PJ'iWdlIv portonwan dan Prosontasl DmIah FWlDslnnal TBknls Non PWJBJIU,19 DosombBr 2008- ISSN :1410·6381

PRE PARAS I 99mTc-HUMAN IMMUNOGLOBULIN G YANG AKAN DIGUNAKANSEBAGAI PREP ARA T PENA TAH INFEKSI/INFLAMASI

Laksmi A, Widyastuti W, Sri Setyawati, Maskur, Agus A, Gina M.PRR - BAT AN

ABSTRAK

PREP ARASI99mTc - HUMAN IMMUNOGLOBULIN G YG AKAN DIGUNAKAN

SEBAGAI PREP ARA T PENA TAH INFEKSI/INFLAMASI , Telah dilakukan preparasi99mTc_Human Immunoglobulin G (99mTc_hIgG) yg akan digunakan sebagai penatahinfeksi/inflamasi. Preparasi 99mTc_hIgGini dilakukan dengan melalui beberapa tahapan yaitu:Reduksi hIgG menggunakan merkaptoetanol dg perbandingan molar hIgG terhadapmerkaptoetanol 1:2000, pemurnian melalui kolom PD-I0, hasil pemurnian diukur serapannyadengan spektrometer UV pada panjang gelombang 280 nm dan pelabelan hIgG dengan Tc99m , yang mana pada pelabelan ini ditambahkan kit MDP sebagai sumber Sn(lI) dan co­ligand serta larutan perteknetat Tc-99m dari generator Mo-99/Tc-99m. Hasil penandaandianalisis dengan kromatografi lapis tipis/kromatografi kertas untuk mengetahui kemumianradiokimianya. Untuk mengetahui stabilitas sediaan di dalam tubuh dilakukan uji stabilitasdalam serum manusia selama 1,2 dan 3jam .Hasil analisis dengan kromatografi lapistipis/kromatografi kertas diperoleh kemurnian radiokimia 99mTc_hIgGlebih besar 95%. Hasilpengujian kestabilan dalam serum manusa menunjukkan kemurnian radiokimia masih stabilsampai 3 jam dan dari pengamatan didapatkan hasil reduksi hIgG masih cukup stabil sampai 3bulan

ABSTRACT

PREP ARA TION OF 99mTc HUMAN IMMUNOGLOBULIN G AS

INFECTION/INFLAMMATION IMAGING AGENT. /Prep~ation of 99mTc -HumanImmunoglobulin G(99mTq_hIgG) and its analysis have been carried out.This preparationneeds several steps, first reducing hIgG using mercaptoetanol with molar ratio 2000:1,purification using PD-I0 column ( sephadex G-25,Pharmacia), and the reduced hIgG waslabeled with 99mTcand MDP as transchelator. The radiochemical purity of 99mTc_hIgG wasanalysed using TLC/paper chromatography. The stability in the body was carried out by usingfresh human serum after 1 ,2 and 3 hours incubation. the raqiochemical purity of 99mTc_hIgGanalysed with TLC/paper chromatography was higher than 95 %. The stability of labeledhIgG in fresh human serum was stable after 1 ,2, 3 hours incubation and the reduced hIgG wasstable until 3 months

84

PM. P8rtml11JandaD Prosentasl Umlah FIIDIIsionalToknls Non PIlll8lltl.18 Daswnbor 2006---PENDAHULUAN

ISSN :1410 - 6381

Radiofarmaka telah menunjukkan manfaat yang nyata dan spesifik dalam pelayanan

kesehatan, terutama untuk keperluan diagnosis dan terapi, antara lain penyakit kanker, infeksi

/ inflamasi dan lain lain.

Akhir akhir ini penelitian/pengembangan mengenai radiofarmaka penyidik infeksi dan

irrt1amasi berkembang dengan pesat, misalnya monoklonal antibodi bertanda, fragmen

antibodi, peptida kemotaktik dan antibiotik bertanda [ 1 ].

