoceniacute jejiacutech funkčniacutech vlastnostiacute
bull Použitiacute buněk FRTL-5 takeacute umožnilo dalšiacute studium funkčniacute heterogenity a-TSHr (samostatneacute posouzeniacute uacutečinků jednotlivyacutech IgG na dvě odlišneacute buněčneacute aktivity aktivity produkce cAMP a buněčneacuteho růstu) 7)
1)Toccafondi RS Aterini S Medici MA Rotella CM Tanini A Zonefrati R Thyroid-stimulating antibody (TSAb) detected in sera of Gravesrsquo patients using human thyroid cell cultures Clin Exp Immunol (1980) 40532ndash9 2) Ambesi-Impiombato FS Parks LAM Coon HG Culture of hormone-depen- dent functional epithelial cells from rat thyroids Proc Natl Acad Sci U S A (1980) 773455ndash9 doi101073pnas7763455 3) Vitti P Chiovato L Lopez G Lombardi A Santini F Mammoli C et al Measurement of TSAb directly in serum using FRTL-5 cells J Endocrinol Invest (1988) 11313ndash7 doi101007BF03350157 4) Yavin E Yavin Z Schneider MD Kohn LD Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor implications for receptor structure and the action of autoantibodies in Gravesrsquo disease Proc Natl Acad Sci U S A (1981) 783180ndash4 doi101073pnas7853180 5) Valente WA Vitti P Yavin Z Yavin E Rotella CM Grollman EF et al Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor stimulating and blocking antibodies derived from the lymphocytes of patients with Gravesrsquo disease Proc Natl Acad Sci U S A (1982) 796680ndash4 doi101073pnas79216680 6) Valente WA Yavin Z Yavin E Grollman EF Schneider M Rotella CM et al Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor the identification of blocking and stimulating antibodies J Endocrinol Invest (1982) 5293ndash301 doi101007BF03350517 7) Valente WA Vitti P Rotella CM Vaughan MM Aloj SM Grollman EF et al Antibodies that promote thyroid growth A distinct population of thyroid-stimulating autoantibodies N Engl J Med (1983) 3091028ndash34 doi101056NEJM198310273091705
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 1
bull Hlavniacute průlom přišel s naklonovaacuteniacutem TSHr v r 1989 1-3) ndash využitiacute lidskeacuteho TSHr pro RIA i bioassays 45) ndash senzitivita 96 pro RIA
bull Pomociacute mutačniacutech technik byly připraveny chimerickeacute TSHr
bull V 90 leacutetech byly vyvinuty monoklonaacutelniacute protilaacutetky proti C-terminus region rh-TSHr 67)
1)Parmentier M Libert F Maenhaut C Lefort Gerard C Perret J Van Sande J et al Molecular cloning of the thyrotropin receptor Science (1989) 2461620ndash2 doi101126science2556796 2)Nagayama Y Kaufman KD Seto P Rapoport B Molecular cloning sequence and functional expression of the cDNA for the human thyrotropin receptor Biochem Biophys Res Commun (1989) 1651184ndash90 doi1010160006- 291X(89)92727-7 3) Akamizu T Ikuyama S Saji M Kosugi S Kozak C McBride OW et al Cloning chromosomal assignment and regulation of the rat thyrotropin receptor expression of the gene is regulated by thyrotropin agents that increase cAMP levels and thyroid autoantibodies Proc Natl Acad Sci U S A (1990) 875677ndash81 doi101073pnas87155677 4)Ludgate M Perret J Parmentier M Gerard C Libert F Dumont JE et al Use of recombinant human thyrotropin receptor (TSH-R) expressed in mammalian cell lines to assay TSH-R autoantibodies Mol Cell Endocrinol (1991) 73R13ndash8 doi1010160303-7207(90)90050-I 5) Filetti S Foti D Costante G Rapoport B Recombinant human thyrotropin (TSH) receptor in a radioreceptor assay for the measurement of TSH receptor autoantibodies J Clin Endocrinol Metab (1991) 721096ndash101 doi101210 jcem-72-5-1096 6) Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 7)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 2
bull Druhaacute generace imunotestů (ELISA) ndash solid-phase ndash se staly standardem pro dg a-TSHr diacuteky přesnosti (988 senzitivita a 996 specifita) a non-RIA 123)
bull Použitiacutem rh-TSHr nebo vepřovyacute TSHr ziacuteskaacuteme stejnou analytickou přesnost3)
1)Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 2)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071 3)Kamijo K TSH-receptor antibody measurement in patients with various thyrotoxicosis and Hashimotorsquos thyroiditis a comparison of two two-step assays coated plate ELISA using porcine TSH-receptor and coated tube radio- assay using human recombinant TSH-receptor Endocr J (2003) 50113ndash6 doi101507endocrj50113
Monoclonal a-TSHr stimulujiacuteciacute
bull Na přelomu mileacutenia byly studovaacuteny stimulujiacuteciacute protilaacutetky a-TSHr 123)
bull Tato data jsou zaacutesadniacute pro pochopeniacute vztahů struktury a funkciacute TSHRr a jejiacute role v patogenezi Gravesovy choroby
bull To vše vedlo k izolaci a charakterizaci lidskeacute monoklonaacutelniacute protilaacutetky a-TSHr stimulujiacuteciacute ndash M22 4)
1)Ando T Latif R Pritsker A Moran T Nagayama Y Davies TF A monoclonal thyroid-stimulating antibody J Clin Invest (2002) 1101667ndash74 doi101172 JCI0216991 2)Costagliola S Franssen JDF Bonomi M Urizar E Willnich M Bergmann A et al Generation of a mouse monoclonal TSH receptor antibody with stimu- lating activity Biochem Biophys Res Commun (2002) 299891ndash6 doi101016 S0006-291X(02)02762-6 3)Sanders J Jeffreys J Depraetere H Richards T Evans M Kiddie A et al Thyroid-stimulating monoclonal antibodies Thyroid (2002) 121043ndash50 doi101089105072502321085135 4) Sanders J Evans M Premawardhana LDKE Depraetere H Jeffreys J Richards T et al Human monoclonal stimulating autoantibody Lancet (2003) 362126ndash8 doi101016S0140-6736(03)13866-4
Třetiacute generace testů ndash M22
bull V r2004 byl vyvinut test použitiacutem M22 ve formaacutetu ELISA 1) senzitivita 974 a specifita 992 (např Medipan)
bull Test byl vhodnyacute i pro automatizaci 23)
bull Dostupnost a znalost jak stimulujiacuteciacutech tak blokujiacuteciacutech protilaacutetek byla důležitaacute k pochopeniacute krystalickeacute struktury TSHr a jejiacutech interakciacute s a-TSHr 4) poukaacutezalo to na širokeacute překryvy epitopů mezi stimulujiacuteciacutemi a blokujiacuteciacutemi protilaacutetkami 4)
bull Roche nativniacute vepřovyacute TSH s M22
1)Rees Smith B Bolton J Young S Collyer A Weeden A Bradbury J et al A new assay for thyrotropin receptor autoantibodies Thyroid (2004) 14830ndash5 doi1010891050725042451248 2) Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003 3) Zophel K Roggenbuck D von Landenberg P Wunderlich G Gruning T Kotzerke J et al TSH receptor antibody (TRAb) assays based on the human monoclonal autoantibody M22 are more sensitive than bovine TSH based assays Horm Metab Res (2010) 4265ndash9 doi101055s-0029-1241196 4) Furmaniak J Sanders J Nunez Miguel R Rees Smith B Mechanisms of action of TSHR autoantibodies Horm Metab Res (2015) 47735ndash52 doi10105 5s-0035-1559648
Mc4 bioassay
bull Souběžně s testy 3-generace Kohn vyvinul test využiacutevajiacuteciacute bdquoMc4 chimeacuteruldquo založenou na metodaacutech chemiluminiscence 1)
bull Ciacutelem bylo měřit pouze stimulujiacuteciacute protilaacutetky a tiacutem dosaacutehnout jasneacuteho cutoff mezi pacienty s GD a kontrolami
bull Porovnaacuteniacute senzitivity a specifity v tabulce 2) bull Mc4 testy mohou byacutet využity jako testy prvniacute
volby pro pacienty s GD
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Mc4 bioassay
bull Testy s M22 diacuteky podobně specifitě a senzitivitě ale lepšiacute bdquoproveditelnostildquo jsou zatiacutem preferovanějšiacute
bull Daacutele jsou lepšiacute pro prognoacutezu GD než testy s M22 a leacutepe korelujiacute s aktivitou a zaacutevažnostiacute GD orbitopatiiacute 2)
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Bridge Assay
bull Novaacute technologie využitiacute chimeacuterickyacutech receptorů Mc4 a N-terminaacutelniacute TSHr fůsovanyacute s alkalickou fosfataacutezou 1) senzitivita 998 a specifita 995
bull TSI ndash Siemens tato metoda je založena na sendvičoveacutem kompetetivniacute formaacutetu kteryacute se lišiacute od klasickeacuteho kompetetivniacute formaacutetu komerčniacutech IMA druheacute a třetiacute generace 2)
1)Frank CU Braeth S Dietrich JW Wanjura D Loos U Bridge technology with TSH receptor chimera for sensitive direct detection of TSH receptor antibodies causing Gravesrsquo disease analytical and clinical evaluation Horm Metab Res (2015) 47880ndash8 doi101055s-0035-1554662 2)Tozzoli R DrsquoAurizio F Villalta D Giovanella L (2017) Evalu- ation of the first fully automated immunoassay method for the measurement of stimulating TSH receptor autoantibodies in Gravesrsquo disease Clin Chem Lab Med 5558ndash64
Mezinaacuterodniacute standard
bull Prvniacute mezinaacuterodniacute standard připraven v r 1995 WHO označeniacute 90672 Připraven ECBS zdroj pacientskaacute plasma
bull V r 2006 nahrazen lidskou monoklonaacutelniacute protilaacutetkou M22 (NIBSC 08240) odkazuje na detekci S-TRAb 1)
1) Diana T1 Kanitz M Lehmann M Li Y Olivo PD Kahaly GJ Standardization of a bioassay for thyrotropin receptor stimulating autoantibodies Thyroid 2015 Feb25(2)169-75
EHK ndash SEKK AT217
EHK ndash SEKK AT217
SEKK - Dotazniacutek
EHK ndash SEKK AT113
EHK ndash SEKK AT113
Hashimotova tyreoiditida (HT)
bull HT 1) a SLE 2) byly prvniacute dvě autoimunitniacute onemocněniacute kde se prokaacutezala genetickaacute asociace (geny MHC třiacutedy II) 70 leacuteta
bull Nicmeacuteně nebyl nalezen gen kteryacute by spouštěl HT nalezeny pouze geny ktereacute přispiacutevajiacute k fenotypu onemocněniacute 3)
1)VladutiuAO RoseNR Autoimmunemurine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type Science 19711741137ndash9 2)Grumet FC Coukell A Bodmer JG Bodmer WF McDevitt HO Histocompatibility (HL-A) antigens associated with systemic lupus erythematosus A possible genetic predisposition to disease N Engl J Med 1971285193ndash6 3) Simmonds MJ Gough SC The search for the genetic contribution to autoimmune thyroid disease the never ending story Brief Funct Genomics 20111077ndash90
Hashimotova tyreoiditida
bull Do 50 let raritniacute onemocněniacute nyniacute nejběžnějšiacute s prevalenciacute 81000 biochemickyacute naacutelez + autoprotilaacutetky 461000
bull Ženymuži 81
a-TPO
bull Přiacutetomnost protilaacutetek TPOAb obvykle předchaacuteziacute vzniku tyreoidaacutelniacute dysfunkce
bull Patogenetickaacute role protilaacutetek TgAb zůstaacutevaacute nejasnaacute
a-TPO
bull Autoprotilaacutetky TPOAb byly nejdřiacuteve popsaacuteny jako antimikrozomaacutelniacute autoprotilaacutetky (AMA) neboť bylo zjištěno že reagujiacute s neupravenyacutemi membraacutenami tyreoidaacutelniacutech buněk
bull Mikrozomaacutelniacute antigen byl později popsaacuten jako TPO
bull Dřiacuteve se využiacutevaly ke stanoveniacute TPO metody imunofluorescenčniacute metody a aglutinačniacute testy s pasivniacutem barveniacutem erytrocytů
a-TPO jako rizikovyacute faktor
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TPO je znaacutemyacutem rizikovyacutem faktorem pro vznik tyreoidaacutelniacute dysfunkce pokud jsou pacienti leacutečeni lithiem amiodaronem interleukinem-2 nebo alfa-interferonem
a-TG
bull Tg vykazuje vysokou heterogenitu způsobenou rozdiacutely v posttranslačniacutech modifikaciacutech (glykosylace jodizace sulfatace atd) Během synteacutezy tyreoidaacutelniacuteho hormonu a jeho uvolněniacute je Tg polymerizovaacuten a degradovaacuten
bull Vlivem toho je imunologickaacute struktura Tg mimořaacutedně komplexniacute Charakteristika standardů pro Tg se může lišit v zaacutevislosti na vstupniacute lidskeacute tyreoidaacutelniacute tkaacuteni a použiteacutem purifikačniacutem procesu To vysvětluje proč jsou testy na TgAb a takeacute Tg tak obtiacutežně standardizovatelneacute
Titr protilaacutetek
bull Titr protilaacutetek literaacuterně koreluje s počtem autoreaktivniacutech lymfocytů ktereacute infiltrujiacute štiacutetnou žlaacutezu a sonografickyacutem obrazem 1)
bull a-TG nižšiacute senzitivita (60-80 u HT) a menšiacute specifita (pozitivniacute ve většiacute čaacutesti zdravyacutech kontrol) než a-TPO
bull a-TG a a-TPO představujiacute dva různeacute aspekty autoimunniacute odpovědi na štiacutetnou žlaacutezu a-TG by mohly odraacutežet počaacutetečniacute (vrozenyacute) typ imunitniacute odpovědi zatiacutemco a-TPO by mohly charakterizovat pozdějšiacute adaptivniacute imunitniacute odpovědi 2)
1)Pandit AA VijayWardeMMenon PS Correlation of number of intrathyroid lympho- cytes with antimicrosomal antibody titer in Hashimotos thyroiditis Diagn Cytopathol 20032863ndash5 2) Rose NR Autoimmune escalation through the crystal ball Clin Exp Immunol 20071479
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
Protilaacutetky bull Je popsaacuteno několik variant a-TSHr stimulujiacuteciacute blokujiacuteciacute a
neutraacutelniacute bull a-TSHr podobně jako TSH se primaacuterně vaacuteže na N-terminaacutelniacute
čaacutest extracelulaacuterniacute domeacuteny TSHr a aktivuje draacutehu transdukce signaacutelu cAMP ndash předevšiacutem STIMULUJIacuteCIacute protilaacutetky vedouciacute ke stimulaci tvorby tyroidniacutech hormonů a proliferaci tyrocytů
bull Jineacute typy protilaacutetek mohou TSHr antagonizovat nebo blokovat uacutečinek TSH a tiacutem způsobit hypotyreoacutezu u některyacutech pacientů s různyacutemi typy autoimunitniacute tyroiditidy zejmeacutena Hashimotovou tyreoiditidou 1)
bull Neutraacutelniacute (nově nazyacutevaneacute i apoptickeacute) a-TSHr jsou namiacuteřeny proti clevage region a můžou indukovat signaacutelniacute draacutehy odlišneacute od draacutehy cAMP a indukujiacute apoptoacutezu tyrocytů 2)
1) (Kahaly GJ Diana T TSH receptor antibody functionality and nomenclature Front Endocrinol (2017) 2)Danilo Villalta Federica DrsquoAurizio Mirella Da Re Debora Ricci Francesco Latrofa Renato Tozzoli Diagnostic accuracy of a new fluoroenzyme immunoassay for the detection of TSH receptor autoantibodies in Gravesrsquo disease
MOMENKLATURA dle Kahaly GJ Diana T TSH receptor antibody functionality and nomenclature Front
Endocrinol (2017) 828103389fendo201700028
Stimulujiacuteciacute ndash N-terminaacutel region Neutralniacute ndash Cleavage region Blokujiacuteciacute ndash C-terminaacutel region
Upraveno dle Balucan FS Morshed SA Davies TF Thyroid autoantibodies in pregnancy their role regulation and clinical relevance J Thyroid Res (2013) 2013
Protilaacutetky
bull Přiacutetomnost a-TSHr vylučuje dalšiacute tyreotoxikosy
bull Koncentrace protilaacutetek nesloužiacute pouze k určeniacute diagnosy ale i k predikci vyacutevoje onemocněniacute 1)2)
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TSHr v těhotenstviacute je rizikovyacutem faktorem pro dysfunkci štiacutetneacute žlaacutezy novorozence v důsledku transplacentaacuterniacuteho přenosu mateřskyacutech protilaacutetek
1) Jang SY Shin DY Lee EJ Lee SY Yoon JS Relevance of TSH-receptor anti- body levels in predicting disease course in Gravesrsquo orbitopathy comparison of the third-generation TBII assay and Mc4-TSI bioassay Eye (Lond) (2013) 27964ndash71 2) Bartalena L Burch HB Burman KD Kahaly GJ A 2013 European survey of clinical practice patterns in the management of Gravesrsquo disease Clin Endocrinol (2016) 84115ndash20
Protilaacutetky
bull a-TSHr je patogenetickyacute znak GD detekovatelnyacute prakticky u všech pacientů s GD Protilaacutetky jsou zodpovědneacute za patologickeacute funkce nemoci (stimulace růstu a funkce štiacutetneacute žlaacutezy orbitopatie dermatologickeacute potiacuteže)1)
bull a-TSHr se uacutečastniacute patogeneze u hypotyreodismu i u atrofickeacute formy Hashimotoveacute tyreoitidy 2)
bull TSHr je exprimovaacuten v řadě extra-tyroidniacutech buněk včetně fibroblastů adipocytů a kostniacutech buněk kde je znaacutemo že moduluje funkci ciacutelovyacutech buněk
1)Michalek K Morshed SA Latif R Davies TF TSH receptor autoantibodies Autoimmun Rev (2009) 9113ndash6 doi101016jautrev200903012 2) Giuliani C Monaco F Adult primary hypothyroidism In Monaco F editor Thyroid Diseases Boca Raton FL CRC Press (2012) p 171ndash94
Protilaacutetky
bull Titr a-TSHr taky klesajiacute po tyroidektomii (čaacutestečneacute či celkoveacute) kvůli odstraněniacute zdroje antigenu
bull Naopak naacuterůst titrů a-TSHr pozorujeme po leacutečbě radioiodine I131 (asi dle uvolněniacute antigenů a zpracovaacuteniacute antigenů antigen-presentujiacuteciacutemi buňkami)
Protilaacutetky + typ bull Bylo prokaacutezaacuteno že nedostatečnaacute korelace mezi
koncentracemi a-TSHr a klinickyacutem stavem pacienta je většinou způsobena tiacutem že protilaacutetky a-TSHr v oběhu jsou heterogenniacute
bull Přechod z TSAbs na TBAbs je zodpovědnyacute za vyacutevoj hypotyreoacutezy u maleacuteho procenta pacientů s Gravesovou nemociacute a naopak
bull Skutečnost že heterogenniacute protilaacutetky a-TSHr mohou koexistovat u jednoho pacienta a měnit se v průběhu času je jedniacutem z důvodů proč bylo těžkeacute vyvinout diagnosticky přesneacute testy na stanoveniacute protilaacutetek a-TSHr
bull Klinickeacute projevy pacientů s Gravesovou chorobou kteřiacute vykazujiacute přiacutetomnost protilaacutetek TSAb i TBAbTSBAb budou zaacutevisleacute spiacuteše na relativniacute koncentraci a afinitě predominantniacute protilaacutetky
Protilaacutetky - sledovaacuteniacute
bull Sledovaacuteniacute hladin TSAb přidaacutevaacute dalšiacute rozměr k hodnoceniacute aktivity GD s potenciaacutelem předpovědět recidivu nebo remisii u jednotlivyacutech pacientů
bull Vysokaacute perzistentniacute hladina TSAb je spojena s aktivniacutemi a zaacutevažnyacutemi systeacutemovyacutemi projevy a se špatnou odezvou na terapii Naopak niacutezkeacute hladiny TSAb jsou nachaacutezeny u pacientů v remisi
Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Diagnostika
bull a-TSHr lze měřit v podstatě dvěma typy testů
ndash Biologickyacutem testem (biotestem bioassay) ktereacute detekujiacute produkci cAMP v buněčnyacutech kulturaacutech inkubovanyacutech se seacuterami pacientů Tyto testy identifikujiacute pouze stimulačniacute a-TSHr Biotesty prokazujiacute nejen přiacutetomnost Ab ale takeacute jejich funkčniacute aktivitu a uacutečinnost Historicky sloužily biotesty k vyacutezkumu ke studiu patofyziologie GD
ndash Protilaacutetkoveacute testy (vazebneacute receptoroveacute) Naopak receptoroveacute metody rutinně použiacutevaneacute v klinickyacutech laboratořiacutech udaacutevajiacute pouze přiacutetomnost nebo nepřiacutetomnost a-TSHr a jejich koncentrace ale neuvaacutedějiacute jejich funkčniacute aktivitu 2)
bull Tento zaacutekladniacute rozdiacutel v uspořaacutedaacuteniacute metody vysvětluje proč biotesty a protilaacutetkoveacute testy vykazujiacute nižšiacute korelaci (r = 031 ndash 065) 1)
1)Gupta MK Thyrotropin-receptor antibodies in thyroid diseases advances in detection techniques and clinical application Clin Chem Acta 20002931-29 2) Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Biotesty
bull Biotesty mohou detekovat funkčniacute změny u heterogenniacutech a-TSHr
bull Skutečnost že heterogenniacute protilaacutetky a-TSHr mohou koexistovat u jednoho pacienta a měnit se v průběhu času je jedniacutem z důvodů proč bylo těžkeacute vyvinout diagnosticky přesneacute testy na stanoveniacute protilaacutetek a-TSHr
bull Biotesty mohou zlepšit peacuteči o pacienta ve smyslu bdquopersonalisovaneacute mediciacutenyldquo
bull Biotesty jsou nabiacutezeny referenčniacutemi laboratořeni je jistyacute předpoklady že by se mohly viacutece rozšiacuteřit
Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Biotesty
bull Během posledniacutech 60 let se biologickaacute analyacuteza a-TSHr vyvinula těžkopaacutednyacutech a časově naacuteročnyacutech postupů na geneticky upraveneacute testy založeneacute na buňkaacutech ktereacute jsou charakterizovaacuteny dobrou proveditelnostiacute a rychlyacutemi provozniacutemi časy a ktereacute jsou takeacute k dispozici jako komerčniacute sady
bull Komerčně dostupnyacute biotest je Thyretain fa Quidel kteryacute detekuje stimulačniacute aktivitu a-TSHr pomociacute chimeacuterickeacuteho TSHR a genu pro cAMP (signalizace luciferaacutezou) Je schvaacutelen FDA pro použitiacute v klinickyacutech laboratořiacutech
HISTORIE
Historickyacute vyacutevoj metod pro měřeniacute a-TSHr ndash dle Giuliani etal 2016
Cesidio Giuliani1 Motoyasu Saji2 Ines Bucci1 and Giorgio Napolitano Bioassays for TSH Receptor Autoantibodies from FRTL-5 Cells to TSH ReceptorndashLHCG Receptor Chimeras The Contribution of Leonard D Kohn Front Endocrinol (Lausanne) 2016 7 103
LATS
bull V r 1956 Adams a Purves zjistili že seacutera pacientů s tyreotoxikosou indukujiacute abnormaacutelniacute prodlouženou odpověď v TSH testu (s morčetem)1)2)
bull Nazvali jej ldquoabnormal thyroid stimulatorrdquo posleacuteze ldquolong-acting thyroid stimulatorrdquo (LATS) 2)3) bylo jasneacute že je odlišnyacute od TSH a neniacute produkovaacuten hypofyacutezou
bull V roce 1964 byla LATS identifikovaacutena jako protein podobnyacute protilaacutetkaacutem (4) a dalšiacute studie jednoznačně potvrdily že se jednaacute o IgG (56)
bull Prvniacute testy k detekci LATS měly niacutezkou senzitivitu (60-70) 7) bull Vyacuteznamneacute zlepšeniacute v testech nastalo v r 1975 a to s vyacutevojem
radioligandoveacuteho receptoroveacuteho testu Test hodnotil inhibici seacutera od pacientů s GD vaacutezaacutenyacutemi radioaktivně značeneacuteho TSH na lidskeacute tyroidniacute membraacuteny (8 Test byl nicmeacuteně staacutele zatiacutežen niacutezkou přesnostiacute
bull Dalšiacute zlepšeniacute přineslo nahrazeniacute tyroidaacutelniacute membraacuteny čaacutestečně vyčištěneacuteho TSHr - liquid phase first-generation immunoassay použiacutevanaacute dalšiacutech 20 let 910) specifita 99 senzitivita 80 11)
1)Adams DD Purves HD Abnormal responses in the assay of thyrotropin Proc Univ Otago Med Sch (1956) 3411ndash5 2)Adams DD The presence of an abnormal thyroid-stimulating hormone in the serum of some thyrotoxic patients J Clin Endocrinol Metab (1958) 18699ndash712 doi101210jcem-18-7-699 3) Adams DD Bioassay of long-acting thyroid stimulator (LATS) the dose-re- sponse relationship J Clin Endocrinol Metab (1961) 21799ndash805 4) Kriss JP Pleshakov V Chien JR Isolation and identification of the long-acting thyroid stimulator and its relation to hyperthyroidism and circumscribed pretibial myxedema J Clin Endocrinol Metab (1964) 241005ndash28 doi101210 jcem-24-10-1005 5) Kriss JP Inactivation of long-acting thyroid stimulator (LATS) by anti- kappa and anti-lamba antisera J Clin Endocrinol Metab (1968) 281440ndash4 doi101210jcem-28-10-1440 6) Volpeacute R The immunologic basis of Gravesrsquos disease N Engl J Med (1972) 287463ndash4 doi101056NEJM197208312870910 7) McKenzie JM Review pathogenesis of Gravesrsquo disease role of the long-acting thyroid stimulator J Clin Endocrinol Metab (1965) 25424ndash31 8) Mehdi SQ Nussey SS A radio-ligand receptor assay for the long-acting thy- roid stimulator Inhibition by the long-acting thyroid stimulator of the binding of radioiodinated thyroid stimulating hormone to human thyroid membranes Biochem J (1975) 145105ndash11 doi101042bj1450105 9)Shewring G Rees Smith B An improved radioreceptor assay for TSH receptor antibodies Clin Endocrinol (1982) 17409ndash17 doi101111j1365-22651982 tb01607x 10)Southgate K Creagh FM Teece M Kingswood C Rees Smith B A receptor assay for the measurement of TSH receptor antibodies in unextracted serum Clin Endocrinol (1984) 20539ndash48 doi101111j1365-22651984tb00102x 11)Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003
FRTL-5 bull Souběžně s vyacutevojem radioligandovyacutech receptorovyacutech testů dochaacutezelo k vyacutevoji
bdquobiotestůldquo Změna v in vivo na in vitro jako je použitiacute primaacuterniacutech buněčnyacutech kultur 1)
bull Dalšiacute zlepšeniacute přišlo s použitiacutem FRTL-5 buněk ndash netransformovanyacutech buněčnyacutech liniiacute krysiacutech thyroid epithelial buněk v kontinuaacutelniacute kultuře 2) Test byl založen na schopnosti purifikovanyacutech IgG indukovat produkci cAMP Naacutesledně bylo umožněno využiacutet pacientskeacute seacutera 3)
bull Tento test nesloužil jen pro diagnostiku ale měl zaacutesadniacute vyacuteznam v pochopeniacute patfyz vlastnostiacute a-TSHr
bull Kohn etal 4)5)6) vyvinuli monoklonaacutelniacute protilaacutetku k hodnoceniacute jejiacutech funkčniacutech vlastnostiacute
bull Použitiacute buněk FRTL-5 takeacute umožnilo dalšiacute studium funkčniacute heterogenity a-TSHr (samostatneacute posouzeniacute uacutečinků jednotlivyacutech IgG na dvě odlišneacute buněčneacute aktivity aktivity produkce cAMP a buněčneacuteho růstu) 7)
1)Toccafondi RS Aterini S Medici MA Rotella CM Tanini A Zonefrati R Thyroid-stimulating antibody (TSAb) detected in sera of Gravesrsquo patients using human thyroid cell cultures Clin Exp Immunol (1980) 40532ndash9 2) Ambesi-Impiombato FS Parks LAM Coon HG Culture of hormone-depen- dent functional epithelial cells from rat thyroids Proc Natl Acad Sci U S A (1980) 773455ndash9 doi101073pnas7763455 3) Vitti P Chiovato L Lopez G Lombardi A Santini F Mammoli C et al Measurement of TSAb directly in serum using FRTL-5 cells J Endocrinol Invest (1988) 11313ndash7 doi101007BF03350157 4) Yavin E Yavin Z Schneider MD Kohn LD Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor implications for receptor structure and the action of autoantibodies in Gravesrsquo disease Proc Natl Acad Sci U S A (1981) 783180ndash4 doi101073pnas7853180 5) Valente WA Vitti P Yavin Z Yavin E Rotella CM Grollman EF et al Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor stimulating and blocking antibodies derived from the lymphocytes of patients with Gravesrsquo disease Proc Natl Acad Sci U S A (1982) 796680ndash4 doi101073pnas79216680 6) Valente WA Yavin Z Yavin E Grollman EF Schneider M Rotella CM et al Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor the identification of blocking and stimulating antibodies J Endocrinol Invest (1982) 5293ndash301 doi101007BF03350517 7) Valente WA Vitti P Rotella CM Vaughan MM Aloj SM Grollman EF et al Antibodies that promote thyroid growth A distinct population of thyroid-stimulating autoantibodies N Engl J Med (1983) 3091028ndash34 doi101056NEJM198310273091705
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 1
bull Hlavniacute průlom přišel s naklonovaacuteniacutem TSHr v r 1989 1-3) ndash využitiacute lidskeacuteho TSHr pro RIA i bioassays 45) ndash senzitivita 96 pro RIA
bull Pomociacute mutačniacutech technik byly připraveny chimerickeacute TSHr
bull V 90 leacutetech byly vyvinuty monoklonaacutelniacute protilaacutetky proti C-terminus region rh-TSHr 67)
1)Parmentier M Libert F Maenhaut C Lefort Gerard C Perret J Van Sande J et al Molecular cloning of the thyrotropin receptor Science (1989) 2461620ndash2 doi101126science2556796 2)Nagayama Y Kaufman KD Seto P Rapoport B Molecular cloning sequence and functional expression of the cDNA for the human thyrotropin receptor Biochem Biophys Res Commun (1989) 1651184ndash90 doi1010160006- 291X(89)92727-7 3) Akamizu T Ikuyama S Saji M Kosugi S Kozak C McBride OW et al Cloning chromosomal assignment and regulation of the rat thyrotropin receptor expression of the gene is regulated by thyrotropin agents that increase cAMP levels and thyroid autoantibodies Proc Natl Acad Sci U S A (1990) 875677ndash81 doi101073pnas87155677 4)Ludgate M Perret J Parmentier M Gerard C Libert F Dumont JE et al Use of recombinant human thyrotropin receptor (TSH-R) expressed in mammalian cell lines to assay TSH-R autoantibodies Mol Cell Endocrinol (1991) 73R13ndash8 doi1010160303-7207(90)90050-I 5) Filetti S Foti D Costante G Rapoport B Recombinant human thyrotropin (TSH) receptor in a radioreceptor assay for the measurement of TSH receptor autoantibodies J Clin Endocrinol Metab (1991) 721096ndash101 doi101210 jcem-72-5-1096 6) Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 7)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 2
bull Druhaacute generace imunotestů (ELISA) ndash solid-phase ndash se staly standardem pro dg a-TSHr diacuteky přesnosti (988 senzitivita a 996 specifita) a non-RIA 123)
bull Použitiacutem rh-TSHr nebo vepřovyacute TSHr ziacuteskaacuteme stejnou analytickou přesnost3)
1)Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 2)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071 3)Kamijo K TSH-receptor antibody measurement in patients with various thyrotoxicosis and Hashimotorsquos thyroiditis a comparison of two two-step assays coated plate ELISA using porcine TSH-receptor and coated tube radio- assay using human recombinant TSH-receptor Endocr J (2003) 50113ndash6 doi101507endocrj50113
Monoclonal a-TSHr stimulujiacuteciacute
bull Na přelomu mileacutenia byly studovaacuteny stimulujiacuteciacute protilaacutetky a-TSHr 123)
bull Tato data jsou zaacutesadniacute pro pochopeniacute vztahů struktury a funkciacute TSHRr a jejiacute role v patogenezi Gravesovy choroby
bull To vše vedlo k izolaci a charakterizaci lidskeacute monoklonaacutelniacute protilaacutetky a-TSHr stimulujiacuteciacute ndash M22 4)
1)Ando T Latif R Pritsker A Moran T Nagayama Y Davies TF A monoclonal thyroid-stimulating antibody J Clin Invest (2002) 1101667ndash74 doi101172 JCI0216991 2)Costagliola S Franssen JDF Bonomi M Urizar E Willnich M Bergmann A et al Generation of a mouse monoclonal TSH receptor antibody with stimu- lating activity Biochem Biophys Res Commun (2002) 299891ndash6 doi101016 S0006-291X(02)02762-6 3)Sanders J Jeffreys J Depraetere H Richards T Evans M Kiddie A et al Thyroid-stimulating monoclonal antibodies Thyroid (2002) 121043ndash50 doi101089105072502321085135 4) Sanders J Evans M Premawardhana LDKE Depraetere H Jeffreys J Richards T et al Human monoclonal stimulating autoantibody Lancet (2003) 362126ndash8 doi101016S0140-6736(03)13866-4
Třetiacute generace testů ndash M22
bull V r2004 byl vyvinut test použitiacutem M22 ve formaacutetu ELISA 1) senzitivita 974 a specifita 992 (např Medipan)
bull Test byl vhodnyacute i pro automatizaci 23)
bull Dostupnost a znalost jak stimulujiacuteciacutech tak blokujiacuteciacutech protilaacutetek byla důležitaacute k pochopeniacute krystalickeacute struktury TSHr a jejiacutech interakciacute s a-TSHr 4) poukaacutezalo to na širokeacute překryvy epitopů mezi stimulujiacuteciacutemi a blokujiacuteciacutemi protilaacutetkami 4)
bull Roche nativniacute vepřovyacute TSH s M22
1)Rees Smith B Bolton J Young S Collyer A Weeden A Bradbury J et al A new assay for thyrotropin receptor autoantibodies Thyroid (2004) 14830ndash5 doi1010891050725042451248 2) Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003 3) Zophel K Roggenbuck D von Landenberg P Wunderlich G Gruning T Kotzerke J et al TSH receptor antibody (TRAb) assays based on the human monoclonal autoantibody M22 are more sensitive than bovine TSH based assays Horm Metab Res (2010) 4265ndash9 doi101055s-0029-1241196 4) Furmaniak J Sanders J Nunez Miguel R Rees Smith B Mechanisms of action of TSHR autoantibodies Horm Metab Res (2015) 47735ndash52 doi10105 5s-0035-1559648
Mc4 bioassay
bull Souběžně s testy 3-generace Kohn vyvinul test využiacutevajiacuteciacute bdquoMc4 chimeacuteruldquo založenou na metodaacutech chemiluminiscence 1)
bull Ciacutelem bylo měřit pouze stimulujiacuteciacute protilaacutetky a tiacutem dosaacutehnout jasneacuteho cutoff mezi pacienty s GD a kontrolami
bull Porovnaacuteniacute senzitivity a specifity v tabulce 2) bull Mc4 testy mohou byacutet využity jako testy prvniacute
volby pro pacienty s GD
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Mc4 bioassay
bull Testy s M22 diacuteky podobně specifitě a senzitivitě ale lepšiacute bdquoproveditelnostildquo jsou zatiacutem preferovanějšiacute
bull Daacutele jsou lepšiacute pro prognoacutezu GD než testy s M22 a leacutepe korelujiacute s aktivitou a zaacutevažnostiacute GD orbitopatiiacute 2)
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Bridge Assay
bull Novaacute technologie využitiacute chimeacuterickyacutech receptorů Mc4 a N-terminaacutelniacute TSHr fůsovanyacute s alkalickou fosfataacutezou 1) senzitivita 998 a specifita 995
bull TSI ndash Siemens tato metoda je založena na sendvičoveacutem kompetetivniacute formaacutetu kteryacute se lišiacute od klasickeacuteho kompetetivniacute formaacutetu komerčniacutech IMA druheacute a třetiacute generace 2)
1)Frank CU Braeth S Dietrich JW Wanjura D Loos U Bridge technology with TSH receptor chimera for sensitive direct detection of TSH receptor antibodies causing Gravesrsquo disease analytical and clinical evaluation Horm Metab Res (2015) 47880ndash8 doi101055s-0035-1554662 2)Tozzoli R DrsquoAurizio F Villalta D Giovanella L (2017) Evalu- ation of the first fully automated immunoassay method for the measurement of stimulating TSH receptor autoantibodies in Gravesrsquo disease Clin Chem Lab Med 5558ndash64
Mezinaacuterodniacute standard
bull Prvniacute mezinaacuterodniacute standard připraven v r 1995 WHO označeniacute 90672 Připraven ECBS zdroj pacientskaacute plasma
bull V r 2006 nahrazen lidskou monoklonaacutelniacute protilaacutetkou M22 (NIBSC 08240) odkazuje na detekci S-TRAb 1)
1) Diana T1 Kanitz M Lehmann M Li Y Olivo PD Kahaly GJ Standardization of a bioassay for thyrotropin receptor stimulating autoantibodies Thyroid 2015 Feb25(2)169-75
EHK ndash SEKK AT217
EHK ndash SEKK AT217
SEKK - Dotazniacutek
EHK ndash SEKK AT113
EHK ndash SEKK AT113
Hashimotova tyreoiditida (HT)
bull HT 1) a SLE 2) byly prvniacute dvě autoimunitniacute onemocněniacute kde se prokaacutezala genetickaacute asociace (geny MHC třiacutedy II) 70 leacuteta
bull Nicmeacuteně nebyl nalezen gen kteryacute by spouštěl HT nalezeny pouze geny ktereacute přispiacutevajiacute k fenotypu onemocněniacute 3)
1)VladutiuAO RoseNR Autoimmunemurine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type Science 19711741137ndash9 2)Grumet FC Coukell A Bodmer JG Bodmer WF McDevitt HO Histocompatibility (HL-A) antigens associated with systemic lupus erythematosus A possible genetic predisposition to disease N Engl J Med 1971285193ndash6 3) Simmonds MJ Gough SC The search for the genetic contribution to autoimmune thyroid disease the never ending story Brief Funct Genomics 20111077ndash90
Hashimotova tyreoiditida
bull Do 50 let raritniacute onemocněniacute nyniacute nejběžnějšiacute s prevalenciacute 81000 biochemickyacute naacutelez + autoprotilaacutetky 461000
bull Ženymuži 81
a-TPO
bull Přiacutetomnost protilaacutetek TPOAb obvykle předchaacuteziacute vzniku tyreoidaacutelniacute dysfunkce
bull Patogenetickaacute role protilaacutetek TgAb zůstaacutevaacute nejasnaacute
a-TPO
bull Autoprotilaacutetky TPOAb byly nejdřiacuteve popsaacuteny jako antimikrozomaacutelniacute autoprotilaacutetky (AMA) neboť bylo zjištěno že reagujiacute s neupravenyacutemi membraacutenami tyreoidaacutelniacutech buněk
bull Mikrozomaacutelniacute antigen byl později popsaacuten jako TPO
bull Dřiacuteve se využiacutevaly ke stanoveniacute TPO metody imunofluorescenčniacute metody a aglutinačniacute testy s pasivniacutem barveniacutem erytrocytů
a-TPO jako rizikovyacute faktor
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TPO je znaacutemyacutem rizikovyacutem faktorem pro vznik tyreoidaacutelniacute dysfunkce pokud jsou pacienti leacutečeni lithiem amiodaronem interleukinem-2 nebo alfa-interferonem
a-TG
bull Tg vykazuje vysokou heterogenitu způsobenou rozdiacutely v posttranslačniacutech modifikaciacutech (glykosylace jodizace sulfatace atd) Během synteacutezy tyreoidaacutelniacuteho hormonu a jeho uvolněniacute je Tg polymerizovaacuten a degradovaacuten
bull Vlivem toho je imunologickaacute struktura Tg mimořaacutedně komplexniacute Charakteristika standardů pro Tg se může lišit v zaacutevislosti na vstupniacute lidskeacute tyreoidaacutelniacute tkaacuteni a použiteacutem purifikačniacutem procesu To vysvětluje proč jsou testy na TgAb a takeacute Tg tak obtiacutežně standardizovatelneacute
Titr protilaacutetek
bull Titr protilaacutetek literaacuterně koreluje s počtem autoreaktivniacutech lymfocytů ktereacute infiltrujiacute štiacutetnou žlaacutezu a sonografickyacutem obrazem 1)
bull a-TG nižšiacute senzitivita (60-80 u HT) a menšiacute specifita (pozitivniacute ve většiacute čaacutesti zdravyacutech kontrol) než a-TPO
bull a-TG a a-TPO představujiacute dva různeacute aspekty autoimunniacute odpovědi na štiacutetnou žlaacutezu a-TG by mohly odraacutežet počaacutetečniacute (vrozenyacute) typ imunitniacute odpovědi zatiacutemco a-TPO by mohly charakterizovat pozdějšiacute adaptivniacute imunitniacute odpovědi 2)
1)Pandit AA VijayWardeMMenon PS Correlation of number of intrathyroid lympho- cytes with antimicrosomal antibody titer in Hashimotos thyroiditis Diagn Cytopathol 20032863ndash5 2) Rose NR Autoimmune escalation through the crystal ball Clin Exp Immunol 20071479
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
MOMENKLATURA dle Kahaly GJ Diana T TSH receptor antibody functionality and nomenclature Front
Endocrinol (2017) 828103389fendo201700028
Stimulujiacuteciacute ndash N-terminaacutel region Neutralniacute ndash Cleavage region Blokujiacuteciacute ndash C-terminaacutel region
Upraveno dle Balucan FS Morshed SA Davies TF Thyroid autoantibodies in pregnancy their role regulation and clinical relevance J Thyroid Res (2013) 2013
Protilaacutetky
bull Přiacutetomnost a-TSHr vylučuje dalšiacute tyreotoxikosy
bull Koncentrace protilaacutetek nesloužiacute pouze k určeniacute diagnosy ale i k predikci vyacutevoje onemocněniacute 1)2)
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TSHr v těhotenstviacute je rizikovyacutem faktorem pro dysfunkci štiacutetneacute žlaacutezy novorozence v důsledku transplacentaacuterniacuteho přenosu mateřskyacutech protilaacutetek
1) Jang SY Shin DY Lee EJ Lee SY Yoon JS Relevance of TSH-receptor anti- body levels in predicting disease course in Gravesrsquo orbitopathy comparison of the third-generation TBII assay and Mc4-TSI bioassay Eye (Lond) (2013) 27964ndash71 2) Bartalena L Burch HB Burman KD Kahaly GJ A 2013 European survey of clinical practice patterns in the management of Gravesrsquo disease Clin Endocrinol (2016) 84115ndash20
Protilaacutetky
bull a-TSHr je patogenetickyacute znak GD detekovatelnyacute prakticky u všech pacientů s GD Protilaacutetky jsou zodpovědneacute za patologickeacute funkce nemoci (stimulace růstu a funkce štiacutetneacute žlaacutezy orbitopatie dermatologickeacute potiacuteže)1)
bull a-TSHr se uacutečastniacute patogeneze u hypotyreodismu i u atrofickeacute formy Hashimotoveacute tyreoitidy 2)
bull TSHr je exprimovaacuten v řadě extra-tyroidniacutech buněk včetně fibroblastů adipocytů a kostniacutech buněk kde je znaacutemo že moduluje funkci ciacutelovyacutech buněk
1)Michalek K Morshed SA Latif R Davies TF TSH receptor autoantibodies Autoimmun Rev (2009) 9113ndash6 doi101016jautrev200903012 2) Giuliani C Monaco F Adult primary hypothyroidism In Monaco F editor Thyroid Diseases Boca Raton FL CRC Press (2012) p 171ndash94
Protilaacutetky
bull Titr a-TSHr taky klesajiacute po tyroidektomii (čaacutestečneacute či celkoveacute) kvůli odstraněniacute zdroje antigenu
bull Naopak naacuterůst titrů a-TSHr pozorujeme po leacutečbě radioiodine I131 (asi dle uvolněniacute antigenů a zpracovaacuteniacute antigenů antigen-presentujiacuteciacutemi buňkami)
Protilaacutetky + typ bull Bylo prokaacutezaacuteno že nedostatečnaacute korelace mezi
koncentracemi a-TSHr a klinickyacutem stavem pacienta je většinou způsobena tiacutem že protilaacutetky a-TSHr v oběhu jsou heterogenniacute
bull Přechod z TSAbs na TBAbs je zodpovědnyacute za vyacutevoj hypotyreoacutezy u maleacuteho procenta pacientů s Gravesovou nemociacute a naopak
bull Skutečnost že heterogenniacute protilaacutetky a-TSHr mohou koexistovat u jednoho pacienta a měnit se v průběhu času je jedniacutem z důvodů proč bylo těžkeacute vyvinout diagnosticky přesneacute testy na stanoveniacute protilaacutetek a-TSHr
bull Klinickeacute projevy pacientů s Gravesovou chorobou kteřiacute vykazujiacute přiacutetomnost protilaacutetek TSAb i TBAbTSBAb budou zaacutevisleacute spiacuteše na relativniacute koncentraci a afinitě predominantniacute protilaacutetky
Protilaacutetky - sledovaacuteniacute
bull Sledovaacuteniacute hladin TSAb přidaacutevaacute dalšiacute rozměr k hodnoceniacute aktivity GD s potenciaacutelem předpovědět recidivu nebo remisii u jednotlivyacutech pacientů
bull Vysokaacute perzistentniacute hladina TSAb je spojena s aktivniacutemi a zaacutevažnyacutemi systeacutemovyacutemi projevy a se špatnou odezvou na terapii Naopak niacutezkeacute hladiny TSAb jsou nachaacutezeny u pacientů v remisi
Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Diagnostika
bull a-TSHr lze měřit v podstatě dvěma typy testů
ndash Biologickyacutem testem (biotestem bioassay) ktereacute detekujiacute produkci cAMP v buněčnyacutech kulturaacutech inkubovanyacutech se seacuterami pacientů Tyto testy identifikujiacute pouze stimulačniacute a-TSHr Biotesty prokazujiacute nejen přiacutetomnost Ab ale takeacute jejich funkčniacute aktivitu a uacutečinnost Historicky sloužily biotesty k vyacutezkumu ke studiu patofyziologie GD
ndash Protilaacutetkoveacute testy (vazebneacute receptoroveacute) Naopak receptoroveacute metody rutinně použiacutevaneacute v klinickyacutech laboratořiacutech udaacutevajiacute pouze přiacutetomnost nebo nepřiacutetomnost a-TSHr a jejich koncentrace ale neuvaacutedějiacute jejich funkčniacute aktivitu 2)
bull Tento zaacutekladniacute rozdiacutel v uspořaacutedaacuteniacute metody vysvětluje proč biotesty a protilaacutetkoveacute testy vykazujiacute nižšiacute korelaci (r = 031 ndash 065) 1)
1)Gupta MK Thyrotropin-receptor antibodies in thyroid diseases advances in detection techniques and clinical application Clin Chem Acta 20002931-29 2) Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Biotesty
bull Biotesty mohou detekovat funkčniacute změny u heterogenniacutech a-TSHr
bull Skutečnost že heterogenniacute protilaacutetky a-TSHr mohou koexistovat u jednoho pacienta a měnit se v průběhu času je jedniacutem z důvodů proč bylo těžkeacute vyvinout diagnosticky přesneacute testy na stanoveniacute protilaacutetek a-TSHr
bull Biotesty mohou zlepšit peacuteči o pacienta ve smyslu bdquopersonalisovaneacute mediciacutenyldquo
bull Biotesty jsou nabiacutezeny referenčniacutemi laboratořeni je jistyacute předpoklady že by se mohly viacutece rozšiacuteřit
Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Biotesty
bull Během posledniacutech 60 let se biologickaacute analyacuteza a-TSHr vyvinula těžkopaacutednyacutech a časově naacuteročnyacutech postupů na geneticky upraveneacute testy založeneacute na buňkaacutech ktereacute jsou charakterizovaacuteny dobrou proveditelnostiacute a rychlyacutemi provozniacutemi časy a ktereacute jsou takeacute k dispozici jako komerčniacute sady
bull Komerčně dostupnyacute biotest je Thyretain fa Quidel kteryacute detekuje stimulačniacute aktivitu a-TSHr pomociacute chimeacuterickeacuteho TSHR a genu pro cAMP (signalizace luciferaacutezou) Je schvaacutelen FDA pro použitiacute v klinickyacutech laboratořiacutech
HISTORIE
Historickyacute vyacutevoj metod pro měřeniacute a-TSHr ndash dle Giuliani etal 2016
Cesidio Giuliani1 Motoyasu Saji2 Ines Bucci1 and Giorgio Napolitano Bioassays for TSH Receptor Autoantibodies from FRTL-5 Cells to TSH ReceptorndashLHCG Receptor Chimeras The Contribution of Leonard D Kohn Front Endocrinol (Lausanne) 2016 7 103
LATS
bull V r 1956 Adams a Purves zjistili že seacutera pacientů s tyreotoxikosou indukujiacute abnormaacutelniacute prodlouženou odpověď v TSH testu (s morčetem)1)2)
bull Nazvali jej ldquoabnormal thyroid stimulatorrdquo posleacuteze ldquolong-acting thyroid stimulatorrdquo (LATS) 2)3) bylo jasneacute že je odlišnyacute od TSH a neniacute produkovaacuten hypofyacutezou
bull V roce 1964 byla LATS identifikovaacutena jako protein podobnyacute protilaacutetkaacutem (4) a dalšiacute studie jednoznačně potvrdily že se jednaacute o IgG (56)
bull Prvniacute testy k detekci LATS měly niacutezkou senzitivitu (60-70) 7) bull Vyacuteznamneacute zlepšeniacute v testech nastalo v r 1975 a to s vyacutevojem
radioligandoveacuteho receptoroveacuteho testu Test hodnotil inhibici seacutera od pacientů s GD vaacutezaacutenyacutemi radioaktivně značeneacuteho TSH na lidskeacute tyroidniacute membraacuteny (8 Test byl nicmeacuteně staacutele zatiacutežen niacutezkou přesnostiacute
bull Dalšiacute zlepšeniacute přineslo nahrazeniacute tyroidaacutelniacute membraacuteny čaacutestečně vyčištěneacuteho TSHr - liquid phase first-generation immunoassay použiacutevanaacute dalšiacutech 20 let 910) specifita 99 senzitivita 80 11)
1)Adams DD Purves HD Abnormal responses in the assay of thyrotropin Proc Univ Otago Med Sch (1956) 3411ndash5 2)Adams DD The presence of an abnormal thyroid-stimulating hormone in the serum of some thyrotoxic patients J Clin Endocrinol Metab (1958) 18699ndash712 doi101210jcem-18-7-699 3) Adams DD Bioassay of long-acting thyroid stimulator (LATS) the dose-re- sponse relationship J Clin Endocrinol Metab (1961) 21799ndash805 4) Kriss JP Pleshakov V Chien JR Isolation and identification of the long-acting thyroid stimulator and its relation to hyperthyroidism and circumscribed pretibial myxedema J Clin Endocrinol Metab (1964) 241005ndash28 doi101210 jcem-24-10-1005 5) Kriss JP Inactivation of long-acting thyroid stimulator (LATS) by anti- kappa and anti-lamba antisera J Clin Endocrinol Metab (1968) 281440ndash4 doi101210jcem-28-10-1440 6) Volpeacute R The immunologic basis of Gravesrsquos disease N Engl J Med (1972) 287463ndash4 doi101056NEJM197208312870910 7) McKenzie JM Review pathogenesis of Gravesrsquo disease role of the long-acting thyroid stimulator J Clin Endocrinol Metab (1965) 25424ndash31 8) Mehdi SQ Nussey SS A radio-ligand receptor assay for the long-acting thy- roid stimulator Inhibition by the long-acting thyroid stimulator of the binding of radioiodinated thyroid stimulating hormone to human thyroid membranes Biochem J (1975) 145105ndash11 doi101042bj1450105 9)Shewring G Rees Smith B An improved radioreceptor assay for TSH receptor antibodies Clin Endocrinol (1982) 17409ndash17 doi101111j1365-22651982 tb01607x 10)Southgate K Creagh FM Teece M Kingswood C Rees Smith B A receptor assay for the measurement of TSH receptor antibodies in unextracted serum Clin Endocrinol (1984) 20539ndash48 doi101111j1365-22651984tb00102x 11)Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003
FRTL-5 bull Souběžně s vyacutevojem radioligandovyacutech receptorovyacutech testů dochaacutezelo k vyacutevoji
bdquobiotestůldquo Změna v in vivo na in vitro jako je použitiacute primaacuterniacutech buněčnyacutech kultur 1)
bull Dalšiacute zlepšeniacute přišlo s použitiacutem FRTL-5 buněk ndash netransformovanyacutech buněčnyacutech liniiacute krysiacutech thyroid epithelial buněk v kontinuaacutelniacute kultuře 2) Test byl založen na schopnosti purifikovanyacutech IgG indukovat produkci cAMP Naacutesledně bylo umožněno využiacutet pacientskeacute seacutera 3)
bull Tento test nesloužil jen pro diagnostiku ale měl zaacutesadniacute vyacuteznam v pochopeniacute patfyz vlastnostiacute a-TSHr
bull Kohn etal 4)5)6) vyvinuli monoklonaacutelniacute protilaacutetku k hodnoceniacute jejiacutech funkčniacutech vlastnostiacute
bull Použitiacute buněk FRTL-5 takeacute umožnilo dalšiacute studium funkčniacute heterogenity a-TSHr (samostatneacute posouzeniacute uacutečinků jednotlivyacutech IgG na dvě odlišneacute buněčneacute aktivity aktivity produkce cAMP a buněčneacuteho růstu) 7)
1)Toccafondi RS Aterini S Medici MA Rotella CM Tanini A Zonefrati R Thyroid-stimulating antibody (TSAb) detected in sera of Gravesrsquo patients using human thyroid cell cultures Clin Exp Immunol (1980) 40532ndash9 2) Ambesi-Impiombato FS Parks LAM Coon HG Culture of hormone-depen- dent functional epithelial cells from rat thyroids Proc Natl Acad Sci U S A (1980) 773455ndash9 doi101073pnas7763455 3) Vitti P Chiovato L Lopez G Lombardi A Santini F Mammoli C et al Measurement of TSAb directly in serum using FRTL-5 cells J Endocrinol Invest (1988) 11313ndash7 doi101007BF03350157 4) Yavin E Yavin Z Schneider MD Kohn LD Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor implications for receptor structure and the action of autoantibodies in Gravesrsquo disease Proc Natl Acad Sci U S A (1981) 783180ndash4 doi101073pnas7853180 5) Valente WA Vitti P Yavin Z Yavin E Rotella CM Grollman EF et al Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor stimulating and blocking antibodies derived from the lymphocytes of patients with Gravesrsquo disease Proc Natl Acad Sci U S A (1982) 796680ndash4 doi101073pnas79216680 6) Valente WA Yavin Z Yavin E Grollman EF Schneider M Rotella CM et al Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor the identification of blocking and stimulating antibodies J Endocrinol Invest (1982) 5293ndash301 doi101007BF03350517 7) Valente WA Vitti P Rotella CM Vaughan MM Aloj SM Grollman EF et al Antibodies that promote thyroid growth A distinct population of thyroid-stimulating autoantibodies N Engl J Med (1983) 3091028ndash34 doi101056NEJM198310273091705
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 1
bull Hlavniacute průlom přišel s naklonovaacuteniacutem TSHr v r 1989 1-3) ndash využitiacute lidskeacuteho TSHr pro RIA i bioassays 45) ndash senzitivita 96 pro RIA
bull Pomociacute mutačniacutech technik byly připraveny chimerickeacute TSHr
bull V 90 leacutetech byly vyvinuty monoklonaacutelniacute protilaacutetky proti C-terminus region rh-TSHr 67)
1)Parmentier M Libert F Maenhaut C Lefort Gerard C Perret J Van Sande J et al Molecular cloning of the thyrotropin receptor Science (1989) 2461620ndash2 doi101126science2556796 2)Nagayama Y Kaufman KD Seto P Rapoport B Molecular cloning sequence and functional expression of the cDNA for the human thyrotropin receptor Biochem Biophys Res Commun (1989) 1651184ndash90 doi1010160006- 291X(89)92727-7 3) Akamizu T Ikuyama S Saji M Kosugi S Kozak C McBride OW et al Cloning chromosomal assignment and regulation of the rat thyrotropin receptor expression of the gene is regulated by thyrotropin agents that increase cAMP levels and thyroid autoantibodies Proc Natl Acad Sci U S A (1990) 875677ndash81 doi101073pnas87155677 4)Ludgate M Perret J Parmentier M Gerard C Libert F Dumont JE et al Use of recombinant human thyrotropin receptor (TSH-R) expressed in mammalian cell lines to assay TSH-R autoantibodies Mol Cell Endocrinol (1991) 73R13ndash8 doi1010160303-7207(90)90050-I 5) Filetti S Foti D Costante G Rapoport B Recombinant human thyrotropin (TSH) receptor in a radioreceptor assay for the measurement of TSH receptor autoantibodies J Clin Endocrinol Metab (1991) 721096ndash101 doi101210 jcem-72-5-1096 6) Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 7)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 2
bull Druhaacute generace imunotestů (ELISA) ndash solid-phase ndash se staly standardem pro dg a-TSHr diacuteky přesnosti (988 senzitivita a 996 specifita) a non-RIA 123)
bull Použitiacutem rh-TSHr nebo vepřovyacute TSHr ziacuteskaacuteme stejnou analytickou přesnost3)
1)Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 2)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071 3)Kamijo K TSH-receptor antibody measurement in patients with various thyrotoxicosis and Hashimotorsquos thyroiditis a comparison of two two-step assays coated plate ELISA using porcine TSH-receptor and coated tube radio- assay using human recombinant TSH-receptor Endocr J (2003) 50113ndash6 doi101507endocrj50113
Monoclonal a-TSHr stimulujiacuteciacute
bull Na přelomu mileacutenia byly studovaacuteny stimulujiacuteciacute protilaacutetky a-TSHr 123)
bull Tato data jsou zaacutesadniacute pro pochopeniacute vztahů struktury a funkciacute TSHRr a jejiacute role v patogenezi Gravesovy choroby
bull To vše vedlo k izolaci a charakterizaci lidskeacute monoklonaacutelniacute protilaacutetky a-TSHr stimulujiacuteciacute ndash M22 4)
1)Ando T Latif R Pritsker A Moran T Nagayama Y Davies TF A monoclonal thyroid-stimulating antibody J Clin Invest (2002) 1101667ndash74 doi101172 JCI0216991 2)Costagliola S Franssen JDF Bonomi M Urizar E Willnich M Bergmann A et al Generation of a mouse monoclonal TSH receptor antibody with stimu- lating activity Biochem Biophys Res Commun (2002) 299891ndash6 doi101016 S0006-291X(02)02762-6 3)Sanders J Jeffreys J Depraetere H Richards T Evans M Kiddie A et al Thyroid-stimulating monoclonal antibodies Thyroid (2002) 121043ndash50 doi101089105072502321085135 4) Sanders J Evans M Premawardhana LDKE Depraetere H Jeffreys J Richards T et al Human monoclonal stimulating autoantibody Lancet (2003) 362126ndash8 doi101016S0140-6736(03)13866-4
Třetiacute generace testů ndash M22
bull V r2004 byl vyvinut test použitiacutem M22 ve formaacutetu ELISA 1) senzitivita 974 a specifita 992 (např Medipan)
bull Test byl vhodnyacute i pro automatizaci 23)
bull Dostupnost a znalost jak stimulujiacuteciacutech tak blokujiacuteciacutech protilaacutetek byla důležitaacute k pochopeniacute krystalickeacute struktury TSHr a jejiacutech interakciacute s a-TSHr 4) poukaacutezalo to na širokeacute překryvy epitopů mezi stimulujiacuteciacutemi a blokujiacuteciacutemi protilaacutetkami 4)
bull Roche nativniacute vepřovyacute TSH s M22
1)Rees Smith B Bolton J Young S Collyer A Weeden A Bradbury J et al A new assay for thyrotropin receptor autoantibodies Thyroid (2004) 14830ndash5 doi1010891050725042451248 2) Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003 3) Zophel K Roggenbuck D von Landenberg P Wunderlich G Gruning T Kotzerke J et al TSH receptor antibody (TRAb) assays based on the human monoclonal autoantibody M22 are more sensitive than bovine TSH based assays Horm Metab Res (2010) 4265ndash9 doi101055s-0029-1241196 4) Furmaniak J Sanders J Nunez Miguel R Rees Smith B Mechanisms of action of TSHR autoantibodies Horm Metab Res (2015) 47735ndash52 doi10105 5s-0035-1559648
Mc4 bioassay
bull Souběžně s testy 3-generace Kohn vyvinul test využiacutevajiacuteciacute bdquoMc4 chimeacuteruldquo založenou na metodaacutech chemiluminiscence 1)
bull Ciacutelem bylo měřit pouze stimulujiacuteciacute protilaacutetky a tiacutem dosaacutehnout jasneacuteho cutoff mezi pacienty s GD a kontrolami
bull Porovnaacuteniacute senzitivity a specifity v tabulce 2) bull Mc4 testy mohou byacutet využity jako testy prvniacute
volby pro pacienty s GD
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Mc4 bioassay
bull Testy s M22 diacuteky podobně specifitě a senzitivitě ale lepšiacute bdquoproveditelnostildquo jsou zatiacutem preferovanějšiacute
bull Daacutele jsou lepšiacute pro prognoacutezu GD než testy s M22 a leacutepe korelujiacute s aktivitou a zaacutevažnostiacute GD orbitopatiiacute 2)
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Bridge Assay
bull Novaacute technologie využitiacute chimeacuterickyacutech receptorů Mc4 a N-terminaacutelniacute TSHr fůsovanyacute s alkalickou fosfataacutezou 1) senzitivita 998 a specifita 995
bull TSI ndash Siemens tato metoda je založena na sendvičoveacutem kompetetivniacute formaacutetu kteryacute se lišiacute od klasickeacuteho kompetetivniacute formaacutetu komerčniacutech IMA druheacute a třetiacute generace 2)
1)Frank CU Braeth S Dietrich JW Wanjura D Loos U Bridge technology with TSH receptor chimera for sensitive direct detection of TSH receptor antibodies causing Gravesrsquo disease analytical and clinical evaluation Horm Metab Res (2015) 47880ndash8 doi101055s-0035-1554662 2)Tozzoli R DrsquoAurizio F Villalta D Giovanella L (2017) Evalu- ation of the first fully automated immunoassay method for the measurement of stimulating TSH receptor autoantibodies in Gravesrsquo disease Clin Chem Lab Med 5558ndash64
Mezinaacuterodniacute standard
bull Prvniacute mezinaacuterodniacute standard připraven v r 1995 WHO označeniacute 90672 Připraven ECBS zdroj pacientskaacute plasma
bull V r 2006 nahrazen lidskou monoklonaacutelniacute protilaacutetkou M22 (NIBSC 08240) odkazuje na detekci S-TRAb 1)
1) Diana T1 Kanitz M Lehmann M Li Y Olivo PD Kahaly GJ Standardization of a bioassay for thyrotropin receptor stimulating autoantibodies Thyroid 2015 Feb25(2)169-75
EHK ndash SEKK AT217
EHK ndash SEKK AT217
SEKK - Dotazniacutek
EHK ndash SEKK AT113
EHK ndash SEKK AT113
Hashimotova tyreoiditida (HT)
bull HT 1) a SLE 2) byly prvniacute dvě autoimunitniacute onemocněniacute kde se prokaacutezala genetickaacute asociace (geny MHC třiacutedy II) 70 leacuteta
bull Nicmeacuteně nebyl nalezen gen kteryacute by spouštěl HT nalezeny pouze geny ktereacute přispiacutevajiacute k fenotypu onemocněniacute 3)
1)VladutiuAO RoseNR Autoimmunemurine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type Science 19711741137ndash9 2)Grumet FC Coukell A Bodmer JG Bodmer WF McDevitt HO Histocompatibility (HL-A) antigens associated with systemic lupus erythematosus A possible genetic predisposition to disease N Engl J Med 1971285193ndash6 3) Simmonds MJ Gough SC The search for the genetic contribution to autoimmune thyroid disease the never ending story Brief Funct Genomics 20111077ndash90
Hashimotova tyreoiditida
bull Do 50 let raritniacute onemocněniacute nyniacute nejběžnějšiacute s prevalenciacute 81000 biochemickyacute naacutelez + autoprotilaacutetky 461000
bull Ženymuži 81
a-TPO
bull Přiacutetomnost protilaacutetek TPOAb obvykle předchaacuteziacute vzniku tyreoidaacutelniacute dysfunkce
bull Patogenetickaacute role protilaacutetek TgAb zůstaacutevaacute nejasnaacute
a-TPO
bull Autoprotilaacutetky TPOAb byly nejdřiacuteve popsaacuteny jako antimikrozomaacutelniacute autoprotilaacutetky (AMA) neboť bylo zjištěno že reagujiacute s neupravenyacutemi membraacutenami tyreoidaacutelniacutech buněk
bull Mikrozomaacutelniacute antigen byl později popsaacuten jako TPO
bull Dřiacuteve se využiacutevaly ke stanoveniacute TPO metody imunofluorescenčniacute metody a aglutinačniacute testy s pasivniacutem barveniacutem erytrocytů
a-TPO jako rizikovyacute faktor
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TPO je znaacutemyacutem rizikovyacutem faktorem pro vznik tyreoidaacutelniacute dysfunkce pokud jsou pacienti leacutečeni lithiem amiodaronem interleukinem-2 nebo alfa-interferonem
a-TG
bull Tg vykazuje vysokou heterogenitu způsobenou rozdiacutely v posttranslačniacutech modifikaciacutech (glykosylace jodizace sulfatace atd) Během synteacutezy tyreoidaacutelniacuteho hormonu a jeho uvolněniacute je Tg polymerizovaacuten a degradovaacuten
bull Vlivem toho je imunologickaacute struktura Tg mimořaacutedně komplexniacute Charakteristika standardů pro Tg se může lišit v zaacutevislosti na vstupniacute lidskeacute tyreoidaacutelniacute tkaacuteni a použiteacutem purifikačniacutem procesu To vysvětluje proč jsou testy na TgAb a takeacute Tg tak obtiacutežně standardizovatelneacute
Titr protilaacutetek
bull Titr protilaacutetek literaacuterně koreluje s počtem autoreaktivniacutech lymfocytů ktereacute infiltrujiacute štiacutetnou žlaacutezu a sonografickyacutem obrazem 1)
bull a-TG nižšiacute senzitivita (60-80 u HT) a menšiacute specifita (pozitivniacute ve většiacute čaacutesti zdravyacutech kontrol) než a-TPO
bull a-TG a a-TPO představujiacute dva různeacute aspekty autoimunniacute odpovědi na štiacutetnou žlaacutezu a-TG by mohly odraacutežet počaacutetečniacute (vrozenyacute) typ imunitniacute odpovědi zatiacutemco a-TPO by mohly charakterizovat pozdějšiacute adaptivniacute imunitniacute odpovědi 2)
1)Pandit AA VijayWardeMMenon PS Correlation of number of intrathyroid lympho- cytes with antimicrosomal antibody titer in Hashimotos thyroiditis Diagn Cytopathol 20032863ndash5 2) Rose NR Autoimmune escalation through the crystal ball Clin Exp Immunol 20071479
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
Stimulujiacuteciacute ndash N-terminaacutel region Neutralniacute ndash Cleavage region Blokujiacuteciacute ndash C-terminaacutel region
Upraveno dle Balucan FS Morshed SA Davies TF Thyroid autoantibodies in pregnancy their role regulation and clinical relevance J Thyroid Res (2013) 2013
Protilaacutetky
bull Přiacutetomnost a-TSHr vylučuje dalšiacute tyreotoxikosy
bull Koncentrace protilaacutetek nesloužiacute pouze k určeniacute diagnosy ale i k predikci vyacutevoje onemocněniacute 1)2)
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TSHr v těhotenstviacute je rizikovyacutem faktorem pro dysfunkci štiacutetneacute žlaacutezy novorozence v důsledku transplacentaacuterniacuteho přenosu mateřskyacutech protilaacutetek
1) Jang SY Shin DY Lee EJ Lee SY Yoon JS Relevance of TSH-receptor anti- body levels in predicting disease course in Gravesrsquo orbitopathy comparison of the third-generation TBII assay and Mc4-TSI bioassay Eye (Lond) (2013) 27964ndash71 2) Bartalena L Burch HB Burman KD Kahaly GJ A 2013 European survey of clinical practice patterns in the management of Gravesrsquo disease Clin Endocrinol (2016) 84115ndash20
Protilaacutetky
bull a-TSHr je patogenetickyacute znak GD detekovatelnyacute prakticky u všech pacientů s GD Protilaacutetky jsou zodpovědneacute za patologickeacute funkce nemoci (stimulace růstu a funkce štiacutetneacute žlaacutezy orbitopatie dermatologickeacute potiacuteže)1)
bull a-TSHr se uacutečastniacute patogeneze u hypotyreodismu i u atrofickeacute formy Hashimotoveacute tyreoitidy 2)
bull TSHr je exprimovaacuten v řadě extra-tyroidniacutech buněk včetně fibroblastů adipocytů a kostniacutech buněk kde je znaacutemo že moduluje funkci ciacutelovyacutech buněk
1)Michalek K Morshed SA Latif R Davies TF TSH receptor autoantibodies Autoimmun Rev (2009) 9113ndash6 doi101016jautrev200903012 2) Giuliani C Monaco F Adult primary hypothyroidism In Monaco F editor Thyroid Diseases Boca Raton FL CRC Press (2012) p 171ndash94
Protilaacutetky
bull Titr a-TSHr taky klesajiacute po tyroidektomii (čaacutestečneacute či celkoveacute) kvůli odstraněniacute zdroje antigenu
bull Naopak naacuterůst titrů a-TSHr pozorujeme po leacutečbě radioiodine I131 (asi dle uvolněniacute antigenů a zpracovaacuteniacute antigenů antigen-presentujiacuteciacutemi buňkami)
Protilaacutetky + typ bull Bylo prokaacutezaacuteno že nedostatečnaacute korelace mezi
koncentracemi a-TSHr a klinickyacutem stavem pacienta je většinou způsobena tiacutem že protilaacutetky a-TSHr v oběhu jsou heterogenniacute
bull Přechod z TSAbs na TBAbs je zodpovědnyacute za vyacutevoj hypotyreoacutezy u maleacuteho procenta pacientů s Gravesovou nemociacute a naopak
bull Skutečnost že heterogenniacute protilaacutetky a-TSHr mohou koexistovat u jednoho pacienta a měnit se v průběhu času je jedniacutem z důvodů proč bylo těžkeacute vyvinout diagnosticky přesneacute testy na stanoveniacute protilaacutetek a-TSHr
bull Klinickeacute projevy pacientů s Gravesovou chorobou kteřiacute vykazujiacute přiacutetomnost protilaacutetek TSAb i TBAbTSBAb budou zaacutevisleacute spiacuteše na relativniacute koncentraci a afinitě predominantniacute protilaacutetky
Protilaacutetky - sledovaacuteniacute
bull Sledovaacuteniacute hladin TSAb přidaacutevaacute dalšiacute rozměr k hodnoceniacute aktivity GD s potenciaacutelem předpovědět recidivu nebo remisii u jednotlivyacutech pacientů
bull Vysokaacute perzistentniacute hladina TSAb je spojena s aktivniacutemi a zaacutevažnyacutemi systeacutemovyacutemi projevy a se špatnou odezvou na terapii Naopak niacutezkeacute hladiny TSAb jsou nachaacutezeny u pacientů v remisi
Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Diagnostika
bull a-TSHr lze měřit v podstatě dvěma typy testů
ndash Biologickyacutem testem (biotestem bioassay) ktereacute detekujiacute produkci cAMP v buněčnyacutech kulturaacutech inkubovanyacutech se seacuterami pacientů Tyto testy identifikujiacute pouze stimulačniacute a-TSHr Biotesty prokazujiacute nejen přiacutetomnost Ab ale takeacute jejich funkčniacute aktivitu a uacutečinnost Historicky sloužily biotesty k vyacutezkumu ke studiu patofyziologie GD
ndash Protilaacutetkoveacute testy (vazebneacute receptoroveacute) Naopak receptoroveacute metody rutinně použiacutevaneacute v klinickyacutech laboratořiacutech udaacutevajiacute pouze přiacutetomnost nebo nepřiacutetomnost a-TSHr a jejich koncentrace ale neuvaacutedějiacute jejich funkčniacute aktivitu 2)
bull Tento zaacutekladniacute rozdiacutel v uspořaacutedaacuteniacute metody vysvětluje proč biotesty a protilaacutetkoveacute testy vykazujiacute nižšiacute korelaci (r = 031 ndash 065) 1)
1)Gupta MK Thyrotropin-receptor antibodies in thyroid diseases advances in detection techniques and clinical application Clin Chem Acta 20002931-29 2) Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Biotesty
bull Biotesty mohou detekovat funkčniacute změny u heterogenniacutech a-TSHr
bull Skutečnost že heterogenniacute protilaacutetky a-TSHr mohou koexistovat u jednoho pacienta a měnit se v průběhu času je jedniacutem z důvodů proč bylo těžkeacute vyvinout diagnosticky přesneacute testy na stanoveniacute protilaacutetek a-TSHr
bull Biotesty mohou zlepšit peacuteči o pacienta ve smyslu bdquopersonalisovaneacute mediciacutenyldquo
bull Biotesty jsou nabiacutezeny referenčniacutemi laboratořeni je jistyacute předpoklady že by se mohly viacutece rozšiacuteřit
Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Biotesty
bull Během posledniacutech 60 let se biologickaacute analyacuteza a-TSHr vyvinula těžkopaacutednyacutech a časově naacuteročnyacutech postupů na geneticky upraveneacute testy založeneacute na buňkaacutech ktereacute jsou charakterizovaacuteny dobrou proveditelnostiacute a rychlyacutemi provozniacutemi časy a ktereacute jsou takeacute k dispozici jako komerčniacute sady
bull Komerčně dostupnyacute biotest je Thyretain fa Quidel kteryacute detekuje stimulačniacute aktivitu a-TSHr pomociacute chimeacuterickeacuteho TSHR a genu pro cAMP (signalizace luciferaacutezou) Je schvaacutelen FDA pro použitiacute v klinickyacutech laboratořiacutech
HISTORIE
Historickyacute vyacutevoj metod pro měřeniacute a-TSHr ndash dle Giuliani etal 2016
Cesidio Giuliani1 Motoyasu Saji2 Ines Bucci1 and Giorgio Napolitano Bioassays for TSH Receptor Autoantibodies from FRTL-5 Cells to TSH ReceptorndashLHCG Receptor Chimeras The Contribution of Leonard D Kohn Front Endocrinol (Lausanne) 2016 7 103
LATS
bull V r 1956 Adams a Purves zjistili že seacutera pacientů s tyreotoxikosou indukujiacute abnormaacutelniacute prodlouženou odpověď v TSH testu (s morčetem)1)2)
bull Nazvali jej ldquoabnormal thyroid stimulatorrdquo posleacuteze ldquolong-acting thyroid stimulatorrdquo (LATS) 2)3) bylo jasneacute že je odlišnyacute od TSH a neniacute produkovaacuten hypofyacutezou
bull V roce 1964 byla LATS identifikovaacutena jako protein podobnyacute protilaacutetkaacutem (4) a dalšiacute studie jednoznačně potvrdily že se jednaacute o IgG (56)
bull Prvniacute testy k detekci LATS měly niacutezkou senzitivitu (60-70) 7) bull Vyacuteznamneacute zlepšeniacute v testech nastalo v r 1975 a to s vyacutevojem
radioligandoveacuteho receptoroveacuteho testu Test hodnotil inhibici seacutera od pacientů s GD vaacutezaacutenyacutemi radioaktivně značeneacuteho TSH na lidskeacute tyroidniacute membraacuteny (8 Test byl nicmeacuteně staacutele zatiacutežen niacutezkou přesnostiacute
bull Dalšiacute zlepšeniacute přineslo nahrazeniacute tyroidaacutelniacute membraacuteny čaacutestečně vyčištěneacuteho TSHr - liquid phase first-generation immunoassay použiacutevanaacute dalšiacutech 20 let 910) specifita 99 senzitivita 80 11)
1)Adams DD Purves HD Abnormal responses in the assay of thyrotropin Proc Univ Otago Med Sch (1956) 3411ndash5 2)Adams DD The presence of an abnormal thyroid-stimulating hormone in the serum of some thyrotoxic patients J Clin Endocrinol Metab (1958) 18699ndash712 doi101210jcem-18-7-699 3) Adams DD Bioassay of long-acting thyroid stimulator (LATS) the dose-re- sponse relationship J Clin Endocrinol Metab (1961) 21799ndash805 4) Kriss JP Pleshakov V Chien JR Isolation and identification of the long-acting thyroid stimulator and its relation to hyperthyroidism and circumscribed pretibial myxedema J Clin Endocrinol Metab (1964) 241005ndash28 doi101210 jcem-24-10-1005 5) Kriss JP Inactivation of long-acting thyroid stimulator (LATS) by anti- kappa and anti-lamba antisera J Clin Endocrinol Metab (1968) 281440ndash4 doi101210jcem-28-10-1440 6) Volpeacute R The immunologic basis of Gravesrsquos disease N Engl J Med (1972) 287463ndash4 doi101056NEJM197208312870910 7) McKenzie JM Review pathogenesis of Gravesrsquo disease role of the long-acting thyroid stimulator J Clin Endocrinol Metab (1965) 25424ndash31 8) Mehdi SQ Nussey SS A radio-ligand receptor assay for the long-acting thy- roid stimulator Inhibition by the long-acting thyroid stimulator of the binding of radioiodinated thyroid stimulating hormone to human thyroid membranes Biochem J (1975) 145105ndash11 doi101042bj1450105 9)Shewring G Rees Smith B An improved radioreceptor assay for TSH receptor antibodies Clin Endocrinol (1982) 17409ndash17 doi101111j1365-22651982 tb01607x 10)Southgate K Creagh FM Teece M Kingswood C Rees Smith B A receptor assay for the measurement of TSH receptor antibodies in unextracted serum Clin Endocrinol (1984) 20539ndash48 doi101111j1365-22651984tb00102x 11)Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003
FRTL-5 bull Souběžně s vyacutevojem radioligandovyacutech receptorovyacutech testů dochaacutezelo k vyacutevoji
bdquobiotestůldquo Změna v in vivo na in vitro jako je použitiacute primaacuterniacutech buněčnyacutech kultur 1)
bull Dalšiacute zlepšeniacute přišlo s použitiacutem FRTL-5 buněk ndash netransformovanyacutech buněčnyacutech liniiacute krysiacutech thyroid epithelial buněk v kontinuaacutelniacute kultuře 2) Test byl založen na schopnosti purifikovanyacutech IgG indukovat produkci cAMP Naacutesledně bylo umožněno využiacutet pacientskeacute seacutera 3)
bull Tento test nesloužil jen pro diagnostiku ale měl zaacutesadniacute vyacuteznam v pochopeniacute patfyz vlastnostiacute a-TSHr
bull Kohn etal 4)5)6) vyvinuli monoklonaacutelniacute protilaacutetku k hodnoceniacute jejiacutech funkčniacutech vlastnostiacute
bull Použitiacute buněk FRTL-5 takeacute umožnilo dalšiacute studium funkčniacute heterogenity a-TSHr (samostatneacute posouzeniacute uacutečinků jednotlivyacutech IgG na dvě odlišneacute buněčneacute aktivity aktivity produkce cAMP a buněčneacuteho růstu) 7)
1)Toccafondi RS Aterini S Medici MA Rotella CM Tanini A Zonefrati R Thyroid-stimulating antibody (TSAb) detected in sera of Gravesrsquo patients using human thyroid cell cultures Clin Exp Immunol (1980) 40532ndash9 2) Ambesi-Impiombato FS Parks LAM Coon HG Culture of hormone-depen- dent functional epithelial cells from rat thyroids Proc Natl Acad Sci U S A (1980) 773455ndash9 doi101073pnas7763455 3) Vitti P Chiovato L Lopez G Lombardi A Santini F Mammoli C et al Measurement of TSAb directly in serum using FRTL-5 cells J Endocrinol Invest (1988) 11313ndash7 doi101007BF03350157 4) Yavin E Yavin Z Schneider MD Kohn LD Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor implications for receptor structure and the action of autoantibodies in Gravesrsquo disease Proc Natl Acad Sci U S A (1981) 783180ndash4 doi101073pnas7853180 5) Valente WA Vitti P Yavin Z Yavin E Rotella CM Grollman EF et al Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor stimulating and blocking antibodies derived from the lymphocytes of patients with Gravesrsquo disease Proc Natl Acad Sci U S A (1982) 796680ndash4 doi101073pnas79216680 6) Valente WA Yavin Z Yavin E Grollman EF Schneider M Rotella CM et al Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor the identification of blocking and stimulating antibodies J Endocrinol Invest (1982) 5293ndash301 doi101007BF03350517 7) Valente WA Vitti P Rotella CM Vaughan MM Aloj SM Grollman EF et al Antibodies that promote thyroid growth A distinct population of thyroid-stimulating autoantibodies N Engl J Med (1983) 3091028ndash34 doi101056NEJM198310273091705
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 1
bull Hlavniacute průlom přišel s naklonovaacuteniacutem TSHr v r 1989 1-3) ndash využitiacute lidskeacuteho TSHr pro RIA i bioassays 45) ndash senzitivita 96 pro RIA
bull Pomociacute mutačniacutech technik byly připraveny chimerickeacute TSHr
bull V 90 leacutetech byly vyvinuty monoklonaacutelniacute protilaacutetky proti C-terminus region rh-TSHr 67)
1)Parmentier M Libert F Maenhaut C Lefort Gerard C Perret J Van Sande J et al Molecular cloning of the thyrotropin receptor Science (1989) 2461620ndash2 doi101126science2556796 2)Nagayama Y Kaufman KD Seto P Rapoport B Molecular cloning sequence and functional expression of the cDNA for the human thyrotropin receptor Biochem Biophys Res Commun (1989) 1651184ndash90 doi1010160006- 291X(89)92727-7 3) Akamizu T Ikuyama S Saji M Kosugi S Kozak C McBride OW et al Cloning chromosomal assignment and regulation of the rat thyrotropin receptor expression of the gene is regulated by thyrotropin agents that increase cAMP levels and thyroid autoantibodies Proc Natl Acad Sci U S A (1990) 875677ndash81 doi101073pnas87155677 4)Ludgate M Perret J Parmentier M Gerard C Libert F Dumont JE et al Use of recombinant human thyrotropin receptor (TSH-R) expressed in mammalian cell lines to assay TSH-R autoantibodies Mol Cell Endocrinol (1991) 73R13ndash8 doi1010160303-7207(90)90050-I 5) Filetti S Foti D Costante G Rapoport B Recombinant human thyrotropin (TSH) receptor in a radioreceptor assay for the measurement of TSH receptor autoantibodies J Clin Endocrinol Metab (1991) 721096ndash101 doi101210 jcem-72-5-1096 6) Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 7)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 2
bull Druhaacute generace imunotestů (ELISA) ndash solid-phase ndash se staly standardem pro dg a-TSHr diacuteky přesnosti (988 senzitivita a 996 specifita) a non-RIA 123)
bull Použitiacutem rh-TSHr nebo vepřovyacute TSHr ziacuteskaacuteme stejnou analytickou přesnost3)
1)Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 2)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071 3)Kamijo K TSH-receptor antibody measurement in patients with various thyrotoxicosis and Hashimotorsquos thyroiditis a comparison of two two-step assays coated plate ELISA using porcine TSH-receptor and coated tube radio- assay using human recombinant TSH-receptor Endocr J (2003) 50113ndash6 doi101507endocrj50113
Monoclonal a-TSHr stimulujiacuteciacute
bull Na přelomu mileacutenia byly studovaacuteny stimulujiacuteciacute protilaacutetky a-TSHr 123)
bull Tato data jsou zaacutesadniacute pro pochopeniacute vztahů struktury a funkciacute TSHRr a jejiacute role v patogenezi Gravesovy choroby
bull To vše vedlo k izolaci a charakterizaci lidskeacute monoklonaacutelniacute protilaacutetky a-TSHr stimulujiacuteciacute ndash M22 4)
1)Ando T Latif R Pritsker A Moran T Nagayama Y Davies TF A monoclonal thyroid-stimulating antibody J Clin Invest (2002) 1101667ndash74 doi101172 JCI0216991 2)Costagliola S Franssen JDF Bonomi M Urizar E Willnich M Bergmann A et al Generation of a mouse monoclonal TSH receptor antibody with stimu- lating activity Biochem Biophys Res Commun (2002) 299891ndash6 doi101016 S0006-291X(02)02762-6 3)Sanders J Jeffreys J Depraetere H Richards T Evans M Kiddie A et al Thyroid-stimulating monoclonal antibodies Thyroid (2002) 121043ndash50 doi101089105072502321085135 4) Sanders J Evans M Premawardhana LDKE Depraetere H Jeffreys J Richards T et al Human monoclonal stimulating autoantibody Lancet (2003) 362126ndash8 doi101016S0140-6736(03)13866-4
Třetiacute generace testů ndash M22
bull V r2004 byl vyvinut test použitiacutem M22 ve formaacutetu ELISA 1) senzitivita 974 a specifita 992 (např Medipan)
bull Test byl vhodnyacute i pro automatizaci 23)
bull Dostupnost a znalost jak stimulujiacuteciacutech tak blokujiacuteciacutech protilaacutetek byla důležitaacute k pochopeniacute krystalickeacute struktury TSHr a jejiacutech interakciacute s a-TSHr 4) poukaacutezalo to na širokeacute překryvy epitopů mezi stimulujiacuteciacutemi a blokujiacuteciacutemi protilaacutetkami 4)
bull Roche nativniacute vepřovyacute TSH s M22
1)Rees Smith B Bolton J Young S Collyer A Weeden A Bradbury J et al A new assay for thyrotropin receptor autoantibodies Thyroid (2004) 14830ndash5 doi1010891050725042451248 2) Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003 3) Zophel K Roggenbuck D von Landenberg P Wunderlich G Gruning T Kotzerke J et al TSH receptor antibody (TRAb) assays based on the human monoclonal autoantibody M22 are more sensitive than bovine TSH based assays Horm Metab Res (2010) 4265ndash9 doi101055s-0029-1241196 4) Furmaniak J Sanders J Nunez Miguel R Rees Smith B Mechanisms of action of TSHR autoantibodies Horm Metab Res (2015) 47735ndash52 doi10105 5s-0035-1559648
Mc4 bioassay
bull Souběžně s testy 3-generace Kohn vyvinul test využiacutevajiacuteciacute bdquoMc4 chimeacuteruldquo založenou na metodaacutech chemiluminiscence 1)
bull Ciacutelem bylo měřit pouze stimulujiacuteciacute protilaacutetky a tiacutem dosaacutehnout jasneacuteho cutoff mezi pacienty s GD a kontrolami
bull Porovnaacuteniacute senzitivity a specifity v tabulce 2) bull Mc4 testy mohou byacutet využity jako testy prvniacute
volby pro pacienty s GD
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Mc4 bioassay
bull Testy s M22 diacuteky podobně specifitě a senzitivitě ale lepšiacute bdquoproveditelnostildquo jsou zatiacutem preferovanějšiacute
bull Daacutele jsou lepšiacute pro prognoacutezu GD než testy s M22 a leacutepe korelujiacute s aktivitou a zaacutevažnostiacute GD orbitopatiiacute 2)
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Bridge Assay
bull Novaacute technologie využitiacute chimeacuterickyacutech receptorů Mc4 a N-terminaacutelniacute TSHr fůsovanyacute s alkalickou fosfataacutezou 1) senzitivita 998 a specifita 995
bull TSI ndash Siemens tato metoda je založena na sendvičoveacutem kompetetivniacute formaacutetu kteryacute se lišiacute od klasickeacuteho kompetetivniacute formaacutetu komerčniacutech IMA druheacute a třetiacute generace 2)
1)Frank CU Braeth S Dietrich JW Wanjura D Loos U Bridge technology with TSH receptor chimera for sensitive direct detection of TSH receptor antibodies causing Gravesrsquo disease analytical and clinical evaluation Horm Metab Res (2015) 47880ndash8 doi101055s-0035-1554662 2)Tozzoli R DrsquoAurizio F Villalta D Giovanella L (2017) Evalu- ation of the first fully automated immunoassay method for the measurement of stimulating TSH receptor autoantibodies in Gravesrsquo disease Clin Chem Lab Med 5558ndash64
Mezinaacuterodniacute standard
bull Prvniacute mezinaacuterodniacute standard připraven v r 1995 WHO označeniacute 90672 Připraven ECBS zdroj pacientskaacute plasma
bull V r 2006 nahrazen lidskou monoklonaacutelniacute protilaacutetkou M22 (NIBSC 08240) odkazuje na detekci S-TRAb 1)
1) Diana T1 Kanitz M Lehmann M Li Y Olivo PD Kahaly GJ Standardization of a bioassay for thyrotropin receptor stimulating autoantibodies Thyroid 2015 Feb25(2)169-75
EHK ndash SEKK AT217
EHK ndash SEKK AT217
SEKK - Dotazniacutek
EHK ndash SEKK AT113
EHK ndash SEKK AT113
Hashimotova tyreoiditida (HT)
bull HT 1) a SLE 2) byly prvniacute dvě autoimunitniacute onemocněniacute kde se prokaacutezala genetickaacute asociace (geny MHC třiacutedy II) 70 leacuteta
bull Nicmeacuteně nebyl nalezen gen kteryacute by spouštěl HT nalezeny pouze geny ktereacute přispiacutevajiacute k fenotypu onemocněniacute 3)
1)VladutiuAO RoseNR Autoimmunemurine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type Science 19711741137ndash9 2)Grumet FC Coukell A Bodmer JG Bodmer WF McDevitt HO Histocompatibility (HL-A) antigens associated with systemic lupus erythematosus A possible genetic predisposition to disease N Engl J Med 1971285193ndash6 3) Simmonds MJ Gough SC The search for the genetic contribution to autoimmune thyroid disease the never ending story Brief Funct Genomics 20111077ndash90
Hashimotova tyreoiditida
bull Do 50 let raritniacute onemocněniacute nyniacute nejběžnějšiacute s prevalenciacute 81000 biochemickyacute naacutelez + autoprotilaacutetky 461000
bull Ženymuži 81
a-TPO
bull Přiacutetomnost protilaacutetek TPOAb obvykle předchaacuteziacute vzniku tyreoidaacutelniacute dysfunkce
bull Patogenetickaacute role protilaacutetek TgAb zůstaacutevaacute nejasnaacute
a-TPO
bull Autoprotilaacutetky TPOAb byly nejdřiacuteve popsaacuteny jako antimikrozomaacutelniacute autoprotilaacutetky (AMA) neboť bylo zjištěno že reagujiacute s neupravenyacutemi membraacutenami tyreoidaacutelniacutech buněk
bull Mikrozomaacutelniacute antigen byl později popsaacuten jako TPO
bull Dřiacuteve se využiacutevaly ke stanoveniacute TPO metody imunofluorescenčniacute metody a aglutinačniacute testy s pasivniacutem barveniacutem erytrocytů
a-TPO jako rizikovyacute faktor
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TPO je znaacutemyacutem rizikovyacutem faktorem pro vznik tyreoidaacutelniacute dysfunkce pokud jsou pacienti leacutečeni lithiem amiodaronem interleukinem-2 nebo alfa-interferonem
a-TG
bull Tg vykazuje vysokou heterogenitu způsobenou rozdiacutely v posttranslačniacutech modifikaciacutech (glykosylace jodizace sulfatace atd) Během synteacutezy tyreoidaacutelniacuteho hormonu a jeho uvolněniacute je Tg polymerizovaacuten a degradovaacuten
bull Vlivem toho je imunologickaacute struktura Tg mimořaacutedně komplexniacute Charakteristika standardů pro Tg se může lišit v zaacutevislosti na vstupniacute lidskeacute tyreoidaacutelniacute tkaacuteni a použiteacutem purifikačniacutem procesu To vysvětluje proč jsou testy na TgAb a takeacute Tg tak obtiacutežně standardizovatelneacute
Titr protilaacutetek
bull Titr protilaacutetek literaacuterně koreluje s počtem autoreaktivniacutech lymfocytů ktereacute infiltrujiacute štiacutetnou žlaacutezu a sonografickyacutem obrazem 1)
bull a-TG nižšiacute senzitivita (60-80 u HT) a menšiacute specifita (pozitivniacute ve většiacute čaacutesti zdravyacutech kontrol) než a-TPO
bull a-TG a a-TPO představujiacute dva různeacute aspekty autoimunniacute odpovědi na štiacutetnou žlaacutezu a-TG by mohly odraacutežet počaacutetečniacute (vrozenyacute) typ imunitniacute odpovědi zatiacutemco a-TPO by mohly charakterizovat pozdějšiacute adaptivniacute imunitniacute odpovědi 2)
1)Pandit AA VijayWardeMMenon PS Correlation of number of intrathyroid lympho- cytes with antimicrosomal antibody titer in Hashimotos thyroiditis Diagn Cytopathol 20032863ndash5 2) Rose NR Autoimmune escalation through the crystal ball Clin Exp Immunol 20071479
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
Protilaacutetky
bull Přiacutetomnost a-TSHr vylučuje dalšiacute tyreotoxikosy
bull Koncentrace protilaacutetek nesloužiacute pouze k určeniacute diagnosy ale i k predikci vyacutevoje onemocněniacute 1)2)
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TSHr v těhotenstviacute je rizikovyacutem faktorem pro dysfunkci štiacutetneacute žlaacutezy novorozence v důsledku transplacentaacuterniacuteho přenosu mateřskyacutech protilaacutetek
1) Jang SY Shin DY Lee EJ Lee SY Yoon JS Relevance of TSH-receptor anti- body levels in predicting disease course in Gravesrsquo orbitopathy comparison of the third-generation TBII assay and Mc4-TSI bioassay Eye (Lond) (2013) 27964ndash71 2) Bartalena L Burch HB Burman KD Kahaly GJ A 2013 European survey of clinical practice patterns in the management of Gravesrsquo disease Clin Endocrinol (2016) 84115ndash20
Protilaacutetky
bull a-TSHr je patogenetickyacute znak GD detekovatelnyacute prakticky u všech pacientů s GD Protilaacutetky jsou zodpovědneacute za patologickeacute funkce nemoci (stimulace růstu a funkce štiacutetneacute žlaacutezy orbitopatie dermatologickeacute potiacuteže)1)
bull a-TSHr se uacutečastniacute patogeneze u hypotyreodismu i u atrofickeacute formy Hashimotoveacute tyreoitidy 2)
bull TSHr je exprimovaacuten v řadě extra-tyroidniacutech buněk včetně fibroblastů adipocytů a kostniacutech buněk kde je znaacutemo že moduluje funkci ciacutelovyacutech buněk
1)Michalek K Morshed SA Latif R Davies TF TSH receptor autoantibodies Autoimmun Rev (2009) 9113ndash6 doi101016jautrev200903012 2) Giuliani C Monaco F Adult primary hypothyroidism In Monaco F editor Thyroid Diseases Boca Raton FL CRC Press (2012) p 171ndash94
Protilaacutetky
bull Titr a-TSHr taky klesajiacute po tyroidektomii (čaacutestečneacute či celkoveacute) kvůli odstraněniacute zdroje antigenu
bull Naopak naacuterůst titrů a-TSHr pozorujeme po leacutečbě radioiodine I131 (asi dle uvolněniacute antigenů a zpracovaacuteniacute antigenů antigen-presentujiacuteciacutemi buňkami)
Protilaacutetky + typ bull Bylo prokaacutezaacuteno že nedostatečnaacute korelace mezi
koncentracemi a-TSHr a klinickyacutem stavem pacienta je většinou způsobena tiacutem že protilaacutetky a-TSHr v oběhu jsou heterogenniacute
bull Přechod z TSAbs na TBAbs je zodpovědnyacute za vyacutevoj hypotyreoacutezy u maleacuteho procenta pacientů s Gravesovou nemociacute a naopak
bull Skutečnost že heterogenniacute protilaacutetky a-TSHr mohou koexistovat u jednoho pacienta a měnit se v průběhu času je jedniacutem z důvodů proč bylo těžkeacute vyvinout diagnosticky přesneacute testy na stanoveniacute protilaacutetek a-TSHr
bull Klinickeacute projevy pacientů s Gravesovou chorobou kteřiacute vykazujiacute přiacutetomnost protilaacutetek TSAb i TBAbTSBAb budou zaacutevisleacute spiacuteše na relativniacute koncentraci a afinitě predominantniacute protilaacutetky
Protilaacutetky - sledovaacuteniacute
bull Sledovaacuteniacute hladin TSAb přidaacutevaacute dalšiacute rozměr k hodnoceniacute aktivity GD s potenciaacutelem předpovědět recidivu nebo remisii u jednotlivyacutech pacientů
bull Vysokaacute perzistentniacute hladina TSAb je spojena s aktivniacutemi a zaacutevažnyacutemi systeacutemovyacutemi projevy a se špatnou odezvou na terapii Naopak niacutezkeacute hladiny TSAb jsou nachaacutezeny u pacientů v remisi
Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Diagnostika
bull a-TSHr lze měřit v podstatě dvěma typy testů
ndash Biologickyacutem testem (biotestem bioassay) ktereacute detekujiacute produkci cAMP v buněčnyacutech kulturaacutech inkubovanyacutech se seacuterami pacientů Tyto testy identifikujiacute pouze stimulačniacute a-TSHr Biotesty prokazujiacute nejen přiacutetomnost Ab ale takeacute jejich funkčniacute aktivitu a uacutečinnost Historicky sloužily biotesty k vyacutezkumu ke studiu patofyziologie GD
ndash Protilaacutetkoveacute testy (vazebneacute receptoroveacute) Naopak receptoroveacute metody rutinně použiacutevaneacute v klinickyacutech laboratořiacutech udaacutevajiacute pouze přiacutetomnost nebo nepřiacutetomnost a-TSHr a jejich koncentrace ale neuvaacutedějiacute jejich funkčniacute aktivitu 2)
bull Tento zaacutekladniacute rozdiacutel v uspořaacutedaacuteniacute metody vysvětluje proč biotesty a protilaacutetkoveacute testy vykazujiacute nižšiacute korelaci (r = 031 ndash 065) 1)
1)Gupta MK Thyrotropin-receptor antibodies in thyroid diseases advances in detection techniques and clinical application Clin Chem Acta 20002931-29 2) Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Biotesty
bull Biotesty mohou detekovat funkčniacute změny u heterogenniacutech a-TSHr
bull Skutečnost že heterogenniacute protilaacutetky a-TSHr mohou koexistovat u jednoho pacienta a měnit se v průběhu času je jedniacutem z důvodů proč bylo těžkeacute vyvinout diagnosticky přesneacute testy na stanoveniacute protilaacutetek a-TSHr
bull Biotesty mohou zlepšit peacuteči o pacienta ve smyslu bdquopersonalisovaneacute mediciacutenyldquo
bull Biotesty jsou nabiacutezeny referenčniacutemi laboratořeni je jistyacute předpoklady že by se mohly viacutece rozšiacuteřit
Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Biotesty
bull Během posledniacutech 60 let se biologickaacute analyacuteza a-TSHr vyvinula těžkopaacutednyacutech a časově naacuteročnyacutech postupů na geneticky upraveneacute testy založeneacute na buňkaacutech ktereacute jsou charakterizovaacuteny dobrou proveditelnostiacute a rychlyacutemi provozniacutemi časy a ktereacute jsou takeacute k dispozici jako komerčniacute sady
bull Komerčně dostupnyacute biotest je Thyretain fa Quidel kteryacute detekuje stimulačniacute aktivitu a-TSHr pomociacute chimeacuterickeacuteho TSHR a genu pro cAMP (signalizace luciferaacutezou) Je schvaacutelen FDA pro použitiacute v klinickyacutech laboratořiacutech
HISTORIE
Historickyacute vyacutevoj metod pro měřeniacute a-TSHr ndash dle Giuliani etal 2016
Cesidio Giuliani1 Motoyasu Saji2 Ines Bucci1 and Giorgio Napolitano Bioassays for TSH Receptor Autoantibodies from FRTL-5 Cells to TSH ReceptorndashLHCG Receptor Chimeras The Contribution of Leonard D Kohn Front Endocrinol (Lausanne) 2016 7 103
LATS
bull V r 1956 Adams a Purves zjistili že seacutera pacientů s tyreotoxikosou indukujiacute abnormaacutelniacute prodlouženou odpověď v TSH testu (s morčetem)1)2)
bull Nazvali jej ldquoabnormal thyroid stimulatorrdquo posleacuteze ldquolong-acting thyroid stimulatorrdquo (LATS) 2)3) bylo jasneacute že je odlišnyacute od TSH a neniacute produkovaacuten hypofyacutezou
bull V roce 1964 byla LATS identifikovaacutena jako protein podobnyacute protilaacutetkaacutem (4) a dalšiacute studie jednoznačně potvrdily že se jednaacute o IgG (56)
bull Prvniacute testy k detekci LATS měly niacutezkou senzitivitu (60-70) 7) bull Vyacuteznamneacute zlepšeniacute v testech nastalo v r 1975 a to s vyacutevojem
radioligandoveacuteho receptoroveacuteho testu Test hodnotil inhibici seacutera od pacientů s GD vaacutezaacutenyacutemi radioaktivně značeneacuteho TSH na lidskeacute tyroidniacute membraacuteny (8 Test byl nicmeacuteně staacutele zatiacutežen niacutezkou přesnostiacute
bull Dalšiacute zlepšeniacute přineslo nahrazeniacute tyroidaacutelniacute membraacuteny čaacutestečně vyčištěneacuteho TSHr - liquid phase first-generation immunoassay použiacutevanaacute dalšiacutech 20 let 910) specifita 99 senzitivita 80 11)
1)Adams DD Purves HD Abnormal responses in the assay of thyrotropin Proc Univ Otago Med Sch (1956) 3411ndash5 2)Adams DD The presence of an abnormal thyroid-stimulating hormone in the serum of some thyrotoxic patients J Clin Endocrinol Metab (1958) 18699ndash712 doi101210jcem-18-7-699 3) Adams DD Bioassay of long-acting thyroid stimulator (LATS) the dose-re- sponse relationship J Clin Endocrinol Metab (1961) 21799ndash805 4) Kriss JP Pleshakov V Chien JR Isolation and identification of the long-acting thyroid stimulator and its relation to hyperthyroidism and circumscribed pretibial myxedema J Clin Endocrinol Metab (1964) 241005ndash28 doi101210 jcem-24-10-1005 5) Kriss JP Inactivation of long-acting thyroid stimulator (LATS) by anti- kappa and anti-lamba antisera J Clin Endocrinol Metab (1968) 281440ndash4 doi101210jcem-28-10-1440 6) Volpeacute R The immunologic basis of Gravesrsquos disease N Engl J Med (1972) 287463ndash4 doi101056NEJM197208312870910 7) McKenzie JM Review pathogenesis of Gravesrsquo disease role of the long-acting thyroid stimulator J Clin Endocrinol Metab (1965) 25424ndash31 8) Mehdi SQ Nussey SS A radio-ligand receptor assay for the long-acting thy- roid stimulator Inhibition by the long-acting thyroid stimulator of the binding of radioiodinated thyroid stimulating hormone to human thyroid membranes Biochem J (1975) 145105ndash11 doi101042bj1450105 9)Shewring G Rees Smith B An improved radioreceptor assay for TSH receptor antibodies Clin Endocrinol (1982) 17409ndash17 doi101111j1365-22651982 tb01607x 10)Southgate K Creagh FM Teece M Kingswood C Rees Smith B A receptor assay for the measurement of TSH receptor antibodies in unextracted serum Clin Endocrinol (1984) 20539ndash48 doi101111j1365-22651984tb00102x 11)Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003
FRTL-5 bull Souběžně s vyacutevojem radioligandovyacutech receptorovyacutech testů dochaacutezelo k vyacutevoji
bdquobiotestůldquo Změna v in vivo na in vitro jako je použitiacute primaacuterniacutech buněčnyacutech kultur 1)
bull Dalšiacute zlepšeniacute přišlo s použitiacutem FRTL-5 buněk ndash netransformovanyacutech buněčnyacutech liniiacute krysiacutech thyroid epithelial buněk v kontinuaacutelniacute kultuře 2) Test byl založen na schopnosti purifikovanyacutech IgG indukovat produkci cAMP Naacutesledně bylo umožněno využiacutet pacientskeacute seacutera 3)
bull Tento test nesloužil jen pro diagnostiku ale měl zaacutesadniacute vyacuteznam v pochopeniacute patfyz vlastnostiacute a-TSHr
bull Kohn etal 4)5)6) vyvinuli monoklonaacutelniacute protilaacutetku k hodnoceniacute jejiacutech funkčniacutech vlastnostiacute
bull Použitiacute buněk FRTL-5 takeacute umožnilo dalšiacute studium funkčniacute heterogenity a-TSHr (samostatneacute posouzeniacute uacutečinků jednotlivyacutech IgG na dvě odlišneacute buněčneacute aktivity aktivity produkce cAMP a buněčneacuteho růstu) 7)
1)Toccafondi RS Aterini S Medici MA Rotella CM Tanini A Zonefrati R Thyroid-stimulating antibody (TSAb) detected in sera of Gravesrsquo patients using human thyroid cell cultures Clin Exp Immunol (1980) 40532ndash9 2) Ambesi-Impiombato FS Parks LAM Coon HG Culture of hormone-depen- dent functional epithelial cells from rat thyroids Proc Natl Acad Sci U S A (1980) 773455ndash9 doi101073pnas7763455 3) Vitti P Chiovato L Lopez G Lombardi A Santini F Mammoli C et al Measurement of TSAb directly in serum using FRTL-5 cells J Endocrinol Invest (1988) 11313ndash7 doi101007BF03350157 4) Yavin E Yavin Z Schneider MD Kohn LD Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor implications for receptor structure and the action of autoantibodies in Gravesrsquo disease Proc Natl Acad Sci U S A (1981) 783180ndash4 doi101073pnas7853180 5) Valente WA Vitti P Yavin Z Yavin E Rotella CM Grollman EF et al Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor stimulating and blocking antibodies derived from the lymphocytes of patients with Gravesrsquo disease Proc Natl Acad Sci U S A (1982) 796680ndash4 doi101073pnas79216680 6) Valente WA Yavin Z Yavin E Grollman EF Schneider M Rotella CM et al Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor the identification of blocking and stimulating antibodies J Endocrinol Invest (1982) 5293ndash301 doi101007BF03350517 7) Valente WA Vitti P Rotella CM Vaughan MM Aloj SM Grollman EF et al Antibodies that promote thyroid growth A distinct population of thyroid-stimulating autoantibodies N Engl J Med (1983) 3091028ndash34 doi101056NEJM198310273091705
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 1
bull Hlavniacute průlom přišel s naklonovaacuteniacutem TSHr v r 1989 1-3) ndash využitiacute lidskeacuteho TSHr pro RIA i bioassays 45) ndash senzitivita 96 pro RIA
bull Pomociacute mutačniacutech technik byly připraveny chimerickeacute TSHr
bull V 90 leacutetech byly vyvinuty monoklonaacutelniacute protilaacutetky proti C-terminus region rh-TSHr 67)