Inflamasi jaringan dengan atau tanpa infeksi merupakan gangguan yang bersifat

heterogen dan dapat melibatkan berbagai organ dalam tubuh dengan manifestasi klinik yg

bervariasi. Inflamasi adalah suatu respon yang terjadi pada jaringan yang terluka untuk

membawa molekul dan sel dari sistem imun ke tempat terjadinya kerusakan, sedangkan

infeksi adalah inflamasi yang disertai dengan kontaminasi mikro-organisme [2]. Pada

umumnya diagnosis infeksi tidak sulit terutama apabila sudah terbentuk abses, namun

demikian pada keadaan tertentu diagnosis menjadi sulit seperti pada penderita dengan keluhan,

gejala klinik dan dari pemeriksaan fisik ditemukan gambaran yang tidak khas. Pada keadaan

demikian modalitas pencitraan untuk deteksi dan penentuan lokasi inflamasi/infeksi menjadi

suatu hal yang penting dalam klinik, karena dapat memberikan informasi yang penting dalam

pengelolaan penyakit sekaligus dapat memberikan konfirmasi eradikasi infeksi setelah

pemberian antibiotik [3].

Pada saat ini beberapa modalitas diagnostik dapat digunakan untuk deteksi dan

lokalisasi infeksi. Teknik diagnostik tersebut dapat dikelompokkan menjadi dua kelompok ,

yaitu kelompok yg didasarkan pada perubahan anatomis dan fisiologis. Kelompok yang

didasarkan pada perubahan anatomis misalnya pencitraan menggunakan sinar-x konvensional,

USG, CT dan MRI, sedangkan kelompok yang didasarkan pada perubahan fisiologis adalah

p{mcitraan menggunakan teknik kedokteran nuklir. Pada pencitraan menggunakan

radionuklida akan diperoleh informasi berupa perubahan yang terjadi dalam proses

patofisiologi dan patobiokimia pada penderita. Kelebihan pencitraan dengan teknik kedokteran

nuklir dibandingkan dengan pencitraan anatomis adalah, tidak dipengaruhi oleh perubahan

anatomi dan secara rutin dapat dilakukan pada seluruh tubuh tanpa memberikan paparan

radiasi tambahan [3].

85

PCUS_ PortBD\JJ311 dan ProsontaslllmIah FWloslonal Toknls Non POIIODtl.18 DOS8m/Jor 2008- ISSN ;1410·5381

Penandaan monoklonal antibodi dengan IIlIn diperkenalkan oleh Locker dkk. [4]dan

Rusckowski dkk. [5], tetapi secara umum prosedur penandaan dengan IllIn cukup mmit.

P,;:ncitraan dengan III In lamban sampai 24 jam serta menghasilkan kualitas pencitran yang

sub-optimal[6]. Adanya kelemahan penggunaan IlIIn telah merangsang peneliti untuk

menggunakan 99mTc yang mempakan radionuklida ideal untuk pencitraan menggunakan

kamera gamma. Dibandingan dengan 11 IIn, 99mTcmemberikan beberapa keuntungan seperti

paparan radiasi yang diterima penderita relatif lebih rendah, kualitas pencitraan lebih baik

dengan pencitraan lebih pendek, serta diagnostik dapat ditegakkan lebih cepat dalam beberapa

jam dengan akurasi cukup tinggi dibandingkan dengan I11In yang memerlukan waktu 24 jam

[7]. Dalam penelitian ini dilaporkan hasil preparasi 99mTc_hIgG beserta uji kemumian

radiokimia uji kestabilan dalam semm manusia yg akan digunakan sebagai preparat penatah

infeksi/inflamasi. Diharapkan penelitian ini dapat menyumbangkan tambahan informasi

dalam pengembangan Radiofarmaka penatah infeksi/inflamasi.

BAHAN DAN TATA KERJA

Bahan dan Peralatan

Bahan yg digunakan ialah SnCh.2H20 (Merck), MDP ( fluka) , kolom PD-IO (

st::phadex G-25 Pharmacia), Merkaptoetanol ( Sigma), hIgG (Sandoz), air demin, air

bidestilasi steril ( IPHA), larutan HCI 0,01 N,larutan PBS O,OIM pH 7,4,gas nitrogen dan lain

lain.

Alat yang digunakan ialah peralatan gelas standar, tabung mikro, Syringe dan pipet

eppendorf berbagai ukuran, timbangan , Ph meter, HPLC ( Shimadzu ) dengan kolom SE,

Spektrometer UV, peralatan kromatografi kertas/lapis tipis dan lain-lain.