1)Parmentier M Libert F Maenhaut C Lefort Gerard C Perret J Van Sande J et al Molecular cloning of the thyrotropin receptor Science (1989) 2461620ndash2 doi101126science2556796 2)Nagayama Y Kaufman KD Seto P Rapoport B Molecular cloning sequence and functional expression of the cDNA for the human thyrotropin receptor Biochem Biophys Res Commun (1989) 1651184ndash90 doi1010160006- 291X(89)92727-7 3) Akamizu T Ikuyama S Saji M Kosugi S Kozak C McBride OW et al Cloning chromosomal assignment and regulation of the rat thyrotropin receptor expression of the gene is regulated by thyrotropin agents that increase cAMP levels and thyroid autoantibodies Proc Natl Acad Sci U S A (1990) 875677ndash81 doi101073pnas87155677 4)Ludgate M Perret J Parmentier M Gerard C Libert F Dumont JE et al Use of recombinant human thyrotropin receptor (TSH-R) expressed in mammalian cell lines to assay TSH-R autoantibodies Mol Cell Endocrinol (1991) 73R13ndash8 doi1010160303-7207(90)90050-I 5) Filetti S Foti D Costante G Rapoport B Recombinant human thyrotropin (TSH) receptor in a radioreceptor assay for the measurement of TSH receptor autoantibodies J Clin Endocrinol Metab (1991) 721096ndash101 doi101210 jcem-72-5-1096 6) Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 7)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 2
bull Druhaacute generace imunotestů (ELISA) ndash solid-phase ndash se staly standardem pro dg a-TSHr diacuteky přesnosti (988 senzitivita a 996 specifita) a non-RIA 123)
bull Použitiacutem rh-TSHr nebo vepřovyacute TSHr ziacuteskaacuteme stejnou analytickou přesnost3)
1)Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 2)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071 3)Kamijo K TSH-receptor antibody measurement in patients with various thyrotoxicosis and Hashimotorsquos thyroiditis a comparison of two two-step assays coated plate ELISA using porcine TSH-receptor and coated tube radio- assay using human recombinant TSH-receptor Endocr J (2003) 50113ndash6 doi101507endocrj50113
Monoclonal a-TSHr stimulujiacuteciacute
bull Na přelomu mileacutenia byly studovaacuteny stimulujiacuteciacute protilaacutetky a-TSHr 123)
bull Tato data jsou zaacutesadniacute pro pochopeniacute vztahů struktury a funkciacute TSHRr a jejiacute role v patogenezi Gravesovy choroby
bull To vše vedlo k izolaci a charakterizaci lidskeacute monoklonaacutelniacute protilaacutetky a-TSHr stimulujiacuteciacute ndash M22 4)
1)Ando T Latif R Pritsker A Moran T Nagayama Y Davies TF A monoclonal thyroid-stimulating antibody J Clin Invest (2002) 1101667ndash74 doi101172 JCI0216991 2)Costagliola S Franssen JDF Bonomi M Urizar E Willnich M Bergmann A et al Generation of a mouse monoclonal TSH receptor antibody with stimu- lating activity Biochem Biophys Res Commun (2002) 299891ndash6 doi101016 S0006-291X(02)02762-6 3)Sanders J Jeffreys J Depraetere H Richards T Evans M Kiddie A et al Thyroid-stimulating monoclonal antibodies Thyroid (2002) 121043ndash50 doi101089105072502321085135 4) Sanders J Evans M Premawardhana LDKE Depraetere H Jeffreys J Richards T et al Human monoclonal stimulating autoantibody Lancet (2003) 362126ndash8 doi101016S0140-6736(03)13866-4
Třetiacute generace testů ndash M22
bull V r2004 byl vyvinut test použitiacutem M22 ve formaacutetu ELISA 1) senzitivita 974 a specifita 992 (např Medipan)
bull Test byl vhodnyacute i pro automatizaci 23)
bull Dostupnost a znalost jak stimulujiacuteciacutech tak blokujiacuteciacutech protilaacutetek byla důležitaacute k pochopeniacute krystalickeacute struktury TSHr a jejiacutech interakciacute s a-TSHr 4) poukaacutezalo to na širokeacute překryvy epitopů mezi stimulujiacuteciacutemi a blokujiacuteciacutemi protilaacutetkami 4)
bull Roche nativniacute vepřovyacute TSH s M22
1)Rees Smith B Bolton J Young S Collyer A Weeden A Bradbury J et al A new assay for thyrotropin receptor autoantibodies Thyroid (2004) 14830ndash5 doi1010891050725042451248 2) Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003 3) Zophel K Roggenbuck D von Landenberg P Wunderlich G Gruning T Kotzerke J et al TSH receptor antibody (TRAb) assays based on the human monoclonal autoantibody M22 are more sensitive than bovine TSH based assays Horm Metab Res (2010) 4265ndash9 doi101055s-0029-1241196 4) Furmaniak J Sanders J Nunez Miguel R Rees Smith B Mechanisms of action of TSHR autoantibodies Horm Metab Res (2015) 47735ndash52 doi10105 5s-0035-1559648
Mc4 bioassay
bull Souběžně s testy 3-generace Kohn vyvinul test využiacutevajiacuteciacute bdquoMc4 chimeacuteruldquo založenou na metodaacutech chemiluminiscence 1)
bull Ciacutelem bylo měřit pouze stimulujiacuteciacute protilaacutetky a tiacutem dosaacutehnout jasneacuteho cutoff mezi pacienty s GD a kontrolami
bull Porovnaacuteniacute senzitivity a specifity v tabulce 2) bull Mc4 testy mohou byacutet využity jako testy prvniacute
volby pro pacienty s GD
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Mc4 bioassay
bull Testy s M22 diacuteky podobně specifitě a senzitivitě ale lepšiacute bdquoproveditelnostildquo jsou zatiacutem preferovanějšiacute
bull Daacutele jsou lepšiacute pro prognoacutezu GD než testy s M22 a leacutepe korelujiacute s aktivitou a zaacutevažnostiacute GD orbitopatiiacute 2)
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Bridge Assay
bull Novaacute technologie využitiacute chimeacuterickyacutech receptorů Mc4 a N-terminaacutelniacute TSHr fůsovanyacute s alkalickou fosfataacutezou 1) senzitivita 998 a specifita 995
bull TSI ndash Siemens tato metoda je založena na sendvičoveacutem kompetetivniacute formaacutetu kteryacute se lišiacute od klasickeacuteho kompetetivniacute formaacutetu komerčniacutech IMA druheacute a třetiacute generace 2)
1)Frank CU Braeth S Dietrich JW Wanjura D Loos U Bridge technology with TSH receptor chimera for sensitive direct detection of TSH receptor antibodies causing Gravesrsquo disease analytical and clinical evaluation Horm Metab Res (2015) 47880ndash8 doi101055s-0035-1554662 2)Tozzoli R DrsquoAurizio F Villalta D Giovanella L (2017) Evalu- ation of the first fully automated immunoassay method for the measurement of stimulating TSH receptor autoantibodies in Gravesrsquo disease Clin Chem Lab Med 5558ndash64
Mezinaacuterodniacute standard
bull Prvniacute mezinaacuterodniacute standard připraven v r 1995 WHO označeniacute 90672 Připraven ECBS zdroj pacientskaacute plasma
bull V r 2006 nahrazen lidskou monoklonaacutelniacute protilaacutetkou M22 (NIBSC 08240) odkazuje na detekci S-TRAb 1)
1) Diana T1 Kanitz M Lehmann M Li Y Olivo PD Kahaly GJ Standardization of a bioassay for thyrotropin receptor stimulating autoantibodies Thyroid 2015 Feb25(2)169-75
EHK ndash SEKK AT217
EHK ndash SEKK AT217
SEKK - Dotazniacutek
EHK ndash SEKK AT113
EHK ndash SEKK AT113
Hashimotova tyreoiditida (HT)
bull HT 1) a SLE 2) byly prvniacute dvě autoimunitniacute onemocněniacute kde se prokaacutezala genetickaacute asociace (geny MHC třiacutedy II) 70 leacuteta
bull Nicmeacuteně nebyl nalezen gen kteryacute by spouštěl HT nalezeny pouze geny ktereacute přispiacutevajiacute k fenotypu onemocněniacute 3)
1)VladutiuAO RoseNR Autoimmunemurine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type Science 19711741137ndash9 2)Grumet FC Coukell A Bodmer JG Bodmer WF McDevitt HO Histocompatibility (HL-A) antigens associated with systemic lupus erythematosus A possible genetic predisposition to disease N Engl J Med 1971285193ndash6 3) Simmonds MJ Gough SC The search for the genetic contribution to autoimmune thyroid disease the never ending story Brief Funct Genomics 20111077ndash90
Hashimotova tyreoiditida
bull Do 50 let raritniacute onemocněniacute nyniacute nejběžnějšiacute s prevalenciacute 81000 biochemickyacute naacutelez + autoprotilaacutetky 461000
bull Ženymuži 81
a-TPO
bull Přiacutetomnost protilaacutetek TPOAb obvykle předchaacuteziacute vzniku tyreoidaacutelniacute dysfunkce
bull Patogenetickaacute role protilaacutetek TgAb zůstaacutevaacute nejasnaacute
a-TPO
bull Autoprotilaacutetky TPOAb byly nejdřiacuteve popsaacuteny jako antimikrozomaacutelniacute autoprotilaacutetky (AMA) neboť bylo zjištěno že reagujiacute s neupravenyacutemi membraacutenami tyreoidaacutelniacutech buněk
bull Mikrozomaacutelniacute antigen byl později popsaacuten jako TPO
bull Dřiacuteve se využiacutevaly ke stanoveniacute TPO metody imunofluorescenčniacute metody a aglutinačniacute testy s pasivniacutem barveniacutem erytrocytů
a-TPO jako rizikovyacute faktor
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TPO je znaacutemyacutem rizikovyacutem faktorem pro vznik tyreoidaacutelniacute dysfunkce pokud jsou pacienti leacutečeni lithiem amiodaronem interleukinem-2 nebo alfa-interferonem
a-TG
bull Tg vykazuje vysokou heterogenitu způsobenou rozdiacutely v posttranslačniacutech modifikaciacutech (glykosylace jodizace sulfatace atd) Během synteacutezy tyreoidaacutelniacuteho hormonu a jeho uvolněniacute je Tg polymerizovaacuten a degradovaacuten
bull Vlivem toho je imunologickaacute struktura Tg mimořaacutedně komplexniacute Charakteristika standardů pro Tg se může lišit v zaacutevislosti na vstupniacute lidskeacute tyreoidaacutelniacute tkaacuteni a použiteacutem purifikačniacutem procesu To vysvětluje proč jsou testy na TgAb a takeacute Tg tak obtiacutežně standardizovatelneacute
Titr protilaacutetek
bull Titr protilaacutetek literaacuterně koreluje s počtem autoreaktivniacutech lymfocytů ktereacute infiltrujiacute štiacutetnou žlaacutezu a sonografickyacutem obrazem 1)
bull a-TG nižšiacute senzitivita (60-80 u HT) a menšiacute specifita (pozitivniacute ve většiacute čaacutesti zdravyacutech kontrol) než a-TPO
bull a-TG a a-TPO představujiacute dva různeacute aspekty autoimunniacute odpovědi na štiacutetnou žlaacutezu a-TG by mohly odraacutežet počaacutetečniacute (vrozenyacute) typ imunitniacute odpovědi zatiacutemco a-TPO by mohly charakterizovat pozdějšiacute adaptivniacute imunitniacute odpovědi 2)
1)Pandit AA VijayWardeMMenon PS Correlation of number of intrathyroid lympho- cytes with antimicrosomal antibody titer in Hashimotos thyroiditis Diagn Cytopathol 20032863ndash5 2) Rose NR Autoimmune escalation through the crystal ball Clin Exp Immunol 20071479
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
Protilaacutetky
bull a-TSHr je patogenetickyacute znak GD detekovatelnyacute prakticky u všech pacientů s GD Protilaacutetky jsou zodpovědneacute za patologickeacute funkce nemoci (stimulace růstu a funkce štiacutetneacute žlaacutezy orbitopatie dermatologickeacute potiacuteže)1)
bull a-TSHr se uacutečastniacute patogeneze u hypotyreodismu i u atrofickeacute formy Hashimotoveacute tyreoitidy 2)
bull TSHr je exprimovaacuten v řadě extra-tyroidniacutech buněk včetně fibroblastů adipocytů a kostniacutech buněk kde je znaacutemo že moduluje funkci ciacutelovyacutech buněk
1)Michalek K Morshed SA Latif R Davies TF TSH receptor autoantibodies Autoimmun Rev (2009) 9113ndash6 doi101016jautrev200903012 2) Giuliani C Monaco F Adult primary hypothyroidism In Monaco F editor Thyroid Diseases Boca Raton FL CRC Press (2012) p 171ndash94
Protilaacutetky
bull Titr a-TSHr taky klesajiacute po tyroidektomii (čaacutestečneacute či celkoveacute) kvůli odstraněniacute zdroje antigenu
bull Naopak naacuterůst titrů a-TSHr pozorujeme po leacutečbě radioiodine I131 (asi dle uvolněniacute antigenů a zpracovaacuteniacute antigenů antigen-presentujiacuteciacutemi buňkami)
Protilaacutetky + typ bull Bylo prokaacutezaacuteno že nedostatečnaacute korelace mezi
koncentracemi a-TSHr a klinickyacutem stavem pacienta je většinou způsobena tiacutem že protilaacutetky a-TSHr v oběhu jsou heterogenniacute
bull Přechod z TSAbs na TBAbs je zodpovědnyacute za vyacutevoj hypotyreoacutezy u maleacuteho procenta pacientů s Gravesovou nemociacute a naopak
bull Skutečnost že heterogenniacute protilaacutetky a-TSHr mohou koexistovat u jednoho pacienta a měnit se v průběhu času je jedniacutem z důvodů proč bylo těžkeacute vyvinout diagnosticky přesneacute testy na stanoveniacute protilaacutetek a-TSHr
bull Klinickeacute projevy pacientů s Gravesovou chorobou kteřiacute vykazujiacute přiacutetomnost protilaacutetek TSAb i TBAbTSBAb budou zaacutevisleacute spiacuteše na relativniacute koncentraci a afinitě predominantniacute protilaacutetky
Protilaacutetky - sledovaacuteniacute
bull Sledovaacuteniacute hladin TSAb přidaacutevaacute dalšiacute rozměr k hodnoceniacute aktivity GD s potenciaacutelem předpovědět recidivu nebo remisii u jednotlivyacutech pacientů
bull Vysokaacute perzistentniacute hladina TSAb je spojena s aktivniacutemi a zaacutevažnyacutemi systeacutemovyacutemi projevy a se špatnou odezvou na terapii Naopak niacutezkeacute hladiny TSAb jsou nachaacutezeny u pacientů v remisi
Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Diagnostika
bull a-TSHr lze měřit v podstatě dvěma typy testů
ndash Biologickyacutem testem (biotestem bioassay) ktereacute detekujiacute produkci cAMP v buněčnyacutech kulturaacutech inkubovanyacutech se seacuterami pacientů Tyto testy identifikujiacute pouze stimulačniacute a-TSHr Biotesty prokazujiacute nejen přiacutetomnost Ab ale takeacute jejich funkčniacute aktivitu a uacutečinnost Historicky sloužily biotesty k vyacutezkumu ke studiu patofyziologie GD
ndash Protilaacutetkoveacute testy (vazebneacute receptoroveacute) Naopak receptoroveacute metody rutinně použiacutevaneacute v klinickyacutech laboratořiacutech udaacutevajiacute pouze přiacutetomnost nebo nepřiacutetomnost a-TSHr a jejich koncentrace ale neuvaacutedějiacute jejich funkčniacute aktivitu 2)
bull Tento zaacutekladniacute rozdiacutel v uspořaacutedaacuteniacute metody vysvětluje proč biotesty a protilaacutetkoveacute testy vykazujiacute nižšiacute korelaci (r = 031 ndash 065) 1)
1)Gupta MK Thyrotropin-receptor antibodies in thyroid diseases advances in detection techniques and clinical application Clin Chem Acta 20002931-29 2) Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Biotesty
bull Biotesty mohou detekovat funkčniacute změny u heterogenniacutech a-TSHr
bull Skutečnost že heterogenniacute protilaacutetky a-TSHr mohou koexistovat u jednoho pacienta a měnit se v průběhu času je jedniacutem z důvodů proč bylo těžkeacute vyvinout diagnosticky přesneacute testy na stanoveniacute protilaacutetek a-TSHr
bull Biotesty mohou zlepšit peacuteči o pacienta ve smyslu bdquopersonalisovaneacute mediciacutenyldquo
bull Biotesty jsou nabiacutezeny referenčniacutemi laboratořeni je jistyacute předpoklady že by se mohly viacutece rozšiacuteřit
Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Biotesty
bull Během posledniacutech 60 let se biologickaacute analyacuteza a-TSHr vyvinula těžkopaacutednyacutech a časově naacuteročnyacutech postupů na geneticky upraveneacute testy založeneacute na buňkaacutech ktereacute jsou charakterizovaacuteny dobrou proveditelnostiacute a rychlyacutemi provozniacutemi časy a ktereacute jsou takeacute k dispozici jako komerčniacute sady
bull Komerčně dostupnyacute biotest je Thyretain fa Quidel kteryacute detekuje stimulačniacute aktivitu a-TSHr pomociacute chimeacuterickeacuteho TSHR a genu pro cAMP (signalizace luciferaacutezou) Je schvaacutelen FDA pro použitiacute v klinickyacutech laboratořiacutech
HISTORIE
Historickyacute vyacutevoj metod pro měřeniacute a-TSHr ndash dle Giuliani etal 2016
Cesidio Giuliani1 Motoyasu Saji2 Ines Bucci1 and Giorgio Napolitano Bioassays for TSH Receptor Autoantibodies from FRTL-5 Cells to TSH ReceptorndashLHCG Receptor Chimeras The Contribution of Leonard D Kohn Front Endocrinol (Lausanne) 2016 7 103
LATS
bull V r 1956 Adams a Purves zjistili že seacutera pacientů s tyreotoxikosou indukujiacute abnormaacutelniacute prodlouženou odpověď v TSH testu (s morčetem)1)2)
bull Nazvali jej ldquoabnormal thyroid stimulatorrdquo posleacuteze ldquolong-acting thyroid stimulatorrdquo (LATS) 2)3) bylo jasneacute že je odlišnyacute od TSH a neniacute produkovaacuten hypofyacutezou
bull V roce 1964 byla LATS identifikovaacutena jako protein podobnyacute protilaacutetkaacutem (4) a dalšiacute studie jednoznačně potvrdily že se jednaacute o IgG (56)
bull Prvniacute testy k detekci LATS měly niacutezkou senzitivitu (60-70) 7) bull Vyacuteznamneacute zlepšeniacute v testech nastalo v r 1975 a to s vyacutevojem
radioligandoveacuteho receptoroveacuteho testu Test hodnotil inhibici seacutera od pacientů s GD vaacutezaacutenyacutemi radioaktivně značeneacuteho TSH na lidskeacute tyroidniacute membraacuteny (8 Test byl nicmeacuteně staacutele zatiacutežen niacutezkou přesnostiacute
bull Dalšiacute zlepšeniacute přineslo nahrazeniacute tyroidaacutelniacute membraacuteny čaacutestečně vyčištěneacuteho TSHr - liquid phase first-generation immunoassay použiacutevanaacute dalšiacutech 20 let 910) specifita 99 senzitivita 80 11)
1)Adams DD Purves HD Abnormal responses in the assay of thyrotropin Proc Univ Otago Med Sch (1956) 3411ndash5 2)Adams DD The presence of an abnormal thyroid-stimulating hormone in the serum of some thyrotoxic patients J Clin Endocrinol Metab (1958) 18699ndash712 doi101210jcem-18-7-699 3) Adams DD Bioassay of long-acting thyroid stimulator (LATS) the dose-re- sponse relationship J Clin Endocrinol Metab (1961) 21799ndash805 4) Kriss JP Pleshakov V Chien JR Isolation and identification of the long-acting thyroid stimulator and its relation to hyperthyroidism and circumscribed pretibial myxedema J Clin Endocrinol Metab (1964) 241005ndash28 doi101210 jcem-24-10-1005 5) Kriss JP Inactivation of long-acting thyroid stimulator (LATS) by anti- kappa and anti-lamba antisera J Clin Endocrinol Metab (1968) 281440ndash4 doi101210jcem-28-10-1440 6) Volpeacute R The immunologic basis of Gravesrsquos disease N Engl J Med (1972) 287463ndash4 doi101056NEJM197208312870910 7) McKenzie JM Review pathogenesis of Gravesrsquo disease role of the long-acting thyroid stimulator J Clin Endocrinol Metab (1965) 25424ndash31 8) Mehdi SQ Nussey SS A radio-ligand receptor assay for the long-acting thy- roid stimulator Inhibition by the long-acting thyroid stimulator of the binding of radioiodinated thyroid stimulating hormone to human thyroid membranes Biochem J (1975) 145105ndash11 doi101042bj1450105 9)Shewring G Rees Smith B An improved radioreceptor assay for TSH receptor antibodies Clin Endocrinol (1982) 17409ndash17 doi101111j1365-22651982 tb01607x 10)Southgate K Creagh FM Teece M Kingswood C Rees Smith B A receptor assay for the measurement of TSH receptor antibodies in unextracted serum Clin Endocrinol (1984) 20539ndash48 doi101111j1365-22651984tb00102x 11)Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003
FRTL-5 bull Souběžně s vyacutevojem radioligandovyacutech receptorovyacutech testů dochaacutezelo k vyacutevoji
bdquobiotestůldquo Změna v in vivo na in vitro jako je použitiacute primaacuterniacutech buněčnyacutech kultur 1)
bull Dalšiacute zlepšeniacute přišlo s použitiacutem FRTL-5 buněk ndash netransformovanyacutech buněčnyacutech liniiacute krysiacutech thyroid epithelial buněk v kontinuaacutelniacute kultuře 2) Test byl založen na schopnosti purifikovanyacutech IgG indukovat produkci cAMP Naacutesledně bylo umožněno využiacutet pacientskeacute seacutera 3)
bull Tento test nesloužil jen pro diagnostiku ale měl zaacutesadniacute vyacuteznam v pochopeniacute patfyz vlastnostiacute a-TSHr
bull Kohn etal 4)5)6) vyvinuli monoklonaacutelniacute protilaacutetku k hodnoceniacute jejiacutech funkčniacutech vlastnostiacute
bull Použitiacute buněk FRTL-5 takeacute umožnilo dalšiacute studium funkčniacute heterogenity a-TSHr (samostatneacute posouzeniacute uacutečinků jednotlivyacutech IgG na dvě odlišneacute buněčneacute aktivity aktivity produkce cAMP a buněčneacuteho růstu) 7)
1)Toccafondi RS Aterini S Medici MA Rotella CM Tanini A Zonefrati R Thyroid-stimulating antibody (TSAb) detected in sera of Gravesrsquo patients using human thyroid cell cultures Clin Exp Immunol (1980) 40532ndash9 2) Ambesi-Impiombato FS Parks LAM Coon HG Culture of hormone-depen- dent functional epithelial cells from rat thyroids Proc Natl Acad Sci U S A (1980) 773455ndash9 doi101073pnas7763455 3) Vitti P Chiovato L Lopez G Lombardi A Santini F Mammoli C et al Measurement of TSAb directly in serum using FRTL-5 cells J Endocrinol Invest (1988) 11313ndash7 doi101007BF03350157 4) Yavin E Yavin Z Schneider MD Kohn LD Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor implications for receptor structure and the action of autoantibodies in Gravesrsquo disease Proc Natl Acad Sci U S A (1981) 783180ndash4 doi101073pnas7853180 5) Valente WA Vitti P Yavin Z Yavin E Rotella CM Grollman EF et al Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor stimulating and blocking antibodies derived from the lymphocytes of patients with Gravesrsquo disease Proc Natl Acad Sci U S A (1982) 796680ndash4 doi101073pnas79216680 6) Valente WA Yavin Z Yavin E Grollman EF Schneider M Rotella CM et al Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor the identification of blocking and stimulating antibodies J Endocrinol Invest (1982) 5293ndash301 doi101007BF03350517 7) Valente WA Vitti P Rotella CM Vaughan MM Aloj SM Grollman EF et al Antibodies that promote thyroid growth A distinct population of thyroid-stimulating autoantibodies N Engl J Med (1983) 3091028ndash34 doi101056NEJM198310273091705
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 1
bull Hlavniacute průlom přišel s naklonovaacuteniacutem TSHr v r 1989 1-3) ndash využitiacute lidskeacuteho TSHr pro RIA i bioassays 45) ndash senzitivita 96 pro RIA
bull Pomociacute mutačniacutech technik byly připraveny chimerickeacute TSHr
bull V 90 leacutetech byly vyvinuty monoklonaacutelniacute protilaacutetky proti C-terminus region rh-TSHr 67)
1)Parmentier M Libert F Maenhaut C Lefort Gerard C Perret J Van Sande J et al Molecular cloning of the thyrotropin receptor Science (1989) 2461620ndash2 doi101126science2556796 2)Nagayama Y Kaufman KD Seto P Rapoport B Molecular cloning sequence and functional expression of the cDNA for the human thyrotropin receptor Biochem Biophys Res Commun (1989) 1651184ndash90 doi1010160006- 291X(89)92727-7 3) Akamizu T Ikuyama S Saji M Kosugi S Kozak C McBride OW et al Cloning chromosomal assignment and regulation of the rat thyrotropin receptor expression of the gene is regulated by thyrotropin agents that increase cAMP levels and thyroid autoantibodies Proc Natl Acad Sci U S A (1990) 875677ndash81 doi101073pnas87155677 4)Ludgate M Perret J Parmentier M Gerard C Libert F Dumont JE et al Use of recombinant human thyrotropin receptor (TSH-R) expressed in mammalian cell lines to assay TSH-R autoantibodies Mol Cell Endocrinol (1991) 73R13ndash8 doi1010160303-7207(90)90050-I 5) Filetti S Foti D Costante G Rapoport B Recombinant human thyrotropin (TSH) receptor in a radioreceptor assay for the measurement of TSH receptor autoantibodies J Clin Endocrinol Metab (1991) 721096ndash101 doi101210 jcem-72-5-1096 6) Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 7)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 2
bull Druhaacute generace imunotestů (ELISA) ndash solid-phase ndash se staly standardem pro dg a-TSHr diacuteky přesnosti (988 senzitivita a 996 specifita) a non-RIA 123)
bull Použitiacutem rh-TSHr nebo vepřovyacute TSHr ziacuteskaacuteme stejnou analytickou přesnost3)
1)Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 2)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071 3)Kamijo K TSH-receptor antibody measurement in patients with various thyrotoxicosis and Hashimotorsquos thyroiditis a comparison of two two-step assays coated plate ELISA using porcine TSH-receptor and coated tube radio- assay using human recombinant TSH-receptor Endocr J (2003) 50113ndash6 doi101507endocrj50113
Monoclonal a-TSHr stimulujiacuteciacute
bull Na přelomu mileacutenia byly studovaacuteny stimulujiacuteciacute protilaacutetky a-TSHr 123)
bull Tato data jsou zaacutesadniacute pro pochopeniacute vztahů struktury a funkciacute TSHRr a jejiacute role v patogenezi Gravesovy choroby
bull To vše vedlo k izolaci a charakterizaci lidskeacute monoklonaacutelniacute protilaacutetky a-TSHr stimulujiacuteciacute ndash M22 4)
1)Ando T Latif R Pritsker A Moran T Nagayama Y Davies TF A monoclonal thyroid-stimulating antibody J Clin Invest (2002) 1101667ndash74 doi101172 JCI0216991 2)Costagliola S Franssen JDF Bonomi M Urizar E Willnich M Bergmann A et al Generation of a mouse monoclonal TSH receptor antibody with stimu- lating activity Biochem Biophys Res Commun (2002) 299891ndash6 doi101016 S0006-291X(02)02762-6 3)Sanders J Jeffreys J Depraetere H Richards T Evans M Kiddie A et al Thyroid-stimulating monoclonal antibodies Thyroid (2002) 121043ndash50 doi101089105072502321085135 4) Sanders J Evans M Premawardhana LDKE Depraetere H Jeffreys J Richards T et al Human monoclonal stimulating autoantibody Lancet (2003) 362126ndash8 doi101016S0140-6736(03)13866-4
Třetiacute generace testů ndash M22
bull V r2004 byl vyvinut test použitiacutem M22 ve formaacutetu ELISA 1) senzitivita 974 a specifita 992 (např Medipan)
bull Test byl vhodnyacute i pro automatizaci 23)
bull Dostupnost a znalost jak stimulujiacuteciacutech tak blokujiacuteciacutech protilaacutetek byla důležitaacute k pochopeniacute krystalickeacute struktury TSHr a jejiacutech interakciacute s a-TSHr 4) poukaacutezalo to na širokeacute překryvy epitopů mezi stimulujiacuteciacutemi a blokujiacuteciacutemi protilaacutetkami 4)
bull Roche nativniacute vepřovyacute TSH s M22
1)Rees Smith B Bolton J Young S Collyer A Weeden A Bradbury J et al A new assay for thyrotropin receptor autoantibodies Thyroid (2004) 14830ndash5 doi1010891050725042451248 2) Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003 3) Zophel K Roggenbuck D von Landenberg P Wunderlich G Gruning T Kotzerke J et al TSH receptor antibody (TRAb) assays based on the human monoclonal autoantibody M22 are more sensitive than bovine TSH based assays Horm Metab Res (2010) 4265ndash9 doi101055s-0029-1241196 4) Furmaniak J Sanders J Nunez Miguel R Rees Smith B Mechanisms of action of TSHR autoantibodies Horm Metab Res (2015) 47735ndash52 doi10105 5s-0035-1559648
Mc4 bioassay
bull Souběžně s testy 3-generace Kohn vyvinul test využiacutevajiacuteciacute bdquoMc4 chimeacuteruldquo založenou na metodaacutech chemiluminiscence 1)
bull Ciacutelem bylo měřit pouze stimulujiacuteciacute protilaacutetky a tiacutem dosaacutehnout jasneacuteho cutoff mezi pacienty s GD a kontrolami
bull Porovnaacuteniacute senzitivity a specifity v tabulce 2) bull Mc4 testy mohou byacutet využity jako testy prvniacute
volby pro pacienty s GD
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Mc4 bioassay
bull Testy s M22 diacuteky podobně specifitě a senzitivitě ale lepšiacute bdquoproveditelnostildquo jsou zatiacutem preferovanějšiacute
bull Daacutele jsou lepšiacute pro prognoacutezu GD než testy s M22 a leacutepe korelujiacute s aktivitou a zaacutevažnostiacute GD orbitopatiiacute 2)
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Bridge Assay
bull Novaacute technologie využitiacute chimeacuterickyacutech receptorů Mc4 a N-terminaacutelniacute TSHr fůsovanyacute s alkalickou fosfataacutezou 1) senzitivita 998 a specifita 995
bull TSI ndash Siemens tato metoda je založena na sendvičoveacutem kompetetivniacute formaacutetu kteryacute se lišiacute od klasickeacuteho kompetetivniacute formaacutetu komerčniacutech IMA druheacute a třetiacute generace 2)
1)Frank CU Braeth S Dietrich JW Wanjura D Loos U Bridge technology with TSH receptor chimera for sensitive direct detection of TSH receptor antibodies causing Gravesrsquo disease analytical and clinical evaluation Horm Metab Res (2015) 47880ndash8 doi101055s-0035-1554662 2)Tozzoli R DrsquoAurizio F Villalta D Giovanella L (2017) Evalu- ation of the first fully automated immunoassay method for the measurement of stimulating TSH receptor autoantibodies in Gravesrsquo disease Clin Chem Lab Med 5558ndash64
Mezinaacuterodniacute standard
bull Prvniacute mezinaacuterodniacute standard připraven v r 1995 WHO označeniacute 90672 Připraven ECBS zdroj pacientskaacute plasma
bull V r 2006 nahrazen lidskou monoklonaacutelniacute protilaacutetkou M22 (NIBSC 08240) odkazuje na detekci S-TRAb 1)
1) Diana T1 Kanitz M Lehmann M Li Y Olivo PD Kahaly GJ Standardization of a bioassay for thyrotropin receptor stimulating autoantibodies Thyroid 2015 Feb25(2)169-75
EHK ndash SEKK AT217
EHK ndash SEKK AT217
SEKK - Dotazniacutek
EHK ndash SEKK AT113
EHK ndash SEKK AT113
Hashimotova tyreoiditida (HT)
bull HT 1) a SLE 2) byly prvniacute dvě autoimunitniacute onemocněniacute kde se prokaacutezala genetickaacute asociace (geny MHC třiacutedy II) 70 leacuteta
bull Nicmeacuteně nebyl nalezen gen kteryacute by spouštěl HT nalezeny pouze geny ktereacute přispiacutevajiacute k fenotypu onemocněniacute 3)
1)VladutiuAO RoseNR Autoimmunemurine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type Science 19711741137ndash9 2)Grumet FC Coukell A Bodmer JG Bodmer WF McDevitt HO Histocompatibility (HL-A) antigens associated with systemic lupus erythematosus A possible genetic predisposition to disease N Engl J Med 1971285193ndash6 3) Simmonds MJ Gough SC The search for the genetic contribution to autoimmune thyroid disease the never ending story Brief Funct Genomics 20111077ndash90
Hashimotova tyreoiditida
bull Do 50 let raritniacute onemocněniacute nyniacute nejběžnějšiacute s prevalenciacute 81000 biochemickyacute naacutelez + autoprotilaacutetky 461000
bull Ženymuži 81
a-TPO
bull Přiacutetomnost protilaacutetek TPOAb obvykle předchaacuteziacute vzniku tyreoidaacutelniacute dysfunkce
bull Patogenetickaacute role protilaacutetek TgAb zůstaacutevaacute nejasnaacute
a-TPO
bull Autoprotilaacutetky TPOAb byly nejdřiacuteve popsaacuteny jako antimikrozomaacutelniacute autoprotilaacutetky (AMA) neboť bylo zjištěno že reagujiacute s neupravenyacutemi membraacutenami tyreoidaacutelniacutech buněk
bull Mikrozomaacutelniacute antigen byl později popsaacuten jako TPO
bull Dřiacuteve se využiacutevaly ke stanoveniacute TPO metody imunofluorescenčniacute metody a aglutinačniacute testy s pasivniacutem barveniacutem erytrocytů
a-TPO jako rizikovyacute faktor
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TPO je znaacutemyacutem rizikovyacutem faktorem pro vznik tyreoidaacutelniacute dysfunkce pokud jsou pacienti leacutečeni lithiem amiodaronem interleukinem-2 nebo alfa-interferonem
a-TG
bull Tg vykazuje vysokou heterogenitu způsobenou rozdiacutely v posttranslačniacutech modifikaciacutech (glykosylace jodizace sulfatace atd) Během synteacutezy tyreoidaacutelniacuteho hormonu a jeho uvolněniacute je Tg polymerizovaacuten a degradovaacuten
bull Vlivem toho je imunologickaacute struktura Tg mimořaacutedně komplexniacute Charakteristika standardů pro Tg se může lišit v zaacutevislosti na vstupniacute lidskeacute tyreoidaacutelniacute tkaacuteni a použiteacutem purifikačniacutem procesu To vysvětluje proč jsou testy na TgAb a takeacute Tg tak obtiacutežně standardizovatelneacute
Titr protilaacutetek
bull Titr protilaacutetek literaacuterně koreluje s počtem autoreaktivniacutech lymfocytů ktereacute infiltrujiacute štiacutetnou žlaacutezu a sonografickyacutem obrazem 1)
bull a-TG nižšiacute senzitivita (60-80 u HT) a menšiacute specifita (pozitivniacute ve většiacute čaacutesti zdravyacutech kontrol) než a-TPO
bull a-TG a a-TPO představujiacute dva různeacute aspekty autoimunniacute odpovědi na štiacutetnou žlaacutezu a-TG by mohly odraacutežet počaacutetečniacute (vrozenyacute) typ imunitniacute odpovědi zatiacutemco a-TPO by mohly charakterizovat pozdějšiacute adaptivniacute imunitniacute odpovědi 2)
1)Pandit AA VijayWardeMMenon PS Correlation of number of intrathyroid lympho- cytes with antimicrosomal antibody titer in Hashimotos thyroiditis Diagn Cytopathol 20032863ndash5 2) Rose NR Autoimmune escalation through the crystal ball Clin Exp Immunol 20071479
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
Protilaacutetky
bull Titr a-TSHr taky klesajiacute po tyroidektomii (čaacutestečneacute či celkoveacute) kvůli odstraněniacute zdroje antigenu
bull Naopak naacuterůst titrů a-TSHr pozorujeme po leacutečbě radioiodine I131 (asi dle uvolněniacute antigenů a zpracovaacuteniacute antigenů antigen-presentujiacuteciacutemi buňkami)
Protilaacutetky + typ bull Bylo prokaacutezaacuteno že nedostatečnaacute korelace mezi
koncentracemi a-TSHr a klinickyacutem stavem pacienta je většinou způsobena tiacutem že protilaacutetky a-TSHr v oběhu jsou heterogenniacute
bull Přechod z TSAbs na TBAbs je zodpovědnyacute za vyacutevoj hypotyreoacutezy u maleacuteho procenta pacientů s Gravesovou nemociacute a naopak
bull Skutečnost že heterogenniacute protilaacutetky a-TSHr mohou koexistovat u jednoho pacienta a měnit se v průběhu času je jedniacutem z důvodů proč bylo těžkeacute vyvinout diagnosticky přesneacute testy na stanoveniacute protilaacutetek a-TSHr
bull Klinickeacute projevy pacientů s Gravesovou chorobou kteřiacute vykazujiacute přiacutetomnost protilaacutetek TSAb i TBAbTSBAb budou zaacutevisleacute spiacuteše na relativniacute koncentraci a afinitě predominantniacute protilaacutetky
Protilaacutetky - sledovaacuteniacute
bull Sledovaacuteniacute hladin TSAb přidaacutevaacute dalšiacute rozměr k hodnoceniacute aktivity GD s potenciaacutelem předpovědět recidivu nebo remisii u jednotlivyacutech pacientů
bull Vysokaacute perzistentniacute hladina TSAb je spojena s aktivniacutemi a zaacutevažnyacutemi systeacutemovyacutemi projevy a se špatnou odezvou na terapii Naopak niacutezkeacute hladiny TSAb jsou nachaacutezeny u pacientů v remisi
Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Diagnostika
bull a-TSHr lze měřit v podstatě dvěma typy testů
ndash Biologickyacutem testem (biotestem bioassay) ktereacute detekujiacute produkci cAMP v buněčnyacutech kulturaacutech inkubovanyacutech se seacuterami pacientů Tyto testy identifikujiacute pouze stimulačniacute a-TSHr Biotesty prokazujiacute nejen přiacutetomnost Ab ale takeacute jejich funkčniacute aktivitu a uacutečinnost Historicky sloužily biotesty k vyacutezkumu ke studiu patofyziologie GD
ndash Protilaacutetkoveacute testy (vazebneacute receptoroveacute) Naopak receptoroveacute metody rutinně použiacutevaneacute v klinickyacutech laboratořiacutech udaacutevajiacute pouze přiacutetomnost nebo nepřiacutetomnost a-TSHr a jejich koncentrace ale neuvaacutedějiacute jejich funkčniacute aktivitu 2)
bull Tento zaacutekladniacute rozdiacutel v uspořaacutedaacuteniacute metody vysvětluje proč biotesty a protilaacutetkoveacute testy vykazujiacute nižšiacute korelaci (r = 031 ndash 065) 1)
1)Gupta MK Thyrotropin-receptor antibodies in thyroid diseases advances in detection techniques and clinical application Clin Chem Acta 20002931-29 2) Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Biotesty
bull Biotesty mohou detekovat funkčniacute změny u heterogenniacutech a-TSHr
bull Skutečnost že heterogenniacute protilaacutetky a-TSHr mohou koexistovat u jednoho pacienta a měnit se v průběhu času je jedniacutem z důvodů proč bylo těžkeacute vyvinout diagnosticky přesneacute testy na stanoveniacute protilaacutetek a-TSHr
bull Biotesty mohou zlepšit peacuteči o pacienta ve smyslu bdquopersonalisovaneacute mediciacutenyldquo
bull Biotesty jsou nabiacutezeny referenčniacutemi laboratořeni je jistyacute předpoklady že by se mohly viacutece rozšiacuteřit
Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Biotesty
bull Během posledniacutech 60 let se biologickaacute analyacuteza a-TSHr vyvinula těžkopaacutednyacutech a časově naacuteročnyacutech postupů na geneticky upraveneacute testy založeneacute na buňkaacutech ktereacute jsou charakterizovaacuteny dobrou proveditelnostiacute a rychlyacutemi provozniacutemi časy a ktereacute jsou takeacute k dispozici jako komerčniacute sady
bull Komerčně dostupnyacute biotest je Thyretain fa Quidel kteryacute detekuje stimulačniacute aktivitu a-TSHr pomociacute chimeacuterickeacuteho TSHR a genu pro cAMP (signalizace luciferaacutezou) Je schvaacutelen FDA pro použitiacute v klinickyacutech laboratořiacutech
HISTORIE
Historickyacute vyacutevoj metod pro měřeniacute a-TSHr ndash dle Giuliani etal 2016
Cesidio Giuliani1 Motoyasu Saji2 Ines Bucci1 and Giorgio Napolitano Bioassays for TSH Receptor Autoantibodies from FRTL-5 Cells to TSH ReceptorndashLHCG Receptor Chimeras The Contribution of Leonard D Kohn Front Endocrinol (Lausanne) 2016 7 103
LATS
bull V r 1956 Adams a Purves zjistili že seacutera pacientů s tyreotoxikosou indukujiacute abnormaacutelniacute prodlouženou odpověď v TSH testu (s morčetem)1)2)
bull Nazvali jej ldquoabnormal thyroid stimulatorrdquo posleacuteze ldquolong-acting thyroid stimulatorrdquo (LATS) 2)3) bylo jasneacute že je odlišnyacute od TSH a neniacute produkovaacuten hypofyacutezou
bull V roce 1964 byla LATS identifikovaacutena jako protein podobnyacute protilaacutetkaacutem (4) a dalšiacute studie jednoznačně potvrdily že se jednaacute o IgG (56)
bull Prvniacute testy k detekci LATS měly niacutezkou senzitivitu (60-70) 7) bull Vyacuteznamneacute zlepšeniacute v testech nastalo v r 1975 a to s vyacutevojem
radioligandoveacuteho receptoroveacuteho testu Test hodnotil inhibici seacutera od pacientů s GD vaacutezaacutenyacutemi radioaktivně značeneacuteho TSH na lidskeacute tyroidniacute membraacuteny (8 Test byl nicmeacuteně staacutele zatiacutežen niacutezkou přesnostiacute
bull Dalšiacute zlepšeniacute přineslo nahrazeniacute tyroidaacutelniacute membraacuteny čaacutestečně vyčištěneacuteho TSHr - liquid phase first-generation immunoassay použiacutevanaacute dalšiacutech 20 let 910) specifita 99 senzitivita 80 11)
1)Adams DD Purves HD Abnormal responses in the assay of thyrotropin Proc Univ Otago Med Sch (1956) 3411ndash5 2)Adams DD The presence of an abnormal thyroid-stimulating hormone in the serum of some thyrotoxic patients J Clin Endocrinol Metab (1958) 18699ndash712 doi101210jcem-18-7-699 3) Adams DD Bioassay of long-acting thyroid stimulator (LATS) the dose-re- sponse relationship J Clin Endocrinol Metab (1961) 21799ndash805 4) Kriss JP Pleshakov V Chien JR Isolation and identification of the long-acting thyroid stimulator and its relation to hyperthyroidism and circumscribed pretibial myxedema J Clin Endocrinol Metab (1964) 241005ndash28 doi101210 jcem-24-10-1005 5) Kriss JP Inactivation of long-acting thyroid stimulator (LATS) by anti- kappa and anti-lamba antisera J Clin Endocrinol Metab (1968) 281440ndash4 doi101210jcem-28-10-1440 6) Volpeacute R The immunologic basis of Gravesrsquos disease N Engl J Med (1972) 287463ndash4 doi101056NEJM197208312870910 7) McKenzie JM Review pathogenesis of Gravesrsquo disease role of the long-acting thyroid stimulator J Clin Endocrinol Metab (1965) 25424ndash31 8) Mehdi SQ Nussey SS A radio-ligand receptor assay for the long-acting thy- roid stimulator Inhibition by the long-acting thyroid stimulator of the binding of radioiodinated thyroid stimulating hormone to human thyroid membranes Biochem J (1975) 145105ndash11 doi101042bj1450105 9)Shewring G Rees Smith B An improved radioreceptor assay for TSH receptor antibodies Clin Endocrinol (1982) 17409ndash17 doi101111j1365-22651982 tb01607x 10)Southgate K Creagh FM Teece M Kingswood C Rees Smith B A receptor assay for the measurement of TSH receptor antibodies in unextracted serum Clin Endocrinol (1984) 20539ndash48 doi101111j1365-22651984tb00102x 11)Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003
FRTL-5 bull Souběžně s vyacutevojem radioligandovyacutech receptorovyacutech testů dochaacutezelo k vyacutevoji
bdquobiotestůldquo Změna v in vivo na in vitro jako je použitiacute primaacuterniacutech buněčnyacutech kultur 1)
bull Dalšiacute zlepšeniacute přišlo s použitiacutem FRTL-5 buněk ndash netransformovanyacutech buněčnyacutech liniiacute krysiacutech thyroid epithelial buněk v kontinuaacutelniacute kultuře 2) Test byl založen na schopnosti purifikovanyacutech IgG indukovat produkci cAMP Naacutesledně bylo umožněno využiacutet pacientskeacute seacutera 3)
bull Tento test nesloužil jen pro diagnostiku ale měl zaacutesadniacute vyacuteznam v pochopeniacute patfyz vlastnostiacute a-TSHr
bull Kohn etal 4)5)6) vyvinuli monoklonaacutelniacute protilaacutetku k hodnoceniacute jejiacutech funkčniacutech vlastnostiacute
bull Použitiacute buněk FRTL-5 takeacute umožnilo dalšiacute studium funkčniacute heterogenity a-TSHr (samostatneacute posouzeniacute uacutečinků jednotlivyacutech IgG na dvě odlišneacute buněčneacute aktivity aktivity produkce cAMP a buněčneacuteho růstu) 7)
1)Toccafondi RS Aterini S Medici MA Rotella CM Tanini A Zonefrati R Thyroid-stimulating antibody (TSAb) detected in sera of Gravesrsquo patients using human thyroid cell cultures Clin Exp Immunol (1980) 40532ndash9 2) Ambesi-Impiombato FS Parks LAM Coon HG Culture of hormone-depen- dent functional epithelial cells from rat thyroids Proc Natl Acad Sci U S A (1980) 773455ndash9 doi101073pnas7763455 3) Vitti P Chiovato L Lopez G Lombardi A Santini F Mammoli C et al Measurement of TSAb directly in serum using FRTL-5 cells J Endocrinol Invest (1988) 11313ndash7 doi101007BF03350157 4) Yavin E Yavin Z Schneider MD Kohn LD Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor implications for receptor structure and the action of autoantibodies in Gravesrsquo disease Proc Natl Acad Sci U S A (1981) 783180ndash4 doi101073pnas7853180 5) Valente WA Vitti P Yavin Z Yavin E Rotella CM Grollman EF et al Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor stimulating and blocking antibodies derived from the lymphocytes of patients with Gravesrsquo disease Proc Natl Acad Sci U S A (1982) 796680ndash4 doi101073pnas79216680 6) Valente WA Yavin Z Yavin E Grollman EF Schneider M Rotella CM et al Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor the identification of blocking and stimulating antibodies J Endocrinol Invest (1982) 5293ndash301 doi101007BF03350517 7) Valente WA Vitti P Rotella CM Vaughan MM Aloj SM Grollman EF et al Antibodies that promote thyroid growth A distinct population of thyroid-stimulating autoantibodies N Engl J Med (1983) 3091028ndash34 doi101056NEJM198310273091705
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 1
bull Hlavniacute průlom přišel s naklonovaacuteniacutem TSHr v r 1989 1-3) ndash využitiacute lidskeacuteho TSHr pro RIA i bioassays 45) ndash senzitivita 96 pro RIA
bull Pomociacute mutačniacutech technik byly připraveny chimerickeacute TSHr
bull V 90 leacutetech byly vyvinuty monoklonaacutelniacute protilaacutetky proti C-terminus region rh-TSHr 67)
1)Parmentier M Libert F Maenhaut C Lefort Gerard C Perret J Van Sande J et al Molecular cloning of the thyrotropin receptor Science (1989) 2461620ndash2 doi101126science2556796 2)Nagayama Y Kaufman KD Seto P Rapoport B Molecular cloning sequence and functional expression of the cDNA for the human thyrotropin receptor Biochem Biophys Res Commun (1989) 1651184ndash90 doi1010160006- 291X(89)92727-7 3) Akamizu T Ikuyama S Saji M Kosugi S Kozak C McBride OW et al Cloning chromosomal assignment and regulation of the rat thyrotropin receptor expression of the gene is regulated by thyrotropin agents that increase cAMP levels and thyroid autoantibodies Proc Natl Acad Sci U S A (1990) 875677ndash81 doi101073pnas87155677 4)Ludgate M Perret J Parmentier M Gerard C Libert F Dumont JE et al Use of recombinant human thyrotropin receptor (TSH-R) expressed in mammalian cell lines to assay TSH-R autoantibodies Mol Cell Endocrinol (1991) 73R13ndash8 doi1010160303-7207(90)90050-I 5) Filetti S Foti D Costante G Rapoport B Recombinant human thyrotropin (TSH) receptor in a radioreceptor assay for the measurement of TSH receptor autoantibodies J Clin Endocrinol Metab (1991) 721096ndash101 doi101210 jcem-72-5-1096 6) Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 7)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 2
bull Druhaacute generace imunotestů (ELISA) ndash solid-phase ndash se staly standardem pro dg a-TSHr diacuteky přesnosti (988 senzitivita a 996 specifita) a non-RIA 123)
bull Použitiacutem rh-TSHr nebo vepřovyacute TSHr ziacuteskaacuteme stejnou analytickou přesnost3)
1)Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 2)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071 3)Kamijo K TSH-receptor antibody measurement in patients with various thyrotoxicosis and Hashimotorsquos thyroiditis a comparison of two two-step assays coated plate ELISA using porcine TSH-receptor and coated tube radio- assay using human recombinant TSH-receptor Endocr J (2003) 50113ndash6 doi101507endocrj50113
Monoclonal a-TSHr stimulujiacuteciacute
bull Na přelomu mileacutenia byly studovaacuteny stimulujiacuteciacute protilaacutetky a-TSHr 123)
bull Tato data jsou zaacutesadniacute pro pochopeniacute vztahů struktury a funkciacute TSHRr a jejiacute role v patogenezi Gravesovy choroby
bull To vše vedlo k izolaci a charakterizaci lidskeacute monoklonaacutelniacute protilaacutetky a-TSHr stimulujiacuteciacute ndash M22 4)
1)Ando T Latif R Pritsker A Moran T Nagayama Y Davies TF A monoclonal thyroid-stimulating antibody J Clin Invest (2002) 1101667ndash74 doi101172 JCI0216991 2)Costagliola S Franssen JDF Bonomi M Urizar E Willnich M Bergmann A et al Generation of a mouse monoclonal TSH receptor antibody with stimu- lating activity Biochem Biophys Res Commun (2002) 299891ndash6 doi101016 S0006-291X(02)02762-6 3)Sanders J Jeffreys J Depraetere H Richards T Evans M Kiddie A et al Thyroid-stimulating monoclonal antibodies Thyroid (2002) 121043ndash50 doi101089105072502321085135 4) Sanders J Evans M Premawardhana LDKE Depraetere H Jeffreys J Richards T et al Human monoclonal stimulating autoantibody Lancet (2003) 362126ndash8 doi101016S0140-6736(03)13866-4
Třetiacute generace testů ndash M22
bull V r2004 byl vyvinut test použitiacutem M22 ve formaacutetu ELISA 1) senzitivita 974 a specifita 992 (např Medipan)
bull Test byl vhodnyacute i pro automatizaci 23)
bull Dostupnost a znalost jak stimulujiacuteciacutech tak blokujiacuteciacutech protilaacutetek byla důležitaacute k pochopeniacute krystalickeacute struktury TSHr a jejiacutech interakciacute s a-TSHr 4) poukaacutezalo to na širokeacute překryvy epitopů mezi stimulujiacuteciacutemi a blokujiacuteciacutemi protilaacutetkami 4)
bull Roche nativniacute vepřovyacute TSH s M22
1)Rees Smith B Bolton J Young S Collyer A Weeden A Bradbury J et al A new assay for thyrotropin receptor autoantibodies Thyroid (2004) 14830ndash5 doi1010891050725042451248 2) Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003 3) Zophel K Roggenbuck D von Landenberg P Wunderlich G Gruning T Kotzerke J et al TSH receptor antibody (TRAb) assays based on the human monoclonal autoantibody M22 are more sensitive than bovine TSH based assays Horm Metab Res (2010) 4265ndash9 doi101055s-0029-1241196 4) Furmaniak J Sanders J Nunez Miguel R Rees Smith B Mechanisms of action of TSHR autoantibodies Horm Metab Res (2015) 47735ndash52 doi10105 5s-0035-1559648
Mc4 bioassay
bull Souběžně s testy 3-generace Kohn vyvinul test využiacutevajiacuteciacute bdquoMc4 chimeacuteruldquo založenou na metodaacutech chemiluminiscence 1)
bull Ciacutelem bylo měřit pouze stimulujiacuteciacute protilaacutetky a tiacutem dosaacutehnout jasneacuteho cutoff mezi pacienty s GD a kontrolami
bull Porovnaacuteniacute senzitivity a specifity v tabulce 2) bull Mc4 testy mohou byacutet využity jako testy prvniacute
volby pro pacienty s GD
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Mc4 bioassay
bull Testy s M22 diacuteky podobně specifitě a senzitivitě ale lepšiacute bdquoproveditelnostildquo jsou zatiacutem preferovanějšiacute
bull Daacutele jsou lepšiacute pro prognoacutezu GD než testy s M22 a leacutepe korelujiacute s aktivitou a zaacutevažnostiacute GD orbitopatiiacute 2)
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Bridge Assay
bull Novaacute technologie využitiacute chimeacuterickyacutech receptorů Mc4 a N-terminaacutelniacute TSHr fůsovanyacute s alkalickou fosfataacutezou 1) senzitivita 998 a specifita 995
bull TSI ndash Siemens tato metoda je založena na sendvičoveacutem kompetetivniacute formaacutetu kteryacute se lišiacute od klasickeacuteho kompetetivniacute formaacutetu komerčniacutech IMA druheacute a třetiacute generace 2)
1)Frank CU Braeth S Dietrich JW Wanjura D Loos U Bridge technology with TSH receptor chimera for sensitive direct detection of TSH receptor antibodies causing Gravesrsquo disease analytical and clinical evaluation Horm Metab Res (2015) 47880ndash8 doi101055s-0035-1554662 2)Tozzoli R DrsquoAurizio F Villalta D Giovanella L (2017) Evalu- ation of the first fully automated immunoassay method for the measurement of stimulating TSH receptor autoantibodies in Gravesrsquo disease Clin Chem Lab Med 5558ndash64
Mezinaacuterodniacute standard
bull Prvniacute mezinaacuterodniacute standard připraven v r 1995 WHO označeniacute 90672 Připraven ECBS zdroj pacientskaacute plasma
bull V r 2006 nahrazen lidskou monoklonaacutelniacute protilaacutetkou M22 (NIBSC 08240) odkazuje na detekci S-TRAb 1)
1) Diana T1 Kanitz M Lehmann M Li Y Olivo PD Kahaly GJ Standardization of a bioassay for thyrotropin receptor stimulating autoantibodies Thyroid 2015 Feb25(2)169-75
EHK ndash SEKK AT217
EHK ndash SEKK AT217
SEKK - Dotazniacutek
EHK ndash SEKK AT113
EHK ndash SEKK AT113
Hashimotova tyreoiditida (HT)
bull HT 1) a SLE 2) byly prvniacute dvě autoimunitniacute onemocněniacute kde se prokaacutezala genetickaacute asociace (geny MHC třiacutedy II) 70 leacuteta
bull Nicmeacuteně nebyl nalezen gen kteryacute by spouštěl HT nalezeny pouze geny ktereacute přispiacutevajiacute k fenotypu onemocněniacute 3)
1)VladutiuAO RoseNR Autoimmunemurine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type Science 19711741137ndash9 2)Grumet FC Coukell A Bodmer JG Bodmer WF McDevitt HO Histocompatibility (HL-A) antigens associated with systemic lupus erythematosus A possible genetic predisposition to disease N Engl J Med 1971285193ndash6 3) Simmonds MJ Gough SC The search for the genetic contribution to autoimmune thyroid disease the never ending story Brief Funct Genomics 20111077ndash90
Hashimotova tyreoiditida
bull Do 50 let raritniacute onemocněniacute nyniacute nejběžnějšiacute s prevalenciacute 81000 biochemickyacute naacutelez + autoprotilaacutetky 461000
bull Ženymuži 81
a-TPO
bull Přiacutetomnost protilaacutetek TPOAb obvykle předchaacuteziacute vzniku tyreoidaacutelniacute dysfunkce
bull Patogenetickaacute role protilaacutetek TgAb zůstaacutevaacute nejasnaacute
a-TPO
bull Autoprotilaacutetky TPOAb byly nejdřiacuteve popsaacuteny jako antimikrozomaacutelniacute autoprotilaacutetky (AMA) neboť bylo zjištěno že reagujiacute s neupravenyacutemi membraacutenami tyreoidaacutelniacutech buněk
bull Mikrozomaacutelniacute antigen byl později popsaacuten jako TPO
bull Dřiacuteve se využiacutevaly ke stanoveniacute TPO metody imunofluorescenčniacute metody a aglutinačniacute testy s pasivniacutem barveniacutem erytrocytů
a-TPO jako rizikovyacute faktor
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TPO je znaacutemyacutem rizikovyacutem faktorem pro vznik tyreoidaacutelniacute dysfunkce pokud jsou pacienti leacutečeni lithiem amiodaronem interleukinem-2 nebo alfa-interferonem
a-TG
bull Tg vykazuje vysokou heterogenitu způsobenou rozdiacutely v posttranslačniacutech modifikaciacutech (glykosylace jodizace sulfatace atd) Během synteacutezy tyreoidaacutelniacuteho hormonu a jeho uvolněniacute je Tg polymerizovaacuten a degradovaacuten
bull Vlivem toho je imunologickaacute struktura Tg mimořaacutedně komplexniacute Charakteristika standardů pro Tg se může lišit v zaacutevislosti na vstupniacute lidskeacute tyreoidaacutelniacute tkaacuteni a použiteacutem purifikačniacutem procesu To vysvětluje proč jsou testy na TgAb a takeacute Tg tak obtiacutežně standardizovatelneacute
Titr protilaacutetek
bull Titr protilaacutetek literaacuterně koreluje s počtem autoreaktivniacutech lymfocytů ktereacute infiltrujiacute štiacutetnou žlaacutezu a sonografickyacutem obrazem 1)
bull a-TG nižšiacute senzitivita (60-80 u HT) a menšiacute specifita (pozitivniacute ve většiacute čaacutesti zdravyacutech kontrol) než a-TPO
bull a-TG a a-TPO představujiacute dva různeacute aspekty autoimunniacute odpovědi na štiacutetnou žlaacutezu a-TG by mohly odraacutežet počaacutetečniacute (vrozenyacute) typ imunitniacute odpovědi zatiacutemco a-TPO by mohly charakterizovat pozdějšiacute adaptivniacute imunitniacute odpovědi 2)
1)Pandit AA VijayWardeMMenon PS Correlation of number of intrathyroid lympho- cytes with antimicrosomal antibody titer in Hashimotos thyroiditis Diagn Cytopathol 20032863ndash5 2) Rose NR Autoimmune escalation through the crystal ball Clin Exp Immunol 20071479
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
Protilaacutetky + typ bull Bylo prokaacutezaacuteno že nedostatečnaacute korelace mezi
koncentracemi a-TSHr a klinickyacutem stavem pacienta je většinou způsobena tiacutem že protilaacutetky a-TSHr v oběhu jsou heterogenniacute
bull Přechod z TSAbs na TBAbs je zodpovědnyacute za vyacutevoj hypotyreoacutezy u maleacuteho procenta pacientů s Gravesovou nemociacute a naopak
bull Skutečnost že heterogenniacute protilaacutetky a-TSHr mohou koexistovat u jednoho pacienta a měnit se v průběhu času je jedniacutem z důvodů proč bylo těžkeacute vyvinout diagnosticky přesneacute testy na stanoveniacute protilaacutetek a-TSHr
bull Klinickeacute projevy pacientů s Gravesovou chorobou kteřiacute vykazujiacute přiacutetomnost protilaacutetek TSAb i TBAbTSBAb budou zaacutevisleacute spiacuteše na relativniacute koncentraci a afinitě predominantniacute protilaacutetky
Protilaacutetky - sledovaacuteniacute
bull Sledovaacuteniacute hladin TSAb přidaacutevaacute dalšiacute rozměr k hodnoceniacute aktivity GD s potenciaacutelem předpovědět recidivu nebo remisii u jednotlivyacutech pacientů
bull Vysokaacute perzistentniacute hladina TSAb je spojena s aktivniacutemi a zaacutevažnyacutemi systeacutemovyacutemi projevy a se špatnou odezvou na terapii Naopak niacutezkeacute hladiny TSAb jsou nachaacutezeny u pacientů v remisi
Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Diagnostika
bull a-TSHr lze měřit v podstatě dvěma typy testů
ndash Biologickyacutem testem (biotestem bioassay) ktereacute detekujiacute produkci cAMP v buněčnyacutech kulturaacutech inkubovanyacutech se seacuterami pacientů Tyto testy identifikujiacute pouze stimulačniacute a-TSHr Biotesty prokazujiacute nejen přiacutetomnost Ab ale takeacute jejich funkčniacute aktivitu a uacutečinnost Historicky sloužily biotesty k vyacutezkumu ke studiu patofyziologie GD
ndash Protilaacutetkoveacute testy (vazebneacute receptoroveacute) Naopak receptoroveacute metody rutinně použiacutevaneacute v klinickyacutech laboratořiacutech udaacutevajiacute pouze přiacutetomnost nebo nepřiacutetomnost a-TSHr a jejich koncentrace ale neuvaacutedějiacute jejich funkčniacute aktivitu 2)
bull Tento zaacutekladniacute rozdiacutel v uspořaacutedaacuteniacute metody vysvětluje proč biotesty a protilaacutetkoveacute testy vykazujiacute nižšiacute korelaci (r = 031 ndash 065) 1)
1)Gupta MK Thyrotropin-receptor antibodies in thyroid diseases advances in detection techniques and clinical application Clin Chem Acta 20002931-29 2) Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Biotesty
bull Biotesty mohou detekovat funkčniacute změny u heterogenniacutech a-TSHr
bull Skutečnost že heterogenniacute protilaacutetky a-TSHr mohou koexistovat u jednoho pacienta a měnit se v průběhu času je jedniacutem z důvodů proč bylo těžkeacute vyvinout diagnosticky přesneacute testy na stanoveniacute protilaacutetek a-TSHr
bull Biotesty mohou zlepšit peacuteči o pacienta ve smyslu bdquopersonalisovaneacute mediciacutenyldquo
bull Biotesty jsou nabiacutezeny referenčniacutemi laboratořeni je jistyacute předpoklady že by se mohly viacutece rozšiacuteřit
Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Biotesty
bull Během posledniacutech 60 let se biologickaacute analyacuteza a-TSHr vyvinula těžkopaacutednyacutech a časově naacuteročnyacutech postupů na geneticky upraveneacute testy založeneacute na buňkaacutech ktereacute jsou charakterizovaacuteny dobrou proveditelnostiacute a rychlyacutemi provozniacutemi časy a ktereacute jsou takeacute k dispozici jako komerčniacute sady
bull Komerčně dostupnyacute biotest je Thyretain fa Quidel kteryacute detekuje stimulačniacute aktivitu a-TSHr pomociacute chimeacuterickeacuteho TSHR a genu pro cAMP (signalizace luciferaacutezou) Je schvaacutelen FDA pro použitiacute v klinickyacutech laboratořiacutech
HISTORIE
Historickyacute vyacutevoj metod pro měřeniacute a-TSHr ndash dle Giuliani etal 2016
Cesidio Giuliani1 Motoyasu Saji2 Ines Bucci1 and Giorgio Napolitano Bioassays for TSH Receptor Autoantibodies from FRTL-5 Cells to TSH ReceptorndashLHCG Receptor Chimeras The Contribution of Leonard D Kohn Front Endocrinol (Lausanne) 2016 7 103
LATS
bull V r 1956 Adams a Purves zjistili že seacutera pacientů s tyreotoxikosou indukujiacute abnormaacutelniacute prodlouženou odpověď v TSH testu (s morčetem)1)2)
bull Nazvali jej ldquoabnormal thyroid stimulatorrdquo posleacuteze ldquolong-acting thyroid stimulatorrdquo (LATS) 2)3) bylo jasneacute že je odlišnyacute od TSH a neniacute produkovaacuten hypofyacutezou
bull V roce 1964 byla LATS identifikovaacutena jako protein podobnyacute protilaacutetkaacutem (4) a dalšiacute studie jednoznačně potvrdily že se jednaacute o IgG (56)
bull Prvniacute testy k detekci LATS měly niacutezkou senzitivitu (60-70) 7) bull Vyacuteznamneacute zlepšeniacute v testech nastalo v r 1975 a to s vyacutevojem
radioligandoveacuteho receptoroveacuteho testu Test hodnotil inhibici seacutera od pacientů s GD vaacutezaacutenyacutemi radioaktivně značeneacuteho TSH na lidskeacute tyroidniacute membraacuteny (8 Test byl nicmeacuteně staacutele zatiacutežen niacutezkou přesnostiacute
bull Dalšiacute zlepšeniacute přineslo nahrazeniacute tyroidaacutelniacute membraacuteny čaacutestečně vyčištěneacuteho TSHr - liquid phase first-generation immunoassay použiacutevanaacute dalšiacutech 20 let 910) specifita 99 senzitivita 80 11)
1)Adams DD Purves HD Abnormal responses in the assay of thyrotropin Proc Univ Otago Med Sch (1956) 3411ndash5 2)Adams DD The presence of an abnormal thyroid-stimulating hormone in the serum of some thyrotoxic patients J Clin Endocrinol Metab (1958) 18699ndash712 doi101210jcem-18-7-699 3) Adams DD Bioassay of long-acting thyroid stimulator (LATS) the dose-re- sponse relationship J Clin Endocrinol Metab (1961) 21799ndash805 4) Kriss JP Pleshakov V Chien JR Isolation and identification of the long-acting thyroid stimulator and its relation to hyperthyroidism and circumscribed pretibial myxedema J Clin Endocrinol Metab (1964) 241005ndash28 doi101210 jcem-24-10-1005 5) Kriss JP Inactivation of long-acting thyroid stimulator (LATS) by anti- kappa and anti-lamba antisera J Clin Endocrinol Metab (1968) 281440ndash4 doi101210jcem-28-10-1440 6) Volpeacute R The immunologic basis of Gravesrsquos disease N Engl J Med (1972) 287463ndash4 doi101056NEJM197208312870910 7) McKenzie JM Review pathogenesis of Gravesrsquo disease role of the long-acting thyroid stimulator J Clin Endocrinol Metab (1965) 25424ndash31 8) Mehdi SQ Nussey SS A radio-ligand receptor assay for the long-acting thy- roid stimulator Inhibition by the long-acting thyroid stimulator of the binding of radioiodinated thyroid stimulating hormone to human thyroid membranes Biochem J (1975) 145105ndash11 doi101042bj1450105 9)Shewring G Rees Smith B An improved radioreceptor assay for TSH receptor antibodies Clin Endocrinol (1982) 17409ndash17 doi101111j1365-22651982 tb01607x 10)Southgate K Creagh FM Teece M Kingswood C Rees Smith B A receptor assay for the measurement of TSH receptor antibodies in unextracted serum Clin Endocrinol (1984) 20539ndash48 doi101111j1365-22651984tb00102x 11)Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003
FRTL-5 bull Souběžně s vyacutevojem radioligandovyacutech receptorovyacutech testů dochaacutezelo k vyacutevoji
bdquobiotestůldquo Změna v in vivo na in vitro jako je použitiacute primaacuterniacutech buněčnyacutech kultur 1)
bull Dalšiacute zlepšeniacute přišlo s použitiacutem FRTL-5 buněk ndash netransformovanyacutech buněčnyacutech liniiacute krysiacutech thyroid epithelial buněk v kontinuaacutelniacute kultuře 2) Test byl založen na schopnosti purifikovanyacutech IgG indukovat produkci cAMP Naacutesledně bylo umožněno využiacutet pacientskeacute seacutera 3)
bull Tento test nesloužil jen pro diagnostiku ale měl zaacutesadniacute vyacuteznam v pochopeniacute patfyz vlastnostiacute a-TSHr
bull Kohn etal 4)5)6) vyvinuli monoklonaacutelniacute protilaacutetku k hodnoceniacute jejiacutech funkčniacutech vlastnostiacute
bull Použitiacute buněk FRTL-5 takeacute umožnilo dalšiacute studium funkčniacute heterogenity a-TSHr (samostatneacute posouzeniacute uacutečinků jednotlivyacutech IgG na dvě odlišneacute buněčneacute aktivity aktivity produkce cAMP a buněčneacuteho růstu) 7)
1)Toccafondi RS Aterini S Medici MA Rotella CM Tanini A Zonefrati R Thyroid-stimulating antibody (TSAb) detected in sera of Gravesrsquo patients using human thyroid cell cultures Clin Exp Immunol (1980) 40532ndash9 2) Ambesi-Impiombato FS Parks LAM Coon HG Culture of hormone-depen- dent functional epithelial cells from rat thyroids Proc Natl Acad Sci U S A (1980) 773455ndash9 doi101073pnas7763455 3) Vitti P Chiovato L Lopez G Lombardi A Santini F Mammoli C et al Measurement of TSAb directly in serum using FRTL-5 cells J Endocrinol Invest (1988) 11313ndash7 doi101007BF03350157 4) Yavin E Yavin Z Schneider MD Kohn LD Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor implications for receptor structure and the action of autoantibodies in Gravesrsquo disease Proc Natl Acad Sci U S A (1981) 783180ndash4 doi101073pnas7853180 5) Valente WA Vitti P Yavin Z Yavin E Rotella CM Grollman EF et al Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor stimulating and blocking antibodies derived from the lymphocytes of patients with Gravesrsquo disease Proc Natl Acad Sci U S A (1982) 796680ndash4 doi101073pnas79216680 6) Valente WA Yavin Z Yavin E Grollman EF Schneider M Rotella CM et al Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor the identification of blocking and stimulating antibodies J Endocrinol Invest (1982) 5293ndash301 doi101007BF03350517 7) Valente WA Vitti P Rotella CM Vaughan MM Aloj SM Grollman EF et al Antibodies that promote thyroid growth A distinct population of thyroid-stimulating autoantibodies N Engl J Med (1983) 3091028ndash34 doi101056NEJM198310273091705
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 1
bull Hlavniacute průlom přišel s naklonovaacuteniacutem TSHr v r 1989 1-3) ndash využitiacute lidskeacuteho TSHr pro RIA i bioassays 45) ndash senzitivita 96 pro RIA
bull Pomociacute mutačniacutech technik byly připraveny chimerickeacute TSHr
bull V 90 leacutetech byly vyvinuty monoklonaacutelniacute protilaacutetky proti C-terminus region rh-TSHr 67)
1)Parmentier M Libert F Maenhaut C Lefort Gerard C Perret J Van Sande J et al Molecular cloning of the thyrotropin receptor Science (1989) 2461620ndash2 doi101126science2556796 2)Nagayama Y Kaufman KD Seto P Rapoport B Molecular cloning sequence and functional expression of the cDNA for the human thyrotropin receptor Biochem Biophys Res Commun (1989) 1651184ndash90 doi1010160006- 291X(89)92727-7 3) Akamizu T Ikuyama S Saji M Kosugi S Kozak C McBride OW et al Cloning chromosomal assignment and regulation of the rat thyrotropin receptor expression of the gene is regulated by thyrotropin agents that increase cAMP levels and thyroid autoantibodies Proc Natl Acad Sci U S A (1990) 875677ndash81 doi101073pnas87155677 4)Ludgate M Perret J Parmentier M Gerard C Libert F Dumont JE et al Use of recombinant human thyrotropin receptor (TSH-R) expressed in mammalian cell lines to assay TSH-R autoantibodies Mol Cell Endocrinol (1991) 73R13ndash8 doi1010160303-7207(90)90050-I 5) Filetti S Foti D Costante G Rapoport B Recombinant human thyrotropin (TSH) receptor in a radioreceptor assay for the measurement of TSH receptor autoantibodies J Clin Endocrinol Metab (1991) 721096ndash101 doi101210 jcem-72-5-1096 6) Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 7)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 2
bull Druhaacute generace imunotestů (ELISA) ndash solid-phase ndash se staly standardem pro dg a-TSHr diacuteky přesnosti (988 senzitivita a 996 specifita) a non-RIA 123)
bull Použitiacutem rh-TSHr nebo vepřovyacute TSHr ziacuteskaacuteme stejnou analytickou přesnost3)
1)Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 2)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071 3)Kamijo K TSH-receptor antibody measurement in patients with various thyrotoxicosis and Hashimotorsquos thyroiditis a comparison of two two-step assays coated plate ELISA using porcine TSH-receptor and coated tube radio- assay using human recombinant TSH-receptor Endocr J (2003) 50113ndash6 doi101507endocrj50113
Monoclonal a-TSHr stimulujiacuteciacute
bull Na přelomu mileacutenia byly studovaacuteny stimulujiacuteciacute protilaacutetky a-TSHr 123)
bull Tato data jsou zaacutesadniacute pro pochopeniacute vztahů struktury a funkciacute TSHRr a jejiacute role v patogenezi Gravesovy choroby
bull To vše vedlo k izolaci a charakterizaci lidskeacute monoklonaacutelniacute protilaacutetky a-TSHr stimulujiacuteciacute ndash M22 4)
1)Ando T Latif R Pritsker A Moran T Nagayama Y Davies TF A monoclonal thyroid-stimulating antibody J Clin Invest (2002) 1101667ndash74 doi101172 JCI0216991 2)Costagliola S Franssen JDF Bonomi M Urizar E Willnich M Bergmann A et al Generation of a mouse monoclonal TSH receptor antibody with stimu- lating activity Biochem Biophys Res Commun (2002) 299891ndash6 doi101016 S0006-291X(02)02762-6 3)Sanders J Jeffreys J Depraetere H Richards T Evans M Kiddie A et al Thyroid-stimulating monoclonal antibodies Thyroid (2002) 121043ndash50 doi101089105072502321085135 4) Sanders J Evans M Premawardhana LDKE Depraetere H Jeffreys J Richards T et al Human monoclonal stimulating autoantibody Lancet (2003) 362126ndash8 doi101016S0140-6736(03)13866-4
Třetiacute generace testů ndash M22
bull V r2004 byl vyvinut test použitiacutem M22 ve formaacutetu ELISA 1) senzitivita 974 a specifita 992 (např Medipan)
bull Test byl vhodnyacute i pro automatizaci 23)
bull Dostupnost a znalost jak stimulujiacuteciacutech tak blokujiacuteciacutech protilaacutetek byla důležitaacute k pochopeniacute krystalickeacute struktury TSHr a jejiacutech interakciacute s a-TSHr 4) poukaacutezalo to na širokeacute překryvy epitopů mezi stimulujiacuteciacutemi a blokujiacuteciacutemi protilaacutetkami 4)
bull Roche nativniacute vepřovyacute TSH s M22
1)Rees Smith B Bolton J Young S Collyer A Weeden A Bradbury J et al A new assay for thyrotropin receptor autoantibodies Thyroid (2004) 14830ndash5 doi1010891050725042451248 2) Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003 3) Zophel K Roggenbuck D von Landenberg P Wunderlich G Gruning T Kotzerke J et al TSH receptor antibody (TRAb) assays based on the human monoclonal autoantibody M22 are more sensitive than bovine TSH based assays Horm Metab Res (2010) 4265ndash9 doi101055s-0029-1241196 4) Furmaniak J Sanders J Nunez Miguel R Rees Smith B Mechanisms of action of TSHR autoantibodies Horm Metab Res (2015) 47735ndash52 doi10105 5s-0035-1559648
Mc4 bioassay
bull Souběžně s testy 3-generace Kohn vyvinul test využiacutevajiacuteciacute bdquoMc4 chimeacuteruldquo založenou na metodaacutech chemiluminiscence 1)
bull Ciacutelem bylo měřit pouze stimulujiacuteciacute protilaacutetky a tiacutem dosaacutehnout jasneacuteho cutoff mezi pacienty s GD a kontrolami
bull Porovnaacuteniacute senzitivity a specifity v tabulce 2) bull Mc4 testy mohou byacutet využity jako testy prvniacute
volby pro pacienty s GD
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Mc4 bioassay
bull Testy s M22 diacuteky podobně specifitě a senzitivitě ale lepšiacute bdquoproveditelnostildquo jsou zatiacutem preferovanějšiacute
bull Daacutele jsou lepšiacute pro prognoacutezu GD než testy s M22 a leacutepe korelujiacute s aktivitou a zaacutevažnostiacute GD orbitopatiiacute 2)
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Bridge Assay
bull Novaacute technologie využitiacute chimeacuterickyacutech receptorů Mc4 a N-terminaacutelniacute TSHr fůsovanyacute s alkalickou fosfataacutezou 1) senzitivita 998 a specifita 995
bull TSI ndash Siemens tato metoda je založena na sendvičoveacutem kompetetivniacute formaacutetu kteryacute se lišiacute od klasickeacuteho kompetetivniacute formaacutetu komerčniacutech IMA druheacute a třetiacute generace 2)
1)Frank CU Braeth S Dietrich JW Wanjura D Loos U Bridge technology with TSH receptor chimera for sensitive direct detection of TSH receptor antibodies causing Gravesrsquo disease analytical and clinical evaluation Horm Metab Res (2015) 47880ndash8 doi101055s-0035-1554662 2)Tozzoli R DrsquoAurizio F Villalta D Giovanella L (2017) Evalu- ation of the first fully automated immunoassay method for the measurement of stimulating TSH receptor autoantibodies in Gravesrsquo disease Clin Chem Lab Med 5558ndash64
Mezinaacuterodniacute standard
bull Prvniacute mezinaacuterodniacute standard připraven v r 1995 WHO označeniacute 90672 Připraven ECBS zdroj pacientskaacute plasma
bull V r 2006 nahrazen lidskou monoklonaacutelniacute protilaacutetkou M22 (NIBSC 08240) odkazuje na detekci S-TRAb 1)
1) Diana T1 Kanitz M Lehmann M Li Y Olivo PD Kahaly GJ Standardization of a bioassay for thyrotropin receptor stimulating autoantibodies Thyroid 2015 Feb25(2)169-75
EHK ndash SEKK AT217
EHK ndash SEKK AT217
SEKK - Dotazniacutek
EHK ndash SEKK AT113
EHK ndash SEKK AT113
Hashimotova tyreoiditida (HT)
bull HT 1) a SLE 2) byly prvniacute dvě autoimunitniacute onemocněniacute kde se prokaacutezala genetickaacute asociace (geny MHC třiacutedy II) 70 leacuteta
bull Nicmeacuteně nebyl nalezen gen kteryacute by spouštěl HT nalezeny pouze geny ktereacute přispiacutevajiacute k fenotypu onemocněniacute 3)
1)VladutiuAO RoseNR Autoimmunemurine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type Science 19711741137ndash9 2)Grumet FC Coukell A Bodmer JG Bodmer WF McDevitt HO Histocompatibility (HL-A) antigens associated with systemic lupus erythematosus A possible genetic predisposition to disease N Engl J Med 1971285193ndash6 3) Simmonds MJ Gough SC The search for the genetic contribution to autoimmune thyroid disease the never ending story Brief Funct Genomics 20111077ndash90
Hashimotova tyreoiditida
bull Do 50 let raritniacute onemocněniacute nyniacute nejběžnějšiacute s prevalenciacute 81000 biochemickyacute naacutelez + autoprotilaacutetky 461000
bull Ženymuži 81
a-TPO
bull Přiacutetomnost protilaacutetek TPOAb obvykle předchaacuteziacute vzniku tyreoidaacutelniacute dysfunkce
bull Patogenetickaacute role protilaacutetek TgAb zůstaacutevaacute nejasnaacute
a-TPO
bull Autoprotilaacutetky TPOAb byly nejdřiacuteve popsaacuteny jako antimikrozomaacutelniacute autoprotilaacutetky (AMA) neboť bylo zjištěno že reagujiacute s neupravenyacutemi membraacutenami tyreoidaacutelniacutech buněk
bull Mikrozomaacutelniacute antigen byl později popsaacuten jako TPO
bull Dřiacuteve se využiacutevaly ke stanoveniacute TPO metody imunofluorescenčniacute metody a aglutinačniacute testy s pasivniacutem barveniacutem erytrocytů
a-TPO jako rizikovyacute faktor
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TPO je znaacutemyacutem rizikovyacutem faktorem pro vznik tyreoidaacutelniacute dysfunkce pokud jsou pacienti leacutečeni lithiem amiodaronem interleukinem-2 nebo alfa-interferonem
a-TG
bull Tg vykazuje vysokou heterogenitu způsobenou rozdiacutely v posttranslačniacutech modifikaciacutech (glykosylace jodizace sulfatace atd) Během synteacutezy tyreoidaacutelniacuteho hormonu a jeho uvolněniacute je Tg polymerizovaacuten a degradovaacuten
bull Vlivem toho je imunologickaacute struktura Tg mimořaacutedně komplexniacute Charakteristika standardů pro Tg se může lišit v zaacutevislosti na vstupniacute lidskeacute tyreoidaacutelniacute tkaacuteni a použiteacutem purifikačniacutem procesu To vysvětluje proč jsou testy na TgAb a takeacute Tg tak obtiacutežně standardizovatelneacute
Titr protilaacutetek
bull Titr protilaacutetek literaacuterně koreluje s počtem autoreaktivniacutech lymfocytů ktereacute infiltrujiacute štiacutetnou žlaacutezu a sonografickyacutem obrazem 1)
bull a-TG nižšiacute senzitivita (60-80 u HT) a menšiacute specifita (pozitivniacute ve většiacute čaacutesti zdravyacutech kontrol) než a-TPO
bull a-TG a a-TPO představujiacute dva různeacute aspekty autoimunniacute odpovědi na štiacutetnou žlaacutezu a-TG by mohly odraacutežet počaacutetečniacute (vrozenyacute) typ imunitniacute odpovědi zatiacutemco a-TPO by mohly charakterizovat pozdějšiacute adaptivniacute imunitniacute odpovědi 2)
1)Pandit AA VijayWardeMMenon PS Correlation of number of intrathyroid lympho- cytes with antimicrosomal antibody titer in Hashimotos thyroiditis Diagn Cytopathol 20032863ndash5 2) Rose NR Autoimmune escalation through the crystal ball Clin Exp Immunol 20071479
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
Protilaacutetky - sledovaacuteniacute
bull Sledovaacuteniacute hladin TSAb přidaacutevaacute dalšiacute rozměr k hodnoceniacute aktivity GD s potenciaacutelem předpovědět recidivu nebo remisii u jednotlivyacutech pacientů
bull Vysokaacute perzistentniacute hladina TSAb je spojena s aktivniacutemi a zaacutevažnyacutemi systeacutemovyacutemi projevy a se špatnou odezvou na terapii Naopak niacutezkeacute hladiny TSAb jsou nachaacutezeny u pacientů v remisi
Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Diagnostika
bull a-TSHr lze měřit v podstatě dvěma typy testů
ndash Biologickyacutem testem (biotestem bioassay) ktereacute detekujiacute produkci cAMP v buněčnyacutech kulturaacutech inkubovanyacutech se seacuterami pacientů Tyto testy identifikujiacute pouze stimulačniacute a-TSHr Biotesty prokazujiacute nejen přiacutetomnost Ab ale takeacute jejich funkčniacute aktivitu a uacutečinnost Historicky sloužily biotesty k vyacutezkumu ke studiu patofyziologie GD
ndash Protilaacutetkoveacute testy (vazebneacute receptoroveacute) Naopak receptoroveacute metody rutinně použiacutevaneacute v klinickyacutech laboratořiacutech udaacutevajiacute pouze přiacutetomnost nebo nepřiacutetomnost a-TSHr a jejich koncentrace ale neuvaacutedějiacute jejich funkčniacute aktivitu 2)
bull Tento zaacutekladniacute rozdiacutel v uspořaacutedaacuteniacute metody vysvětluje proč biotesty a protilaacutetkoveacute testy vykazujiacute nižšiacute korelaci (r = 031 ndash 065) 1)
1)Gupta MK Thyrotropin-receptor antibodies in thyroid diseases advances in detection techniques and clinical application Clin Chem Acta 20002931-29 2) Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Biotesty
bull Biotesty mohou detekovat funkčniacute změny u heterogenniacutech a-TSHr
bull Skutečnost že heterogenniacute protilaacutetky a-TSHr mohou koexistovat u jednoho pacienta a měnit se v průběhu času je jedniacutem z důvodů proč bylo těžkeacute vyvinout diagnosticky přesneacute testy na stanoveniacute protilaacutetek a-TSHr
bull Biotesty mohou zlepšit peacuteči o pacienta ve smyslu bdquopersonalisovaneacute mediciacutenyldquo
bull Biotesty jsou nabiacutezeny referenčniacutemi laboratořeni je jistyacute předpoklady že by se mohly viacutece rozšiacuteřit
Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Biotesty
bull Během posledniacutech 60 let se biologickaacute analyacuteza a-TSHr vyvinula těžkopaacutednyacutech a časově naacuteročnyacutech postupů na geneticky upraveneacute testy založeneacute na buňkaacutech ktereacute jsou charakterizovaacuteny dobrou proveditelnostiacute a rychlyacutemi provozniacutemi časy a ktereacute jsou takeacute k dispozici jako komerčniacute sady
bull Komerčně dostupnyacute biotest je Thyretain fa Quidel kteryacute detekuje stimulačniacute aktivitu a-TSHr pomociacute chimeacuterickeacuteho TSHR a genu pro cAMP (signalizace luciferaacutezou) Je schvaacutelen FDA pro použitiacute v klinickyacutech laboratořiacutech
HISTORIE
Historickyacute vyacutevoj metod pro měřeniacute a-TSHr ndash dle Giuliani etal 2016
Cesidio Giuliani1 Motoyasu Saji2 Ines Bucci1 and Giorgio Napolitano Bioassays for TSH Receptor Autoantibodies from FRTL-5 Cells to TSH ReceptorndashLHCG Receptor Chimeras The Contribution of Leonard D Kohn Front Endocrinol (Lausanne) 2016 7 103
LATS
bull V r 1956 Adams a Purves zjistili že seacutera pacientů s tyreotoxikosou indukujiacute abnormaacutelniacute prodlouženou odpověď v TSH testu (s morčetem)1)2)
bull Nazvali jej ldquoabnormal thyroid stimulatorrdquo posleacuteze ldquolong-acting thyroid stimulatorrdquo (LATS) 2)3) bylo jasneacute že je odlišnyacute od TSH a neniacute produkovaacuten hypofyacutezou
bull V roce 1964 byla LATS identifikovaacutena jako protein podobnyacute protilaacutetkaacutem (4) a dalšiacute studie jednoznačně potvrdily že se jednaacute o IgG (56)
bull Prvniacute testy k detekci LATS měly niacutezkou senzitivitu (60-70) 7) bull Vyacuteznamneacute zlepšeniacute v testech nastalo v r 1975 a to s vyacutevojem
radioligandoveacuteho receptoroveacuteho testu Test hodnotil inhibici seacutera od pacientů s GD vaacutezaacutenyacutemi radioaktivně značeneacuteho TSH na lidskeacute tyroidniacute membraacuteny (8 Test byl nicmeacuteně staacutele zatiacutežen niacutezkou přesnostiacute
bull Dalšiacute zlepšeniacute přineslo nahrazeniacute tyroidaacutelniacute membraacuteny čaacutestečně vyčištěneacuteho TSHr - liquid phase first-generation immunoassay použiacutevanaacute dalšiacutech 20 let 910) specifita 99 senzitivita 80 11)
1)Adams DD Purves HD Abnormal responses in the assay of thyrotropin Proc Univ Otago Med Sch (1956) 3411ndash5 2)Adams DD The presence of an abnormal thyroid-stimulating hormone in the serum of some thyrotoxic patients J Clin Endocrinol Metab (1958) 18699ndash712 doi101210jcem-18-7-699 3) Adams DD Bioassay of long-acting thyroid stimulator (LATS) the dose-re- sponse relationship J Clin Endocrinol Metab (1961) 21799ndash805 4) Kriss JP Pleshakov V Chien JR Isolation and identification of the long-acting thyroid stimulator and its relation to hyperthyroidism and circumscribed pretibial myxedema J Clin Endocrinol Metab (1964) 241005ndash28 doi101210 jcem-24-10-1005 5) Kriss JP Inactivation of long-acting thyroid stimulator (LATS) by anti- kappa and anti-lamba antisera J Clin Endocrinol Metab (1968) 281440ndash4 doi101210jcem-28-10-1440 6) Volpeacute R The immunologic basis of Gravesrsquos disease N Engl J Med (1972) 287463ndash4 doi101056NEJM197208312870910 7) McKenzie JM Review pathogenesis of Gravesrsquo disease role of the long-acting thyroid stimulator J Clin Endocrinol Metab (1965) 25424ndash31 8) Mehdi SQ Nussey SS A radio-ligand receptor assay for the long-acting thy- roid stimulator Inhibition by the long-acting thyroid stimulator of the binding of radioiodinated thyroid stimulating hormone to human thyroid membranes Biochem J (1975) 145105ndash11 doi101042bj1450105 9)Shewring G Rees Smith B An improved radioreceptor assay for TSH receptor antibodies Clin Endocrinol (1982) 17409ndash17 doi101111j1365-22651982 tb01607x 10)Southgate K Creagh FM Teece M Kingswood C Rees Smith B A receptor assay for the measurement of TSH receptor antibodies in unextracted serum Clin Endocrinol (1984) 20539ndash48 doi101111j1365-22651984tb00102x 11)Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003
FRTL-5 bull Souběžně s vyacutevojem radioligandovyacutech receptorovyacutech testů dochaacutezelo k vyacutevoji
bdquobiotestůldquo Změna v in vivo na in vitro jako je použitiacute primaacuterniacutech buněčnyacutech kultur 1)
bull Dalšiacute zlepšeniacute přišlo s použitiacutem FRTL-5 buněk ndash netransformovanyacutech buněčnyacutech liniiacute krysiacutech thyroid epithelial buněk v kontinuaacutelniacute kultuře 2) Test byl založen na schopnosti purifikovanyacutech IgG indukovat produkci cAMP Naacutesledně bylo umožněno využiacutet pacientskeacute seacutera 3)
bull Tento test nesloužil jen pro diagnostiku ale měl zaacutesadniacute vyacuteznam v pochopeniacute patfyz vlastnostiacute a-TSHr
bull Kohn etal 4)5)6) vyvinuli monoklonaacutelniacute protilaacutetku k hodnoceniacute jejiacutech funkčniacutech vlastnostiacute
bull Použitiacute buněk FRTL-5 takeacute umožnilo dalšiacute studium funkčniacute heterogenity a-TSHr (samostatneacute posouzeniacute uacutečinků jednotlivyacutech IgG na dvě odlišneacute buněčneacute aktivity aktivity produkce cAMP a buněčneacuteho růstu) 7)
1)Toccafondi RS Aterini S Medici MA Rotella CM Tanini A Zonefrati R Thyroid-stimulating antibody (TSAb) detected in sera of Gravesrsquo patients using human thyroid cell cultures Clin Exp Immunol (1980) 40532ndash9 2) Ambesi-Impiombato FS Parks LAM Coon HG Culture of hormone-depen- dent functional epithelial cells from rat thyroids Proc Natl Acad Sci U S A (1980) 773455ndash9 doi101073pnas7763455 3) Vitti P Chiovato L Lopez G Lombardi A Santini F Mammoli C et al Measurement of TSAb directly in serum using FRTL-5 cells J Endocrinol Invest (1988) 11313ndash7 doi101007BF03350157 4) Yavin E Yavin Z Schneider MD Kohn LD Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor implications for receptor structure and the action of autoantibodies in Gravesrsquo disease Proc Natl Acad Sci U S A (1981) 783180ndash4 doi101073pnas7853180 5) Valente WA Vitti P Yavin Z Yavin E Rotella CM Grollman EF et al Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor stimulating and blocking antibodies derived from the lymphocytes of patients with Gravesrsquo disease Proc Natl Acad Sci U S A (1982) 796680ndash4 doi101073pnas79216680 6) Valente WA Yavin Z Yavin E Grollman EF Schneider M Rotella CM et al Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor the identification of blocking and stimulating antibodies J Endocrinol Invest (1982) 5293ndash301 doi101007BF03350517 7) Valente WA Vitti P Rotella CM Vaughan MM Aloj SM Grollman EF et al Antibodies that promote thyroid growth A distinct population of thyroid-stimulating autoantibodies N Engl J Med (1983) 3091028ndash34 doi101056NEJM198310273091705
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 1
bull Hlavniacute průlom přišel s naklonovaacuteniacutem TSHr v r 1989 1-3) ndash využitiacute lidskeacuteho TSHr pro RIA i bioassays 45) ndash senzitivita 96 pro RIA
bull Pomociacute mutačniacutech technik byly připraveny chimerickeacute TSHr
bull V 90 leacutetech byly vyvinuty monoklonaacutelniacute protilaacutetky proti C-terminus region rh-TSHr 67)
1)Parmentier M Libert F Maenhaut C Lefort Gerard C Perret J Van Sande J et al Molecular cloning of the thyrotropin receptor Science (1989) 2461620ndash2 doi101126science2556796 2)Nagayama Y Kaufman KD Seto P Rapoport B Molecular cloning sequence and functional expression of the cDNA for the human thyrotropin receptor Biochem Biophys Res Commun (1989) 1651184ndash90 doi1010160006- 291X(89)92727-7 3) Akamizu T Ikuyama S Saji M Kosugi S Kozak C McBride OW et al Cloning chromosomal assignment and regulation of the rat thyrotropin receptor expression of the gene is regulated by thyrotropin agents that increase cAMP levels and thyroid autoantibodies Proc Natl Acad Sci U S A (1990) 875677ndash81 doi101073pnas87155677 4)Ludgate M Perret J Parmentier M Gerard C Libert F Dumont JE et al Use of recombinant human thyrotropin receptor (TSH-R) expressed in mammalian cell lines to assay TSH-R autoantibodies Mol Cell Endocrinol (1991) 73R13ndash8 doi1010160303-7207(90)90050-I 5) Filetti S Foti D Costante G Rapoport B Recombinant human thyrotropin (TSH) receptor in a radioreceptor assay for the measurement of TSH receptor autoantibodies J Clin Endocrinol Metab (1991) 721096ndash101 doi101210 jcem-72-5-1096 6) Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 7)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 2
bull Druhaacute generace imunotestů (ELISA) ndash solid-phase ndash se staly standardem pro dg a-TSHr diacuteky přesnosti (988 senzitivita a 996 specifita) a non-RIA 123)
bull Použitiacutem rh-TSHr nebo vepřovyacute TSHr ziacuteskaacuteme stejnou analytickou přesnost3)
1)Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 2)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071 3)Kamijo K TSH-receptor antibody measurement in patients with various thyrotoxicosis and Hashimotorsquos thyroiditis a comparison of two two-step assays coated plate ELISA using porcine TSH-receptor and coated tube radio- assay using human recombinant TSH-receptor Endocr J (2003) 50113ndash6 doi101507endocrj50113
Monoclonal a-TSHr stimulujiacuteciacute
bull Na přelomu mileacutenia byly studovaacuteny stimulujiacuteciacute protilaacutetky a-TSHr 123)
bull Tato data jsou zaacutesadniacute pro pochopeniacute vztahů struktury a funkciacute TSHRr a jejiacute role v patogenezi Gravesovy choroby
bull To vše vedlo k izolaci a charakterizaci lidskeacute monoklonaacutelniacute protilaacutetky a-TSHr stimulujiacuteciacute ndash M22 4)
1)Ando T Latif R Pritsker A Moran T Nagayama Y Davies TF A monoclonal thyroid-stimulating antibody J Clin Invest (2002) 1101667ndash74 doi101172 JCI0216991 2)Costagliola S Franssen JDF Bonomi M Urizar E Willnich M Bergmann A et al Generation of a mouse monoclonal TSH receptor antibody with stimu- lating activity Biochem Biophys Res Commun (2002) 299891ndash6 doi101016 S0006-291X(02)02762-6 3)Sanders J Jeffreys J Depraetere H Richards T Evans M Kiddie A et al Thyroid-stimulating monoclonal antibodies Thyroid (2002) 121043ndash50 doi101089105072502321085135 4) Sanders J Evans M Premawardhana LDKE Depraetere H Jeffreys J Richards T et al Human monoclonal stimulating autoantibody Lancet (2003) 362126ndash8 doi101016S0140-6736(03)13866-4
Třetiacute generace testů ndash M22
bull V r2004 byl vyvinut test použitiacutem M22 ve formaacutetu ELISA 1) senzitivita 974 a specifita 992 (např Medipan)
bull Test byl vhodnyacute i pro automatizaci 23)
bull Dostupnost a znalost jak stimulujiacuteciacutech tak blokujiacuteciacutech protilaacutetek byla důležitaacute k pochopeniacute krystalickeacute struktury TSHr a jejiacutech interakciacute s a-TSHr 4) poukaacutezalo to na širokeacute překryvy epitopů mezi stimulujiacuteciacutemi a blokujiacuteciacutemi protilaacutetkami 4)
bull Roche nativniacute vepřovyacute TSH s M22
1)Rees Smith B Bolton J Young S Collyer A Weeden A Bradbury J et al A new assay for thyrotropin receptor autoantibodies Thyroid (2004) 14830ndash5 doi1010891050725042451248 2) Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003 3) Zophel K Roggenbuck D von Landenberg P Wunderlich G Gruning T Kotzerke J et al TSH receptor antibody (TRAb) assays based on the human monoclonal autoantibody M22 are more sensitive than bovine TSH based assays Horm Metab Res (2010) 4265ndash9 doi101055s-0029-1241196 4) Furmaniak J Sanders J Nunez Miguel R Rees Smith B Mechanisms of action of TSHR autoantibodies Horm Metab Res (2015) 47735ndash52 doi10105 5s-0035-1559648
Mc4 bioassay
bull Souběžně s testy 3-generace Kohn vyvinul test využiacutevajiacuteciacute bdquoMc4 chimeacuteruldquo založenou na metodaacutech chemiluminiscence 1)
bull Ciacutelem bylo měřit pouze stimulujiacuteciacute protilaacutetky a tiacutem dosaacutehnout jasneacuteho cutoff mezi pacienty s GD a kontrolami
bull Porovnaacuteniacute senzitivity a specifity v tabulce 2) bull Mc4 testy mohou byacutet využity jako testy prvniacute
volby pro pacienty s GD
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Mc4 bioassay
bull Testy s M22 diacuteky podobně specifitě a senzitivitě ale lepšiacute bdquoproveditelnostildquo jsou zatiacutem preferovanějšiacute
bull Daacutele jsou lepšiacute pro prognoacutezu GD než testy s M22 a leacutepe korelujiacute s aktivitou a zaacutevažnostiacute GD orbitopatiiacute 2)
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Bridge Assay
bull Novaacute technologie využitiacute chimeacuterickyacutech receptorů Mc4 a N-terminaacutelniacute TSHr fůsovanyacute s alkalickou fosfataacutezou 1) senzitivita 998 a specifita 995
bull TSI ndash Siemens tato metoda je založena na sendvičoveacutem kompetetivniacute formaacutetu kteryacute se lišiacute od klasickeacuteho kompetetivniacute formaacutetu komerčniacutech IMA druheacute a třetiacute generace 2)
1)Frank CU Braeth S Dietrich JW Wanjura D Loos U Bridge technology with TSH receptor chimera for sensitive direct detection of TSH receptor antibodies causing Gravesrsquo disease analytical and clinical evaluation Horm Metab Res (2015) 47880ndash8 doi101055s-0035-1554662 2)Tozzoli R DrsquoAurizio F Villalta D Giovanella L (2017) Evalu- ation of the first fully automated immunoassay method for the measurement of stimulating TSH receptor autoantibodies in Gravesrsquo disease Clin Chem Lab Med 5558ndash64
Mezinaacuterodniacute standard
bull Prvniacute mezinaacuterodniacute standard připraven v r 1995 WHO označeniacute 90672 Připraven ECBS zdroj pacientskaacute plasma
bull V r 2006 nahrazen lidskou monoklonaacutelniacute protilaacutetkou M22 (NIBSC 08240) odkazuje na detekci S-TRAb 1)
1) Diana T1 Kanitz M Lehmann M Li Y Olivo PD Kahaly GJ Standardization of a bioassay for thyrotropin receptor stimulating autoantibodies Thyroid 2015 Feb25(2)169-75
EHK ndash SEKK AT217
EHK ndash SEKK AT217
SEKK - Dotazniacutek
EHK ndash SEKK AT113
EHK ndash SEKK AT113
Hashimotova tyreoiditida (HT)
bull HT 1) a SLE 2) byly prvniacute dvě autoimunitniacute onemocněniacute kde se prokaacutezala genetickaacute asociace (geny MHC třiacutedy II) 70 leacuteta
bull Nicmeacuteně nebyl nalezen gen kteryacute by spouštěl HT nalezeny pouze geny ktereacute přispiacutevajiacute k fenotypu onemocněniacute 3)
1)VladutiuAO RoseNR Autoimmunemurine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type Science 19711741137ndash9 2)Grumet FC Coukell A Bodmer JG Bodmer WF McDevitt HO Histocompatibility (HL-A) antigens associated with systemic lupus erythematosus A possible genetic predisposition to disease N Engl J Med 1971285193ndash6 3) Simmonds MJ Gough SC The search for the genetic contribution to autoimmune thyroid disease the never ending story Brief Funct Genomics 20111077ndash90
Hashimotova tyreoiditida
bull Do 50 let raritniacute onemocněniacute nyniacute nejběžnějšiacute s prevalenciacute 81000 biochemickyacute naacutelez + autoprotilaacutetky 461000
bull Ženymuži 81
a-TPO
bull Přiacutetomnost protilaacutetek TPOAb obvykle předchaacuteziacute vzniku tyreoidaacutelniacute dysfunkce
bull Patogenetickaacute role protilaacutetek TgAb zůstaacutevaacute nejasnaacute
a-TPO
bull Autoprotilaacutetky TPOAb byly nejdřiacuteve popsaacuteny jako antimikrozomaacutelniacute autoprotilaacutetky (AMA) neboť bylo zjištěno že reagujiacute s neupravenyacutemi membraacutenami tyreoidaacutelniacutech buněk
bull Mikrozomaacutelniacute antigen byl později popsaacuten jako TPO
bull Dřiacuteve se využiacutevaly ke stanoveniacute TPO metody imunofluorescenčniacute metody a aglutinačniacute testy s pasivniacutem barveniacutem erytrocytů
a-TPO jako rizikovyacute faktor
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TPO je znaacutemyacutem rizikovyacutem faktorem pro vznik tyreoidaacutelniacute dysfunkce pokud jsou pacienti leacutečeni lithiem amiodaronem interleukinem-2 nebo alfa-interferonem
a-TG
bull Tg vykazuje vysokou heterogenitu způsobenou rozdiacutely v posttranslačniacutech modifikaciacutech (glykosylace jodizace sulfatace atd) Během synteacutezy tyreoidaacutelniacuteho hormonu a jeho uvolněniacute je Tg polymerizovaacuten a degradovaacuten
bull Vlivem toho je imunologickaacute struktura Tg mimořaacutedně komplexniacute Charakteristika standardů pro Tg se může lišit v zaacutevislosti na vstupniacute lidskeacute tyreoidaacutelniacute tkaacuteni a použiteacutem purifikačniacutem procesu To vysvětluje proč jsou testy na TgAb a takeacute Tg tak obtiacutežně standardizovatelneacute
Titr protilaacutetek
bull Titr protilaacutetek literaacuterně koreluje s počtem autoreaktivniacutech lymfocytů ktereacute infiltrujiacute štiacutetnou žlaacutezu a sonografickyacutem obrazem 1)
bull a-TG nižšiacute senzitivita (60-80 u HT) a menšiacute specifita (pozitivniacute ve většiacute čaacutesti zdravyacutech kontrol) než a-TPO
bull a-TG a a-TPO představujiacute dva různeacute aspekty autoimunniacute odpovědi na štiacutetnou žlaacutezu a-TG by mohly odraacutežet počaacutetečniacute (vrozenyacute) typ imunitniacute odpovědi zatiacutemco a-TPO by mohly charakterizovat pozdějšiacute adaptivniacute imunitniacute odpovědi 2)
1)Pandit AA VijayWardeMMenon PS Correlation of number of intrathyroid lympho- cytes with antimicrosomal antibody titer in Hashimotos thyroiditis Diagn Cytopathol 20032863ndash5 2) Rose NR Autoimmune escalation through the crystal ball Clin Exp Immunol 20071479
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
Diagnostika
bull a-TSHr lze měřit v podstatě dvěma typy testů
ndash Biologickyacutem testem (biotestem bioassay) ktereacute detekujiacute produkci cAMP v buněčnyacutech kulturaacutech inkubovanyacutech se seacuterami pacientů Tyto testy identifikujiacute pouze stimulačniacute a-TSHr Biotesty prokazujiacute nejen přiacutetomnost Ab ale takeacute jejich funkčniacute aktivitu a uacutečinnost Historicky sloužily biotesty k vyacutezkumu ke studiu patofyziologie GD
ndash Protilaacutetkoveacute testy (vazebneacute receptoroveacute) Naopak receptoroveacute metody rutinně použiacutevaneacute v klinickyacutech laboratořiacutech udaacutevajiacute pouze přiacutetomnost nebo nepřiacutetomnost a-TSHr a jejich koncentrace ale neuvaacutedějiacute jejich funkčniacute aktivitu 2)
bull Tento zaacutekladniacute rozdiacutel v uspořaacutedaacuteniacute metody vysvětluje proč biotesty a protilaacutetkoveacute testy vykazujiacute nižšiacute korelaci (r = 031 ndash 065) 1)
1)Gupta MK Thyrotropin-receptor antibodies in thyroid diseases advances in detection techniques and clinical application Clin Chem Acta 20002931-29 2) Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Biotesty
bull Biotesty mohou detekovat funkčniacute změny u heterogenniacutech a-TSHr
bull Skutečnost že heterogenniacute protilaacutetky a-TSHr mohou koexistovat u jednoho pacienta a měnit se v průběhu času je jedniacutem z důvodů proč bylo těžkeacute vyvinout diagnosticky přesneacute testy na stanoveniacute protilaacutetek a-TSHr
bull Biotesty mohou zlepšit peacuteči o pacienta ve smyslu bdquopersonalisovaneacute mediciacutenyldquo
bull Biotesty jsou nabiacutezeny referenčniacutemi laboratořeni je jistyacute předpoklady že by se mohly viacutece rozšiacuteřit
Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Biotesty
bull Během posledniacutech 60 let se biologickaacute analyacuteza a-TSHr vyvinula těžkopaacutednyacutech a časově naacuteročnyacutech postupů na geneticky upraveneacute testy založeneacute na buňkaacutech ktereacute jsou charakterizovaacuteny dobrou proveditelnostiacute a rychlyacutemi provozniacutemi časy a ktereacute jsou takeacute k dispozici jako komerčniacute sady