Tata kerja

Reduksi dan pemurnian hIgG.

Sebanyak 500 !1llarutan hIgG yg mengandung 50 mg/ml hIgG direduksi dengan cara

direaksikan dengan merkaptoetanol dengan perbandingan molar 1:2000 dan diinkubasi selama

86

Pr1ls1!11JJJPBl'twnuan dan Prosontasillmlah FWlDSlonaJ Toknls Non PonoIIU,18 Dosombor 2008iii--~- ISSN :1410 • 6381

30 menit dalam suhu kamar, hasil reduksi dilewatkan pada kolom PD-I0 yang telah diaktifkan

, kemudian dielusi dengan larutan PBS O,OIM pH 7,4 yang telah dijenuhkan dengan gas

ni.trogen, eluat ditampung tiap Iml yang masing masing fraksi diukur serapannya dengan

spektrometer UV pada panjang gelombang 280 nm, fraksi yang mengandung hIgG dihitung

kadarnya dari persamaan regresi yang diperoleh dari kurva kalibrasi standar hIgG.

P,mandaan 99mTc_ hIgG

Ke dalam kit MDP (PRR) ditambahkan larutan NaCI fisiologis ( salin ) hingga

volume akhir 5 ml kemudian divortex, kemudian tambahkan sebanyak 3-10 III ke dalam

tabung mikro yang mengandung (10-50) III 5490 ppm larutan hIgG yang telah direduksi

,kemudian tambahkan sebanyak (2-3) mCi larutan 99mTc dari generator Mo99!fc-99m,

diinkubasi dalam suhu kamar selama 30 menit

AJilalisa

Fraksi hIgG yang telah direduksi diidentifikasi dg HPLC menggunakan kolom 'size

exlusion'(SE) BIORAD dengan eluen larutan PBS pH 7 dan detektor UV pada panjang

gelombang 280 nm yang prinsip pemisahannya berdasarkan perbedaan berat molekul untuk

spesi yang berat molekulnya lebih besar akan terelusi lebih awal, hasilnya dibandingkan

dengan hIgG yang belum direduksi, kemurnian radiokimia diuji dengan kromatografi kertas

dengan eluen aseton untuk menentukan %99mTcbebas dan kromatografi lapis tipis dengan

eluen buffer sitrat 0,15 M pH 5,5 untuk menentukan % 99mTc02 , dg demikian kemurnian

radiokimia 99mTc- hIgG dapat dihitung. Untuk mengetahui stabilitas sediaan di dalam tubuh

dilakukan uji stabilitas dalam serum manusia dengan cara mereaksikan sediaan yang telah

ditandai dengan 99mTcdengan serum manusia dan PBS , diinkubasi selama 1, 2, 3 jam dan

hasilnya dianalisis kromatografi kertas / kromatografi lapis tipis

87

pros_ PW'tanwan dan Prosontasillmlah FW\lJsJonaI ToknIs NDn PonoDtI, 18 Dosombor 2006iiii- --

HASIL DAN PEMBAHASAN.

ISSN :14ID - 6381

HasH pengujian dengan HPLC untuk hIgG standar menunjukkan puncak tunggal pada

menit ke 9,017 ditunjukkan pada Gambar 1 dan untuk hIgG hasH reduksi menunjukkan

puncak pada menit ke 16,763 dan 20.417 yang ditunjukkan pada Gambar 2, hal ini

menunjukkan bahwa telah terjadi fragmentasi molekul pada hIgG hasil reduksi atau ikatan

disulfida pada antibodi terse but telah tereduksi.

~1,,--,'don 'irn_ (MNT)

10 IIin

311

Gambar 1. Kromatogram HPLC hIgG standar kolom SE250 BIORAD, eluen bufferphospat pH 7 , detektor UV dengan panjang gelombang 280 nm

10 1$

Gambar 2. Kromatogram HPLC hIgG hasil reduksi kolom SE250 BIORAD, eluen bufferphospat pH 7 , detektor UV dg panjang gelombang 280 nm

88

ProsldllJJ pcrtumuan dan Prosontaslllrnlah FWloslonai Tokllls Non PonuDtl.18 Dosamllor 2DD8- ISSN :1410 . 6381