bull Komerčně dostupnyacute biotest je Thyretain fa Quidel kteryacute detekuje stimulačniacute aktivitu a-TSHr pomociacute chimeacuterickeacuteho TSHR a genu pro cAMP (signalizace luciferaacutezou) Je schvaacutelen FDA pro použitiacute v klinickyacutech laboratořiacutech
HISTORIE
Historickyacute vyacutevoj metod pro měřeniacute a-TSHr ndash dle Giuliani etal 2016
Cesidio Giuliani1 Motoyasu Saji2 Ines Bucci1 and Giorgio Napolitano Bioassays for TSH Receptor Autoantibodies from FRTL-5 Cells to TSH ReceptorndashLHCG Receptor Chimeras The Contribution of Leonard D Kohn Front Endocrinol (Lausanne) 2016 7 103
LATS
bull V r 1956 Adams a Purves zjistili že seacutera pacientů s tyreotoxikosou indukujiacute abnormaacutelniacute prodlouženou odpověď v TSH testu (s morčetem)1)2)
bull Nazvali jej ldquoabnormal thyroid stimulatorrdquo posleacuteze ldquolong-acting thyroid stimulatorrdquo (LATS) 2)3) bylo jasneacute že je odlišnyacute od TSH a neniacute produkovaacuten hypofyacutezou
bull V roce 1964 byla LATS identifikovaacutena jako protein podobnyacute protilaacutetkaacutem (4) a dalšiacute studie jednoznačně potvrdily že se jednaacute o IgG (56)
bull Prvniacute testy k detekci LATS měly niacutezkou senzitivitu (60-70) 7) bull Vyacuteznamneacute zlepšeniacute v testech nastalo v r 1975 a to s vyacutevojem
radioligandoveacuteho receptoroveacuteho testu Test hodnotil inhibici seacutera od pacientů s GD vaacutezaacutenyacutemi radioaktivně značeneacuteho TSH na lidskeacute tyroidniacute membraacuteny (8 Test byl nicmeacuteně staacutele zatiacutežen niacutezkou přesnostiacute
bull Dalšiacute zlepšeniacute přineslo nahrazeniacute tyroidaacutelniacute membraacuteny čaacutestečně vyčištěneacuteho TSHr - liquid phase first-generation immunoassay použiacutevanaacute dalšiacutech 20 let 910) specifita 99 senzitivita 80 11)
1)Adams DD Purves HD Abnormal responses in the assay of thyrotropin Proc Univ Otago Med Sch (1956) 3411ndash5 2)Adams DD The presence of an abnormal thyroid-stimulating hormone in the serum of some thyrotoxic patients J Clin Endocrinol Metab (1958) 18699ndash712 doi101210jcem-18-7-699 3) Adams DD Bioassay of long-acting thyroid stimulator (LATS) the dose-re- sponse relationship J Clin Endocrinol Metab (1961) 21799ndash805 4) Kriss JP Pleshakov V Chien JR Isolation and identification of the long-acting thyroid stimulator and its relation to hyperthyroidism and circumscribed pretibial myxedema J Clin Endocrinol Metab (1964) 241005ndash28 doi101210 jcem-24-10-1005 5) Kriss JP Inactivation of long-acting thyroid stimulator (LATS) by anti- kappa and anti-lamba antisera J Clin Endocrinol Metab (1968) 281440ndash4 doi101210jcem-28-10-1440 6) Volpeacute R The immunologic basis of Gravesrsquos disease N Engl J Med (1972) 287463ndash4 doi101056NEJM197208312870910 7) McKenzie JM Review pathogenesis of Gravesrsquo disease role of the long-acting thyroid stimulator J Clin Endocrinol Metab (1965) 25424ndash31 8) Mehdi SQ Nussey SS A radio-ligand receptor assay for the long-acting thy- roid stimulator Inhibition by the long-acting thyroid stimulator of the binding of radioiodinated thyroid stimulating hormone to human thyroid membranes Biochem J (1975) 145105ndash11 doi101042bj1450105 9)Shewring G Rees Smith B An improved radioreceptor assay for TSH receptor antibodies Clin Endocrinol (1982) 17409ndash17 doi101111j1365-22651982 tb01607x 10)Southgate K Creagh FM Teece M Kingswood C Rees Smith B A receptor assay for the measurement of TSH receptor antibodies in unextracted serum Clin Endocrinol (1984) 20539ndash48 doi101111j1365-22651984tb00102x 11)Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003
FRTL-5 bull Souběžně s vyacutevojem radioligandovyacutech receptorovyacutech testů dochaacutezelo k vyacutevoji
bdquobiotestůldquo Změna v in vivo na in vitro jako je použitiacute primaacuterniacutech buněčnyacutech kultur 1)
bull Dalšiacute zlepšeniacute přišlo s použitiacutem FRTL-5 buněk ndash netransformovanyacutech buněčnyacutech liniiacute krysiacutech thyroid epithelial buněk v kontinuaacutelniacute kultuře 2) Test byl založen na schopnosti purifikovanyacutech IgG indukovat produkci cAMP Naacutesledně bylo umožněno využiacutet pacientskeacute seacutera 3)
bull Tento test nesloužil jen pro diagnostiku ale měl zaacutesadniacute vyacuteznam v pochopeniacute patfyz vlastnostiacute a-TSHr
bull Kohn etal 4)5)6) vyvinuli monoklonaacutelniacute protilaacutetku k hodnoceniacute jejiacutech funkčniacutech vlastnostiacute
bull Použitiacute buněk FRTL-5 takeacute umožnilo dalšiacute studium funkčniacute heterogenity a-TSHr (samostatneacute posouzeniacute uacutečinků jednotlivyacutech IgG na dvě odlišneacute buněčneacute aktivity aktivity produkce cAMP a buněčneacuteho růstu) 7)
1)Toccafondi RS Aterini S Medici MA Rotella CM Tanini A Zonefrati R Thyroid-stimulating antibody (TSAb) detected in sera of Gravesrsquo patients using human thyroid cell cultures Clin Exp Immunol (1980) 40532ndash9 2) Ambesi-Impiombato FS Parks LAM Coon HG Culture of hormone-depen- dent functional epithelial cells from rat thyroids Proc Natl Acad Sci U S A (1980) 773455ndash9 doi101073pnas7763455 3) Vitti P Chiovato L Lopez G Lombardi A Santini F Mammoli C et al Measurement of TSAb directly in serum using FRTL-5 cells J Endocrinol Invest (1988) 11313ndash7 doi101007BF03350157 4) Yavin E Yavin Z Schneider MD Kohn LD Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor implications for receptor structure and the action of autoantibodies in Gravesrsquo disease Proc Natl Acad Sci U S A (1981) 783180ndash4 doi101073pnas7853180 5) Valente WA Vitti P Yavin Z Yavin E Rotella CM Grollman EF et al Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor stimulating and blocking antibodies derived from the lymphocytes of patients with Gravesrsquo disease Proc Natl Acad Sci U S A (1982) 796680ndash4 doi101073pnas79216680 6) Valente WA Yavin Z Yavin E Grollman EF Schneider M Rotella CM et al Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor the identification of blocking and stimulating antibodies J Endocrinol Invest (1982) 5293ndash301 doi101007BF03350517 7) Valente WA Vitti P Rotella CM Vaughan MM Aloj SM Grollman EF et al Antibodies that promote thyroid growth A distinct population of thyroid-stimulating autoantibodies N Engl J Med (1983) 3091028ndash34 doi101056NEJM198310273091705
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 1
bull Hlavniacute průlom přišel s naklonovaacuteniacutem TSHr v r 1989 1-3) ndash využitiacute lidskeacuteho TSHr pro RIA i bioassays 45) ndash senzitivita 96 pro RIA
bull Pomociacute mutačniacutech technik byly připraveny chimerickeacute TSHr
bull V 90 leacutetech byly vyvinuty monoklonaacutelniacute protilaacutetky proti C-terminus region rh-TSHr 67)
1)Parmentier M Libert F Maenhaut C Lefort Gerard C Perret J Van Sande J et al Molecular cloning of the thyrotropin receptor Science (1989) 2461620ndash2 doi101126science2556796 2)Nagayama Y Kaufman KD Seto P Rapoport B Molecular cloning sequence and functional expression of the cDNA for the human thyrotropin receptor Biochem Biophys Res Commun (1989) 1651184ndash90 doi1010160006- 291X(89)92727-7 3) Akamizu T Ikuyama S Saji M Kosugi S Kozak C McBride OW et al Cloning chromosomal assignment and regulation of the rat thyrotropin receptor expression of the gene is regulated by thyrotropin agents that increase cAMP levels and thyroid autoantibodies Proc Natl Acad Sci U S A (1990) 875677ndash81 doi101073pnas87155677 4)Ludgate M Perret J Parmentier M Gerard C Libert F Dumont JE et al Use of recombinant human thyrotropin receptor (TSH-R) expressed in mammalian cell lines to assay TSH-R autoantibodies Mol Cell Endocrinol (1991) 73R13ndash8 doi1010160303-7207(90)90050-I 5) Filetti S Foti D Costante G Rapoport B Recombinant human thyrotropin (TSH) receptor in a radioreceptor assay for the measurement of TSH receptor autoantibodies J Clin Endocrinol Metab (1991) 721096ndash101 doi101210 jcem-72-5-1096 6) Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 7)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 2
bull Druhaacute generace imunotestů (ELISA) ndash solid-phase ndash se staly standardem pro dg a-TSHr diacuteky přesnosti (988 senzitivita a 996 specifita) a non-RIA 123)
bull Použitiacutem rh-TSHr nebo vepřovyacute TSHr ziacuteskaacuteme stejnou analytickou přesnost3)
1)Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 2)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071 3)Kamijo K TSH-receptor antibody measurement in patients with various thyrotoxicosis and Hashimotorsquos thyroiditis a comparison of two two-step assays coated plate ELISA using porcine TSH-receptor and coated tube radio- assay using human recombinant TSH-receptor Endocr J (2003) 50113ndash6 doi101507endocrj50113
Monoclonal a-TSHr stimulujiacuteciacute
bull Na přelomu mileacutenia byly studovaacuteny stimulujiacuteciacute protilaacutetky a-TSHr 123)
bull Tato data jsou zaacutesadniacute pro pochopeniacute vztahů struktury a funkciacute TSHRr a jejiacute role v patogenezi Gravesovy choroby
bull To vše vedlo k izolaci a charakterizaci lidskeacute monoklonaacutelniacute protilaacutetky a-TSHr stimulujiacuteciacute ndash M22 4)
1)Ando T Latif R Pritsker A Moran T Nagayama Y Davies TF A monoclonal thyroid-stimulating antibody J Clin Invest (2002) 1101667ndash74 doi101172 JCI0216991 2)Costagliola S Franssen JDF Bonomi M Urizar E Willnich M Bergmann A et al Generation of a mouse monoclonal TSH receptor antibody with stimu- lating activity Biochem Biophys Res Commun (2002) 299891ndash6 doi101016 S0006-291X(02)02762-6 3)Sanders J Jeffreys J Depraetere H Richards T Evans M Kiddie A et al Thyroid-stimulating monoclonal antibodies Thyroid (2002) 121043ndash50 doi101089105072502321085135 4) Sanders J Evans M Premawardhana LDKE Depraetere H Jeffreys J Richards T et al Human monoclonal stimulating autoantibody Lancet (2003) 362126ndash8 doi101016S0140-6736(03)13866-4
Třetiacute generace testů ndash M22
bull V r2004 byl vyvinut test použitiacutem M22 ve formaacutetu ELISA 1) senzitivita 974 a specifita 992 (např Medipan)
bull Test byl vhodnyacute i pro automatizaci 23)
bull Dostupnost a znalost jak stimulujiacuteciacutech tak blokujiacuteciacutech protilaacutetek byla důležitaacute k pochopeniacute krystalickeacute struktury TSHr a jejiacutech interakciacute s a-TSHr 4) poukaacutezalo to na širokeacute překryvy epitopů mezi stimulujiacuteciacutemi a blokujiacuteciacutemi protilaacutetkami 4)
bull Roche nativniacute vepřovyacute TSH s M22
1)Rees Smith B Bolton J Young S Collyer A Weeden A Bradbury J et al A new assay for thyrotropin receptor autoantibodies Thyroid (2004) 14830ndash5 doi1010891050725042451248 2) Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003 3) Zophel K Roggenbuck D von Landenberg P Wunderlich G Gruning T Kotzerke J et al TSH receptor antibody (TRAb) assays based on the human monoclonal autoantibody M22 are more sensitive than bovine TSH based assays Horm Metab Res (2010) 4265ndash9 doi101055s-0029-1241196 4) Furmaniak J Sanders J Nunez Miguel R Rees Smith B Mechanisms of action of TSHR autoantibodies Horm Metab Res (2015) 47735ndash52 doi10105 5s-0035-1559648
Mc4 bioassay
bull Souběžně s testy 3-generace Kohn vyvinul test využiacutevajiacuteciacute bdquoMc4 chimeacuteruldquo založenou na metodaacutech chemiluminiscence 1)
bull Ciacutelem bylo měřit pouze stimulujiacuteciacute protilaacutetky a tiacutem dosaacutehnout jasneacuteho cutoff mezi pacienty s GD a kontrolami
bull Porovnaacuteniacute senzitivity a specifity v tabulce 2) bull Mc4 testy mohou byacutet využity jako testy prvniacute
volby pro pacienty s GD
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Mc4 bioassay
bull Testy s M22 diacuteky podobně specifitě a senzitivitě ale lepšiacute bdquoproveditelnostildquo jsou zatiacutem preferovanějšiacute
bull Daacutele jsou lepšiacute pro prognoacutezu GD než testy s M22 a leacutepe korelujiacute s aktivitou a zaacutevažnostiacute GD orbitopatiiacute 2)
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Bridge Assay
bull Novaacute technologie využitiacute chimeacuterickyacutech receptorů Mc4 a N-terminaacutelniacute TSHr fůsovanyacute s alkalickou fosfataacutezou 1) senzitivita 998 a specifita 995
bull TSI ndash Siemens tato metoda je založena na sendvičoveacutem kompetetivniacute formaacutetu kteryacute se lišiacute od klasickeacuteho kompetetivniacute formaacutetu komerčniacutech IMA druheacute a třetiacute generace 2)
1)Frank CU Braeth S Dietrich JW Wanjura D Loos U Bridge technology with TSH receptor chimera for sensitive direct detection of TSH receptor antibodies causing Gravesrsquo disease analytical and clinical evaluation Horm Metab Res (2015) 47880ndash8 doi101055s-0035-1554662 2)Tozzoli R DrsquoAurizio F Villalta D Giovanella L (2017) Evalu- ation of the first fully automated immunoassay method for the measurement of stimulating TSH receptor autoantibodies in Gravesrsquo disease Clin Chem Lab Med 5558ndash64
Mezinaacuterodniacute standard
bull Prvniacute mezinaacuterodniacute standard připraven v r 1995 WHO označeniacute 90672 Připraven ECBS zdroj pacientskaacute plasma
bull V r 2006 nahrazen lidskou monoklonaacutelniacute protilaacutetkou M22 (NIBSC 08240) odkazuje na detekci S-TRAb 1)
1) Diana T1 Kanitz M Lehmann M Li Y Olivo PD Kahaly GJ Standardization of a bioassay for thyrotropin receptor stimulating autoantibodies Thyroid 2015 Feb25(2)169-75
EHK ndash SEKK AT217
EHK ndash SEKK AT217
SEKK - Dotazniacutek
EHK ndash SEKK AT113
EHK ndash SEKK AT113
Hashimotova tyreoiditida (HT)
bull HT 1) a SLE 2) byly prvniacute dvě autoimunitniacute onemocněniacute kde se prokaacutezala genetickaacute asociace (geny MHC třiacutedy II) 70 leacuteta
bull Nicmeacuteně nebyl nalezen gen kteryacute by spouštěl HT nalezeny pouze geny ktereacute přispiacutevajiacute k fenotypu onemocněniacute 3)
1)VladutiuAO RoseNR Autoimmunemurine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type Science 19711741137ndash9 2)Grumet FC Coukell A Bodmer JG Bodmer WF McDevitt HO Histocompatibility (HL-A) antigens associated with systemic lupus erythematosus A possible genetic predisposition to disease N Engl J Med 1971285193ndash6 3) Simmonds MJ Gough SC The search for the genetic contribution to autoimmune thyroid disease the never ending story Brief Funct Genomics 20111077ndash90
Hashimotova tyreoiditida
bull Do 50 let raritniacute onemocněniacute nyniacute nejběžnějšiacute s prevalenciacute 81000 biochemickyacute naacutelez + autoprotilaacutetky 461000
bull Ženymuži 81
a-TPO
bull Přiacutetomnost protilaacutetek TPOAb obvykle předchaacuteziacute vzniku tyreoidaacutelniacute dysfunkce
bull Patogenetickaacute role protilaacutetek TgAb zůstaacutevaacute nejasnaacute
a-TPO
bull Autoprotilaacutetky TPOAb byly nejdřiacuteve popsaacuteny jako antimikrozomaacutelniacute autoprotilaacutetky (AMA) neboť bylo zjištěno že reagujiacute s neupravenyacutemi membraacutenami tyreoidaacutelniacutech buněk
bull Mikrozomaacutelniacute antigen byl později popsaacuten jako TPO
bull Dřiacuteve se využiacutevaly ke stanoveniacute TPO metody imunofluorescenčniacute metody a aglutinačniacute testy s pasivniacutem barveniacutem erytrocytů
a-TPO jako rizikovyacute faktor
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TPO je znaacutemyacutem rizikovyacutem faktorem pro vznik tyreoidaacutelniacute dysfunkce pokud jsou pacienti leacutečeni lithiem amiodaronem interleukinem-2 nebo alfa-interferonem
a-TG
bull Tg vykazuje vysokou heterogenitu způsobenou rozdiacutely v posttranslačniacutech modifikaciacutech (glykosylace jodizace sulfatace atd) Během synteacutezy tyreoidaacutelniacuteho hormonu a jeho uvolněniacute je Tg polymerizovaacuten a degradovaacuten
bull Vlivem toho je imunologickaacute struktura Tg mimořaacutedně komplexniacute Charakteristika standardů pro Tg se může lišit v zaacutevislosti na vstupniacute lidskeacute tyreoidaacutelniacute tkaacuteni a použiteacutem purifikačniacutem procesu To vysvětluje proč jsou testy na TgAb a takeacute Tg tak obtiacutežně standardizovatelneacute
Titr protilaacutetek
bull Titr protilaacutetek literaacuterně koreluje s počtem autoreaktivniacutech lymfocytů ktereacute infiltrujiacute štiacutetnou žlaacutezu a sonografickyacutem obrazem 1)
bull a-TG nižšiacute senzitivita (60-80 u HT) a menšiacute specifita (pozitivniacute ve většiacute čaacutesti zdravyacutech kontrol) než a-TPO
bull a-TG a a-TPO představujiacute dva různeacute aspekty autoimunniacute odpovědi na štiacutetnou žlaacutezu a-TG by mohly odraacutežet počaacutetečniacute (vrozenyacute) typ imunitniacute odpovědi zatiacutemco a-TPO by mohly charakterizovat pozdějšiacute adaptivniacute imunitniacute odpovědi 2)
1)Pandit AA VijayWardeMMenon PS Correlation of number of intrathyroid lympho- cytes with antimicrosomal antibody titer in Hashimotos thyroiditis Diagn Cytopathol 20032863ndash5 2) Rose NR Autoimmune escalation through the crystal ball Clin Exp Immunol 20071479
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
Biotesty
bull Biotesty mohou detekovat funkčniacute změny u heterogenniacutech a-TSHr
bull Skutečnost že heterogenniacute protilaacutetky a-TSHr mohou koexistovat u jednoho pacienta a měnit se v průběhu času je jedniacutem z důvodů proč bylo těžkeacute vyvinout diagnosticky přesneacute testy na stanoveniacute protilaacutetek a-TSHr
bull Biotesty mohou zlepšit peacuteči o pacienta ve smyslu bdquopersonalisovaneacute mediciacutenyldquo
bull Biotesty jsou nabiacutezeny referenčniacutemi laboratořeni je jistyacute předpoklady že by se mohly viacutece rozšiacuteřit
Kahaly GJ Bioassays for TSH receptor antibodies quo Vadis Eur Thyroid J 201543ndash5 doi 101159000375445
Biotesty
bull Během posledniacutech 60 let se biologickaacute analyacuteza a-TSHr vyvinula těžkopaacutednyacutech a časově naacuteročnyacutech postupů na geneticky upraveneacute testy založeneacute na buňkaacutech ktereacute jsou charakterizovaacuteny dobrou proveditelnostiacute a rychlyacutemi provozniacutemi časy a ktereacute jsou takeacute k dispozici jako komerčniacute sady
bull Komerčně dostupnyacute biotest je Thyretain fa Quidel kteryacute detekuje stimulačniacute aktivitu a-TSHr pomociacute chimeacuterickeacuteho TSHR a genu pro cAMP (signalizace luciferaacutezou) Je schvaacutelen FDA pro použitiacute v klinickyacutech laboratořiacutech
HISTORIE
Historickyacute vyacutevoj metod pro měřeniacute a-TSHr ndash dle Giuliani etal 2016
Cesidio Giuliani1 Motoyasu Saji2 Ines Bucci1 and Giorgio Napolitano Bioassays for TSH Receptor Autoantibodies from FRTL-5 Cells to TSH ReceptorndashLHCG Receptor Chimeras The Contribution of Leonard D Kohn Front Endocrinol (Lausanne) 2016 7 103
LATS
bull V r 1956 Adams a Purves zjistili že seacutera pacientů s tyreotoxikosou indukujiacute abnormaacutelniacute prodlouženou odpověď v TSH testu (s morčetem)1)2)
bull Nazvali jej ldquoabnormal thyroid stimulatorrdquo posleacuteze ldquolong-acting thyroid stimulatorrdquo (LATS) 2)3) bylo jasneacute že je odlišnyacute od TSH a neniacute produkovaacuten hypofyacutezou
bull V roce 1964 byla LATS identifikovaacutena jako protein podobnyacute protilaacutetkaacutem (4) a dalšiacute studie jednoznačně potvrdily že se jednaacute o IgG (56)
bull Prvniacute testy k detekci LATS měly niacutezkou senzitivitu (60-70) 7) bull Vyacuteznamneacute zlepšeniacute v testech nastalo v r 1975 a to s vyacutevojem
radioligandoveacuteho receptoroveacuteho testu Test hodnotil inhibici seacutera od pacientů s GD vaacutezaacutenyacutemi radioaktivně značeneacuteho TSH na lidskeacute tyroidniacute membraacuteny (8 Test byl nicmeacuteně staacutele zatiacutežen niacutezkou přesnostiacute
bull Dalšiacute zlepšeniacute přineslo nahrazeniacute tyroidaacutelniacute membraacuteny čaacutestečně vyčištěneacuteho TSHr - liquid phase first-generation immunoassay použiacutevanaacute dalšiacutech 20 let 910) specifita 99 senzitivita 80 11)
1)Adams DD Purves HD Abnormal responses in the assay of thyrotropin Proc Univ Otago Med Sch (1956) 3411ndash5 2)Adams DD The presence of an abnormal thyroid-stimulating hormone in the serum of some thyrotoxic patients J Clin Endocrinol Metab (1958) 18699ndash712 doi101210jcem-18-7-699 3) Adams DD Bioassay of long-acting thyroid stimulator (LATS) the dose-re- sponse relationship J Clin Endocrinol Metab (1961) 21799ndash805 4) Kriss JP Pleshakov V Chien JR Isolation and identification of the long-acting thyroid stimulator and its relation to hyperthyroidism and circumscribed pretibial myxedema J Clin Endocrinol Metab (1964) 241005ndash28 doi101210 jcem-24-10-1005 5) Kriss JP Inactivation of long-acting thyroid stimulator (LATS) by anti- kappa and anti-lamba antisera J Clin Endocrinol Metab (1968) 281440ndash4 doi101210jcem-28-10-1440 6) Volpeacute R The immunologic basis of Gravesrsquos disease N Engl J Med (1972) 287463ndash4 doi101056NEJM197208312870910 7) McKenzie JM Review pathogenesis of Gravesrsquo disease role of the long-acting thyroid stimulator J Clin Endocrinol Metab (1965) 25424ndash31 8) Mehdi SQ Nussey SS A radio-ligand receptor assay for the long-acting thy- roid stimulator Inhibition by the long-acting thyroid stimulator of the binding of radioiodinated thyroid stimulating hormone to human thyroid membranes Biochem J (1975) 145105ndash11 doi101042bj1450105 9)Shewring G Rees Smith B An improved radioreceptor assay for TSH receptor antibodies Clin Endocrinol (1982) 17409ndash17 doi101111j1365-22651982 tb01607x 10)Southgate K Creagh FM Teece M Kingswood C Rees Smith B A receptor assay for the measurement of TSH receptor antibodies in unextracted serum Clin Endocrinol (1984) 20539ndash48 doi101111j1365-22651984tb00102x 11)Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003
FRTL-5 bull Souběžně s vyacutevojem radioligandovyacutech receptorovyacutech testů dochaacutezelo k vyacutevoji
bdquobiotestůldquo Změna v in vivo na in vitro jako je použitiacute primaacuterniacutech buněčnyacutech kultur 1)
bull Dalšiacute zlepšeniacute přišlo s použitiacutem FRTL-5 buněk ndash netransformovanyacutech buněčnyacutech liniiacute krysiacutech thyroid epithelial buněk v kontinuaacutelniacute kultuře 2) Test byl založen na schopnosti purifikovanyacutech IgG indukovat produkci cAMP Naacutesledně bylo umožněno využiacutet pacientskeacute seacutera 3)
bull Tento test nesloužil jen pro diagnostiku ale měl zaacutesadniacute vyacuteznam v pochopeniacute patfyz vlastnostiacute a-TSHr
bull Kohn etal 4)5)6) vyvinuli monoklonaacutelniacute protilaacutetku k hodnoceniacute jejiacutech funkčniacutech vlastnostiacute
bull Použitiacute buněk FRTL-5 takeacute umožnilo dalšiacute studium funkčniacute heterogenity a-TSHr (samostatneacute posouzeniacute uacutečinků jednotlivyacutech IgG na dvě odlišneacute buněčneacute aktivity aktivity produkce cAMP a buněčneacuteho růstu) 7)
1)Toccafondi RS Aterini S Medici MA Rotella CM Tanini A Zonefrati R Thyroid-stimulating antibody (TSAb) detected in sera of Gravesrsquo patients using human thyroid cell cultures Clin Exp Immunol (1980) 40532ndash9 2) Ambesi-Impiombato FS Parks LAM Coon HG Culture of hormone-depen- dent functional epithelial cells from rat thyroids Proc Natl Acad Sci U S A (1980) 773455ndash9 doi101073pnas7763455 3) Vitti P Chiovato L Lopez G Lombardi A Santini F Mammoli C et al Measurement of TSAb directly in serum using FRTL-5 cells J Endocrinol Invest (1988) 11313ndash7 doi101007BF03350157 4) Yavin E Yavin Z Schneider MD Kohn LD Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor implications for receptor structure and the action of autoantibodies in Gravesrsquo disease Proc Natl Acad Sci U S A (1981) 783180ndash4 doi101073pnas7853180 5) Valente WA Vitti P Yavin Z Yavin E Rotella CM Grollman EF et al Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor stimulating and blocking antibodies derived from the lymphocytes of patients with Gravesrsquo disease Proc Natl Acad Sci U S A (1982) 796680ndash4 doi101073pnas79216680 6) Valente WA Yavin Z Yavin E Grollman EF Schneider M Rotella CM et al Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor the identification of blocking and stimulating antibodies J Endocrinol Invest (1982) 5293ndash301 doi101007BF03350517 7) Valente WA Vitti P Rotella CM Vaughan MM Aloj SM Grollman EF et al Antibodies that promote thyroid growth A distinct population of thyroid-stimulating autoantibodies N Engl J Med (1983) 3091028ndash34 doi101056NEJM198310273091705
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 1
bull Hlavniacute průlom přišel s naklonovaacuteniacutem TSHr v r 1989 1-3) ndash využitiacute lidskeacuteho TSHr pro RIA i bioassays 45) ndash senzitivita 96 pro RIA
bull Pomociacute mutačniacutech technik byly připraveny chimerickeacute TSHr
bull V 90 leacutetech byly vyvinuty monoklonaacutelniacute protilaacutetky proti C-terminus region rh-TSHr 67)
1)Parmentier M Libert F Maenhaut C Lefort Gerard C Perret J Van Sande J et al Molecular cloning of the thyrotropin receptor Science (1989) 2461620ndash2 doi101126science2556796 2)Nagayama Y Kaufman KD Seto P Rapoport B Molecular cloning sequence and functional expression of the cDNA for the human thyrotropin receptor Biochem Biophys Res Commun (1989) 1651184ndash90 doi1010160006- 291X(89)92727-7 3) Akamizu T Ikuyama S Saji M Kosugi S Kozak C McBride OW et al Cloning chromosomal assignment and regulation of the rat thyrotropin receptor expression of the gene is regulated by thyrotropin agents that increase cAMP levels and thyroid autoantibodies Proc Natl Acad Sci U S A (1990) 875677ndash81 doi101073pnas87155677 4)Ludgate M Perret J Parmentier M Gerard C Libert F Dumont JE et al Use of recombinant human thyrotropin receptor (TSH-R) expressed in mammalian cell lines to assay TSH-R autoantibodies Mol Cell Endocrinol (1991) 73R13ndash8 doi1010160303-7207(90)90050-I 5) Filetti S Foti D Costante G Rapoport B Recombinant human thyrotropin (TSH) receptor in a radioreceptor assay for the measurement of TSH receptor autoantibodies J Clin Endocrinol Metab (1991) 721096ndash101 doi101210 jcem-72-5-1096 6) Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 7)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 2
bull Druhaacute generace imunotestů (ELISA) ndash solid-phase ndash se staly standardem pro dg a-TSHr diacuteky přesnosti (988 senzitivita a 996 specifita) a non-RIA 123)
bull Použitiacutem rh-TSHr nebo vepřovyacute TSHr ziacuteskaacuteme stejnou analytickou přesnost3)
1)Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 2)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071 3)Kamijo K TSH-receptor antibody measurement in patients with various thyrotoxicosis and Hashimotorsquos thyroiditis a comparison of two two-step assays coated plate ELISA using porcine TSH-receptor and coated tube radio- assay using human recombinant TSH-receptor Endocr J (2003) 50113ndash6 doi101507endocrj50113
Monoclonal a-TSHr stimulujiacuteciacute
bull Na přelomu mileacutenia byly studovaacuteny stimulujiacuteciacute protilaacutetky a-TSHr 123)
bull Tato data jsou zaacutesadniacute pro pochopeniacute vztahů struktury a funkciacute TSHRr a jejiacute role v patogenezi Gravesovy choroby
bull To vše vedlo k izolaci a charakterizaci lidskeacute monoklonaacutelniacute protilaacutetky a-TSHr stimulujiacuteciacute ndash M22 4)
1)Ando T Latif R Pritsker A Moran T Nagayama Y Davies TF A monoclonal thyroid-stimulating antibody J Clin Invest (2002) 1101667ndash74 doi101172 JCI0216991 2)Costagliola S Franssen JDF Bonomi M Urizar E Willnich M Bergmann A et al Generation of a mouse monoclonal TSH receptor antibody with stimu- lating activity Biochem Biophys Res Commun (2002) 299891ndash6 doi101016 S0006-291X(02)02762-6 3)Sanders J Jeffreys J Depraetere H Richards T Evans M Kiddie A et al Thyroid-stimulating monoclonal antibodies Thyroid (2002) 121043ndash50 doi101089105072502321085135 4) Sanders J Evans M Premawardhana LDKE Depraetere H Jeffreys J Richards T et al Human monoclonal stimulating autoantibody Lancet (2003) 362126ndash8 doi101016S0140-6736(03)13866-4
Třetiacute generace testů ndash M22
bull V r2004 byl vyvinut test použitiacutem M22 ve formaacutetu ELISA 1) senzitivita 974 a specifita 992 (např Medipan)
bull Test byl vhodnyacute i pro automatizaci 23)
bull Dostupnost a znalost jak stimulujiacuteciacutech tak blokujiacuteciacutech protilaacutetek byla důležitaacute k pochopeniacute krystalickeacute struktury TSHr a jejiacutech interakciacute s a-TSHr 4) poukaacutezalo to na širokeacute překryvy epitopů mezi stimulujiacuteciacutemi a blokujiacuteciacutemi protilaacutetkami 4)
bull Roche nativniacute vepřovyacute TSH s M22
1)Rees Smith B Bolton J Young S Collyer A Weeden A Bradbury J et al A new assay for thyrotropin receptor autoantibodies Thyroid (2004) 14830ndash5 doi1010891050725042451248 2) Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003 3) Zophel K Roggenbuck D von Landenberg P Wunderlich G Gruning T Kotzerke J et al TSH receptor antibody (TRAb) assays based on the human monoclonal autoantibody M22 are more sensitive than bovine TSH based assays Horm Metab Res (2010) 4265ndash9 doi101055s-0029-1241196 4) Furmaniak J Sanders J Nunez Miguel R Rees Smith B Mechanisms of action of TSHR autoantibodies Horm Metab Res (2015) 47735ndash52 doi10105 5s-0035-1559648
Mc4 bioassay
bull Souběžně s testy 3-generace Kohn vyvinul test využiacutevajiacuteciacute bdquoMc4 chimeacuteruldquo založenou na metodaacutech chemiluminiscence 1)
bull Ciacutelem bylo měřit pouze stimulujiacuteciacute protilaacutetky a tiacutem dosaacutehnout jasneacuteho cutoff mezi pacienty s GD a kontrolami
bull Porovnaacuteniacute senzitivity a specifity v tabulce 2) bull Mc4 testy mohou byacutet využity jako testy prvniacute
volby pro pacienty s GD
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Mc4 bioassay
bull Testy s M22 diacuteky podobně specifitě a senzitivitě ale lepšiacute bdquoproveditelnostildquo jsou zatiacutem preferovanějšiacute
bull Daacutele jsou lepšiacute pro prognoacutezu GD než testy s M22 a leacutepe korelujiacute s aktivitou a zaacutevažnostiacute GD orbitopatiiacute 2)
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Bridge Assay
bull Novaacute technologie využitiacute chimeacuterickyacutech receptorů Mc4 a N-terminaacutelniacute TSHr fůsovanyacute s alkalickou fosfataacutezou 1) senzitivita 998 a specifita 995
bull TSI ndash Siemens tato metoda je založena na sendvičoveacutem kompetetivniacute formaacutetu kteryacute se lišiacute od klasickeacuteho kompetetivniacute formaacutetu komerčniacutech IMA druheacute a třetiacute generace 2)
1)Frank CU Braeth S Dietrich JW Wanjura D Loos U Bridge technology with TSH receptor chimera for sensitive direct detection of TSH receptor antibodies causing Gravesrsquo disease analytical and clinical evaluation Horm Metab Res (2015) 47880ndash8 doi101055s-0035-1554662 2)Tozzoli R DrsquoAurizio F Villalta D Giovanella L (2017) Evalu- ation of the first fully automated immunoassay method for the measurement of stimulating TSH receptor autoantibodies in Gravesrsquo disease Clin Chem Lab Med 5558ndash64
Mezinaacuterodniacute standard
bull Prvniacute mezinaacuterodniacute standard připraven v r 1995 WHO označeniacute 90672 Připraven ECBS zdroj pacientskaacute plasma
bull V r 2006 nahrazen lidskou monoklonaacutelniacute protilaacutetkou M22 (NIBSC 08240) odkazuje na detekci S-TRAb 1)
1) Diana T1 Kanitz M Lehmann M Li Y Olivo PD Kahaly GJ Standardization of a bioassay for thyrotropin receptor stimulating autoantibodies Thyroid 2015 Feb25(2)169-75
EHK ndash SEKK AT217
EHK ndash SEKK AT217
SEKK - Dotazniacutek
EHK ndash SEKK AT113
EHK ndash SEKK AT113
Hashimotova tyreoiditida (HT)
bull HT 1) a SLE 2) byly prvniacute dvě autoimunitniacute onemocněniacute kde se prokaacutezala genetickaacute asociace (geny MHC třiacutedy II) 70 leacuteta
bull Nicmeacuteně nebyl nalezen gen kteryacute by spouštěl HT nalezeny pouze geny ktereacute přispiacutevajiacute k fenotypu onemocněniacute 3)
1)VladutiuAO RoseNR Autoimmunemurine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type Science 19711741137ndash9 2)Grumet FC Coukell A Bodmer JG Bodmer WF McDevitt HO Histocompatibility (HL-A) antigens associated with systemic lupus erythematosus A possible genetic predisposition to disease N Engl J Med 1971285193ndash6 3) Simmonds MJ Gough SC The search for the genetic contribution to autoimmune thyroid disease the never ending story Brief Funct Genomics 20111077ndash90
Hashimotova tyreoiditida
bull Do 50 let raritniacute onemocněniacute nyniacute nejběžnějšiacute s prevalenciacute 81000 biochemickyacute naacutelez + autoprotilaacutetky 461000
bull Ženymuži 81
a-TPO
bull Přiacutetomnost protilaacutetek TPOAb obvykle předchaacuteziacute vzniku tyreoidaacutelniacute dysfunkce
bull Patogenetickaacute role protilaacutetek TgAb zůstaacutevaacute nejasnaacute
a-TPO
bull Autoprotilaacutetky TPOAb byly nejdřiacuteve popsaacuteny jako antimikrozomaacutelniacute autoprotilaacutetky (AMA) neboť bylo zjištěno že reagujiacute s neupravenyacutemi membraacutenami tyreoidaacutelniacutech buněk
bull Mikrozomaacutelniacute antigen byl později popsaacuten jako TPO
bull Dřiacuteve se využiacutevaly ke stanoveniacute TPO metody imunofluorescenčniacute metody a aglutinačniacute testy s pasivniacutem barveniacutem erytrocytů
a-TPO jako rizikovyacute faktor
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TPO je znaacutemyacutem rizikovyacutem faktorem pro vznik tyreoidaacutelniacute dysfunkce pokud jsou pacienti leacutečeni lithiem amiodaronem interleukinem-2 nebo alfa-interferonem
a-TG
bull Tg vykazuje vysokou heterogenitu způsobenou rozdiacutely v posttranslačniacutech modifikaciacutech (glykosylace jodizace sulfatace atd) Během synteacutezy tyreoidaacutelniacuteho hormonu a jeho uvolněniacute je Tg polymerizovaacuten a degradovaacuten
bull Vlivem toho je imunologickaacute struktura Tg mimořaacutedně komplexniacute Charakteristika standardů pro Tg se může lišit v zaacutevislosti na vstupniacute lidskeacute tyreoidaacutelniacute tkaacuteni a použiteacutem purifikačniacutem procesu To vysvětluje proč jsou testy na TgAb a takeacute Tg tak obtiacutežně standardizovatelneacute
Titr protilaacutetek
bull Titr protilaacutetek literaacuterně koreluje s počtem autoreaktivniacutech lymfocytů ktereacute infiltrujiacute štiacutetnou žlaacutezu a sonografickyacutem obrazem 1)
bull a-TG nižšiacute senzitivita (60-80 u HT) a menšiacute specifita (pozitivniacute ve většiacute čaacutesti zdravyacutech kontrol) než a-TPO
bull a-TG a a-TPO představujiacute dva různeacute aspekty autoimunniacute odpovědi na štiacutetnou žlaacutezu a-TG by mohly odraacutežet počaacutetečniacute (vrozenyacute) typ imunitniacute odpovědi zatiacutemco a-TPO by mohly charakterizovat pozdějšiacute adaptivniacute imunitniacute odpovědi 2)
1)Pandit AA VijayWardeMMenon PS Correlation of number of intrathyroid lympho- cytes with antimicrosomal antibody titer in Hashimotos thyroiditis Diagn Cytopathol 20032863ndash5 2) Rose NR Autoimmune escalation through the crystal ball Clin Exp Immunol 20071479
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
Biotesty
bull Během posledniacutech 60 let se biologickaacute analyacuteza a-TSHr vyvinula těžkopaacutednyacutech a časově naacuteročnyacutech postupů na geneticky upraveneacute testy založeneacute na buňkaacutech ktereacute jsou charakterizovaacuteny dobrou proveditelnostiacute a rychlyacutemi provozniacutemi časy a ktereacute jsou takeacute k dispozici jako komerčniacute sady
bull Komerčně dostupnyacute biotest je Thyretain fa Quidel kteryacute detekuje stimulačniacute aktivitu a-TSHr pomociacute chimeacuterickeacuteho TSHR a genu pro cAMP (signalizace luciferaacutezou) Je schvaacutelen FDA pro použitiacute v klinickyacutech laboratořiacutech
HISTORIE
Historickyacute vyacutevoj metod pro měřeniacute a-TSHr ndash dle Giuliani etal 2016
Cesidio Giuliani1 Motoyasu Saji2 Ines Bucci1 and Giorgio Napolitano Bioassays for TSH Receptor Autoantibodies from FRTL-5 Cells to TSH ReceptorndashLHCG Receptor Chimeras The Contribution of Leonard D Kohn Front Endocrinol (Lausanne) 2016 7 103
LATS
bull V r 1956 Adams a Purves zjistili že seacutera pacientů s tyreotoxikosou indukujiacute abnormaacutelniacute prodlouženou odpověď v TSH testu (s morčetem)1)2)
bull Nazvali jej ldquoabnormal thyroid stimulatorrdquo posleacuteze ldquolong-acting thyroid stimulatorrdquo (LATS) 2)3) bylo jasneacute že je odlišnyacute od TSH a neniacute produkovaacuten hypofyacutezou
bull V roce 1964 byla LATS identifikovaacutena jako protein podobnyacute protilaacutetkaacutem (4) a dalšiacute studie jednoznačně potvrdily že se jednaacute o IgG (56)
bull Prvniacute testy k detekci LATS měly niacutezkou senzitivitu (60-70) 7) bull Vyacuteznamneacute zlepšeniacute v testech nastalo v r 1975 a to s vyacutevojem
radioligandoveacuteho receptoroveacuteho testu Test hodnotil inhibici seacutera od pacientů s GD vaacutezaacutenyacutemi radioaktivně značeneacuteho TSH na lidskeacute tyroidniacute membraacuteny (8 Test byl nicmeacuteně staacutele zatiacutežen niacutezkou přesnostiacute
bull Dalšiacute zlepšeniacute přineslo nahrazeniacute tyroidaacutelniacute membraacuteny čaacutestečně vyčištěneacuteho TSHr - liquid phase first-generation immunoassay použiacutevanaacute dalšiacutech 20 let 910) specifita 99 senzitivita 80 11)
1)Adams DD Purves HD Abnormal responses in the assay of thyrotropin Proc Univ Otago Med Sch (1956) 3411ndash5 2)Adams DD The presence of an abnormal thyroid-stimulating hormone in the serum of some thyrotoxic patients J Clin Endocrinol Metab (1958) 18699ndash712 doi101210jcem-18-7-699 3) Adams DD Bioassay of long-acting thyroid stimulator (LATS) the dose-re- sponse relationship J Clin Endocrinol Metab (1961) 21799ndash805 4) Kriss JP Pleshakov V Chien JR Isolation and identification of the long-acting thyroid stimulator and its relation to hyperthyroidism and circumscribed pretibial myxedema J Clin Endocrinol Metab (1964) 241005ndash28 doi101210 jcem-24-10-1005 5) Kriss JP Inactivation of long-acting thyroid stimulator (LATS) by anti- kappa and anti-lamba antisera J Clin Endocrinol Metab (1968) 281440ndash4 doi101210jcem-28-10-1440 6) Volpeacute R The immunologic basis of Gravesrsquos disease N Engl J Med (1972) 287463ndash4 doi101056NEJM197208312870910 7) McKenzie JM Review pathogenesis of Gravesrsquo disease role of the long-acting thyroid stimulator J Clin Endocrinol Metab (1965) 25424ndash31 8) Mehdi SQ Nussey SS A radio-ligand receptor assay for the long-acting thy- roid stimulator Inhibition by the long-acting thyroid stimulator of the binding of radioiodinated thyroid stimulating hormone to human thyroid membranes Biochem J (1975) 145105ndash11 doi101042bj1450105 9)Shewring G Rees Smith B An improved radioreceptor assay for TSH receptor antibodies Clin Endocrinol (1982) 17409ndash17 doi101111j1365-22651982 tb01607x 10)Southgate K Creagh FM Teece M Kingswood C Rees Smith B A receptor assay for the measurement of TSH receptor antibodies in unextracted serum Clin Endocrinol (1984) 20539ndash48 doi101111j1365-22651984tb00102x 11)Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003
FRTL-5 bull Souběžně s vyacutevojem radioligandovyacutech receptorovyacutech testů dochaacutezelo k vyacutevoji
bdquobiotestůldquo Změna v in vivo na in vitro jako je použitiacute primaacuterniacutech buněčnyacutech kultur 1)
bull Dalšiacute zlepšeniacute přišlo s použitiacutem FRTL-5 buněk ndash netransformovanyacutech buněčnyacutech liniiacute krysiacutech thyroid epithelial buněk v kontinuaacutelniacute kultuře 2) Test byl založen na schopnosti purifikovanyacutech IgG indukovat produkci cAMP Naacutesledně bylo umožněno využiacutet pacientskeacute seacutera 3)
bull Tento test nesloužil jen pro diagnostiku ale měl zaacutesadniacute vyacuteznam v pochopeniacute patfyz vlastnostiacute a-TSHr
bull Kohn etal 4)5)6) vyvinuli monoklonaacutelniacute protilaacutetku k hodnoceniacute jejiacutech funkčniacutech vlastnostiacute
bull Použitiacute buněk FRTL-5 takeacute umožnilo dalšiacute studium funkčniacute heterogenity a-TSHr (samostatneacute posouzeniacute uacutečinků jednotlivyacutech IgG na dvě odlišneacute buněčneacute aktivity aktivity produkce cAMP a buněčneacuteho růstu) 7)
1)Toccafondi RS Aterini S Medici MA Rotella CM Tanini A Zonefrati R Thyroid-stimulating antibody (TSAb) detected in sera of Gravesrsquo patients using human thyroid cell cultures Clin Exp Immunol (1980) 40532ndash9 2) Ambesi-Impiombato FS Parks LAM Coon HG Culture of hormone-depen- dent functional epithelial cells from rat thyroids Proc Natl Acad Sci U S A (1980) 773455ndash9 doi101073pnas7763455 3) Vitti P Chiovato L Lopez G Lombardi A Santini F Mammoli C et al Measurement of TSAb directly in serum using FRTL-5 cells J Endocrinol Invest (1988) 11313ndash7 doi101007BF03350157 4) Yavin E Yavin Z Schneider MD Kohn LD Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor implications for receptor structure and the action of autoantibodies in Gravesrsquo disease Proc Natl Acad Sci U S A (1981) 783180ndash4 doi101073pnas7853180 5) Valente WA Vitti P Yavin Z Yavin E Rotella CM Grollman EF et al Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor stimulating and blocking antibodies derived from the lymphocytes of patients with Gravesrsquo disease Proc Natl Acad Sci U S A (1982) 796680ndash4 doi101073pnas79216680 6) Valente WA Yavin Z Yavin E Grollman EF Schneider M Rotella CM et al Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor the identification of blocking and stimulating antibodies J Endocrinol Invest (1982) 5293ndash301 doi101007BF03350517 7) Valente WA Vitti P Rotella CM Vaughan MM Aloj SM Grollman EF et al Antibodies that promote thyroid growth A distinct population of thyroid-stimulating autoantibodies N Engl J Med (1983) 3091028ndash34 doi101056NEJM198310273091705
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 1
bull Hlavniacute průlom přišel s naklonovaacuteniacutem TSHr v r 1989 1-3) ndash využitiacute lidskeacuteho TSHr pro RIA i bioassays 45) ndash senzitivita 96 pro RIA
bull Pomociacute mutačniacutech technik byly připraveny chimerickeacute TSHr
bull V 90 leacutetech byly vyvinuty monoklonaacutelniacute protilaacutetky proti C-terminus region rh-TSHr 67)
1)Parmentier M Libert F Maenhaut C Lefort Gerard C Perret J Van Sande J et al Molecular cloning of the thyrotropin receptor Science (1989) 2461620ndash2 doi101126science2556796 2)Nagayama Y Kaufman KD Seto P Rapoport B Molecular cloning sequence and functional expression of the cDNA for the human thyrotropin receptor Biochem Biophys Res Commun (1989) 1651184ndash90 doi1010160006- 291X(89)92727-7 3) Akamizu T Ikuyama S Saji M Kosugi S Kozak C McBride OW et al Cloning chromosomal assignment and regulation of the rat thyrotropin receptor expression of the gene is regulated by thyrotropin agents that increase cAMP levels and thyroid autoantibodies Proc Natl Acad Sci U S A (1990) 875677ndash81 doi101073pnas87155677 4)Ludgate M Perret J Parmentier M Gerard C Libert F Dumont JE et al Use of recombinant human thyrotropin receptor (TSH-R) expressed in mammalian cell lines to assay TSH-R autoantibodies Mol Cell Endocrinol (1991) 73R13ndash8 doi1010160303-7207(90)90050-I 5) Filetti S Foti D Costante G Rapoport B Recombinant human thyrotropin (TSH) receptor in a radioreceptor assay for the measurement of TSH receptor autoantibodies J Clin Endocrinol Metab (1991) 721096ndash101 doi101210 jcem-72-5-1096 6) Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 7)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 2
bull Druhaacute generace imunotestů (ELISA) ndash solid-phase ndash se staly standardem pro dg a-TSHr diacuteky přesnosti (988 senzitivita a 996 specifita) a non-RIA 123)
bull Použitiacutem rh-TSHr nebo vepřovyacute TSHr ziacuteskaacuteme stejnou analytickou přesnost3)
1)Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 2)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071 3)Kamijo K TSH-receptor antibody measurement in patients with various thyrotoxicosis and Hashimotorsquos thyroiditis a comparison of two two-step assays coated plate ELISA using porcine TSH-receptor and coated tube radio- assay using human recombinant TSH-receptor Endocr J (2003) 50113ndash6 doi101507endocrj50113
Monoclonal a-TSHr stimulujiacuteciacute
bull Na přelomu mileacutenia byly studovaacuteny stimulujiacuteciacute protilaacutetky a-TSHr 123)
bull Tato data jsou zaacutesadniacute pro pochopeniacute vztahů struktury a funkciacute TSHRr a jejiacute role v patogenezi Gravesovy choroby
bull To vše vedlo k izolaci a charakterizaci lidskeacute monoklonaacutelniacute protilaacutetky a-TSHr stimulujiacuteciacute ndash M22 4)
1)Ando T Latif R Pritsker A Moran T Nagayama Y Davies TF A monoclonal thyroid-stimulating antibody J Clin Invest (2002) 1101667ndash74 doi101172 JCI0216991 2)Costagliola S Franssen JDF Bonomi M Urizar E Willnich M Bergmann A et al Generation of a mouse monoclonal TSH receptor antibody with stimu- lating activity Biochem Biophys Res Commun (2002) 299891ndash6 doi101016 S0006-291X(02)02762-6 3)Sanders J Jeffreys J Depraetere H Richards T Evans M Kiddie A et al Thyroid-stimulating monoclonal antibodies Thyroid (2002) 121043ndash50 doi101089105072502321085135 4) Sanders J Evans M Premawardhana LDKE Depraetere H Jeffreys J Richards T et al Human monoclonal stimulating autoantibody Lancet (2003) 362126ndash8 doi101016S0140-6736(03)13866-4
Třetiacute generace testů ndash M22
bull V r2004 byl vyvinut test použitiacutem M22 ve formaacutetu ELISA 1) senzitivita 974 a specifita 992 (např Medipan)
bull Test byl vhodnyacute i pro automatizaci 23)
bull Dostupnost a znalost jak stimulujiacuteciacutech tak blokujiacuteciacutech protilaacutetek byla důležitaacute k pochopeniacute krystalickeacute struktury TSHr a jejiacutech interakciacute s a-TSHr 4) poukaacutezalo to na širokeacute překryvy epitopů mezi stimulujiacuteciacutemi a blokujiacuteciacutemi protilaacutetkami 4)
bull Roche nativniacute vepřovyacute TSH s M22
1)Rees Smith B Bolton J Young S Collyer A Weeden A Bradbury J et al A new assay for thyrotropin receptor autoantibodies Thyroid (2004) 14830ndash5 doi1010891050725042451248 2) Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003 3) Zophel K Roggenbuck D von Landenberg P Wunderlich G Gruning T Kotzerke J et al TSH receptor antibody (TRAb) assays based on the human monoclonal autoantibody M22 are more sensitive than bovine TSH based assays Horm Metab Res (2010) 4265ndash9 doi101055s-0029-1241196 4) Furmaniak J Sanders J Nunez Miguel R Rees Smith B Mechanisms of action of TSHR autoantibodies Horm Metab Res (2015) 47735ndash52 doi10105 5s-0035-1559648
Mc4 bioassay
bull Souběžně s testy 3-generace Kohn vyvinul test využiacutevajiacuteciacute bdquoMc4 chimeacuteruldquo založenou na metodaacutech chemiluminiscence 1)
bull Ciacutelem bylo měřit pouze stimulujiacuteciacute protilaacutetky a tiacutem dosaacutehnout jasneacuteho cutoff mezi pacienty s GD a kontrolami
bull Porovnaacuteniacute senzitivity a specifity v tabulce 2) bull Mc4 testy mohou byacutet využity jako testy prvniacute
volby pro pacienty s GD
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Mc4 bioassay
bull Testy s M22 diacuteky podobně specifitě a senzitivitě ale lepšiacute bdquoproveditelnostildquo jsou zatiacutem preferovanějšiacute
bull Daacutele jsou lepšiacute pro prognoacutezu GD než testy s M22 a leacutepe korelujiacute s aktivitou a zaacutevažnostiacute GD orbitopatiiacute 2)
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Bridge Assay
bull Novaacute technologie využitiacute chimeacuterickyacutech receptorů Mc4 a N-terminaacutelniacute TSHr fůsovanyacute s alkalickou fosfataacutezou 1) senzitivita 998 a specifita 995
bull TSI ndash Siemens tato metoda je založena na sendvičoveacutem kompetetivniacute formaacutetu kteryacute se lišiacute od klasickeacuteho kompetetivniacute formaacutetu komerčniacutech IMA druheacute a třetiacute generace 2)
1)Frank CU Braeth S Dietrich JW Wanjura D Loos U Bridge technology with TSH receptor chimera for sensitive direct detection of TSH receptor antibodies causing Gravesrsquo disease analytical and clinical evaluation Horm Metab Res (2015) 47880ndash8 doi101055s-0035-1554662 2)Tozzoli R DrsquoAurizio F Villalta D Giovanella L (2017) Evalu- ation of the first fully automated immunoassay method for the measurement of stimulating TSH receptor autoantibodies in Gravesrsquo disease Clin Chem Lab Med 5558ndash64
Mezinaacuterodniacute standard
bull Prvniacute mezinaacuterodniacute standard připraven v r 1995 WHO označeniacute 90672 Připraven ECBS zdroj pacientskaacute plasma
bull V r 2006 nahrazen lidskou monoklonaacutelniacute protilaacutetkou M22 (NIBSC 08240) odkazuje na detekci S-TRAb 1)
1) Diana T1 Kanitz M Lehmann M Li Y Olivo PD Kahaly GJ Standardization of a bioassay for thyrotropin receptor stimulating autoantibodies Thyroid 2015 Feb25(2)169-75
EHK ndash SEKK AT217
EHK ndash SEKK AT217
SEKK - Dotazniacutek
EHK ndash SEKK AT113
EHK ndash SEKK AT113
Hashimotova tyreoiditida (HT)
bull HT 1) a SLE 2) byly prvniacute dvě autoimunitniacute onemocněniacute kde se prokaacutezala genetickaacute asociace (geny MHC třiacutedy II) 70 leacuteta
bull Nicmeacuteně nebyl nalezen gen kteryacute by spouštěl HT nalezeny pouze geny ktereacute přispiacutevajiacute k fenotypu onemocněniacute 3)
1)VladutiuAO RoseNR Autoimmunemurine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type Science 19711741137ndash9 2)Grumet FC Coukell A Bodmer JG Bodmer WF McDevitt HO Histocompatibility (HL-A) antigens associated with systemic lupus erythematosus A possible genetic predisposition to disease N Engl J Med 1971285193ndash6 3) Simmonds MJ Gough SC The search for the genetic contribution to autoimmune thyroid disease the never ending story Brief Funct Genomics 20111077ndash90
Hashimotova tyreoiditida
bull Do 50 let raritniacute onemocněniacute nyniacute nejběžnějšiacute s prevalenciacute 81000 biochemickyacute naacutelez + autoprotilaacutetky 461000
bull Ženymuži 81
a-TPO
bull Přiacutetomnost protilaacutetek TPOAb obvykle předchaacuteziacute vzniku tyreoidaacutelniacute dysfunkce
bull Patogenetickaacute role protilaacutetek TgAb zůstaacutevaacute nejasnaacute
a-TPO
bull Autoprotilaacutetky TPOAb byly nejdřiacuteve popsaacuteny jako antimikrozomaacutelniacute autoprotilaacutetky (AMA) neboť bylo zjištěno že reagujiacute s neupravenyacutemi membraacutenami tyreoidaacutelniacutech buněk
bull Mikrozomaacutelniacute antigen byl později popsaacuten jako TPO
bull Dřiacuteve se využiacutevaly ke stanoveniacute TPO metody imunofluorescenčniacute metody a aglutinačniacute testy s pasivniacutem barveniacutem erytrocytů
a-TPO jako rizikovyacute faktor
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TPO je znaacutemyacutem rizikovyacutem faktorem pro vznik tyreoidaacutelniacute dysfunkce pokud jsou pacienti leacutečeni lithiem amiodaronem interleukinem-2 nebo alfa-interferonem
a-TG
bull Tg vykazuje vysokou heterogenitu způsobenou rozdiacutely v posttranslačniacutech modifikaciacutech (glykosylace jodizace sulfatace atd) Během synteacutezy tyreoidaacutelniacuteho hormonu a jeho uvolněniacute je Tg polymerizovaacuten a degradovaacuten
bull Vlivem toho je imunologickaacute struktura Tg mimořaacutedně komplexniacute Charakteristika standardů pro Tg se může lišit v zaacutevislosti na vstupniacute lidskeacute tyreoidaacutelniacute tkaacuteni a použiteacutem purifikačniacutem procesu To vysvětluje proč jsou testy na TgAb a takeacute Tg tak obtiacutežně standardizovatelneacute
Titr protilaacutetek
bull Titr protilaacutetek literaacuterně koreluje s počtem autoreaktivniacutech lymfocytů ktereacute infiltrujiacute štiacutetnou žlaacutezu a sonografickyacutem obrazem 1)
bull a-TG nižšiacute senzitivita (60-80 u HT) a menšiacute specifita (pozitivniacute ve většiacute čaacutesti zdravyacutech kontrol) než a-TPO
bull a-TG a a-TPO představujiacute dva různeacute aspekty autoimunniacute odpovědi na štiacutetnou žlaacutezu a-TG by mohly odraacutežet počaacutetečniacute (vrozenyacute) typ imunitniacute odpovědi zatiacutemco a-TPO by mohly charakterizovat pozdějšiacute adaptivniacute imunitniacute odpovědi 2)
1)Pandit AA VijayWardeMMenon PS Correlation of number of intrathyroid lympho- cytes with antimicrosomal antibody titer in Hashimotos thyroiditis Diagn Cytopathol 20032863ndash5 2) Rose NR Autoimmune escalation through the crystal ball Clin Exp Immunol 20071479
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
HISTORIE
Historickyacute vyacutevoj metod pro měřeniacute a-TSHr ndash dle Giuliani etal 2016
Cesidio Giuliani1 Motoyasu Saji2 Ines Bucci1 and Giorgio Napolitano Bioassays for TSH Receptor Autoantibodies from FRTL-5 Cells to TSH ReceptorndashLHCG Receptor Chimeras The Contribution of Leonard D Kohn Front Endocrinol (Lausanne) 2016 7 103
LATS
bull V r 1956 Adams a Purves zjistili že seacutera pacientů s tyreotoxikosou indukujiacute abnormaacutelniacute prodlouženou odpověď v TSH testu (s morčetem)1)2)
bull Nazvali jej ldquoabnormal thyroid stimulatorrdquo posleacuteze ldquolong-acting thyroid stimulatorrdquo (LATS) 2)3) bylo jasneacute že je odlišnyacute od TSH a neniacute produkovaacuten hypofyacutezou
bull V roce 1964 byla LATS identifikovaacutena jako protein podobnyacute protilaacutetkaacutem (4) a dalšiacute studie jednoznačně potvrdily že se jednaacute o IgG (56)
bull Prvniacute testy k detekci LATS měly niacutezkou senzitivitu (60-70) 7) bull Vyacuteznamneacute zlepšeniacute v testech nastalo v r 1975 a to s vyacutevojem
radioligandoveacuteho receptoroveacuteho testu Test hodnotil inhibici seacutera od pacientů s GD vaacutezaacutenyacutemi radioaktivně značeneacuteho TSH na lidskeacute tyroidniacute membraacuteny (8 Test byl nicmeacuteně staacutele zatiacutežen niacutezkou přesnostiacute
bull Dalšiacute zlepšeniacute přineslo nahrazeniacute tyroidaacutelniacute membraacuteny čaacutestečně vyčištěneacuteho TSHr - liquid phase first-generation immunoassay použiacutevanaacute dalšiacutech 20 let 910) specifita 99 senzitivita 80 11)
1)Adams DD Purves HD Abnormal responses in the assay of thyrotropin Proc Univ Otago Med Sch (1956) 3411ndash5 2)Adams DD The presence of an abnormal thyroid-stimulating hormone in the serum of some thyrotoxic patients J Clin Endocrinol Metab (1958) 18699ndash712 doi101210jcem-18-7-699 3) Adams DD Bioassay of long-acting thyroid stimulator (LATS) the dose-re- sponse relationship J Clin Endocrinol Metab (1961) 21799ndash805 4) Kriss JP Pleshakov V Chien JR Isolation and identification of the long-acting thyroid stimulator and its relation to hyperthyroidism and circumscribed pretibial myxedema J Clin Endocrinol Metab (1964) 241005ndash28 doi101210 jcem-24-10-1005 5) Kriss JP Inactivation of long-acting thyroid stimulator (LATS) by anti- kappa and anti-lamba antisera J Clin Endocrinol Metab (1968) 281440ndash4 doi101210jcem-28-10-1440 6) Volpeacute R The immunologic basis of Gravesrsquos disease N Engl J Med (1972) 287463ndash4 doi101056NEJM197208312870910 7) McKenzie JM Review pathogenesis of Gravesrsquo disease role of the long-acting thyroid stimulator J Clin Endocrinol Metab (1965) 25424ndash31 8) Mehdi SQ Nussey SS A radio-ligand receptor assay for the long-acting thy- roid stimulator Inhibition by the long-acting thyroid stimulator of the binding of radioiodinated thyroid stimulating hormone to human thyroid membranes Biochem J (1975) 145105ndash11 doi101042bj1450105 9)Shewring G Rees Smith B An improved radioreceptor assay for TSH receptor antibodies Clin Endocrinol (1982) 17409ndash17 doi101111j1365-22651982 tb01607x 10)Southgate K Creagh FM Teece M Kingswood C Rees Smith B A receptor assay for the measurement of TSH receptor antibodies in unextracted serum Clin Endocrinol (1984) 20539ndash48 doi101111j1365-22651984tb00102x 11)Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003
FRTL-5 bull Souběžně s vyacutevojem radioligandovyacutech receptorovyacutech testů dochaacutezelo k vyacutevoji
bdquobiotestůldquo Změna v in vivo na in vitro jako je použitiacute primaacuterniacutech buněčnyacutech kultur 1)
bull Dalšiacute zlepšeniacute přišlo s použitiacutem FRTL-5 buněk ndash netransformovanyacutech buněčnyacutech liniiacute krysiacutech thyroid epithelial buněk v kontinuaacutelniacute kultuře 2) Test byl založen na schopnosti purifikovanyacutech IgG indukovat produkci cAMP Naacutesledně bylo umožněno využiacutet pacientskeacute seacutera 3)
bull Tento test nesloužil jen pro diagnostiku ale měl zaacutesadniacute vyacuteznam v pochopeniacute patfyz vlastnostiacute a-TSHr
bull Kohn etal 4)5)6) vyvinuli monoklonaacutelniacute protilaacutetku k hodnoceniacute jejiacutech funkčniacutech vlastnostiacute
bull Použitiacute buněk FRTL-5 takeacute umožnilo dalšiacute studium funkčniacute heterogenity a-TSHr (samostatneacute posouzeniacute uacutečinků jednotlivyacutech IgG na dvě odlišneacute buněčneacute aktivity aktivity produkce cAMP a buněčneacuteho růstu) 7)
1)Toccafondi RS Aterini S Medici MA Rotella CM Tanini A Zonefrati R Thyroid-stimulating antibody (TSAb) detected in sera of Gravesrsquo patients using human thyroid cell cultures Clin Exp Immunol (1980) 40532ndash9 2) Ambesi-Impiombato FS Parks LAM Coon HG Culture of hormone-depen- dent functional epithelial cells from rat thyroids Proc Natl Acad Sci U S A (1980) 773455ndash9 doi101073pnas7763455 3) Vitti P Chiovato L Lopez G Lombardi A Santini F Mammoli C et al Measurement of TSAb directly in serum using FRTL-5 cells J Endocrinol Invest (1988) 11313ndash7 doi101007BF03350157 4) Yavin E Yavin Z Schneider MD Kohn LD Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor implications for receptor structure and the action of autoantibodies in Gravesrsquo disease Proc Natl Acad Sci U S A (1981) 783180ndash4 doi101073pnas7853180 5) Valente WA Vitti P Yavin Z Yavin E Rotella CM Grollman EF et al Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor stimulating and blocking antibodies derived from the lymphocytes of patients with Gravesrsquo disease Proc Natl Acad Sci U S A (1982) 796680ndash4 doi101073pnas79216680 6) Valente WA Yavin Z Yavin E Grollman EF Schneider M Rotella CM et al Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor the identification of blocking and stimulating antibodies J Endocrinol Invest (1982) 5293ndash301 doi101007BF03350517 7) Valente WA Vitti P Rotella CM Vaughan MM Aloj SM Grollman EF et al Antibodies that promote thyroid growth A distinct population of thyroid-stimulating autoantibodies N Engl J Med (1983) 3091028ndash34 doi101056NEJM198310273091705
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 1
bull Hlavniacute průlom přišel s naklonovaacuteniacutem TSHr v r 1989 1-3) ndash využitiacute lidskeacuteho TSHr pro RIA i bioassays 45) ndash senzitivita 96 pro RIA
bull Pomociacute mutačniacutech technik byly připraveny chimerickeacute TSHr
bull V 90 leacutetech byly vyvinuty monoklonaacutelniacute protilaacutetky proti C-terminus region rh-TSHr 67)
1)Parmentier M Libert F Maenhaut C Lefort Gerard C Perret J Van Sande J et al Molecular cloning of the thyrotropin receptor Science (1989) 2461620ndash2 doi101126science2556796 2)Nagayama Y Kaufman KD Seto P Rapoport B Molecular cloning sequence and functional expression of the cDNA for the human thyrotropin receptor Biochem Biophys Res Commun (1989) 1651184ndash90 doi1010160006- 291X(89)92727-7 3) Akamizu T Ikuyama S Saji M Kosugi S Kozak C McBride OW et al Cloning chromosomal assignment and regulation of the rat thyrotropin receptor expression of the gene is regulated by thyrotropin agents that increase cAMP levels and thyroid autoantibodies Proc Natl Acad Sci U S A (1990) 875677ndash81 doi101073pnas87155677 4)Ludgate M Perret J Parmentier M Gerard C Libert F Dumont JE et al Use of recombinant human thyrotropin receptor (TSH-R) expressed in mammalian cell lines to assay TSH-R autoantibodies Mol Cell Endocrinol (1991) 73R13ndash8 doi1010160303-7207(90)90050-I 5) Filetti S Foti D Costante G Rapoport B Recombinant human thyrotropin (TSH) receptor in a radioreceptor assay for the measurement of TSH receptor autoantibodies J Clin Endocrinol Metab (1991) 721096ndash101 doi101210 jcem-72-5-1096 6) Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 7)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 2
bull Druhaacute generace imunotestů (ELISA) ndash solid-phase ndash se staly standardem pro dg a-TSHr diacuteky přesnosti (988 senzitivita a 996 specifita) a non-RIA 123)
bull Použitiacutem rh-TSHr nebo vepřovyacute TSHr ziacuteskaacuteme stejnou analytickou přesnost3)
1)Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 2)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071 3)Kamijo K TSH-receptor antibody measurement in patients with various thyrotoxicosis and Hashimotorsquos thyroiditis a comparison of two two-step assays coated plate ELISA using porcine TSH-receptor and coated tube radio- assay using human recombinant TSH-receptor Endocr J (2003) 50113ndash6 doi101507endocrj50113
Monoclonal a-TSHr stimulujiacuteciacute
bull Na přelomu mileacutenia byly studovaacuteny stimulujiacuteciacute protilaacutetky a-TSHr 123)
bull Tato data jsou zaacutesadniacute pro pochopeniacute vztahů struktury a funkciacute TSHRr a jejiacute role v patogenezi Gravesovy choroby
bull To vše vedlo k izolaci a charakterizaci lidskeacute monoklonaacutelniacute protilaacutetky a-TSHr stimulujiacuteciacute ndash M22 4)
1)Ando T Latif R Pritsker A Moran T Nagayama Y Davies TF A monoclonal thyroid-stimulating antibody J Clin Invest (2002) 1101667ndash74 doi101172 JCI0216991 2)Costagliola S Franssen JDF Bonomi M Urizar E Willnich M Bergmann A et al Generation of a mouse monoclonal TSH receptor antibody with stimu- lating activity Biochem Biophys Res Commun (2002) 299891ndash6 doi101016 S0006-291X(02)02762-6 3)Sanders J Jeffreys J Depraetere H Richards T Evans M Kiddie A et al Thyroid-stimulating monoclonal antibodies Thyroid (2002) 121043ndash50 doi101089105072502321085135 4) Sanders J Evans M Premawardhana LDKE Depraetere H Jeffreys J Richards T et al Human monoclonal stimulating autoantibody Lancet (2003) 362126ndash8 doi101016S0140-6736(03)13866-4
Třetiacute generace testů ndash M22
bull V r2004 byl vyvinut test použitiacutem M22 ve formaacutetu ELISA 1) senzitivita 974 a specifita 992 (např Medipan)
bull Test byl vhodnyacute i pro automatizaci 23)
bull Dostupnost a znalost jak stimulujiacuteciacutech tak blokujiacuteciacutech protilaacutetek byla důležitaacute k pochopeniacute krystalickeacute struktury TSHr a jejiacutech interakciacute s a-TSHr 4) poukaacutezalo to na širokeacute překryvy epitopů mezi stimulujiacuteciacutemi a blokujiacuteciacutemi protilaacutetkami 4)
bull Roche nativniacute vepřovyacute TSH s M22
1)Rees Smith B Bolton J Young S Collyer A Weeden A Bradbury J et al A new assay for thyrotropin receptor autoantibodies Thyroid (2004) 14830ndash5 doi1010891050725042451248 2) Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003 3) Zophel K Roggenbuck D von Landenberg P Wunderlich G Gruning T Kotzerke J et al TSH receptor antibody (TRAb) assays based on the human monoclonal autoantibody M22 are more sensitive than bovine TSH based assays Horm Metab Res (2010) 4265ndash9 doi101055s-0029-1241196 4) Furmaniak J Sanders J Nunez Miguel R Rees Smith B Mechanisms of action of TSHR autoantibodies Horm Metab Res (2015) 47735ndash52 doi10105 5s-0035-1559648
Mc4 bioassay
bull Souběžně s testy 3-generace Kohn vyvinul test využiacutevajiacuteciacute bdquoMc4 chimeacuteruldquo založenou na metodaacutech chemiluminiscence 1)
bull Ciacutelem bylo měřit pouze stimulujiacuteciacute protilaacutetky a tiacutem dosaacutehnout jasneacuteho cutoff mezi pacienty s GD a kontrolami
bull Porovnaacuteniacute senzitivity a specifity v tabulce 2) bull Mc4 testy mohou byacutet využity jako testy prvniacute
volby pro pacienty s GD
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Mc4 bioassay
bull Testy s M22 diacuteky podobně specifitě a senzitivitě ale lepšiacute bdquoproveditelnostildquo jsou zatiacutem preferovanějšiacute
bull Daacutele jsou lepšiacute pro prognoacutezu GD než testy s M22 a leacutepe korelujiacute s aktivitou a zaacutevažnostiacute GD orbitopatiiacute 2)
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Bridge Assay
bull Novaacute technologie využitiacute chimeacuterickyacutech receptorů Mc4 a N-terminaacutelniacute TSHr fůsovanyacute s alkalickou fosfataacutezou 1) senzitivita 998 a specifita 995
bull TSI ndash Siemens tato metoda je založena na sendvičoveacutem kompetetivniacute formaacutetu kteryacute se lišiacute od klasickeacuteho kompetetivniacute formaacutetu komerčniacutech IMA druheacute a třetiacute generace 2)
1)Frank CU Braeth S Dietrich JW Wanjura D Loos U Bridge technology with TSH receptor chimera for sensitive direct detection of TSH receptor antibodies causing Gravesrsquo disease analytical and clinical evaluation Horm Metab Res (2015) 47880ndash8 doi101055s-0035-1554662 2)Tozzoli R DrsquoAurizio F Villalta D Giovanella L (2017) Evalu- ation of the first fully automated immunoassay method for the measurement of stimulating TSH receptor autoantibodies in Gravesrsquo disease Clin Chem Lab Med 5558ndash64
Mezinaacuterodniacute standard
bull Prvniacute mezinaacuterodniacute standard připraven v r 1995 WHO označeniacute 90672 Připraven ECBS zdroj pacientskaacute plasma
bull V r 2006 nahrazen lidskou monoklonaacutelniacute protilaacutetkou M22 (NIBSC 08240) odkazuje na detekci S-TRAb 1)
1) Diana T1 Kanitz M Lehmann M Li Y Olivo PD Kahaly GJ Standardization of a bioassay for thyrotropin receptor stimulating autoantibodies Thyroid 2015 Feb25(2)169-75
EHK ndash SEKK AT217
EHK ndash SEKK AT217
SEKK - Dotazniacutek
EHK ndash SEKK AT113
EHK ndash SEKK AT113
Hashimotova tyreoiditida (HT)
bull HT 1) a SLE 2) byly prvniacute dvě autoimunitniacute onemocněniacute kde se prokaacutezala genetickaacute asociace (geny MHC třiacutedy II) 70 leacuteta
bull Nicmeacuteně nebyl nalezen gen kteryacute by spouštěl HT nalezeny pouze geny ktereacute přispiacutevajiacute k fenotypu onemocněniacute 3)
1)VladutiuAO RoseNR Autoimmunemurine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type Science 19711741137ndash9 2)Grumet FC Coukell A Bodmer JG Bodmer WF McDevitt HO Histocompatibility (HL-A) antigens associated with systemic lupus erythematosus A possible genetic predisposition to disease N Engl J Med 1971285193ndash6 3) Simmonds MJ Gough SC The search for the genetic contribution to autoimmune thyroid disease the never ending story Brief Funct Genomics 20111077ndash90
Hashimotova tyreoiditida
bull Do 50 let raritniacute onemocněniacute nyniacute nejběžnějšiacute s prevalenciacute 81000 biochemickyacute naacutelez + autoprotilaacutetky 461000
bull Ženymuži 81
a-TPO
bull Přiacutetomnost protilaacutetek TPOAb obvykle předchaacuteziacute vzniku tyreoidaacutelniacute dysfunkce
bull Patogenetickaacute role protilaacutetek TgAb zůstaacutevaacute nejasnaacute
a-TPO
bull Autoprotilaacutetky TPOAb byly nejdřiacuteve popsaacuteny jako antimikrozomaacutelniacute autoprotilaacutetky (AMA) neboť bylo zjištěno že reagujiacute s neupravenyacutemi membraacutenami tyreoidaacutelniacutech buněk
bull Mikrozomaacutelniacute antigen byl později popsaacuten jako TPO
bull Dřiacuteve se využiacutevaly ke stanoveniacute TPO metody imunofluorescenčniacute metody a aglutinačniacute testy s pasivniacutem barveniacutem erytrocytů
a-TPO jako rizikovyacute faktor
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TPO je znaacutemyacutem rizikovyacutem faktorem pro vznik tyreoidaacutelniacute dysfunkce pokud jsou pacienti leacutečeni lithiem amiodaronem interleukinem-2 nebo alfa-interferonem
a-TG
bull Tg vykazuje vysokou heterogenitu způsobenou rozdiacutely v posttranslačniacutech modifikaciacutech (glykosylace jodizace sulfatace atd) Během synteacutezy tyreoidaacutelniacuteho hormonu a jeho uvolněniacute je Tg polymerizovaacuten a degradovaacuten
bull Vlivem toho je imunologickaacute struktura Tg mimořaacutedně komplexniacute Charakteristika standardů pro Tg se může lišit v zaacutevislosti na vstupniacute lidskeacute tyreoidaacutelniacute tkaacuteni a použiteacutem purifikačniacutem procesu To vysvětluje proč jsou testy na TgAb a takeacute Tg tak obtiacutežně standardizovatelneacute
Titr protilaacutetek
bull Titr protilaacutetek literaacuterně koreluje s počtem autoreaktivniacutech lymfocytů ktereacute infiltrujiacute štiacutetnou žlaacutezu a sonografickyacutem obrazem 1)
bull a-TG nižšiacute senzitivita (60-80 u HT) a menšiacute specifita (pozitivniacute ve většiacute čaacutesti zdravyacutech kontrol) než a-TPO
bull a-TG a a-TPO představujiacute dva různeacute aspekty autoimunniacute odpovědi na štiacutetnou žlaacutezu a-TG by mohly odraacutežet počaacutetečniacute (vrozenyacute) typ imunitniacute odpovědi zatiacutemco a-TPO by mohly charakterizovat pozdějšiacute adaptivniacute imunitniacute odpovědi 2)
1)Pandit AA VijayWardeMMenon PS Correlation of number of intrathyroid lympho- cytes with antimicrosomal antibody titer in Hashimotos thyroiditis Diagn Cytopathol 20032863ndash5 2) Rose NR Autoimmune escalation through the crystal ball Clin Exp Immunol 20071479
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
LATS
bull V r 1956 Adams a Purves zjistili že seacutera pacientů s tyreotoxikosou indukujiacute abnormaacutelniacute prodlouženou odpověď v TSH testu (s morčetem)1)2)
bull Nazvali jej ldquoabnormal thyroid stimulatorrdquo posleacuteze ldquolong-acting thyroid stimulatorrdquo (LATS) 2)3) bylo jasneacute že je odlišnyacute od TSH a neniacute produkovaacuten hypofyacutezou
bull V roce 1964 byla LATS identifikovaacutena jako protein podobnyacute protilaacutetkaacutem (4) a dalšiacute studie jednoznačně potvrdily že se jednaacute o IgG (56)
bull Prvniacute testy k detekci LATS měly niacutezkou senzitivitu (60-70) 7) bull Vyacuteznamneacute zlepšeniacute v testech nastalo v r 1975 a to s vyacutevojem
radioligandoveacuteho receptoroveacuteho testu Test hodnotil inhibici seacutera od pacientů s GD vaacutezaacutenyacutemi radioaktivně značeneacuteho TSH na lidskeacute tyroidniacute membraacuteny (8 Test byl nicmeacuteně staacutele zatiacutežen niacutezkou přesnostiacute
bull Dalšiacute zlepšeniacute přineslo nahrazeniacute tyroidaacutelniacute membraacuteny čaacutestečně vyčištěneacuteho TSHr - liquid phase first-generation immunoassay použiacutevanaacute dalšiacutech 20 let 910) specifita 99 senzitivita 80 11)
1)Adams DD Purves HD Abnormal responses in the assay of thyrotropin Proc Univ Otago Med Sch (1956) 3411ndash5 2)Adams DD The presence of an abnormal thyroid-stimulating hormone in the serum of some thyrotoxic patients J Clin Endocrinol Metab (1958) 18699ndash712 doi101210jcem-18-7-699 3) Adams DD Bioassay of long-acting thyroid stimulator (LATS) the dose-re- sponse relationship J Clin Endocrinol Metab (1961) 21799ndash805 4) Kriss JP Pleshakov V Chien JR Isolation and identification of the long-acting thyroid stimulator and its relation to hyperthyroidism and circumscribed pretibial myxedema J Clin Endocrinol Metab (1964) 241005ndash28 doi101210 jcem-24-10-1005 5) Kriss JP Inactivation of long-acting thyroid stimulator (LATS) by anti- kappa and anti-lamba antisera J Clin Endocrinol Metab (1968) 281440ndash4 doi101210jcem-28-10-1440 6) Volpeacute R The immunologic basis of Gravesrsquos disease N Engl J Med (1972) 287463ndash4 doi101056NEJM197208312870910 7) McKenzie JM Review pathogenesis of Gravesrsquo disease role of the long-acting thyroid stimulator J Clin Endocrinol Metab (1965) 25424ndash31 8) Mehdi SQ Nussey SS A radio-ligand receptor assay for the long-acting thy- roid stimulator Inhibition by the long-acting thyroid stimulator of the binding of radioiodinated thyroid stimulating hormone to human thyroid membranes Biochem J (1975) 145105ndash11 doi101042bj1450105 9)Shewring G Rees Smith B An improved radioreceptor assay for TSH receptor antibodies Clin Endocrinol (1982) 17409ndash17 doi101111j1365-22651982 tb01607x 10)Southgate K Creagh FM Teece M Kingswood C Rees Smith B A receptor assay for the measurement of TSH receptor antibodies in unextracted serum Clin Endocrinol (1984) 20539ndash48 doi101111j1365-22651984tb00102x 11)Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003
FRTL-5 bull Souběžně s vyacutevojem radioligandovyacutech receptorovyacutech testů dochaacutezelo k vyacutevoji
bdquobiotestůldquo Změna v in vivo na in vitro jako je použitiacute primaacuterniacutech buněčnyacutech kultur 1)
bull Dalšiacute zlepšeniacute přišlo s použitiacutem FRTL-5 buněk ndash netransformovanyacutech buněčnyacutech liniiacute krysiacutech thyroid epithelial buněk v kontinuaacutelniacute kultuře 2) Test byl založen na schopnosti purifikovanyacutech IgG indukovat produkci cAMP Naacutesledně bylo umožněno využiacutet pacientskeacute seacutera 3)
bull Tento test nesloužil jen pro diagnostiku ale měl zaacutesadniacute vyacuteznam v pochopeniacute patfyz vlastnostiacute a-TSHr
bull Kohn etal 4)5)6) vyvinuli monoklonaacutelniacute protilaacutetku k hodnoceniacute jejiacutech funkčniacutech vlastnostiacute
bull Použitiacute buněk FRTL-5 takeacute umožnilo dalšiacute studium funkčniacute heterogenity a-TSHr (samostatneacute posouzeniacute uacutečinků jednotlivyacutech IgG na dvě odlišneacute buněčneacute aktivity aktivity produkce cAMP a buněčneacuteho růstu) 7)
1)Toccafondi RS Aterini S Medici MA Rotella CM Tanini A Zonefrati R Thyroid-stimulating antibody (TSAb) detected in sera of Gravesrsquo patients using human thyroid cell cultures Clin Exp Immunol (1980) 40532ndash9 2) Ambesi-Impiombato FS Parks LAM Coon HG Culture of hormone-depen- dent functional epithelial cells from rat thyroids Proc Natl Acad Sci U S A (1980) 773455ndash9 doi101073pnas7763455 3) Vitti P Chiovato L Lopez G Lombardi A Santini F Mammoli C et al Measurement of TSAb directly in serum using FRTL-5 cells J Endocrinol Invest (1988) 11313ndash7 doi101007BF03350157 4) Yavin E Yavin Z Schneider MD Kohn LD Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor implications for receptor structure and the action of autoantibodies in Gravesrsquo disease Proc Natl Acad Sci U S A (1981) 783180ndash4 doi101073pnas7853180 5) Valente WA Vitti P Yavin Z Yavin E Rotella CM Grollman EF et al Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor stimulating and blocking antibodies derived from the lymphocytes of patients with Gravesrsquo disease Proc Natl Acad Sci U S A (1982) 796680ndash4 doi101073pnas79216680 6) Valente WA Yavin Z Yavin E Grollman EF Schneider M Rotella CM et al Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor the identification of blocking and stimulating antibodies J Endocrinol Invest (1982) 5293ndash301 doi101007BF03350517 7) Valente WA Vitti P Rotella CM Vaughan MM Aloj SM Grollman EF et al Antibodies that promote thyroid growth A distinct population of thyroid-stimulating autoantibodies N Engl J Med (1983) 3091028ndash34 doi101056NEJM198310273091705
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 1
bull Hlavniacute průlom přišel s naklonovaacuteniacutem TSHr v r 1989 1-3) ndash využitiacute lidskeacuteho TSHr pro RIA i bioassays 45) ndash senzitivita 96 pro RIA
bull Pomociacute mutačniacutech technik byly připraveny chimerickeacute TSHr
bull V 90 leacutetech byly vyvinuty monoklonaacutelniacute protilaacutetky proti C-terminus region rh-TSHr 67)
1)Parmentier M Libert F Maenhaut C Lefort Gerard C Perret J Van Sande J et al Molecular cloning of the thyrotropin receptor Science (1989) 2461620ndash2 doi101126science2556796 2)Nagayama Y Kaufman KD Seto P Rapoport B Molecular cloning sequence and functional expression of the cDNA for the human thyrotropin receptor Biochem Biophys Res Commun (1989) 1651184ndash90 doi1010160006- 291X(89)92727-7 3) Akamizu T Ikuyama S Saji M Kosugi S Kozak C McBride OW et al Cloning chromosomal assignment and regulation of the rat thyrotropin receptor expression of the gene is regulated by thyrotropin agents that increase cAMP levels and thyroid autoantibodies Proc Natl Acad Sci U S A (1990) 875677ndash81 doi101073pnas87155677 4)Ludgate M Perret J Parmentier M Gerard C Libert F Dumont JE et al Use of recombinant human thyrotropin receptor (TSH-R) expressed in mammalian cell lines to assay TSH-R autoantibodies Mol Cell Endocrinol (1991) 73R13ndash8 doi1010160303-7207(90)90050-I 5) Filetti S Foti D Costante G Rapoport B Recombinant human thyrotropin (TSH) receptor in a radioreceptor assay for the measurement of TSH receptor autoantibodies J Clin Endocrinol Metab (1991) 721096ndash101 doi101210 jcem-72-5-1096 6) Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 7)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 2
bull Druhaacute generace imunotestů (ELISA) ndash solid-phase ndash se staly standardem pro dg a-TSHr diacuteky přesnosti (988 senzitivita a 996 specifita) a non-RIA 123)
bull Použitiacutem rh-TSHr nebo vepřovyacute TSHr ziacuteskaacuteme stejnou analytickou přesnost3)
1)Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 2)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071 3)Kamijo K TSH-receptor antibody measurement in patients with various thyrotoxicosis and Hashimotorsquos thyroiditis a comparison of two two-step assays coated plate ELISA using porcine TSH-receptor and coated tube radio- assay using human recombinant TSH-receptor Endocr J (2003) 50113ndash6 doi101507endocrj50113
Monoclonal a-TSHr stimulujiacuteciacute
bull Na přelomu mileacutenia byly studovaacuteny stimulujiacuteciacute protilaacutetky a-TSHr 123)
bull Tato data jsou zaacutesadniacute pro pochopeniacute vztahů struktury a funkciacute TSHRr a jejiacute role v patogenezi Gravesovy choroby
bull To vše vedlo k izolaci a charakterizaci lidskeacute monoklonaacutelniacute protilaacutetky a-TSHr stimulujiacuteciacute ndash M22 4)
1)Ando T Latif R Pritsker A Moran T Nagayama Y Davies TF A monoclonal thyroid-stimulating antibody J Clin Invest (2002) 1101667ndash74 doi101172 JCI0216991 2)Costagliola S Franssen JDF Bonomi M Urizar E Willnich M Bergmann A et al Generation of a mouse monoclonal TSH receptor antibody with stimu- lating activity Biochem Biophys Res Commun (2002) 299891ndash6 doi101016 S0006-291X(02)02762-6 3)Sanders J Jeffreys J Depraetere H Richards T Evans M Kiddie A et al Thyroid-stimulating monoclonal antibodies Thyroid (2002) 121043ndash50 doi101089105072502321085135 4) Sanders J Evans M Premawardhana LDKE Depraetere H Jeffreys J Richards T et al Human monoclonal stimulating autoantibody Lancet (2003) 362126ndash8 doi101016S0140-6736(03)13866-4
Třetiacute generace testů ndash M22
bull V r2004 byl vyvinut test použitiacutem M22 ve formaacutetu ELISA 1) senzitivita 974 a specifita 992 (např Medipan)
bull Test byl vhodnyacute i pro automatizaci 23)
bull Dostupnost a znalost jak stimulujiacuteciacutech tak blokujiacuteciacutech protilaacutetek byla důležitaacute k pochopeniacute krystalickeacute struktury TSHr a jejiacutech interakciacute s a-TSHr 4) poukaacutezalo to na širokeacute překryvy epitopů mezi stimulujiacuteciacutemi a blokujiacuteciacutemi protilaacutetkami 4)
bull Roche nativniacute vepřovyacute TSH s M22
1)Rees Smith B Bolton J Young S Collyer A Weeden A Bradbury J et al A new assay for thyrotropin receptor autoantibodies Thyroid (2004) 14830ndash5 doi1010891050725042451248 2) Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003 3) Zophel K Roggenbuck D von Landenberg P Wunderlich G Gruning T Kotzerke J et al TSH receptor antibody (TRAb) assays based on the human monoclonal autoantibody M22 are more sensitive than bovine TSH based assays Horm Metab Res (2010) 4265ndash9 doi101055s-0029-1241196 4) Furmaniak J Sanders J Nunez Miguel R Rees Smith B Mechanisms of action of TSHR autoantibodies Horm Metab Res (2015) 47735ndash52 doi10105 5s-0035-1559648
Mc4 bioassay
bull Souběžně s testy 3-generace Kohn vyvinul test využiacutevajiacuteciacute bdquoMc4 chimeacuteruldquo založenou na metodaacutech chemiluminiscence 1)
bull Ciacutelem bylo měřit pouze stimulujiacuteciacute protilaacutetky a tiacutem dosaacutehnout jasneacuteho cutoff mezi pacienty s GD a kontrolami
bull Porovnaacuteniacute senzitivity a specifity v tabulce 2) bull Mc4 testy mohou byacutet využity jako testy prvniacute
volby pro pacienty s GD
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Mc4 bioassay
bull Testy s M22 diacuteky podobně specifitě a senzitivitě ale lepšiacute bdquoproveditelnostildquo jsou zatiacutem preferovanějšiacute
bull Daacutele jsou lepšiacute pro prognoacutezu GD než testy s M22 a leacutepe korelujiacute s aktivitou a zaacutevažnostiacute GD orbitopatiiacute 2)
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Bridge Assay
bull Novaacute technologie využitiacute chimeacuterickyacutech receptorů Mc4 a N-terminaacutelniacute TSHr fůsovanyacute s alkalickou fosfataacutezou 1) senzitivita 998 a specifita 995
bull TSI ndash Siemens tato metoda je založena na sendvičoveacutem kompetetivniacute formaacutetu kteryacute se lišiacute od klasickeacuteho kompetetivniacute formaacutetu komerčniacutech IMA druheacute a třetiacute generace 2)
1)Frank CU Braeth S Dietrich JW Wanjura D Loos U Bridge technology with TSH receptor chimera for sensitive direct detection of TSH receptor antibodies causing Gravesrsquo disease analytical and clinical evaluation Horm Metab Res (2015) 47880ndash8 doi101055s-0035-1554662 2)Tozzoli R DrsquoAurizio F Villalta D Giovanella L (2017) Evalu- ation of the first fully automated immunoassay method for the measurement of stimulating TSH receptor autoantibodies in Gravesrsquo disease Clin Chem Lab Med 5558ndash64
Mezinaacuterodniacute standard
bull Prvniacute mezinaacuterodniacute standard připraven v r 1995 WHO označeniacute 90672 Připraven ECBS zdroj pacientskaacute plasma
bull V r 2006 nahrazen lidskou monoklonaacutelniacute protilaacutetkou M22 (NIBSC 08240) odkazuje na detekci S-TRAb 1)
1) Diana T1 Kanitz M Lehmann M Li Y Olivo PD Kahaly GJ Standardization of a bioassay for thyrotropin receptor stimulating autoantibodies Thyroid 2015 Feb25(2)169-75
EHK ndash SEKK AT217
EHK ndash SEKK AT217
SEKK - Dotazniacutek
EHK ndash SEKK AT113
EHK ndash SEKK AT113
Hashimotova tyreoiditida (HT)
bull HT 1) a SLE 2) byly prvniacute dvě autoimunitniacute onemocněniacute kde se prokaacutezala genetickaacute asociace (geny MHC třiacutedy II) 70 leacuteta
bull Nicmeacuteně nebyl nalezen gen kteryacute by spouštěl HT nalezeny pouze geny ktereacute přispiacutevajiacute k fenotypu onemocněniacute 3)
1)VladutiuAO RoseNR Autoimmunemurine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type Science 19711741137ndash9 2)Grumet FC Coukell A Bodmer JG Bodmer WF McDevitt HO Histocompatibility (HL-A) antigens associated with systemic lupus erythematosus A possible genetic predisposition to disease N Engl J Med 1971285193ndash6 3) Simmonds MJ Gough SC The search for the genetic contribution to autoimmune thyroid disease the never ending story Brief Funct Genomics 20111077ndash90
Hashimotova tyreoiditida
bull Do 50 let raritniacute onemocněniacute nyniacute nejběžnějšiacute s prevalenciacute 81000 biochemickyacute naacutelez + autoprotilaacutetky 461000
bull Ženymuži 81
a-TPO
bull Přiacutetomnost protilaacutetek TPOAb obvykle předchaacuteziacute vzniku tyreoidaacutelniacute dysfunkce
bull Patogenetickaacute role protilaacutetek TgAb zůstaacutevaacute nejasnaacute
a-TPO
bull Autoprotilaacutetky TPOAb byly nejdřiacuteve popsaacuteny jako antimikrozomaacutelniacute autoprotilaacutetky (AMA) neboť bylo zjištěno že reagujiacute s neupravenyacutemi membraacutenami tyreoidaacutelniacutech buněk
bull Mikrozomaacutelniacute antigen byl později popsaacuten jako TPO
bull Dřiacuteve se využiacutevaly ke stanoveniacute TPO metody imunofluorescenčniacute metody a aglutinačniacute testy s pasivniacutem barveniacutem erytrocytů
a-TPO jako rizikovyacute faktor
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TPO je znaacutemyacutem rizikovyacutem faktorem pro vznik tyreoidaacutelniacute dysfunkce pokud jsou pacienti leacutečeni lithiem amiodaronem interleukinem-2 nebo alfa-interferonem
a-TG
bull Tg vykazuje vysokou heterogenitu způsobenou rozdiacutely v posttranslačniacutech modifikaciacutech (glykosylace jodizace sulfatace atd) Během synteacutezy tyreoidaacutelniacuteho hormonu a jeho uvolněniacute je Tg polymerizovaacuten a degradovaacuten
bull Vlivem toho je imunologickaacute struktura Tg mimořaacutedně komplexniacute Charakteristika standardů pro Tg se může lišit v zaacutevislosti na vstupniacute lidskeacute tyreoidaacutelniacute tkaacuteni a použiteacutem purifikačniacutem procesu To vysvětluje proč jsou testy na TgAb a takeacute Tg tak obtiacutežně standardizovatelneacute
Titr protilaacutetek
bull Titr protilaacutetek literaacuterně koreluje s počtem autoreaktivniacutech lymfocytů ktereacute infiltrujiacute štiacutetnou žlaacutezu a sonografickyacutem obrazem 1)
bull a-TG nižšiacute senzitivita (60-80 u HT) a menšiacute specifita (pozitivniacute ve většiacute čaacutesti zdravyacutech kontrol) než a-TPO
bull a-TG a a-TPO představujiacute dva různeacute aspekty autoimunniacute odpovědi na štiacutetnou žlaacutezu a-TG by mohly odraacutežet počaacutetečniacute (vrozenyacute) typ imunitniacute odpovědi zatiacutemco a-TPO by mohly charakterizovat pozdějšiacute adaptivniacute imunitniacute odpovědi 2)
1)Pandit AA VijayWardeMMenon PS Correlation of number of intrathyroid lympho- cytes with antimicrosomal antibody titer in Hashimotos thyroiditis Diagn Cytopathol 20032863ndash5 2) Rose NR Autoimmune escalation through the crystal ball Clin Exp Immunol 20071479
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
FRTL-5 bull Souběžně s vyacutevojem radioligandovyacutech receptorovyacutech testů dochaacutezelo k vyacutevoji
bdquobiotestůldquo Změna v in vivo na in vitro jako je použitiacute primaacuterniacutech buněčnyacutech kultur 1)
bull Dalšiacute zlepšeniacute přišlo s použitiacutem FRTL-5 buněk ndash netransformovanyacutech buněčnyacutech liniiacute krysiacutech thyroid epithelial buněk v kontinuaacutelniacute kultuře 2) Test byl založen na schopnosti purifikovanyacutech IgG indukovat produkci cAMP Naacutesledně bylo umožněno využiacutet pacientskeacute seacutera 3)
bull Tento test nesloužil jen pro diagnostiku ale měl zaacutesadniacute vyacuteznam v pochopeniacute patfyz vlastnostiacute a-TSHr
bull Kohn etal 4)5)6) vyvinuli monoklonaacutelniacute protilaacutetku k hodnoceniacute jejiacutech funkčniacutech vlastnostiacute
bull Použitiacute buněk FRTL-5 takeacute umožnilo dalšiacute studium funkčniacute heterogenity a-TSHr (samostatneacute posouzeniacute uacutečinků jednotlivyacutech IgG na dvě odlišneacute buněčneacute aktivity aktivity produkce cAMP a buněčneacuteho růstu) 7)
1)Toccafondi RS Aterini S Medici MA Rotella CM Tanini A Zonefrati R Thyroid-stimulating antibody (TSAb) detected in sera of Gravesrsquo patients using human thyroid cell cultures Clin Exp Immunol (1980) 40532ndash9 2) Ambesi-Impiombato FS Parks LAM Coon HG Culture of hormone-depen- dent functional epithelial cells from rat thyroids Proc Natl Acad Sci U S A (1980) 773455ndash9 doi101073pnas7763455 3) Vitti P Chiovato L Lopez G Lombardi A Santini F Mammoli C et al Measurement of TSAb directly in serum using FRTL-5 cells J Endocrinol Invest (1988) 11313ndash7 doi101007BF03350157 4) Yavin E Yavin Z Schneider MD Kohn LD Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor implications for receptor structure and the action of autoantibodies in Gravesrsquo disease Proc Natl Acad Sci U S A (1981) 783180ndash4 doi101073pnas7853180 5) Valente WA Vitti P Yavin Z Yavin E Rotella CM Grollman EF et al Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor stimulating and blocking antibodies derived from the lymphocytes of patients with Gravesrsquo disease Proc Natl Acad Sci U S A (1982) 796680ndash4 doi101073pnas79216680 6) Valente WA Yavin Z Yavin E Grollman EF Schneider M Rotella CM et al Monoclonal antibodies to the thyrotropin receptor the identification of blocking and stimulating antibodies J Endocrinol Invest (1982) 5293ndash301 doi101007BF03350517 7) Valente WA Vitti P Rotella CM Vaughan MM Aloj SM Grollman EF et al Antibodies that promote thyroid growth A distinct population of thyroid-stimulating autoantibodies N Engl J Med (1983) 3091028ndash34 doi101056NEJM198310273091705
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 1
bull Hlavniacute průlom přišel s naklonovaacuteniacutem TSHr v r 1989 1-3) ndash využitiacute lidskeacuteho TSHr pro RIA i bioassays 45) ndash senzitivita 96 pro RIA
bull Pomociacute mutačniacutech technik byly připraveny chimerickeacute TSHr
bull V 90 leacutetech byly vyvinuty monoklonaacutelniacute protilaacutetky proti C-terminus region rh-TSHr 67)
1)Parmentier M Libert F Maenhaut C Lefort Gerard C Perret J Van Sande J et al Molecular cloning of the thyrotropin receptor Science (1989) 2461620ndash2 doi101126science2556796 2)Nagayama Y Kaufman KD Seto P Rapoport B Molecular cloning sequence and functional expression of the cDNA for the human thyrotropin receptor Biochem Biophys Res Commun (1989) 1651184ndash90 doi1010160006- 291X(89)92727-7 3) Akamizu T Ikuyama S Saji M Kosugi S Kozak C McBride OW et al Cloning chromosomal assignment and regulation of the rat thyrotropin receptor expression of the gene is regulated by thyrotropin agents that increase cAMP levels and thyroid autoantibodies Proc Natl Acad Sci U S A (1990) 875677ndash81 doi101073pnas87155677 4)Ludgate M Perret J Parmentier M Gerard C Libert F Dumont JE et al Use of recombinant human thyrotropin receptor (TSH-R) expressed in mammalian cell lines to assay TSH-R autoantibodies Mol Cell Endocrinol (1991) 73R13ndash8 doi1010160303-7207(90)90050-I 5) Filetti S Foti D Costante G Rapoport B Recombinant human thyrotropin (TSH) receptor in a radioreceptor assay for the measurement of TSH receptor autoantibodies J Clin Endocrinol Metab (1991) 721096ndash101 doi101210 jcem-72-5-1096 6) Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 7)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 2
bull Druhaacute generace imunotestů (ELISA) ndash solid-phase ndash se staly standardem pro dg a-TSHr diacuteky přesnosti (988 senzitivita a 996 specifita) a non-RIA 123)
bull Použitiacutem rh-TSHr nebo vepřovyacute TSHr ziacuteskaacuteme stejnou analytickou přesnost3)
1)Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 2)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071 3)Kamijo K TSH-receptor antibody measurement in patients with various thyrotoxicosis and Hashimotorsquos thyroiditis a comparison of two two-step assays coated plate ELISA using porcine TSH-receptor and coated tube radio- assay using human recombinant TSH-receptor Endocr J (2003) 50113ndash6 doi101507endocrj50113
Monoclonal a-TSHr stimulujiacuteciacute
bull Na přelomu mileacutenia byly studovaacuteny stimulujiacuteciacute protilaacutetky a-TSHr 123)
bull Tato data jsou zaacutesadniacute pro pochopeniacute vztahů struktury a funkciacute TSHRr a jejiacute role v patogenezi Gravesovy choroby
bull To vše vedlo k izolaci a charakterizaci lidskeacute monoklonaacutelniacute protilaacutetky a-TSHr stimulujiacuteciacute ndash M22 4)
1)Ando T Latif R Pritsker A Moran T Nagayama Y Davies TF A monoclonal thyroid-stimulating antibody J Clin Invest (2002) 1101667ndash74 doi101172 JCI0216991 2)Costagliola S Franssen JDF Bonomi M Urizar E Willnich M Bergmann A et al Generation of a mouse monoclonal TSH receptor antibody with stimu- lating activity Biochem Biophys Res Commun (2002) 299891ndash6 doi101016 S0006-291X(02)02762-6 3)Sanders J Jeffreys J Depraetere H Richards T Evans M Kiddie A et al Thyroid-stimulating monoclonal antibodies Thyroid (2002) 121043ndash50 doi101089105072502321085135 4) Sanders J Evans M Premawardhana LDKE Depraetere H Jeffreys J Richards T et al Human monoclonal stimulating autoantibody Lancet (2003) 362126ndash8 doi101016S0140-6736(03)13866-4
Třetiacute generace testů ndash M22
bull V r2004 byl vyvinut test použitiacutem M22 ve formaacutetu ELISA 1) senzitivita 974 a specifita 992 (např Medipan)
bull Test byl vhodnyacute i pro automatizaci 23)
bull Dostupnost a znalost jak stimulujiacuteciacutech tak blokujiacuteciacutech protilaacutetek byla důležitaacute k pochopeniacute krystalickeacute struktury TSHr a jejiacutech interakciacute s a-TSHr 4) poukaacutezalo to na širokeacute překryvy epitopů mezi stimulujiacuteciacutemi a blokujiacuteciacutemi protilaacutetkami 4)
bull Roche nativniacute vepřovyacute TSH s M22
1)Rees Smith B Bolton J Young S Collyer A Weeden A Bradbury J et al A new assay for thyrotropin receptor autoantibodies Thyroid (2004) 14830ndash5 doi1010891050725042451248 2) Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003 3) Zophel K Roggenbuck D von Landenberg P Wunderlich G Gruning T Kotzerke J et al TSH receptor antibody (TRAb) assays based on the human monoclonal autoantibody M22 are more sensitive than bovine TSH based assays Horm Metab Res (2010) 4265ndash9 doi101055s-0029-1241196 4) Furmaniak J Sanders J Nunez Miguel R Rees Smith B Mechanisms of action of TSHR autoantibodies Horm Metab Res (2015) 47735ndash52 doi10105 5s-0035-1559648
Mc4 bioassay
bull Souběžně s testy 3-generace Kohn vyvinul test využiacutevajiacuteciacute bdquoMc4 chimeacuteruldquo založenou na metodaacutech chemiluminiscence 1)
bull Ciacutelem bylo měřit pouze stimulujiacuteciacute protilaacutetky a tiacutem dosaacutehnout jasneacuteho cutoff mezi pacienty s GD a kontrolami
bull Porovnaacuteniacute senzitivity a specifity v tabulce 2) bull Mc4 testy mohou byacutet využity jako testy prvniacute
volby pro pacienty s GD
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Mc4 bioassay
bull Testy s M22 diacuteky podobně specifitě a senzitivitě ale lepšiacute bdquoproveditelnostildquo jsou zatiacutem preferovanějšiacute
bull Daacutele jsou lepšiacute pro prognoacutezu GD než testy s M22 a leacutepe korelujiacute s aktivitou a zaacutevažnostiacute GD orbitopatiiacute 2)
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Bridge Assay
bull Novaacute technologie využitiacute chimeacuterickyacutech receptorů Mc4 a N-terminaacutelniacute TSHr fůsovanyacute s alkalickou fosfataacutezou 1) senzitivita 998 a specifita 995
bull TSI ndash Siemens tato metoda je založena na sendvičoveacutem kompetetivniacute formaacutetu kteryacute se lišiacute od klasickeacuteho kompetetivniacute formaacutetu komerčniacutech IMA druheacute a třetiacute generace 2)
1)Frank CU Braeth S Dietrich JW Wanjura D Loos U Bridge technology with TSH receptor chimera for sensitive direct detection of TSH receptor antibodies causing Gravesrsquo disease analytical and clinical evaluation Horm Metab Res (2015) 47880ndash8 doi101055s-0035-1554662 2)Tozzoli R DrsquoAurizio F Villalta D Giovanella L (2017) Evalu- ation of the first fully automated immunoassay method for the measurement of stimulating TSH receptor autoantibodies in Gravesrsquo disease Clin Chem Lab Med 5558ndash64
Mezinaacuterodniacute standard
bull Prvniacute mezinaacuterodniacute standard připraven v r 1995 WHO označeniacute 90672 Připraven ECBS zdroj pacientskaacute plasma
bull V r 2006 nahrazen lidskou monoklonaacutelniacute protilaacutetkou M22 (NIBSC 08240) odkazuje na detekci S-TRAb 1)
1) Diana T1 Kanitz M Lehmann M Li Y Olivo PD Kahaly GJ Standardization of a bioassay for thyrotropin receptor stimulating autoantibodies Thyroid 2015 Feb25(2)169-75
EHK ndash SEKK AT217
EHK ndash SEKK AT217
SEKK - Dotazniacutek
EHK ndash SEKK AT113
EHK ndash SEKK AT113
Hashimotova tyreoiditida (HT)
bull HT 1) a SLE 2) byly prvniacute dvě autoimunitniacute onemocněniacute kde se prokaacutezala genetickaacute asociace (geny MHC třiacutedy II) 70 leacuteta
bull Nicmeacuteně nebyl nalezen gen kteryacute by spouštěl HT nalezeny pouze geny ktereacute přispiacutevajiacute k fenotypu onemocněniacute 3)
1)VladutiuAO RoseNR Autoimmunemurine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type Science 19711741137ndash9 2)Grumet FC Coukell A Bodmer JG Bodmer WF McDevitt HO Histocompatibility (HL-A) antigens associated with systemic lupus erythematosus A possible genetic predisposition to disease N Engl J Med 1971285193ndash6 3) Simmonds MJ Gough SC The search for the genetic contribution to autoimmune thyroid disease the never ending story Brief Funct Genomics 20111077ndash90
Hashimotova tyreoiditida
bull Do 50 let raritniacute onemocněniacute nyniacute nejběžnějšiacute s prevalenciacute 81000 biochemickyacute naacutelez + autoprotilaacutetky 461000
bull Ženymuži 81
a-TPO
bull Přiacutetomnost protilaacutetek TPOAb obvykle předchaacuteziacute vzniku tyreoidaacutelniacute dysfunkce
bull Patogenetickaacute role protilaacutetek TgAb zůstaacutevaacute nejasnaacute
a-TPO
bull Autoprotilaacutetky TPOAb byly nejdřiacuteve popsaacuteny jako antimikrozomaacutelniacute autoprotilaacutetky (AMA) neboť bylo zjištěno že reagujiacute s neupravenyacutemi membraacutenami tyreoidaacutelniacutech buněk
bull Mikrozomaacutelniacute antigen byl později popsaacuten jako TPO
bull Dřiacuteve se využiacutevaly ke stanoveniacute TPO metody imunofluorescenčniacute metody a aglutinačniacute testy s pasivniacutem barveniacutem erytrocytů
a-TPO jako rizikovyacute faktor
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TPO je znaacutemyacutem rizikovyacutem faktorem pro vznik tyreoidaacutelniacute dysfunkce pokud jsou pacienti leacutečeni lithiem amiodaronem interleukinem-2 nebo alfa-interferonem
a-TG
bull Tg vykazuje vysokou heterogenitu způsobenou rozdiacutely v posttranslačniacutech modifikaciacutech (glykosylace jodizace sulfatace atd) Během synteacutezy tyreoidaacutelniacuteho hormonu a jeho uvolněniacute je Tg polymerizovaacuten a degradovaacuten
bull Vlivem toho je imunologickaacute struktura Tg mimořaacutedně komplexniacute Charakteristika standardů pro Tg se může lišit v zaacutevislosti na vstupniacute lidskeacute tyreoidaacutelniacute tkaacuteni a použiteacutem purifikačniacutem procesu To vysvětluje proč jsou testy na TgAb a takeacute Tg tak obtiacutežně standardizovatelneacute
Titr protilaacutetek
bull Titr protilaacutetek literaacuterně koreluje s počtem autoreaktivniacutech lymfocytů ktereacute infiltrujiacute štiacutetnou žlaacutezu a sonografickyacutem obrazem 1)
bull a-TG nižšiacute senzitivita (60-80 u HT) a menšiacute specifita (pozitivniacute ve většiacute čaacutesti zdravyacutech kontrol) než a-TPO
bull a-TG a a-TPO představujiacute dva různeacute aspekty autoimunniacute odpovědi na štiacutetnou žlaacutezu a-TG by mohly odraacutežet počaacutetečniacute (vrozenyacute) typ imunitniacute odpovědi zatiacutemco a-TPO by mohly charakterizovat pozdějšiacute adaptivniacute imunitniacute odpovědi 2)
1)Pandit AA VijayWardeMMenon PS Correlation of number of intrathyroid lympho- cytes with antimicrosomal antibody titer in Hashimotos thyroiditis Diagn Cytopathol 20032863ndash5 2) Rose NR Autoimmune escalation through the crystal ball Clin Exp Immunol 20071479
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 1
bull Hlavniacute průlom přišel s naklonovaacuteniacutem TSHr v r 1989 1-3) ndash využitiacute lidskeacuteho TSHr pro RIA i bioassays 45) ndash senzitivita 96 pro RIA
bull Pomociacute mutačniacutech technik byly připraveny chimerickeacute TSHr
bull V 90 leacutetech byly vyvinuty monoklonaacutelniacute protilaacutetky proti C-terminus region rh-TSHr 67)
1)Parmentier M Libert F Maenhaut C Lefort Gerard C Perret J Van Sande J et al Molecular cloning of the thyrotropin receptor Science (1989) 2461620ndash2 doi101126science2556796 2)Nagayama Y Kaufman KD Seto P Rapoport B Molecular cloning sequence and functional expression of the cDNA for the human thyrotropin receptor Biochem Biophys Res Commun (1989) 1651184ndash90 doi1010160006- 291X(89)92727-7 3) Akamizu T Ikuyama S Saji M Kosugi S Kozak C McBride OW et al Cloning chromosomal assignment and regulation of the rat thyrotropin receptor expression of the gene is regulated by thyrotropin agents that increase cAMP levels and thyroid autoantibodies Proc Natl Acad Sci U S A (1990) 875677ndash81 doi101073pnas87155677 4)Ludgate M Perret J Parmentier M Gerard C Libert F Dumont JE et al Use of recombinant human thyrotropin receptor (TSH-R) expressed in mammalian cell lines to assay TSH-R autoantibodies Mol Cell Endocrinol (1991) 73R13ndash8 doi1010160303-7207(90)90050-I 5) Filetti S Foti D Costante G Rapoport B Recombinant human thyrotropin (TSH) receptor in a radioreceptor assay for the measurement of TSH receptor autoantibodies J Clin Endocrinol Metab (1991) 721096ndash101 doi101210 jcem-72-5-1096 6) Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 7)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 2
bull Druhaacute generace imunotestů (ELISA) ndash solid-phase ndash se staly standardem pro dg a-TSHr diacuteky přesnosti (988 senzitivita a 996 specifita) a non-RIA 123)
bull Použitiacutem rh-TSHr nebo vepřovyacute TSHr ziacuteskaacuteme stejnou analytickou přesnost3)
1)Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 2)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071 3)Kamijo K TSH-receptor antibody measurement in patients with various thyrotoxicosis and Hashimotorsquos thyroiditis a comparison of two two-step assays coated plate ELISA using porcine TSH-receptor and coated tube radio- assay using human recombinant TSH-receptor Endocr J (2003) 50113ndash6 doi101507endocrj50113
Monoclonal a-TSHr stimulujiacuteciacute
bull Na přelomu mileacutenia byly studovaacuteny stimulujiacuteciacute protilaacutetky a-TSHr 123)
bull Tato data jsou zaacutesadniacute pro pochopeniacute vztahů struktury a funkciacute TSHRr a jejiacute role v patogenezi Gravesovy choroby
bull To vše vedlo k izolaci a charakterizaci lidskeacute monoklonaacutelniacute protilaacutetky a-TSHr stimulujiacuteciacute ndash M22 4)
1)Ando T Latif R Pritsker A Moran T Nagayama Y Davies TF A monoclonal thyroid-stimulating antibody J Clin Invest (2002) 1101667ndash74 doi101172 JCI0216991 2)Costagliola S Franssen JDF Bonomi M Urizar E Willnich M Bergmann A et al Generation of a mouse monoclonal TSH receptor antibody with stimu- lating activity Biochem Biophys Res Commun (2002) 299891ndash6 doi101016 S0006-291X(02)02762-6 3)Sanders J Jeffreys J Depraetere H Richards T Evans M Kiddie A et al Thyroid-stimulating monoclonal antibodies Thyroid (2002) 121043ndash50 doi101089105072502321085135 4) Sanders J Evans M Premawardhana LDKE Depraetere H Jeffreys J Richards T et al Human monoclonal stimulating autoantibody Lancet (2003) 362126ndash8 doi101016S0140-6736(03)13866-4
Třetiacute generace testů ndash M22
bull V r2004 byl vyvinut test použitiacutem M22 ve formaacutetu ELISA 1) senzitivita 974 a specifita 992 (např Medipan)
bull Test byl vhodnyacute i pro automatizaci 23)
bull Dostupnost a znalost jak stimulujiacuteciacutech tak blokujiacuteciacutech protilaacutetek byla důležitaacute k pochopeniacute krystalickeacute struktury TSHr a jejiacutech interakciacute s a-TSHr 4) poukaacutezalo to na širokeacute překryvy epitopů mezi stimulujiacuteciacutemi a blokujiacuteciacutemi protilaacutetkami 4)
bull Roche nativniacute vepřovyacute TSH s M22
1)Rees Smith B Bolton J Young S Collyer A Weeden A Bradbury J et al A new assay for thyrotropin receptor autoantibodies Thyroid (2004) 14830ndash5 doi1010891050725042451248 2) Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003 3) Zophel K Roggenbuck D von Landenberg P Wunderlich G Gruning T Kotzerke J et al TSH receptor antibody (TRAb) assays based on the human monoclonal autoantibody M22 are more sensitive than bovine TSH based assays Horm Metab Res (2010) 4265ndash9 doi101055s-0029-1241196 4) Furmaniak J Sanders J Nunez Miguel R Rees Smith B Mechanisms of action of TSHR autoantibodies Horm Metab Res (2015) 47735ndash52 doi10105 5s-0035-1559648
Mc4 bioassay
bull Souběžně s testy 3-generace Kohn vyvinul test využiacutevajiacuteciacute bdquoMc4 chimeacuteruldquo založenou na metodaacutech chemiluminiscence 1)
bull Ciacutelem bylo měřit pouze stimulujiacuteciacute protilaacutetky a tiacutem dosaacutehnout jasneacuteho cutoff mezi pacienty s GD a kontrolami
bull Porovnaacuteniacute senzitivity a specifity v tabulce 2) bull Mc4 testy mohou byacutet využity jako testy prvniacute
volby pro pacienty s GD
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Mc4 bioassay
bull Testy s M22 diacuteky podobně specifitě a senzitivitě ale lepšiacute bdquoproveditelnostildquo jsou zatiacutem preferovanějšiacute
bull Daacutele jsou lepšiacute pro prognoacutezu GD než testy s M22 a leacutepe korelujiacute s aktivitou a zaacutevažnostiacute GD orbitopatiiacute 2)
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Bridge Assay
bull Novaacute technologie využitiacute chimeacuterickyacutech receptorů Mc4 a N-terminaacutelniacute TSHr fůsovanyacute s alkalickou fosfataacutezou 1) senzitivita 998 a specifita 995
bull TSI ndash Siemens tato metoda je založena na sendvičoveacutem kompetetivniacute formaacutetu kteryacute se lišiacute od klasickeacuteho kompetetivniacute formaacutetu komerčniacutech IMA druheacute a třetiacute generace 2)
1)Frank CU Braeth S Dietrich JW Wanjura D Loos U Bridge technology with TSH receptor chimera for sensitive direct detection of TSH receptor antibodies causing Gravesrsquo disease analytical and clinical evaluation Horm Metab Res (2015) 47880ndash8 doi101055s-0035-1554662 2)Tozzoli R DrsquoAurizio F Villalta D Giovanella L (2017) Evalu- ation of the first fully automated immunoassay method for the measurement of stimulating TSH receptor autoantibodies in Gravesrsquo disease Clin Chem Lab Med 5558ndash64
Mezinaacuterodniacute standard
bull Prvniacute mezinaacuterodniacute standard připraven v r 1995 WHO označeniacute 90672 Připraven ECBS zdroj pacientskaacute plasma
bull V r 2006 nahrazen lidskou monoklonaacutelniacute protilaacutetkou M22 (NIBSC 08240) odkazuje na detekci S-TRAb 1)
1) Diana T1 Kanitz M Lehmann M Li Y Olivo PD Kahaly GJ Standardization of a bioassay for thyrotropin receptor stimulating autoantibodies Thyroid 2015 Feb25(2)169-75
EHK ndash SEKK AT217
EHK ndash SEKK AT217
SEKK - Dotazniacutek
EHK ndash SEKK AT113
EHK ndash SEKK AT113
Hashimotova tyreoiditida (HT)
bull HT 1) a SLE 2) byly prvniacute dvě autoimunitniacute onemocněniacute kde se prokaacutezala genetickaacute asociace (geny MHC třiacutedy II) 70 leacuteta
bull Nicmeacuteně nebyl nalezen gen kteryacute by spouštěl HT nalezeny pouze geny ktereacute přispiacutevajiacute k fenotypu onemocněniacute 3)
1)VladutiuAO RoseNR Autoimmunemurine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type Science 19711741137ndash9 2)Grumet FC Coukell A Bodmer JG Bodmer WF McDevitt HO Histocompatibility (HL-A) antigens associated with systemic lupus erythematosus A possible genetic predisposition to disease N Engl J Med 1971285193ndash6 3) Simmonds MJ Gough SC The search for the genetic contribution to autoimmune thyroid disease the never ending story Brief Funct Genomics 20111077ndash90
Hashimotova tyreoiditida
bull Do 50 let raritniacute onemocněniacute nyniacute nejběžnějšiacute s prevalenciacute 81000 biochemickyacute naacutelez + autoprotilaacutetky 461000
bull Ženymuži 81
a-TPO
bull Přiacutetomnost protilaacutetek TPOAb obvykle předchaacuteziacute vzniku tyreoidaacutelniacute dysfunkce
bull Patogenetickaacute role protilaacutetek TgAb zůstaacutevaacute nejasnaacute
a-TPO
bull Autoprotilaacutetky TPOAb byly nejdřiacuteve popsaacuteny jako antimikrozomaacutelniacute autoprotilaacutetky (AMA) neboť bylo zjištěno že reagujiacute s neupravenyacutemi membraacutenami tyreoidaacutelniacutech buněk
bull Mikrozomaacutelniacute antigen byl později popsaacuten jako TPO
bull Dřiacuteve se využiacutevaly ke stanoveniacute TPO metody imunofluorescenčniacute metody a aglutinačniacute testy s pasivniacutem barveniacutem erytrocytů
a-TPO jako rizikovyacute faktor
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TPO je znaacutemyacutem rizikovyacutem faktorem pro vznik tyreoidaacutelniacute dysfunkce pokud jsou pacienti leacutečeni lithiem amiodaronem interleukinem-2 nebo alfa-interferonem
a-TG
bull Tg vykazuje vysokou heterogenitu způsobenou rozdiacutely v posttranslačniacutech modifikaciacutech (glykosylace jodizace sulfatace atd) Během synteacutezy tyreoidaacutelniacuteho hormonu a jeho uvolněniacute je Tg polymerizovaacuten a degradovaacuten
bull Vlivem toho je imunologickaacute struktura Tg mimořaacutedně komplexniacute Charakteristika standardů pro Tg se může lišit v zaacutevislosti na vstupniacute lidskeacute tyreoidaacutelniacute tkaacuteni a použiteacutem purifikačniacutem procesu To vysvětluje proč jsou testy na TgAb a takeacute Tg tak obtiacutežně standardizovatelneacute
Titr protilaacutetek
bull Titr protilaacutetek literaacuterně koreluje s počtem autoreaktivniacutech lymfocytů ktereacute infiltrujiacute štiacutetnou žlaacutezu a sonografickyacutem obrazem 1)
bull a-TG nižšiacute senzitivita (60-80 u HT) a menšiacute specifita (pozitivniacute ve většiacute čaacutesti zdravyacutech kontrol) než a-TPO
bull a-TG a a-TPO představujiacute dva různeacute aspekty autoimunniacute odpovědi na štiacutetnou žlaacutezu a-TG by mohly odraacutežet počaacutetečniacute (vrozenyacute) typ imunitniacute odpovědi zatiacutemco a-TPO by mohly charakterizovat pozdějšiacute adaptivniacute imunitniacute odpovědi 2)
1)Pandit AA VijayWardeMMenon PS Correlation of number of intrathyroid lympho- cytes with antimicrosomal antibody titer in Hashimotos thyroiditis Diagn Cytopathol 20032863ndash5 2) Rose NR Autoimmune escalation through the crystal ball Clin Exp Immunol 20071479
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
Clonovaacuteniacute TSHr ndash 2
bull Druhaacute generace imunotestů (ELISA) ndash solid-phase ndash se staly standardem pro dg a-TSHr diacuteky přesnosti (988 senzitivita a 996 specifita) a non-RIA 123)
bull Použitiacutem rh-TSHr nebo vepřovyacute TSHr ziacuteskaacuteme stejnou analytickou přesnost3)
1)Costagliola S Morgenthaler NG Hoermann R Badenhoop K Struck J Freitag D et al Second generation assay for thyrotropin receptor antibodies has superior diagnostic sensitivity for Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (1999) 8490ndash7 doi101210jc84190 2)Sanders J Oda Y Roberts S Kiddie A Richards T Bolton J et al The inter- action of TSH receptor autoantibodies with 125 I-labelled TSH receptor J Clin Endocrinol Metab (1999) 843797ndash802 doi101210jcem84106071 3)Kamijo K TSH-receptor antibody measurement in patients with various thyrotoxicosis and Hashimotorsquos thyroiditis a comparison of two two-step assays coated plate ELISA using porcine TSH-receptor and coated tube radio- assay using human recombinant TSH-receptor Endocr J (2003) 50113ndash6 doi101507endocrj50113
Monoclonal a-TSHr stimulujiacuteciacute
bull Na přelomu mileacutenia byly studovaacuteny stimulujiacuteciacute protilaacutetky a-TSHr 123)
bull Tato data jsou zaacutesadniacute pro pochopeniacute vztahů struktury a funkciacute TSHRr a jejiacute role v patogenezi Gravesovy choroby
bull To vše vedlo k izolaci a charakterizaci lidskeacute monoklonaacutelniacute protilaacutetky a-TSHr stimulujiacuteciacute ndash M22 4)
1)Ando T Latif R Pritsker A Moran T Nagayama Y Davies TF A monoclonal thyroid-stimulating antibody J Clin Invest (2002) 1101667ndash74 doi101172 JCI0216991 2)Costagliola S Franssen JDF Bonomi M Urizar E Willnich M Bergmann A et al Generation of a mouse monoclonal TSH receptor antibody with stimu- lating activity Biochem Biophys Res Commun (2002) 299891ndash6 doi101016 S0006-291X(02)02762-6 3)Sanders J Jeffreys J Depraetere H Richards T Evans M Kiddie A et al Thyroid-stimulating monoclonal antibodies Thyroid (2002) 121043ndash50 doi101089105072502321085135 4) Sanders J Evans M Premawardhana LDKE Depraetere H Jeffreys J Richards T et al Human monoclonal stimulating autoantibody Lancet (2003) 362126ndash8 doi101016S0140-6736(03)13866-4
Třetiacute generace testů ndash M22
bull V r2004 byl vyvinut test použitiacutem M22 ve formaacutetu ELISA 1) senzitivita 974 a specifita 992 (např Medipan)
bull Test byl vhodnyacute i pro automatizaci 23)
bull Dostupnost a znalost jak stimulujiacuteciacutech tak blokujiacuteciacutech protilaacutetek byla důležitaacute k pochopeniacute krystalickeacute struktury TSHr a jejiacutech interakciacute s a-TSHr 4) poukaacutezalo to na širokeacute překryvy epitopů mezi stimulujiacuteciacutemi a blokujiacuteciacutemi protilaacutetkami 4)
bull Roche nativniacute vepřovyacute TSH s M22
1)Rees Smith B Bolton J Young S Collyer A Weeden A Bradbury J et al A new assay for thyrotropin receptor autoantibodies Thyroid (2004) 14830ndash5 doi1010891050725042451248 2) Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003 3) Zophel K Roggenbuck D von Landenberg P Wunderlich G Gruning T Kotzerke J et al TSH receptor antibody (TRAb) assays based on the human monoclonal autoantibody M22 are more sensitive than bovine TSH based assays Horm Metab Res (2010) 4265ndash9 doi101055s-0029-1241196 4) Furmaniak J Sanders J Nunez Miguel R Rees Smith B Mechanisms of action of TSHR autoantibodies Horm Metab Res (2015) 47735ndash52 doi10105 5s-0035-1559648
Mc4 bioassay
bull Souběžně s testy 3-generace Kohn vyvinul test využiacutevajiacuteciacute bdquoMc4 chimeacuteruldquo založenou na metodaacutech chemiluminiscence 1)
bull Ciacutelem bylo měřit pouze stimulujiacuteciacute protilaacutetky a tiacutem dosaacutehnout jasneacuteho cutoff mezi pacienty s GD a kontrolami
bull Porovnaacuteniacute senzitivity a specifity v tabulce 2) bull Mc4 testy mohou byacutet využity jako testy prvniacute
volby pro pacienty s GD
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Mc4 bioassay
bull Testy s M22 diacuteky podobně specifitě a senzitivitě ale lepšiacute bdquoproveditelnostildquo jsou zatiacutem preferovanějšiacute
bull Daacutele jsou lepšiacute pro prognoacutezu GD než testy s M22 a leacutepe korelujiacute s aktivitou a zaacutevažnostiacute GD orbitopatiiacute 2)
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Bridge Assay
bull Novaacute technologie využitiacute chimeacuterickyacutech receptorů Mc4 a N-terminaacutelniacute TSHr fůsovanyacute s alkalickou fosfataacutezou 1) senzitivita 998 a specifita 995
bull TSI ndash Siemens tato metoda je založena na sendvičoveacutem kompetetivniacute formaacutetu kteryacute se lišiacute od klasickeacuteho kompetetivniacute formaacutetu komerčniacutech IMA druheacute a třetiacute generace 2)
1)Frank CU Braeth S Dietrich JW Wanjura D Loos U Bridge technology with TSH receptor chimera for sensitive direct detection of TSH receptor antibodies causing Gravesrsquo disease analytical and clinical evaluation Horm Metab Res (2015) 47880ndash8 doi101055s-0035-1554662 2)Tozzoli R DrsquoAurizio F Villalta D Giovanella L (2017) Evalu- ation of the first fully automated immunoassay method for the measurement of stimulating TSH receptor autoantibodies in Gravesrsquo disease Clin Chem Lab Med 5558ndash64
Mezinaacuterodniacute standard
bull Prvniacute mezinaacuterodniacute standard připraven v r 1995 WHO označeniacute 90672 Připraven ECBS zdroj pacientskaacute plasma
bull V r 2006 nahrazen lidskou monoklonaacutelniacute protilaacutetkou M22 (NIBSC 08240) odkazuje na detekci S-TRAb 1)
1) Diana T1 Kanitz M Lehmann M Li Y Olivo PD Kahaly GJ Standardization of a bioassay for thyrotropin receptor stimulating autoantibodies Thyroid 2015 Feb25(2)169-75
EHK ndash SEKK AT217
EHK ndash SEKK AT217
SEKK - Dotazniacutek
EHK ndash SEKK AT113
EHK ndash SEKK AT113
Hashimotova tyreoiditida (HT)
bull HT 1) a SLE 2) byly prvniacute dvě autoimunitniacute onemocněniacute kde se prokaacutezala genetickaacute asociace (geny MHC třiacutedy II) 70 leacuteta
bull Nicmeacuteně nebyl nalezen gen kteryacute by spouštěl HT nalezeny pouze geny ktereacute přispiacutevajiacute k fenotypu onemocněniacute 3)
1)VladutiuAO RoseNR Autoimmunemurine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type Science 19711741137ndash9 2)Grumet FC Coukell A Bodmer JG Bodmer WF McDevitt HO Histocompatibility (HL-A) antigens associated with systemic lupus erythematosus A possible genetic predisposition to disease N Engl J Med 1971285193ndash6 3) Simmonds MJ Gough SC The search for the genetic contribution to autoimmune thyroid disease the never ending story Brief Funct Genomics 20111077ndash90
Hashimotova tyreoiditida
bull Do 50 let raritniacute onemocněniacute nyniacute nejběžnějšiacute s prevalenciacute 81000 biochemickyacute naacutelez + autoprotilaacutetky 461000
bull Ženymuži 81
a-TPO
bull Přiacutetomnost protilaacutetek TPOAb obvykle předchaacuteziacute vzniku tyreoidaacutelniacute dysfunkce
bull Patogenetickaacute role protilaacutetek TgAb zůstaacutevaacute nejasnaacute
a-TPO
bull Autoprotilaacutetky TPOAb byly nejdřiacuteve popsaacuteny jako antimikrozomaacutelniacute autoprotilaacutetky (AMA) neboť bylo zjištěno že reagujiacute s neupravenyacutemi membraacutenami tyreoidaacutelniacutech buněk
bull Mikrozomaacutelniacute antigen byl později popsaacuten jako TPO
bull Dřiacuteve se využiacutevaly ke stanoveniacute TPO metody imunofluorescenčniacute metody a aglutinačniacute testy s pasivniacutem barveniacutem erytrocytů
a-TPO jako rizikovyacute faktor
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TPO je znaacutemyacutem rizikovyacutem faktorem pro vznik tyreoidaacutelniacute dysfunkce pokud jsou pacienti leacutečeni lithiem amiodaronem interleukinem-2 nebo alfa-interferonem
a-TG
bull Tg vykazuje vysokou heterogenitu způsobenou rozdiacutely v posttranslačniacutech modifikaciacutech (glykosylace jodizace sulfatace atd) Během synteacutezy tyreoidaacutelniacuteho hormonu a jeho uvolněniacute je Tg polymerizovaacuten a degradovaacuten
bull Vlivem toho je imunologickaacute struktura Tg mimořaacutedně komplexniacute Charakteristika standardů pro Tg se může lišit v zaacutevislosti na vstupniacute lidskeacute tyreoidaacutelniacute tkaacuteni a použiteacutem purifikačniacutem procesu To vysvětluje proč jsou testy na TgAb a takeacute Tg tak obtiacutežně standardizovatelneacute
Titr protilaacutetek
bull Titr protilaacutetek literaacuterně koreluje s počtem autoreaktivniacutech lymfocytů ktereacute infiltrujiacute štiacutetnou žlaacutezu a sonografickyacutem obrazem 1)
bull a-TG nižšiacute senzitivita (60-80 u HT) a menšiacute specifita (pozitivniacute ve většiacute čaacutesti zdravyacutech kontrol) než a-TPO
bull a-TG a a-TPO představujiacute dva různeacute aspekty autoimunniacute odpovědi na štiacutetnou žlaacutezu a-TG by mohly odraacutežet počaacutetečniacute (vrozenyacute) typ imunitniacute odpovědi zatiacutemco a-TPO by mohly charakterizovat pozdějšiacute adaptivniacute imunitniacute odpovědi 2)
1)Pandit AA VijayWardeMMenon PS Correlation of number of intrathyroid lympho- cytes with antimicrosomal antibody titer in Hashimotos thyroiditis Diagn Cytopathol 20032863ndash5 2) Rose NR Autoimmune escalation through the crystal ball Clin Exp Immunol 20071479
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
Monoclonal a-TSHr stimulujiacuteciacute
bull Na přelomu mileacutenia byly studovaacuteny stimulujiacuteciacute protilaacutetky a-TSHr 123)
bull Tato data jsou zaacutesadniacute pro pochopeniacute vztahů struktury a funkciacute TSHRr a jejiacute role v patogenezi Gravesovy choroby
bull To vše vedlo k izolaci a charakterizaci lidskeacute monoklonaacutelniacute protilaacutetky a-TSHr stimulujiacuteciacute ndash M22 4)
1)Ando T Latif R Pritsker A Moran T Nagayama Y Davies TF A monoclonal thyroid-stimulating antibody J Clin Invest (2002) 1101667ndash74 doi101172 JCI0216991 2)Costagliola S Franssen JDF Bonomi M Urizar E Willnich M Bergmann A et al Generation of a mouse monoclonal TSH receptor antibody with stimu- lating activity Biochem Biophys Res Commun (2002) 299891ndash6 doi101016 S0006-291X(02)02762-6 3)Sanders J Jeffreys J Depraetere H Richards T Evans M Kiddie A et al Thyroid-stimulating monoclonal antibodies Thyroid (2002) 121043ndash50 doi101089105072502321085135 4) Sanders J Evans M Premawardhana LDKE Depraetere H Jeffreys J Richards T et al Human monoclonal stimulating autoantibody Lancet (2003) 362126ndash8 doi101016S0140-6736(03)13866-4
Třetiacute generace testů ndash M22
bull V r2004 byl vyvinut test použitiacutem M22 ve formaacutetu ELISA 1) senzitivita 974 a specifita 992 (např Medipan)
bull Test byl vhodnyacute i pro automatizaci 23)
bull Dostupnost a znalost jak stimulujiacuteciacutech tak blokujiacuteciacutech protilaacutetek byla důležitaacute k pochopeniacute krystalickeacute struktury TSHr a jejiacutech interakciacute s a-TSHr 4) poukaacutezalo to na širokeacute překryvy epitopů mezi stimulujiacuteciacutemi a blokujiacuteciacutemi protilaacutetkami 4)
bull Roche nativniacute vepřovyacute TSH s M22
1)Rees Smith B Bolton J Young S Collyer A Weeden A Bradbury J et al A new assay for thyrotropin receptor autoantibodies Thyroid (2004) 14830ndash5 doi1010891050725042451248 2) Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003 3) Zophel K Roggenbuck D von Landenberg P Wunderlich G Gruning T Kotzerke J et al TSH receptor antibody (TRAb) assays based on the human monoclonal autoantibody M22 are more sensitive than bovine TSH based assays Horm Metab Res (2010) 4265ndash9 doi101055s-0029-1241196 4) Furmaniak J Sanders J Nunez Miguel R Rees Smith B Mechanisms of action of TSHR autoantibodies Horm Metab Res (2015) 47735ndash52 doi10105 5s-0035-1559648
Mc4 bioassay
bull Souběžně s testy 3-generace Kohn vyvinul test využiacutevajiacuteciacute bdquoMc4 chimeacuteruldquo založenou na metodaacutech chemiluminiscence 1)
bull Ciacutelem bylo měřit pouze stimulujiacuteciacute protilaacutetky a tiacutem dosaacutehnout jasneacuteho cutoff mezi pacienty s GD a kontrolami
bull Porovnaacuteniacute senzitivity a specifity v tabulce 2) bull Mc4 testy mohou byacutet využity jako testy prvniacute
volby pro pacienty s GD
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Mc4 bioassay
bull Testy s M22 diacuteky podobně specifitě a senzitivitě ale lepšiacute bdquoproveditelnostildquo jsou zatiacutem preferovanějšiacute
bull Daacutele jsou lepšiacute pro prognoacutezu GD než testy s M22 a leacutepe korelujiacute s aktivitou a zaacutevažnostiacute GD orbitopatiiacute 2)
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Bridge Assay
bull Novaacute technologie využitiacute chimeacuterickyacutech receptorů Mc4 a N-terminaacutelniacute TSHr fůsovanyacute s alkalickou fosfataacutezou 1) senzitivita 998 a specifita 995
bull TSI ndash Siemens tato metoda je založena na sendvičoveacutem kompetetivniacute formaacutetu kteryacute se lišiacute od klasickeacuteho kompetetivniacute formaacutetu komerčniacutech IMA druheacute a třetiacute generace 2)
1)Frank CU Braeth S Dietrich JW Wanjura D Loos U Bridge technology with TSH receptor chimera for sensitive direct detection of TSH receptor antibodies causing Gravesrsquo disease analytical and clinical evaluation Horm Metab Res (2015) 47880ndash8 doi101055s-0035-1554662 2)Tozzoli R DrsquoAurizio F Villalta D Giovanella L (2017) Evalu- ation of the first fully automated immunoassay method for the measurement of stimulating TSH receptor autoantibodies in Gravesrsquo disease Clin Chem Lab Med 5558ndash64
Mezinaacuterodniacute standard
bull Prvniacute mezinaacuterodniacute standard připraven v r 1995 WHO označeniacute 90672 Připraven ECBS zdroj pacientskaacute plasma
bull V r 2006 nahrazen lidskou monoklonaacutelniacute protilaacutetkou M22 (NIBSC 08240) odkazuje na detekci S-TRAb 1)
1) Diana T1 Kanitz M Lehmann M Li Y Olivo PD Kahaly GJ Standardization of a bioassay for thyrotropin receptor stimulating autoantibodies Thyroid 2015 Feb25(2)169-75
EHK ndash SEKK AT217
EHK ndash SEKK AT217
SEKK - Dotazniacutek
EHK ndash SEKK AT113
EHK ndash SEKK AT113
Hashimotova tyreoiditida (HT)
bull HT 1) a SLE 2) byly prvniacute dvě autoimunitniacute onemocněniacute kde se prokaacutezala genetickaacute asociace (geny MHC třiacutedy II) 70 leacuteta
bull Nicmeacuteně nebyl nalezen gen kteryacute by spouštěl HT nalezeny pouze geny ktereacute přispiacutevajiacute k fenotypu onemocněniacute 3)
1)VladutiuAO RoseNR Autoimmunemurine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type Science 19711741137ndash9 2)Grumet FC Coukell A Bodmer JG Bodmer WF McDevitt HO Histocompatibility (HL-A) antigens associated with systemic lupus erythematosus A possible genetic predisposition to disease N Engl J Med 1971285193ndash6 3) Simmonds MJ Gough SC The search for the genetic contribution to autoimmune thyroid disease the never ending story Brief Funct Genomics 20111077ndash90
Hashimotova tyreoiditida
bull Do 50 let raritniacute onemocněniacute nyniacute nejběžnějšiacute s prevalenciacute 81000 biochemickyacute naacutelez + autoprotilaacutetky 461000
bull Ženymuži 81
a-TPO
bull Přiacutetomnost protilaacutetek TPOAb obvykle předchaacuteziacute vzniku tyreoidaacutelniacute dysfunkce
bull Patogenetickaacute role protilaacutetek TgAb zůstaacutevaacute nejasnaacute
a-TPO
bull Autoprotilaacutetky TPOAb byly nejdřiacuteve popsaacuteny jako antimikrozomaacutelniacute autoprotilaacutetky (AMA) neboť bylo zjištěno že reagujiacute s neupravenyacutemi membraacutenami tyreoidaacutelniacutech buněk
bull Mikrozomaacutelniacute antigen byl později popsaacuten jako TPO
bull Dřiacuteve se využiacutevaly ke stanoveniacute TPO metody imunofluorescenčniacute metody a aglutinačniacute testy s pasivniacutem barveniacutem erytrocytů
a-TPO jako rizikovyacute faktor
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TPO je znaacutemyacutem rizikovyacutem faktorem pro vznik tyreoidaacutelniacute dysfunkce pokud jsou pacienti leacutečeni lithiem amiodaronem interleukinem-2 nebo alfa-interferonem
a-TG
bull Tg vykazuje vysokou heterogenitu způsobenou rozdiacutely v posttranslačniacutech modifikaciacutech (glykosylace jodizace sulfatace atd) Během synteacutezy tyreoidaacutelniacuteho hormonu a jeho uvolněniacute je Tg polymerizovaacuten a degradovaacuten
bull Vlivem toho je imunologickaacute struktura Tg mimořaacutedně komplexniacute Charakteristika standardů pro Tg se může lišit v zaacutevislosti na vstupniacute lidskeacute tyreoidaacutelniacute tkaacuteni a použiteacutem purifikačniacutem procesu To vysvětluje proč jsou testy na TgAb a takeacute Tg tak obtiacutežně standardizovatelneacute
Titr protilaacutetek
bull Titr protilaacutetek literaacuterně koreluje s počtem autoreaktivniacutech lymfocytů ktereacute infiltrujiacute štiacutetnou žlaacutezu a sonografickyacutem obrazem 1)
bull a-TG nižšiacute senzitivita (60-80 u HT) a menšiacute specifita (pozitivniacute ve většiacute čaacutesti zdravyacutech kontrol) než a-TPO
bull a-TG a a-TPO představujiacute dva různeacute aspekty autoimunniacute odpovědi na štiacutetnou žlaacutezu a-TG by mohly odraacutežet počaacutetečniacute (vrozenyacute) typ imunitniacute odpovědi zatiacutemco a-TPO by mohly charakterizovat pozdějšiacute adaptivniacute imunitniacute odpovědi 2)
1)Pandit AA VijayWardeMMenon PS Correlation of number of intrathyroid lympho- cytes with antimicrosomal antibody titer in Hashimotos thyroiditis Diagn Cytopathol 20032863ndash5 2) Rose NR Autoimmune escalation through the crystal ball Clin Exp Immunol 20071479
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
Třetiacute generace testů ndash M22
bull V r2004 byl vyvinut test použitiacutem M22 ve formaacutetu ELISA 1) senzitivita 974 a specifita 992 (např Medipan)
bull Test byl vhodnyacute i pro automatizaci 23)
bull Dostupnost a znalost jak stimulujiacuteciacutech tak blokujiacuteciacutech protilaacutetek byla důležitaacute k pochopeniacute krystalickeacute struktury TSHr a jejiacutech interakciacute s a-TSHr 4) poukaacutezalo to na širokeacute překryvy epitopů mezi stimulujiacuteciacutemi a blokujiacuteciacutemi protilaacutetkami 4)
bull Roche nativniacute vepřovyacute TSH s M22
1)Rees Smith B Bolton J Young S Collyer A Weeden A Bradbury J et al A new assay for thyrotropin receptor autoantibodies Thyroid (2004) 14830ndash5 doi1010891050725042451248 2) Tozzoli R Bagnasco M Giavarina D Bizzarro N TSH receptor autoan- tibody immunoassay in patients with Gravesrsquo disease improvement of diagnostic accuracy over different generations of methods systematic review and meta-analysis Autoimmun Rev (2012) 12107ndash13 doi101016j autrev201207003 3) Zophel K Roggenbuck D von Landenberg P Wunderlich G Gruning T Kotzerke J et al TSH receptor antibody (TRAb) assays based on the human monoclonal autoantibody M22 are more sensitive than bovine TSH based assays Horm Metab Res (2010) 4265ndash9 doi101055s-0029-1241196 4) Furmaniak J Sanders J Nunez Miguel R Rees Smith B Mechanisms of action of TSHR autoantibodies Horm Metab Res (2015) 47735ndash52 doi10105 5s-0035-1559648
Mc4 bioassay
bull Souběžně s testy 3-generace Kohn vyvinul test využiacutevajiacuteciacute bdquoMc4 chimeacuteruldquo založenou na metodaacutech chemiluminiscence 1)
bull Ciacutelem bylo měřit pouze stimulujiacuteciacute protilaacutetky a tiacutem dosaacutehnout jasneacuteho cutoff mezi pacienty s GD a kontrolami
bull Porovnaacuteniacute senzitivity a specifity v tabulce 2) bull Mc4 testy mohou byacutet využity jako testy prvniacute
volby pro pacienty s GD
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Mc4 bioassay
bull Testy s M22 diacuteky podobně specifitě a senzitivitě ale lepšiacute bdquoproveditelnostildquo jsou zatiacutem preferovanějšiacute
bull Daacutele jsou lepšiacute pro prognoacutezu GD než testy s M22 a leacutepe korelujiacute s aktivitou a zaacutevažnostiacute GD orbitopatiiacute 2)
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Bridge Assay
bull Novaacute technologie využitiacute chimeacuterickyacutech receptorů Mc4 a N-terminaacutelniacute TSHr fůsovanyacute s alkalickou fosfataacutezou 1) senzitivita 998 a specifita 995
bull TSI ndash Siemens tato metoda je založena na sendvičoveacutem kompetetivniacute formaacutetu kteryacute se lišiacute od klasickeacuteho kompetetivniacute formaacutetu komerčniacutech IMA druheacute a třetiacute generace 2)
1)Frank CU Braeth S Dietrich JW Wanjura D Loos U Bridge technology with TSH receptor chimera for sensitive direct detection of TSH receptor antibodies causing Gravesrsquo disease analytical and clinical evaluation Horm Metab Res (2015) 47880ndash8 doi101055s-0035-1554662 2)Tozzoli R DrsquoAurizio F Villalta D Giovanella L (2017) Evalu- ation of the first fully automated immunoassay method for the measurement of stimulating TSH receptor autoantibodies in Gravesrsquo disease Clin Chem Lab Med 5558ndash64
Mezinaacuterodniacute standard
bull Prvniacute mezinaacuterodniacute standard připraven v r 1995 WHO označeniacute 90672 Připraven ECBS zdroj pacientskaacute plasma
bull V r 2006 nahrazen lidskou monoklonaacutelniacute protilaacutetkou M22 (NIBSC 08240) odkazuje na detekci S-TRAb 1)
1) Diana T1 Kanitz M Lehmann M Li Y Olivo PD Kahaly GJ Standardization of a bioassay for thyrotropin receptor stimulating autoantibodies Thyroid 2015 Feb25(2)169-75
EHK ndash SEKK AT217
EHK ndash SEKK AT217
SEKK - Dotazniacutek
EHK ndash SEKK AT113
EHK ndash SEKK AT113
Hashimotova tyreoiditida (HT)
bull HT 1) a SLE 2) byly prvniacute dvě autoimunitniacute onemocněniacute kde se prokaacutezala genetickaacute asociace (geny MHC třiacutedy II) 70 leacuteta
bull Nicmeacuteně nebyl nalezen gen kteryacute by spouštěl HT nalezeny pouze geny ktereacute přispiacutevajiacute k fenotypu onemocněniacute 3)
1)VladutiuAO RoseNR Autoimmunemurine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type Science 19711741137ndash9 2)Grumet FC Coukell A Bodmer JG Bodmer WF McDevitt HO Histocompatibility (HL-A) antigens associated with systemic lupus erythematosus A possible genetic predisposition to disease N Engl J Med 1971285193ndash6 3) Simmonds MJ Gough SC The search for the genetic contribution to autoimmune thyroid disease the never ending story Brief Funct Genomics 20111077ndash90
Hashimotova tyreoiditida
bull Do 50 let raritniacute onemocněniacute nyniacute nejběžnějšiacute s prevalenciacute 81000 biochemickyacute naacutelez + autoprotilaacutetky 461000
bull Ženymuži 81
a-TPO
bull Přiacutetomnost protilaacutetek TPOAb obvykle předchaacuteziacute vzniku tyreoidaacutelniacute dysfunkce
bull Patogenetickaacute role protilaacutetek TgAb zůstaacutevaacute nejasnaacute
a-TPO
bull Autoprotilaacutetky TPOAb byly nejdřiacuteve popsaacuteny jako antimikrozomaacutelniacute autoprotilaacutetky (AMA) neboť bylo zjištěno že reagujiacute s neupravenyacutemi membraacutenami tyreoidaacutelniacutech buněk
bull Mikrozomaacutelniacute antigen byl později popsaacuten jako TPO
bull Dřiacuteve se využiacutevaly ke stanoveniacute TPO metody imunofluorescenčniacute metody a aglutinačniacute testy s pasivniacutem barveniacutem erytrocytů
a-TPO jako rizikovyacute faktor
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TPO je znaacutemyacutem rizikovyacutem faktorem pro vznik tyreoidaacutelniacute dysfunkce pokud jsou pacienti leacutečeni lithiem amiodaronem interleukinem-2 nebo alfa-interferonem
a-TG
bull Tg vykazuje vysokou heterogenitu způsobenou rozdiacutely v posttranslačniacutech modifikaciacutech (glykosylace jodizace sulfatace atd) Během synteacutezy tyreoidaacutelniacuteho hormonu a jeho uvolněniacute je Tg polymerizovaacuten a degradovaacuten
bull Vlivem toho je imunologickaacute struktura Tg mimořaacutedně komplexniacute Charakteristika standardů pro Tg se může lišit v zaacutevislosti na vstupniacute lidskeacute tyreoidaacutelniacute tkaacuteni a použiteacutem purifikačniacutem procesu To vysvětluje proč jsou testy na TgAb a takeacute Tg tak obtiacutežně standardizovatelneacute
Titr protilaacutetek
bull Titr protilaacutetek literaacuterně koreluje s počtem autoreaktivniacutech lymfocytů ktereacute infiltrujiacute štiacutetnou žlaacutezu a sonografickyacutem obrazem 1)
bull a-TG nižšiacute senzitivita (60-80 u HT) a menšiacute specifita (pozitivniacute ve většiacute čaacutesti zdravyacutech kontrol) než a-TPO
bull a-TG a a-TPO představujiacute dva různeacute aspekty autoimunniacute odpovědi na štiacutetnou žlaacutezu a-TG by mohly odraacutežet počaacutetečniacute (vrozenyacute) typ imunitniacute odpovědi zatiacutemco a-TPO by mohly charakterizovat pozdějšiacute adaptivniacute imunitniacute odpovědi 2)
1)Pandit AA VijayWardeMMenon PS Correlation of number of intrathyroid lympho- cytes with antimicrosomal antibody titer in Hashimotos thyroiditis Diagn Cytopathol 20032863ndash5 2) Rose NR Autoimmune escalation through the crystal ball Clin Exp Immunol 20071479
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
Mc4 bioassay
bull Souběžně s testy 3-generace Kohn vyvinul test využiacutevajiacuteciacute bdquoMc4 chimeacuteruldquo založenou na metodaacutech chemiluminiscence 1)
bull Ciacutelem bylo měřit pouze stimulujiacuteciacute protilaacutetky a tiacutem dosaacutehnout jasneacuteho cutoff mezi pacienty s GD a kontrolami
bull Porovnaacuteniacute senzitivity a specifity v tabulce 2) bull Mc4 testy mohou byacutet využity jako testy prvniacute
volby pro pacienty s GD
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Mc4 bioassay
bull Testy s M22 diacuteky podobně specifitě a senzitivitě ale lepšiacute bdquoproveditelnostildquo jsou zatiacutem preferovanějšiacute
bull Daacutele jsou lepšiacute pro prognoacutezu GD než testy s M22 a leacutepe korelujiacute s aktivitou a zaacutevažnostiacute GD orbitopatiiacute 2)
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Bridge Assay
bull Novaacute technologie využitiacute chimeacuterickyacutech receptorů Mc4 a N-terminaacutelniacute TSHr fůsovanyacute s alkalickou fosfataacutezou 1) senzitivita 998 a specifita 995
bull TSI ndash Siemens tato metoda je založena na sendvičoveacutem kompetetivniacute formaacutetu kteryacute se lišiacute od klasickeacuteho kompetetivniacute formaacutetu komerčniacutech IMA druheacute a třetiacute generace 2)
1)Frank CU Braeth S Dietrich JW Wanjura D Loos U Bridge technology with TSH receptor chimera for sensitive direct detection of TSH receptor antibodies causing Gravesrsquo disease analytical and clinical evaluation Horm Metab Res (2015) 47880ndash8 doi101055s-0035-1554662 2)Tozzoli R DrsquoAurizio F Villalta D Giovanella L (2017) Evalu- ation of the first fully automated immunoassay method for the measurement of stimulating TSH receptor autoantibodies in Gravesrsquo disease Clin Chem Lab Med 5558ndash64
Mezinaacuterodniacute standard
bull Prvniacute mezinaacuterodniacute standard připraven v r 1995 WHO označeniacute 90672 Připraven ECBS zdroj pacientskaacute plasma
bull V r 2006 nahrazen lidskou monoklonaacutelniacute protilaacutetkou M22 (NIBSC 08240) odkazuje na detekci S-TRAb 1)
1) Diana T1 Kanitz M Lehmann M Li Y Olivo PD Kahaly GJ Standardization of a bioassay for thyrotropin receptor stimulating autoantibodies Thyroid 2015 Feb25(2)169-75
EHK ndash SEKK AT217
EHK ndash SEKK AT217
SEKK - Dotazniacutek
EHK ndash SEKK AT113
EHK ndash SEKK AT113
Hashimotova tyreoiditida (HT)
bull HT 1) a SLE 2) byly prvniacute dvě autoimunitniacute onemocněniacute kde se prokaacutezala genetickaacute asociace (geny MHC třiacutedy II) 70 leacuteta
bull Nicmeacuteně nebyl nalezen gen kteryacute by spouštěl HT nalezeny pouze geny ktereacute přispiacutevajiacute k fenotypu onemocněniacute 3)
1)VladutiuAO RoseNR Autoimmunemurine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type Science 19711741137ndash9 2)Grumet FC Coukell A Bodmer JG Bodmer WF McDevitt HO Histocompatibility (HL-A) antigens associated with systemic lupus erythematosus A possible genetic predisposition to disease N Engl J Med 1971285193ndash6 3) Simmonds MJ Gough SC The search for the genetic contribution to autoimmune thyroid disease the never ending story Brief Funct Genomics 20111077ndash90
Hashimotova tyreoiditida
bull Do 50 let raritniacute onemocněniacute nyniacute nejběžnějšiacute s prevalenciacute 81000 biochemickyacute naacutelez + autoprotilaacutetky 461000
bull Ženymuži 81
a-TPO
bull Přiacutetomnost protilaacutetek TPOAb obvykle předchaacuteziacute vzniku tyreoidaacutelniacute dysfunkce
bull Patogenetickaacute role protilaacutetek TgAb zůstaacutevaacute nejasnaacute
a-TPO
bull Autoprotilaacutetky TPOAb byly nejdřiacuteve popsaacuteny jako antimikrozomaacutelniacute autoprotilaacutetky (AMA) neboť bylo zjištěno že reagujiacute s neupravenyacutemi membraacutenami tyreoidaacutelniacutech buněk
bull Mikrozomaacutelniacute antigen byl později popsaacuten jako TPO
bull Dřiacuteve se využiacutevaly ke stanoveniacute TPO metody imunofluorescenčniacute metody a aglutinačniacute testy s pasivniacutem barveniacutem erytrocytů
a-TPO jako rizikovyacute faktor
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TPO je znaacutemyacutem rizikovyacutem faktorem pro vznik tyreoidaacutelniacute dysfunkce pokud jsou pacienti leacutečeni lithiem amiodaronem interleukinem-2 nebo alfa-interferonem
a-TG
bull Tg vykazuje vysokou heterogenitu způsobenou rozdiacutely v posttranslačniacutech modifikaciacutech (glykosylace jodizace sulfatace atd) Během synteacutezy tyreoidaacutelniacuteho hormonu a jeho uvolněniacute je Tg polymerizovaacuten a degradovaacuten
bull Vlivem toho je imunologickaacute struktura Tg mimořaacutedně komplexniacute Charakteristika standardů pro Tg se může lišit v zaacutevislosti na vstupniacute lidskeacute tyreoidaacutelniacute tkaacuteni a použiteacutem purifikačniacutem procesu To vysvětluje proč jsou testy na TgAb a takeacute Tg tak obtiacutežně standardizovatelneacute
Titr protilaacutetek
bull Titr protilaacutetek literaacuterně koreluje s počtem autoreaktivniacutech lymfocytů ktereacute infiltrujiacute štiacutetnou žlaacutezu a sonografickyacutem obrazem 1)
bull a-TG nižšiacute senzitivita (60-80 u HT) a menšiacute specifita (pozitivniacute ve většiacute čaacutesti zdravyacutech kontrol) než a-TPO
bull a-TG a a-TPO představujiacute dva různeacute aspekty autoimunniacute odpovědi na štiacutetnou žlaacutezu a-TG by mohly odraacutežet počaacutetečniacute (vrozenyacute) typ imunitniacute odpovědi zatiacutemco a-TPO by mohly charakterizovat pozdějšiacute adaptivniacute imunitniacute odpovědi 2)
1)Pandit AA VijayWardeMMenon PS Correlation of number of intrathyroid lympho- cytes with antimicrosomal antibody titer in Hashimotos thyroiditis Diagn Cytopathol 20032863ndash5 2) Rose NR Autoimmune escalation through the crystal ball Clin Exp Immunol 20071479
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
Mc4 bioassay
bull Testy s M22 diacuteky podobně specifitě a senzitivitě ale lepšiacute bdquoproveditelnostildquo jsou zatiacutem preferovanějšiacute
bull Daacutele jsou lepšiacute pro prognoacutezu GD než testy s M22 a leacutepe korelujiacute s aktivitou a zaacutevažnostiacute GD orbitopatiiacute 2)
1)Tahara K Ban T Minegishi T Kohn LD Immunoglobulins from Gravesrsquo disease patients interact with different sites on TSH receptorLH-CG receptor chimeras than either TSH or immunoglobulins from idiopathic myxedema patients Biochem Biophys Res Commun (1991) 17970ndash7 doi101016 0006-291X(91)91335-A 2) Giuliani C Cerrone D Harii N Thornton M Kohn LD Dagia NM et al A TSHr-LHCGr chimera that measures functional TSAb in Gravesrsquo disease J Clin Endocrinol Metab (2012) 97E1106ndash15 doi101210jc2011-2893
Bridge Assay
bull Novaacute technologie využitiacute chimeacuterickyacutech receptorů Mc4 a N-terminaacutelniacute TSHr fůsovanyacute s alkalickou fosfataacutezou 1) senzitivita 998 a specifita 995
bull TSI ndash Siemens tato metoda je založena na sendvičoveacutem kompetetivniacute formaacutetu kteryacute se lišiacute od klasickeacuteho kompetetivniacute formaacutetu komerčniacutech IMA druheacute a třetiacute generace 2)
1)Frank CU Braeth S Dietrich JW Wanjura D Loos U Bridge technology with TSH receptor chimera for sensitive direct detection of TSH receptor antibodies causing Gravesrsquo disease analytical and clinical evaluation Horm Metab Res (2015) 47880ndash8 doi101055s-0035-1554662 2)Tozzoli R DrsquoAurizio F Villalta D Giovanella L (2017) Evalu- ation of the first fully automated immunoassay method for the measurement of stimulating TSH receptor autoantibodies in Gravesrsquo disease Clin Chem Lab Med 5558ndash64
Mezinaacuterodniacute standard
bull Prvniacute mezinaacuterodniacute standard připraven v r 1995 WHO označeniacute 90672 Připraven ECBS zdroj pacientskaacute plasma
bull V r 2006 nahrazen lidskou monoklonaacutelniacute protilaacutetkou M22 (NIBSC 08240) odkazuje na detekci S-TRAb 1)
1) Diana T1 Kanitz M Lehmann M Li Y Olivo PD Kahaly GJ Standardization of a bioassay for thyrotropin receptor stimulating autoantibodies Thyroid 2015 Feb25(2)169-75
EHK ndash SEKK AT217
EHK ndash SEKK AT217
SEKK - Dotazniacutek
EHK ndash SEKK AT113
EHK ndash SEKK AT113
Hashimotova tyreoiditida (HT)
bull HT 1) a SLE 2) byly prvniacute dvě autoimunitniacute onemocněniacute kde se prokaacutezala genetickaacute asociace (geny MHC třiacutedy II) 70 leacuteta
bull Nicmeacuteně nebyl nalezen gen kteryacute by spouštěl HT nalezeny pouze geny ktereacute přispiacutevajiacute k fenotypu onemocněniacute 3)
1)VladutiuAO RoseNR Autoimmunemurine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type Science 19711741137ndash9 2)Grumet FC Coukell A Bodmer JG Bodmer WF McDevitt HO Histocompatibility (HL-A) antigens associated with systemic lupus erythematosus A possible genetic predisposition to disease N Engl J Med 1971285193ndash6 3) Simmonds MJ Gough SC The search for the genetic contribution to autoimmune thyroid disease the never ending story Brief Funct Genomics 20111077ndash90
Hashimotova tyreoiditida
bull Do 50 let raritniacute onemocněniacute nyniacute nejběžnějšiacute s prevalenciacute 81000 biochemickyacute naacutelez + autoprotilaacutetky 461000
bull Ženymuži 81
a-TPO
bull Přiacutetomnost protilaacutetek TPOAb obvykle předchaacuteziacute vzniku tyreoidaacutelniacute dysfunkce
bull Patogenetickaacute role protilaacutetek TgAb zůstaacutevaacute nejasnaacute
a-TPO
bull Autoprotilaacutetky TPOAb byly nejdřiacuteve popsaacuteny jako antimikrozomaacutelniacute autoprotilaacutetky (AMA) neboť bylo zjištěno že reagujiacute s neupravenyacutemi membraacutenami tyreoidaacutelniacutech buněk
bull Mikrozomaacutelniacute antigen byl později popsaacuten jako TPO
bull Dřiacuteve se využiacutevaly ke stanoveniacute TPO metody imunofluorescenčniacute metody a aglutinačniacute testy s pasivniacutem barveniacutem erytrocytů
a-TPO jako rizikovyacute faktor
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TPO je znaacutemyacutem rizikovyacutem faktorem pro vznik tyreoidaacutelniacute dysfunkce pokud jsou pacienti leacutečeni lithiem amiodaronem interleukinem-2 nebo alfa-interferonem
a-TG
bull Tg vykazuje vysokou heterogenitu způsobenou rozdiacutely v posttranslačniacutech modifikaciacutech (glykosylace jodizace sulfatace atd) Během synteacutezy tyreoidaacutelniacuteho hormonu a jeho uvolněniacute je Tg polymerizovaacuten a degradovaacuten
bull Vlivem toho je imunologickaacute struktura Tg mimořaacutedně komplexniacute Charakteristika standardů pro Tg se může lišit v zaacutevislosti na vstupniacute lidskeacute tyreoidaacutelniacute tkaacuteni a použiteacutem purifikačniacutem procesu To vysvětluje proč jsou testy na TgAb a takeacute Tg tak obtiacutežně standardizovatelneacute
Titr protilaacutetek
bull Titr protilaacutetek literaacuterně koreluje s počtem autoreaktivniacutech lymfocytů ktereacute infiltrujiacute štiacutetnou žlaacutezu a sonografickyacutem obrazem 1)
bull a-TG nižšiacute senzitivita (60-80 u HT) a menšiacute specifita (pozitivniacute ve většiacute čaacutesti zdravyacutech kontrol) než a-TPO
bull a-TG a a-TPO představujiacute dva různeacute aspekty autoimunniacute odpovědi na štiacutetnou žlaacutezu a-TG by mohly odraacutežet počaacutetečniacute (vrozenyacute) typ imunitniacute odpovědi zatiacutemco a-TPO by mohly charakterizovat pozdějšiacute adaptivniacute imunitniacute odpovědi 2)
1)Pandit AA VijayWardeMMenon PS Correlation of number of intrathyroid lympho- cytes with antimicrosomal antibody titer in Hashimotos thyroiditis Diagn Cytopathol 20032863ndash5 2) Rose NR Autoimmune escalation through the crystal ball Clin Exp Immunol 20071479
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
Bridge Assay
bull Novaacute technologie využitiacute chimeacuterickyacutech receptorů Mc4 a N-terminaacutelniacute TSHr fůsovanyacute s alkalickou fosfataacutezou 1) senzitivita 998 a specifita 995
bull TSI ndash Siemens tato metoda je založena na sendvičoveacutem kompetetivniacute formaacutetu kteryacute se lišiacute od klasickeacuteho kompetetivniacute formaacutetu komerčniacutech IMA druheacute a třetiacute generace 2)
1)Frank CU Braeth S Dietrich JW Wanjura D Loos U Bridge technology with TSH receptor chimera for sensitive direct detection of TSH receptor antibodies causing Gravesrsquo disease analytical and clinical evaluation Horm Metab Res (2015) 47880ndash8 doi101055s-0035-1554662 2)Tozzoli R DrsquoAurizio F Villalta D Giovanella L (2017) Evalu- ation of the first fully automated immunoassay method for the measurement of stimulating TSH receptor autoantibodies in Gravesrsquo disease Clin Chem Lab Med 5558ndash64
Mezinaacuterodniacute standard
bull Prvniacute mezinaacuterodniacute standard připraven v r 1995 WHO označeniacute 90672 Připraven ECBS zdroj pacientskaacute plasma
bull V r 2006 nahrazen lidskou monoklonaacutelniacute protilaacutetkou M22 (NIBSC 08240) odkazuje na detekci S-TRAb 1)
1) Diana T1 Kanitz M Lehmann M Li Y Olivo PD Kahaly GJ Standardization of a bioassay for thyrotropin receptor stimulating autoantibodies Thyroid 2015 Feb25(2)169-75
EHK ndash SEKK AT217
EHK ndash SEKK AT217
SEKK - Dotazniacutek
EHK ndash SEKK AT113
EHK ndash SEKK AT113
Hashimotova tyreoiditida (HT)
bull HT 1) a SLE 2) byly prvniacute dvě autoimunitniacute onemocněniacute kde se prokaacutezala genetickaacute asociace (geny MHC třiacutedy II) 70 leacuteta
bull Nicmeacuteně nebyl nalezen gen kteryacute by spouštěl HT nalezeny pouze geny ktereacute přispiacutevajiacute k fenotypu onemocněniacute 3)
1)VladutiuAO RoseNR Autoimmunemurine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type Science 19711741137ndash9 2)Grumet FC Coukell A Bodmer JG Bodmer WF McDevitt HO Histocompatibility (HL-A) antigens associated with systemic lupus erythematosus A possible genetic predisposition to disease N Engl J Med 1971285193ndash6 3) Simmonds MJ Gough SC The search for the genetic contribution to autoimmune thyroid disease the never ending story Brief Funct Genomics 20111077ndash90
Hashimotova tyreoiditida
bull Do 50 let raritniacute onemocněniacute nyniacute nejběžnějšiacute s prevalenciacute 81000 biochemickyacute naacutelez + autoprotilaacutetky 461000
bull Ženymuži 81
a-TPO
bull Přiacutetomnost protilaacutetek TPOAb obvykle předchaacuteziacute vzniku tyreoidaacutelniacute dysfunkce
bull Patogenetickaacute role protilaacutetek TgAb zůstaacutevaacute nejasnaacute
a-TPO
bull Autoprotilaacutetky TPOAb byly nejdřiacuteve popsaacuteny jako antimikrozomaacutelniacute autoprotilaacutetky (AMA) neboť bylo zjištěno že reagujiacute s neupravenyacutemi membraacutenami tyreoidaacutelniacutech buněk
bull Mikrozomaacutelniacute antigen byl později popsaacuten jako TPO
bull Dřiacuteve se využiacutevaly ke stanoveniacute TPO metody imunofluorescenčniacute metody a aglutinačniacute testy s pasivniacutem barveniacutem erytrocytů
a-TPO jako rizikovyacute faktor
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TPO je znaacutemyacutem rizikovyacutem faktorem pro vznik tyreoidaacutelniacute dysfunkce pokud jsou pacienti leacutečeni lithiem amiodaronem interleukinem-2 nebo alfa-interferonem
a-TG
bull Tg vykazuje vysokou heterogenitu způsobenou rozdiacutely v posttranslačniacutech modifikaciacutech (glykosylace jodizace sulfatace atd) Během synteacutezy tyreoidaacutelniacuteho hormonu a jeho uvolněniacute je Tg polymerizovaacuten a degradovaacuten
bull Vlivem toho je imunologickaacute struktura Tg mimořaacutedně komplexniacute Charakteristika standardů pro Tg se může lišit v zaacutevislosti na vstupniacute lidskeacute tyreoidaacutelniacute tkaacuteni a použiteacutem purifikačniacutem procesu To vysvětluje proč jsou testy na TgAb a takeacute Tg tak obtiacutežně standardizovatelneacute
Titr protilaacutetek
bull Titr protilaacutetek literaacuterně koreluje s počtem autoreaktivniacutech lymfocytů ktereacute infiltrujiacute štiacutetnou žlaacutezu a sonografickyacutem obrazem 1)
bull a-TG nižšiacute senzitivita (60-80 u HT) a menšiacute specifita (pozitivniacute ve většiacute čaacutesti zdravyacutech kontrol) než a-TPO
bull a-TG a a-TPO představujiacute dva různeacute aspekty autoimunniacute odpovědi na štiacutetnou žlaacutezu a-TG by mohly odraacutežet počaacutetečniacute (vrozenyacute) typ imunitniacute odpovědi zatiacutemco a-TPO by mohly charakterizovat pozdějšiacute adaptivniacute imunitniacute odpovědi 2)
1)Pandit AA VijayWardeMMenon PS Correlation of number of intrathyroid lympho- cytes with antimicrosomal antibody titer in Hashimotos thyroiditis Diagn Cytopathol 20032863ndash5 2) Rose NR Autoimmune escalation through the crystal ball Clin Exp Immunol 20071479
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
Mezinaacuterodniacute standard
bull Prvniacute mezinaacuterodniacute standard připraven v r 1995 WHO označeniacute 90672 Připraven ECBS zdroj pacientskaacute plasma
bull V r 2006 nahrazen lidskou monoklonaacutelniacute protilaacutetkou M22 (NIBSC 08240) odkazuje na detekci S-TRAb 1)
1) Diana T1 Kanitz M Lehmann M Li Y Olivo PD Kahaly GJ Standardization of a bioassay for thyrotropin receptor stimulating autoantibodies Thyroid 2015 Feb25(2)169-75
EHK ndash SEKK AT217
EHK ndash SEKK AT217
SEKK - Dotazniacutek
EHK ndash SEKK AT113
EHK ndash SEKK AT113
Hashimotova tyreoiditida (HT)
bull HT 1) a SLE 2) byly prvniacute dvě autoimunitniacute onemocněniacute kde se prokaacutezala genetickaacute asociace (geny MHC třiacutedy II) 70 leacuteta
bull Nicmeacuteně nebyl nalezen gen kteryacute by spouštěl HT nalezeny pouze geny ktereacute přispiacutevajiacute k fenotypu onemocněniacute 3)
1)VladutiuAO RoseNR Autoimmunemurine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type Science 19711741137ndash9 2)Grumet FC Coukell A Bodmer JG Bodmer WF McDevitt HO Histocompatibility (HL-A) antigens associated with systemic lupus erythematosus A possible genetic predisposition to disease N Engl J Med 1971285193ndash6 3) Simmonds MJ Gough SC The search for the genetic contribution to autoimmune thyroid disease the never ending story Brief Funct Genomics 20111077ndash90
Hashimotova tyreoiditida
bull Do 50 let raritniacute onemocněniacute nyniacute nejběžnějšiacute s prevalenciacute 81000 biochemickyacute naacutelez + autoprotilaacutetky 461000
bull Ženymuži 81
a-TPO
bull Přiacutetomnost protilaacutetek TPOAb obvykle předchaacuteziacute vzniku tyreoidaacutelniacute dysfunkce
bull Patogenetickaacute role protilaacutetek TgAb zůstaacutevaacute nejasnaacute
a-TPO
bull Autoprotilaacutetky TPOAb byly nejdřiacuteve popsaacuteny jako antimikrozomaacutelniacute autoprotilaacutetky (AMA) neboť bylo zjištěno že reagujiacute s neupravenyacutemi membraacutenami tyreoidaacutelniacutech buněk
bull Mikrozomaacutelniacute antigen byl později popsaacuten jako TPO
bull Dřiacuteve se využiacutevaly ke stanoveniacute TPO metody imunofluorescenčniacute metody a aglutinačniacute testy s pasivniacutem barveniacutem erytrocytů
a-TPO jako rizikovyacute faktor
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TPO je znaacutemyacutem rizikovyacutem faktorem pro vznik tyreoidaacutelniacute dysfunkce pokud jsou pacienti leacutečeni lithiem amiodaronem interleukinem-2 nebo alfa-interferonem
a-TG
bull Tg vykazuje vysokou heterogenitu způsobenou rozdiacutely v posttranslačniacutech modifikaciacutech (glykosylace jodizace sulfatace atd) Během synteacutezy tyreoidaacutelniacuteho hormonu a jeho uvolněniacute je Tg polymerizovaacuten a degradovaacuten
bull Vlivem toho je imunologickaacute struktura Tg mimořaacutedně komplexniacute Charakteristika standardů pro Tg se může lišit v zaacutevislosti na vstupniacute lidskeacute tyreoidaacutelniacute tkaacuteni a použiteacutem purifikačniacutem procesu To vysvětluje proč jsou testy na TgAb a takeacute Tg tak obtiacutežně standardizovatelneacute
Titr protilaacutetek
bull Titr protilaacutetek literaacuterně koreluje s počtem autoreaktivniacutech lymfocytů ktereacute infiltrujiacute štiacutetnou žlaacutezu a sonografickyacutem obrazem 1)
bull a-TG nižšiacute senzitivita (60-80 u HT) a menšiacute specifita (pozitivniacute ve většiacute čaacutesti zdravyacutech kontrol) než a-TPO
bull a-TG a a-TPO představujiacute dva různeacute aspekty autoimunniacute odpovědi na štiacutetnou žlaacutezu a-TG by mohly odraacutežet počaacutetečniacute (vrozenyacute) typ imunitniacute odpovědi zatiacutemco a-TPO by mohly charakterizovat pozdějšiacute adaptivniacute imunitniacute odpovědi 2)
1)Pandit AA VijayWardeMMenon PS Correlation of number of intrathyroid lympho- cytes with antimicrosomal antibody titer in Hashimotos thyroiditis Diagn Cytopathol 20032863ndash5 2) Rose NR Autoimmune escalation through the crystal ball Clin Exp Immunol 20071479
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
EHK ndash SEKK AT217
EHK ndash SEKK AT217
SEKK - Dotazniacutek
EHK ndash SEKK AT113
EHK ndash SEKK AT113
Hashimotova tyreoiditida (HT)
bull HT 1) a SLE 2) byly prvniacute dvě autoimunitniacute onemocněniacute kde se prokaacutezala genetickaacute asociace (geny MHC třiacutedy II) 70 leacuteta
bull Nicmeacuteně nebyl nalezen gen kteryacute by spouštěl HT nalezeny pouze geny ktereacute přispiacutevajiacute k fenotypu onemocněniacute 3)
1)VladutiuAO RoseNR Autoimmunemurine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type Science 19711741137ndash9 2)Grumet FC Coukell A Bodmer JG Bodmer WF McDevitt HO Histocompatibility (HL-A) antigens associated with systemic lupus erythematosus A possible genetic predisposition to disease N Engl J Med 1971285193ndash6 3) Simmonds MJ Gough SC The search for the genetic contribution to autoimmune thyroid disease the never ending story Brief Funct Genomics 20111077ndash90
Hashimotova tyreoiditida
bull Do 50 let raritniacute onemocněniacute nyniacute nejběžnějšiacute s prevalenciacute 81000 biochemickyacute naacutelez + autoprotilaacutetky 461000
bull Ženymuži 81
a-TPO
bull Přiacutetomnost protilaacutetek TPOAb obvykle předchaacuteziacute vzniku tyreoidaacutelniacute dysfunkce
bull Patogenetickaacute role protilaacutetek TgAb zůstaacutevaacute nejasnaacute
a-TPO
bull Autoprotilaacutetky TPOAb byly nejdřiacuteve popsaacuteny jako antimikrozomaacutelniacute autoprotilaacutetky (AMA) neboť bylo zjištěno že reagujiacute s neupravenyacutemi membraacutenami tyreoidaacutelniacutech buněk
bull Mikrozomaacutelniacute antigen byl později popsaacuten jako TPO
bull Dřiacuteve se využiacutevaly ke stanoveniacute TPO metody imunofluorescenčniacute metody a aglutinačniacute testy s pasivniacutem barveniacutem erytrocytů
a-TPO jako rizikovyacute faktor
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TPO je znaacutemyacutem rizikovyacutem faktorem pro vznik tyreoidaacutelniacute dysfunkce pokud jsou pacienti leacutečeni lithiem amiodaronem interleukinem-2 nebo alfa-interferonem
a-TG
bull Tg vykazuje vysokou heterogenitu způsobenou rozdiacutely v posttranslačniacutech modifikaciacutech (glykosylace jodizace sulfatace atd) Během synteacutezy tyreoidaacutelniacuteho hormonu a jeho uvolněniacute je Tg polymerizovaacuten a degradovaacuten
bull Vlivem toho je imunologickaacute struktura Tg mimořaacutedně komplexniacute Charakteristika standardů pro Tg se může lišit v zaacutevislosti na vstupniacute lidskeacute tyreoidaacutelniacute tkaacuteni a použiteacutem purifikačniacutem procesu To vysvětluje proč jsou testy na TgAb a takeacute Tg tak obtiacutežně standardizovatelneacute
Titr protilaacutetek
bull Titr protilaacutetek literaacuterně koreluje s počtem autoreaktivniacutech lymfocytů ktereacute infiltrujiacute štiacutetnou žlaacutezu a sonografickyacutem obrazem 1)
bull a-TG nižšiacute senzitivita (60-80 u HT) a menšiacute specifita (pozitivniacute ve většiacute čaacutesti zdravyacutech kontrol) než a-TPO
bull a-TG a a-TPO představujiacute dva různeacute aspekty autoimunniacute odpovědi na štiacutetnou žlaacutezu a-TG by mohly odraacutežet počaacutetečniacute (vrozenyacute) typ imunitniacute odpovědi zatiacutemco a-TPO by mohly charakterizovat pozdějšiacute adaptivniacute imunitniacute odpovědi 2)
1)Pandit AA VijayWardeMMenon PS Correlation of number of intrathyroid lympho- cytes with antimicrosomal antibody titer in Hashimotos thyroiditis Diagn Cytopathol 20032863ndash5 2) Rose NR Autoimmune escalation through the crystal ball Clin Exp Immunol 20071479
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
EHK ndash SEKK AT217
SEKK - Dotazniacutek
EHK ndash SEKK AT113
EHK ndash SEKK AT113
Hashimotova tyreoiditida (HT)
bull HT 1) a SLE 2) byly prvniacute dvě autoimunitniacute onemocněniacute kde se prokaacutezala genetickaacute asociace (geny MHC třiacutedy II) 70 leacuteta
bull Nicmeacuteně nebyl nalezen gen kteryacute by spouštěl HT nalezeny pouze geny ktereacute přispiacutevajiacute k fenotypu onemocněniacute 3)
1)VladutiuAO RoseNR Autoimmunemurine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type Science 19711741137ndash9 2)Grumet FC Coukell A Bodmer JG Bodmer WF McDevitt HO Histocompatibility (HL-A) antigens associated with systemic lupus erythematosus A possible genetic predisposition to disease N Engl J Med 1971285193ndash6 3) Simmonds MJ Gough SC The search for the genetic contribution to autoimmune thyroid disease the never ending story Brief Funct Genomics 20111077ndash90
Hashimotova tyreoiditida
bull Do 50 let raritniacute onemocněniacute nyniacute nejběžnějšiacute s prevalenciacute 81000 biochemickyacute naacutelez + autoprotilaacutetky 461000
bull Ženymuži 81
a-TPO
bull Přiacutetomnost protilaacutetek TPOAb obvykle předchaacuteziacute vzniku tyreoidaacutelniacute dysfunkce
bull Patogenetickaacute role protilaacutetek TgAb zůstaacutevaacute nejasnaacute
a-TPO
bull Autoprotilaacutetky TPOAb byly nejdřiacuteve popsaacuteny jako antimikrozomaacutelniacute autoprotilaacutetky (AMA) neboť bylo zjištěno že reagujiacute s neupravenyacutemi membraacutenami tyreoidaacutelniacutech buněk
bull Mikrozomaacutelniacute antigen byl později popsaacuten jako TPO
bull Dřiacuteve se využiacutevaly ke stanoveniacute TPO metody imunofluorescenčniacute metody a aglutinačniacute testy s pasivniacutem barveniacutem erytrocytů
a-TPO jako rizikovyacute faktor
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TPO je znaacutemyacutem rizikovyacutem faktorem pro vznik tyreoidaacutelniacute dysfunkce pokud jsou pacienti leacutečeni lithiem amiodaronem interleukinem-2 nebo alfa-interferonem
a-TG
bull Tg vykazuje vysokou heterogenitu způsobenou rozdiacutely v posttranslačniacutech modifikaciacutech (glykosylace jodizace sulfatace atd) Během synteacutezy tyreoidaacutelniacuteho hormonu a jeho uvolněniacute je Tg polymerizovaacuten a degradovaacuten
bull Vlivem toho je imunologickaacute struktura Tg mimořaacutedně komplexniacute Charakteristika standardů pro Tg se může lišit v zaacutevislosti na vstupniacute lidskeacute tyreoidaacutelniacute tkaacuteni a použiteacutem purifikačniacutem procesu To vysvětluje proč jsou testy na TgAb a takeacute Tg tak obtiacutežně standardizovatelneacute
Titr protilaacutetek
bull Titr protilaacutetek literaacuterně koreluje s počtem autoreaktivniacutech lymfocytů ktereacute infiltrujiacute štiacutetnou žlaacutezu a sonografickyacutem obrazem 1)
bull a-TG nižšiacute senzitivita (60-80 u HT) a menšiacute specifita (pozitivniacute ve většiacute čaacutesti zdravyacutech kontrol) než a-TPO
bull a-TG a a-TPO představujiacute dva různeacute aspekty autoimunniacute odpovědi na štiacutetnou žlaacutezu a-TG by mohly odraacutežet počaacutetečniacute (vrozenyacute) typ imunitniacute odpovědi zatiacutemco a-TPO by mohly charakterizovat pozdějšiacute adaptivniacute imunitniacute odpovědi 2)
1)Pandit AA VijayWardeMMenon PS Correlation of number of intrathyroid lympho- cytes with antimicrosomal antibody titer in Hashimotos thyroiditis Diagn Cytopathol 20032863ndash5 2) Rose NR Autoimmune escalation through the crystal ball Clin Exp Immunol 20071479
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
SEKK - Dotazniacutek
EHK ndash SEKK AT113
EHK ndash SEKK AT113
Hashimotova tyreoiditida (HT)
bull HT 1) a SLE 2) byly prvniacute dvě autoimunitniacute onemocněniacute kde se prokaacutezala genetickaacute asociace (geny MHC třiacutedy II) 70 leacuteta
bull Nicmeacuteně nebyl nalezen gen kteryacute by spouštěl HT nalezeny pouze geny ktereacute přispiacutevajiacute k fenotypu onemocněniacute 3)
1)VladutiuAO RoseNR Autoimmunemurine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type Science 19711741137ndash9 2)Grumet FC Coukell A Bodmer JG Bodmer WF McDevitt HO Histocompatibility (HL-A) antigens associated with systemic lupus erythematosus A possible genetic predisposition to disease N Engl J Med 1971285193ndash6 3) Simmonds MJ Gough SC The search for the genetic contribution to autoimmune thyroid disease the never ending story Brief Funct Genomics 20111077ndash90
Hashimotova tyreoiditida
bull Do 50 let raritniacute onemocněniacute nyniacute nejběžnějšiacute s prevalenciacute 81000 biochemickyacute naacutelez + autoprotilaacutetky 461000
bull Ženymuži 81
a-TPO
bull Přiacutetomnost protilaacutetek TPOAb obvykle předchaacuteziacute vzniku tyreoidaacutelniacute dysfunkce
bull Patogenetickaacute role protilaacutetek TgAb zůstaacutevaacute nejasnaacute
a-TPO
bull Autoprotilaacutetky TPOAb byly nejdřiacuteve popsaacuteny jako antimikrozomaacutelniacute autoprotilaacutetky (AMA) neboť bylo zjištěno že reagujiacute s neupravenyacutemi membraacutenami tyreoidaacutelniacutech buněk
bull Mikrozomaacutelniacute antigen byl později popsaacuten jako TPO
bull Dřiacuteve se využiacutevaly ke stanoveniacute TPO metody imunofluorescenčniacute metody a aglutinačniacute testy s pasivniacutem barveniacutem erytrocytů
a-TPO jako rizikovyacute faktor
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TPO je znaacutemyacutem rizikovyacutem faktorem pro vznik tyreoidaacutelniacute dysfunkce pokud jsou pacienti leacutečeni lithiem amiodaronem interleukinem-2 nebo alfa-interferonem
a-TG
bull Tg vykazuje vysokou heterogenitu způsobenou rozdiacutely v posttranslačniacutech modifikaciacutech (glykosylace jodizace sulfatace atd) Během synteacutezy tyreoidaacutelniacuteho hormonu a jeho uvolněniacute je Tg polymerizovaacuten a degradovaacuten
bull Vlivem toho je imunologickaacute struktura Tg mimořaacutedně komplexniacute Charakteristika standardů pro Tg se může lišit v zaacutevislosti na vstupniacute lidskeacute tyreoidaacutelniacute tkaacuteni a použiteacutem purifikačniacutem procesu To vysvětluje proč jsou testy na TgAb a takeacute Tg tak obtiacutežně standardizovatelneacute
Titr protilaacutetek
bull Titr protilaacutetek literaacuterně koreluje s počtem autoreaktivniacutech lymfocytů ktereacute infiltrujiacute štiacutetnou žlaacutezu a sonografickyacutem obrazem 1)
bull a-TG nižšiacute senzitivita (60-80 u HT) a menšiacute specifita (pozitivniacute ve většiacute čaacutesti zdravyacutech kontrol) než a-TPO
bull a-TG a a-TPO představujiacute dva různeacute aspekty autoimunniacute odpovědi na štiacutetnou žlaacutezu a-TG by mohly odraacutežet počaacutetečniacute (vrozenyacute) typ imunitniacute odpovědi zatiacutemco a-TPO by mohly charakterizovat pozdějšiacute adaptivniacute imunitniacute odpovědi 2)
1)Pandit AA VijayWardeMMenon PS Correlation of number of intrathyroid lympho- cytes with antimicrosomal antibody titer in Hashimotos thyroiditis Diagn Cytopathol 20032863ndash5 2) Rose NR Autoimmune escalation through the crystal ball Clin Exp Immunol 20071479
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
EHK ndash SEKK AT113
EHK ndash SEKK AT113
Hashimotova tyreoiditida (HT)
bull HT 1) a SLE 2) byly prvniacute dvě autoimunitniacute onemocněniacute kde se prokaacutezala genetickaacute asociace (geny MHC třiacutedy II) 70 leacuteta
bull Nicmeacuteně nebyl nalezen gen kteryacute by spouštěl HT nalezeny pouze geny ktereacute přispiacutevajiacute k fenotypu onemocněniacute 3)
1)VladutiuAO RoseNR Autoimmunemurine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type Science 19711741137ndash9 2)Grumet FC Coukell A Bodmer JG Bodmer WF McDevitt HO Histocompatibility (HL-A) antigens associated with systemic lupus erythematosus A possible genetic predisposition to disease N Engl J Med 1971285193ndash6 3) Simmonds MJ Gough SC The search for the genetic contribution to autoimmune thyroid disease the never ending story Brief Funct Genomics 20111077ndash90
Hashimotova tyreoiditida
bull Do 50 let raritniacute onemocněniacute nyniacute nejběžnějšiacute s prevalenciacute 81000 biochemickyacute naacutelez + autoprotilaacutetky 461000
bull Ženymuži 81
a-TPO
bull Přiacutetomnost protilaacutetek TPOAb obvykle předchaacuteziacute vzniku tyreoidaacutelniacute dysfunkce
bull Patogenetickaacute role protilaacutetek TgAb zůstaacutevaacute nejasnaacute
a-TPO
bull Autoprotilaacutetky TPOAb byly nejdřiacuteve popsaacuteny jako antimikrozomaacutelniacute autoprotilaacutetky (AMA) neboť bylo zjištěno že reagujiacute s neupravenyacutemi membraacutenami tyreoidaacutelniacutech buněk
bull Mikrozomaacutelniacute antigen byl později popsaacuten jako TPO
bull Dřiacuteve se využiacutevaly ke stanoveniacute TPO metody imunofluorescenčniacute metody a aglutinačniacute testy s pasivniacutem barveniacutem erytrocytů
a-TPO jako rizikovyacute faktor
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TPO je znaacutemyacutem rizikovyacutem faktorem pro vznik tyreoidaacutelniacute dysfunkce pokud jsou pacienti leacutečeni lithiem amiodaronem interleukinem-2 nebo alfa-interferonem
a-TG
bull Tg vykazuje vysokou heterogenitu způsobenou rozdiacutely v posttranslačniacutech modifikaciacutech (glykosylace jodizace sulfatace atd) Během synteacutezy tyreoidaacutelniacuteho hormonu a jeho uvolněniacute je Tg polymerizovaacuten a degradovaacuten
bull Vlivem toho je imunologickaacute struktura Tg mimořaacutedně komplexniacute Charakteristika standardů pro Tg se může lišit v zaacutevislosti na vstupniacute lidskeacute tyreoidaacutelniacute tkaacuteni a použiteacutem purifikačniacutem procesu To vysvětluje proč jsou testy na TgAb a takeacute Tg tak obtiacutežně standardizovatelneacute
Titr protilaacutetek
bull Titr protilaacutetek literaacuterně koreluje s počtem autoreaktivniacutech lymfocytů ktereacute infiltrujiacute štiacutetnou žlaacutezu a sonografickyacutem obrazem 1)
bull a-TG nižšiacute senzitivita (60-80 u HT) a menšiacute specifita (pozitivniacute ve většiacute čaacutesti zdravyacutech kontrol) než a-TPO
bull a-TG a a-TPO představujiacute dva různeacute aspekty autoimunniacute odpovědi na štiacutetnou žlaacutezu a-TG by mohly odraacutežet počaacutetečniacute (vrozenyacute) typ imunitniacute odpovědi zatiacutemco a-TPO by mohly charakterizovat pozdějšiacute adaptivniacute imunitniacute odpovědi 2)
1)Pandit AA VijayWardeMMenon PS Correlation of number of intrathyroid lympho- cytes with antimicrosomal antibody titer in Hashimotos thyroiditis Diagn Cytopathol 20032863ndash5 2) Rose NR Autoimmune escalation through the crystal ball Clin Exp Immunol 20071479
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
EHK ndash SEKK AT113
Hashimotova tyreoiditida (HT)
bull HT 1) a SLE 2) byly prvniacute dvě autoimunitniacute onemocněniacute kde se prokaacutezala genetickaacute asociace (geny MHC třiacutedy II) 70 leacuteta
bull Nicmeacuteně nebyl nalezen gen kteryacute by spouštěl HT nalezeny pouze geny ktereacute přispiacutevajiacute k fenotypu onemocněniacute 3)
1)VladutiuAO RoseNR Autoimmunemurine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type Science 19711741137ndash9 2)Grumet FC Coukell A Bodmer JG Bodmer WF McDevitt HO Histocompatibility (HL-A) antigens associated with systemic lupus erythematosus A possible genetic predisposition to disease N Engl J Med 1971285193ndash6 3) Simmonds MJ Gough SC The search for the genetic contribution to autoimmune thyroid disease the never ending story Brief Funct Genomics 20111077ndash90
Hashimotova tyreoiditida
bull Do 50 let raritniacute onemocněniacute nyniacute nejběžnějšiacute s prevalenciacute 81000 biochemickyacute naacutelez + autoprotilaacutetky 461000
bull Ženymuži 81
a-TPO
bull Přiacutetomnost protilaacutetek TPOAb obvykle předchaacuteziacute vzniku tyreoidaacutelniacute dysfunkce
bull Patogenetickaacute role protilaacutetek TgAb zůstaacutevaacute nejasnaacute
a-TPO
bull Autoprotilaacutetky TPOAb byly nejdřiacuteve popsaacuteny jako antimikrozomaacutelniacute autoprotilaacutetky (AMA) neboť bylo zjištěno že reagujiacute s neupravenyacutemi membraacutenami tyreoidaacutelniacutech buněk
bull Mikrozomaacutelniacute antigen byl později popsaacuten jako TPO
bull Dřiacuteve se využiacutevaly ke stanoveniacute TPO metody imunofluorescenčniacute metody a aglutinačniacute testy s pasivniacutem barveniacutem erytrocytů
a-TPO jako rizikovyacute faktor
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TPO je znaacutemyacutem rizikovyacutem faktorem pro vznik tyreoidaacutelniacute dysfunkce pokud jsou pacienti leacutečeni lithiem amiodaronem interleukinem-2 nebo alfa-interferonem
a-TG
bull Tg vykazuje vysokou heterogenitu způsobenou rozdiacutely v posttranslačniacutech modifikaciacutech (glykosylace jodizace sulfatace atd) Během synteacutezy tyreoidaacutelniacuteho hormonu a jeho uvolněniacute je Tg polymerizovaacuten a degradovaacuten
bull Vlivem toho je imunologickaacute struktura Tg mimořaacutedně komplexniacute Charakteristika standardů pro Tg se může lišit v zaacutevislosti na vstupniacute lidskeacute tyreoidaacutelniacute tkaacuteni a použiteacutem purifikačniacutem procesu To vysvětluje proč jsou testy na TgAb a takeacute Tg tak obtiacutežně standardizovatelneacute
Titr protilaacutetek
bull Titr protilaacutetek literaacuterně koreluje s počtem autoreaktivniacutech lymfocytů ktereacute infiltrujiacute štiacutetnou žlaacutezu a sonografickyacutem obrazem 1)
bull a-TG nižšiacute senzitivita (60-80 u HT) a menšiacute specifita (pozitivniacute ve většiacute čaacutesti zdravyacutech kontrol) než a-TPO
bull a-TG a a-TPO představujiacute dva různeacute aspekty autoimunniacute odpovědi na štiacutetnou žlaacutezu a-TG by mohly odraacutežet počaacutetečniacute (vrozenyacute) typ imunitniacute odpovědi zatiacutemco a-TPO by mohly charakterizovat pozdějšiacute adaptivniacute imunitniacute odpovědi 2)
1)Pandit AA VijayWardeMMenon PS Correlation of number of intrathyroid lympho- cytes with antimicrosomal antibody titer in Hashimotos thyroiditis Diagn Cytopathol 20032863ndash5 2) Rose NR Autoimmune escalation through the crystal ball Clin Exp Immunol 20071479
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
Hashimotova tyreoiditida (HT)
bull HT 1) a SLE 2) byly prvniacute dvě autoimunitniacute onemocněniacute kde se prokaacutezala genetickaacute asociace (geny MHC třiacutedy II) 70 leacuteta
bull Nicmeacuteně nebyl nalezen gen kteryacute by spouštěl HT nalezeny pouze geny ktereacute přispiacutevajiacute k fenotypu onemocněniacute 3)
1)VladutiuAO RoseNR Autoimmunemurine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type Science 19711741137ndash9 2)Grumet FC Coukell A Bodmer JG Bodmer WF McDevitt HO Histocompatibility (HL-A) antigens associated with systemic lupus erythematosus A possible genetic predisposition to disease N Engl J Med 1971285193ndash6 3) Simmonds MJ Gough SC The search for the genetic contribution to autoimmune thyroid disease the never ending story Brief Funct Genomics 20111077ndash90
Hashimotova tyreoiditida
bull Do 50 let raritniacute onemocněniacute nyniacute nejběžnějšiacute s prevalenciacute 81000 biochemickyacute naacutelez + autoprotilaacutetky 461000
bull Ženymuži 81
a-TPO
bull Přiacutetomnost protilaacutetek TPOAb obvykle předchaacuteziacute vzniku tyreoidaacutelniacute dysfunkce
bull Patogenetickaacute role protilaacutetek TgAb zůstaacutevaacute nejasnaacute
a-TPO
bull Autoprotilaacutetky TPOAb byly nejdřiacuteve popsaacuteny jako antimikrozomaacutelniacute autoprotilaacutetky (AMA) neboť bylo zjištěno že reagujiacute s neupravenyacutemi membraacutenami tyreoidaacutelniacutech buněk
bull Mikrozomaacutelniacute antigen byl později popsaacuten jako TPO
bull Dřiacuteve se využiacutevaly ke stanoveniacute TPO metody imunofluorescenčniacute metody a aglutinačniacute testy s pasivniacutem barveniacutem erytrocytů
a-TPO jako rizikovyacute faktor
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TPO je znaacutemyacutem rizikovyacutem faktorem pro vznik tyreoidaacutelniacute dysfunkce pokud jsou pacienti leacutečeni lithiem amiodaronem interleukinem-2 nebo alfa-interferonem
a-TG
bull Tg vykazuje vysokou heterogenitu způsobenou rozdiacutely v posttranslačniacutech modifikaciacutech (glykosylace jodizace sulfatace atd) Během synteacutezy tyreoidaacutelniacuteho hormonu a jeho uvolněniacute je Tg polymerizovaacuten a degradovaacuten
bull Vlivem toho je imunologickaacute struktura Tg mimořaacutedně komplexniacute Charakteristika standardů pro Tg se může lišit v zaacutevislosti na vstupniacute lidskeacute tyreoidaacutelniacute tkaacuteni a použiteacutem purifikačniacutem procesu To vysvětluje proč jsou testy na TgAb a takeacute Tg tak obtiacutežně standardizovatelneacute
Titr protilaacutetek
bull Titr protilaacutetek literaacuterně koreluje s počtem autoreaktivniacutech lymfocytů ktereacute infiltrujiacute štiacutetnou žlaacutezu a sonografickyacutem obrazem 1)
bull a-TG nižšiacute senzitivita (60-80 u HT) a menšiacute specifita (pozitivniacute ve většiacute čaacutesti zdravyacutech kontrol) než a-TPO
bull a-TG a a-TPO představujiacute dva různeacute aspekty autoimunniacute odpovědi na štiacutetnou žlaacutezu a-TG by mohly odraacutežet počaacutetečniacute (vrozenyacute) typ imunitniacute odpovědi zatiacutemco a-TPO by mohly charakterizovat pozdějšiacute adaptivniacute imunitniacute odpovědi 2)
1)Pandit AA VijayWardeMMenon PS Correlation of number of intrathyroid lympho- cytes with antimicrosomal antibody titer in Hashimotos thyroiditis Diagn Cytopathol 20032863ndash5 2) Rose NR Autoimmune escalation through the crystal ball Clin Exp Immunol 20071479
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
Hashimotova tyreoiditida
bull Do 50 let raritniacute onemocněniacute nyniacute nejběžnějšiacute s prevalenciacute 81000 biochemickyacute naacutelez + autoprotilaacutetky 461000
bull Ženymuži 81
a-TPO
bull Přiacutetomnost protilaacutetek TPOAb obvykle předchaacuteziacute vzniku tyreoidaacutelniacute dysfunkce
bull Patogenetickaacute role protilaacutetek TgAb zůstaacutevaacute nejasnaacute
a-TPO
bull Autoprotilaacutetky TPOAb byly nejdřiacuteve popsaacuteny jako antimikrozomaacutelniacute autoprotilaacutetky (AMA) neboť bylo zjištěno že reagujiacute s neupravenyacutemi membraacutenami tyreoidaacutelniacutech buněk
bull Mikrozomaacutelniacute antigen byl později popsaacuten jako TPO
bull Dřiacuteve se využiacutevaly ke stanoveniacute TPO metody imunofluorescenčniacute metody a aglutinačniacute testy s pasivniacutem barveniacutem erytrocytů
a-TPO jako rizikovyacute faktor
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TPO je znaacutemyacutem rizikovyacutem faktorem pro vznik tyreoidaacutelniacute dysfunkce pokud jsou pacienti leacutečeni lithiem amiodaronem interleukinem-2 nebo alfa-interferonem
a-TG
bull Tg vykazuje vysokou heterogenitu způsobenou rozdiacutely v posttranslačniacutech modifikaciacutech (glykosylace jodizace sulfatace atd) Během synteacutezy tyreoidaacutelniacuteho hormonu a jeho uvolněniacute je Tg polymerizovaacuten a degradovaacuten
bull Vlivem toho je imunologickaacute struktura Tg mimořaacutedně komplexniacute Charakteristika standardů pro Tg se může lišit v zaacutevislosti na vstupniacute lidskeacute tyreoidaacutelniacute tkaacuteni a použiteacutem purifikačniacutem procesu To vysvětluje proč jsou testy na TgAb a takeacute Tg tak obtiacutežně standardizovatelneacute
Titr protilaacutetek
bull Titr protilaacutetek literaacuterně koreluje s počtem autoreaktivniacutech lymfocytů ktereacute infiltrujiacute štiacutetnou žlaacutezu a sonografickyacutem obrazem 1)
bull a-TG nižšiacute senzitivita (60-80 u HT) a menšiacute specifita (pozitivniacute ve většiacute čaacutesti zdravyacutech kontrol) než a-TPO
bull a-TG a a-TPO představujiacute dva různeacute aspekty autoimunniacute odpovědi na štiacutetnou žlaacutezu a-TG by mohly odraacutežet počaacutetečniacute (vrozenyacute) typ imunitniacute odpovědi zatiacutemco a-TPO by mohly charakterizovat pozdějšiacute adaptivniacute imunitniacute odpovědi 2)
1)Pandit AA VijayWardeMMenon PS Correlation of number of intrathyroid lympho- cytes with antimicrosomal antibody titer in Hashimotos thyroiditis Diagn Cytopathol 20032863ndash5 2) Rose NR Autoimmune escalation through the crystal ball Clin Exp Immunol 20071479
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
a-TPO
bull Přiacutetomnost protilaacutetek TPOAb obvykle předchaacuteziacute vzniku tyreoidaacutelniacute dysfunkce
bull Patogenetickaacute role protilaacutetek TgAb zůstaacutevaacute nejasnaacute
a-TPO
bull Autoprotilaacutetky TPOAb byly nejdřiacuteve popsaacuteny jako antimikrozomaacutelniacute autoprotilaacutetky (AMA) neboť bylo zjištěno že reagujiacute s neupravenyacutemi membraacutenami tyreoidaacutelniacutech buněk
bull Mikrozomaacutelniacute antigen byl později popsaacuten jako TPO
bull Dřiacuteve se využiacutevaly ke stanoveniacute TPO metody imunofluorescenčniacute metody a aglutinačniacute testy s pasivniacutem barveniacutem erytrocytů
a-TPO jako rizikovyacute faktor
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TPO je znaacutemyacutem rizikovyacutem faktorem pro vznik tyreoidaacutelniacute dysfunkce pokud jsou pacienti leacutečeni lithiem amiodaronem interleukinem-2 nebo alfa-interferonem
a-TG
bull Tg vykazuje vysokou heterogenitu způsobenou rozdiacutely v posttranslačniacutech modifikaciacutech (glykosylace jodizace sulfatace atd) Během synteacutezy tyreoidaacutelniacuteho hormonu a jeho uvolněniacute je Tg polymerizovaacuten a degradovaacuten
bull Vlivem toho je imunologickaacute struktura Tg mimořaacutedně komplexniacute Charakteristika standardů pro Tg se může lišit v zaacutevislosti na vstupniacute lidskeacute tyreoidaacutelniacute tkaacuteni a použiteacutem purifikačniacutem procesu To vysvětluje proč jsou testy na TgAb a takeacute Tg tak obtiacutežně standardizovatelneacute
Titr protilaacutetek
bull Titr protilaacutetek literaacuterně koreluje s počtem autoreaktivniacutech lymfocytů ktereacute infiltrujiacute štiacutetnou žlaacutezu a sonografickyacutem obrazem 1)
bull a-TG nižšiacute senzitivita (60-80 u HT) a menšiacute specifita (pozitivniacute ve většiacute čaacutesti zdravyacutech kontrol) než a-TPO
bull a-TG a a-TPO představujiacute dva různeacute aspekty autoimunniacute odpovědi na štiacutetnou žlaacutezu a-TG by mohly odraacutežet počaacutetečniacute (vrozenyacute) typ imunitniacute odpovědi zatiacutemco a-TPO by mohly charakterizovat pozdějšiacute adaptivniacute imunitniacute odpovědi 2)
1)Pandit AA VijayWardeMMenon PS Correlation of number of intrathyroid lympho- cytes with antimicrosomal antibody titer in Hashimotos thyroiditis Diagn Cytopathol 20032863ndash5 2) Rose NR Autoimmune escalation through the crystal ball Clin Exp Immunol 20071479
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
a-TPO
bull Autoprotilaacutetky TPOAb byly nejdřiacuteve popsaacuteny jako antimikrozomaacutelniacute autoprotilaacutetky (AMA) neboť bylo zjištěno že reagujiacute s neupravenyacutemi membraacutenami tyreoidaacutelniacutech buněk
bull Mikrozomaacutelniacute antigen byl později popsaacuten jako TPO
bull Dřiacuteve se využiacutevaly ke stanoveniacute TPO metody imunofluorescenčniacute metody a aglutinačniacute testy s pasivniacutem barveniacutem erytrocytů
a-TPO jako rizikovyacute faktor
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TPO je znaacutemyacutem rizikovyacutem faktorem pro vznik tyreoidaacutelniacute dysfunkce pokud jsou pacienti leacutečeni lithiem amiodaronem interleukinem-2 nebo alfa-interferonem
a-TG
bull Tg vykazuje vysokou heterogenitu způsobenou rozdiacutely v posttranslačniacutech modifikaciacutech (glykosylace jodizace sulfatace atd) Během synteacutezy tyreoidaacutelniacuteho hormonu a jeho uvolněniacute je Tg polymerizovaacuten a degradovaacuten
bull Vlivem toho je imunologickaacute struktura Tg mimořaacutedně komplexniacute Charakteristika standardů pro Tg se může lišit v zaacutevislosti na vstupniacute lidskeacute tyreoidaacutelniacute tkaacuteni a použiteacutem purifikačniacutem procesu To vysvětluje proč jsou testy na TgAb a takeacute Tg tak obtiacutežně standardizovatelneacute
Titr protilaacutetek
bull Titr protilaacutetek literaacuterně koreluje s počtem autoreaktivniacutech lymfocytů ktereacute infiltrujiacute štiacutetnou žlaacutezu a sonografickyacutem obrazem 1)
bull a-TG nižšiacute senzitivita (60-80 u HT) a menšiacute specifita (pozitivniacute ve většiacute čaacutesti zdravyacutech kontrol) než a-TPO
bull a-TG a a-TPO představujiacute dva různeacute aspekty autoimunniacute odpovědi na štiacutetnou žlaacutezu a-TG by mohly odraacutežet počaacutetečniacute (vrozenyacute) typ imunitniacute odpovědi zatiacutemco a-TPO by mohly charakterizovat pozdějšiacute adaptivniacute imunitniacute odpovědi 2)
1)Pandit AA VijayWardeMMenon PS Correlation of number of intrathyroid lympho- cytes with antimicrosomal antibody titer in Hashimotos thyroiditis Diagn Cytopathol 20032863ndash5 2) Rose NR Autoimmune escalation through the crystal ball Clin Exp Immunol 20071479
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
a-TPO jako rizikovyacute faktor
bull Přiacutetomnost protilaacutetek a-TPO je znaacutemyacutem rizikovyacutem faktorem pro vznik tyreoidaacutelniacute dysfunkce pokud jsou pacienti leacutečeni lithiem amiodaronem interleukinem-2 nebo alfa-interferonem
a-TG
bull Tg vykazuje vysokou heterogenitu způsobenou rozdiacutely v posttranslačniacutech modifikaciacutech (glykosylace jodizace sulfatace atd) Během synteacutezy tyreoidaacutelniacuteho hormonu a jeho uvolněniacute je Tg polymerizovaacuten a degradovaacuten
bull Vlivem toho je imunologickaacute struktura Tg mimořaacutedně komplexniacute Charakteristika standardů pro Tg se může lišit v zaacutevislosti na vstupniacute lidskeacute tyreoidaacutelniacute tkaacuteni a použiteacutem purifikačniacutem procesu To vysvětluje proč jsou testy na TgAb a takeacute Tg tak obtiacutežně standardizovatelneacute
Titr protilaacutetek
bull Titr protilaacutetek literaacuterně koreluje s počtem autoreaktivniacutech lymfocytů ktereacute infiltrujiacute štiacutetnou žlaacutezu a sonografickyacutem obrazem 1)
bull a-TG nižšiacute senzitivita (60-80 u HT) a menšiacute specifita (pozitivniacute ve většiacute čaacutesti zdravyacutech kontrol) než a-TPO
bull a-TG a a-TPO představujiacute dva různeacute aspekty autoimunniacute odpovědi na štiacutetnou žlaacutezu a-TG by mohly odraacutežet počaacutetečniacute (vrozenyacute) typ imunitniacute odpovědi zatiacutemco a-TPO by mohly charakterizovat pozdějšiacute adaptivniacute imunitniacute odpovědi 2)
1)Pandit AA VijayWardeMMenon PS Correlation of number of intrathyroid lympho- cytes with antimicrosomal antibody titer in Hashimotos thyroiditis Diagn Cytopathol 20032863ndash5 2) Rose NR Autoimmune escalation through the crystal ball Clin Exp Immunol 20071479
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
a-TG
bull Tg vykazuje vysokou heterogenitu způsobenou rozdiacutely v posttranslačniacutech modifikaciacutech (glykosylace jodizace sulfatace atd) Během synteacutezy tyreoidaacutelniacuteho hormonu a jeho uvolněniacute je Tg polymerizovaacuten a degradovaacuten
bull Vlivem toho je imunologickaacute struktura Tg mimořaacutedně komplexniacute Charakteristika standardů pro Tg se může lišit v zaacutevislosti na vstupniacute lidskeacute tyreoidaacutelniacute tkaacuteni a použiteacutem purifikačniacutem procesu To vysvětluje proč jsou testy na TgAb a takeacute Tg tak obtiacutežně standardizovatelneacute
Titr protilaacutetek
bull Titr protilaacutetek literaacuterně koreluje s počtem autoreaktivniacutech lymfocytů ktereacute infiltrujiacute štiacutetnou žlaacutezu a sonografickyacutem obrazem 1)
bull a-TG nižšiacute senzitivita (60-80 u HT) a menšiacute specifita (pozitivniacute ve většiacute čaacutesti zdravyacutech kontrol) než a-TPO
bull a-TG a a-TPO představujiacute dva různeacute aspekty autoimunniacute odpovědi na štiacutetnou žlaacutezu a-TG by mohly odraacutežet počaacutetečniacute (vrozenyacute) typ imunitniacute odpovědi zatiacutemco a-TPO by mohly charakterizovat pozdějšiacute adaptivniacute imunitniacute odpovědi 2)
1)Pandit AA VijayWardeMMenon PS Correlation of number of intrathyroid lympho- cytes with antimicrosomal antibody titer in Hashimotos thyroiditis Diagn Cytopathol 20032863ndash5 2) Rose NR Autoimmune escalation through the crystal ball Clin Exp Immunol 20071479
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
Titr protilaacutetek
bull Titr protilaacutetek literaacuterně koreluje s počtem autoreaktivniacutech lymfocytů ktereacute infiltrujiacute štiacutetnou žlaacutezu a sonografickyacutem obrazem 1)
bull a-TG nižšiacute senzitivita (60-80 u HT) a menšiacute specifita (pozitivniacute ve většiacute čaacutesti zdravyacutech kontrol) než a-TPO
bull a-TG a a-TPO představujiacute dva různeacute aspekty autoimunniacute odpovědi na štiacutetnou žlaacutezu a-TG by mohly odraacutežet počaacutetečniacute (vrozenyacute) typ imunitniacute odpovědi zatiacutemco a-TPO by mohly charakterizovat pozdějšiacute adaptivniacute imunitniacute odpovědi 2)
1)Pandit AA VijayWardeMMenon PS Correlation of number of intrathyroid lympho- cytes with antimicrosomal antibody titer in Hashimotos thyroiditis Diagn Cytopathol 20032863ndash5 2) Rose NR Autoimmune escalation through the crystal ball Clin Exp Immunol 20071479
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
Titr protilaacutetek
bull Vyšetřovat tyreoidaacutelniacute autoprotilaacutetky pro monitorovaacuteniacute leacutečby AITD se obecně nedoporučuje Tento fakt neniacute překvapujiacuteciacute neboť leacutečba AITD se zaměřuje na naacutesledek (tyreoidaacutelniacute dysfunkci) a ne na přiacutečinu onemocněniacute (autoimunitu)
bull Nicmeacuteně změny v koncentraci autoprotilaacutetek dle některyacutech autorů mohou reflektovat změnu aktivity onemocněniacute
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
Titr protilaacutetek
bull Podobně jako u protilaacutetek TPOAb je klinickyacute vyacuteznam niacutezkyacutech koncentraciacute protilaacutetek TgAb ktereacute by ve staršiacutech aglutinačniacutech metodaacutech zůstaly nedetekovatelneacute nejasnyacute
bull Zdaacute se že by niacutezkeacute koncentrace mohly reprezentovat bdquopřirozeneacuterdquo protilaacutetky u normaacutelniacutech jedinců nebo bdquoscavengerrdquo protilaacutetkovou odpověď na uvolněniacute antigenu po operaci štiacutetneacute žlaacutezy nebo leacutečbě radioaktivniacutem joacutedem
bull Niacutezkeacute hladiny mohou takeacute reprezentovat skrytě probiacutehajiacuteciacute AITD
bull Různeacute metody stanoveniacute protilaacutetek TgAb udaacutevajiacute odlišneacute hraničniacute hodnoty referenčniacuteho rozmeziacute
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
Mezinaacuterodniacute standardy a-TPO a-TG
bull Standardizace testů na stanoveniacute tyreoidaacutelniacutech protilaacutetek neniacute v současneacute době optimaacutelniacute
bull Mezinaacuterodniacute referenčniacute standardy (International Reference Preparations) MRC 6593 pro protilaacutetky TgAb a MRC 66387 pro TPOAb
bull Většina současnyacutech metod na stanoveniacute protilaacutetek TPOAb je kvantifikovaacutena v mezinaacuterodniacutech jednotkaacutech za použitiacute referenčniacuteho standardu MRC 66387 Použitiacutem těchto primaacuterniacutech standardů se však nezmenšujiacute rozdiacutely mezi metodami ktereacute jsou patrneacute z velkeacute variability hodnot citlivosti uvaacuteděnyacutech různyacutemi vyacuterobci
bull Komerčniacute soupravy obsahujiacute sekundaacuterniacute standardy ktereacute se pro každou metodu lišiacute
Děkuji za pozornost
Děkuji za pozornost