Hasil pengujian kemurnian radiokimia dengan kromatografi kertas untuk 99mTe_hIgG

dapat dilihat pada Tabel 1 . Dad Tabel 1 dapat dilihat untuk nomer pereobaan 1 sid 3

k{:murnian radiokimia di atas 95% hal ini menunjukkan bahwa· baik hasil reduksi hIGg

,metoda analisis maupun metoda penandaan dan komposisi sediaan yang digunakan eukup

bagus.untuk selanjutnya dipilih formula pereobaan 3 , karena dengan kandungan hIgG yg

lebih keeil kemurnian radiokimianya tidak jauh berbeda hal ini bisa lebih menghemat jumlah

hIgG yang dipakai.

Tabel 1. Hasil Analisis Kemurnian Radiokimia dg TLC

No. lar 5490 ppm hIgGlarAktivitas I/I/IDTc (% I/l/nlTc_hIgG

reduksi(J!l)

MDPmCi)

(J!I)1

50 102,47_ .•..

98,9

2

25 52,21 98,8

3

1032,47 97,8

Hasil uji stabilitas sediaan dalam serum manusia dan dalam PBS dapat dilihat pada

Gambar 3 , dad Gambar 3 ini dapat dilihat bahwa baik dalam serum manusia ataupun dalam

PHS setelah diinkubasi dalam 1 jam, 2 jam maupun 3 jam kemurnian radiokimia sediaan

relatif konstan I rata2 diatas 95% , hal ini menunjukkan bahwa sediaan Te-99m hIgG yang

dihasilkan eukup stabil dalam dalam tubuh manusia , diharapkan sediaan ini bisa digunakan

untuk kepentingan diagnosis infeksi maupun inflamasi.

89

prosldlJJJ pertwnuan dan PrDSontasl 11m/aft FWluslonaJ Jokola Non PonoJJtJ.18 DDSombor 2006_ n

98

97% Tc-99m 96

hlgG 9594

9

dim PBS &Idim serum

ISSN :1410 • 6381

Gambar 3. Uji stabilitas 99mTc_hIgG dalam serum manusia dan dalam PBS

Pengamatan stabilitas hasil reduksi dapat dilihat pada Gambar 4, pengamatan stabilitas

hasil reduksi ini sangatlah penting , karena hal ini menyangkut masa kadaluwarsa dari hasil

reduksi , sehingga bisa memperkirakan berapa banyak hIgG yang ingin di reduksi dan kapan

kira-kira reduksi ulang harus kita lakukan lagi sesuai dengan ~~butuhan atau pesanan,

pengujian stabilitas hasil reduksi dilakukan dengan cara melakukan penandaan sediaan

dengan Tc-99m dan di lakukan analisis kemurnian radiokimia dengan kromatografi kertas dan

kromatografi lapis tipis, dari Gambar 4 dapat dilihat bahwa dari sampai rentang waktu 3bulan

(01/05/06 sid 03/08/06) hasil kemurnian radiokimia99mTc-hIgG ternyata masih cukup tinggi

yaitu masih di atas 92% hal ini menunjukkan bahwa hasil reduksi hIgG masih cukup stabil

sampai rentang waktu 3 bulan.

90

Pro_ PurtBmuan dan PrllS!lJ!aslllr~IUJIgslonal TBknlsNDnPonoIIt118DOS8IIIII8r2008-

uji stabilitas hlgG hasil reduksl

9910/:98

97

96

kemurnian 95radiokimia Tc- 94

99m-lgG 9392

91

90

8910/5/2006 7/6/2006 28/06/06 19/07/06

waktu pengujian

ISSN :1410 • 6381

Gambar 4. Pegamatan stabilitas hasil reduksi hIgG dalam rentang waktu 3 bulan

Reduksi dilakukan pada tanggal 01/05/06

KESIMPULAN DAN SARAN

Dari hasil kromatogram HPLC dan ditunjang dengan hasil penandaan hIgG dg Tc-99m

dapat dikctahui bahwa reduksi hIgG dengan menggunakan merkaptoetanol dengan

perbandingan moll :2000 dan pemurnian dengan kolom PD-IO (sepadex g-25, Pharmacia) ,

(:ukup berhasil . Hasil penandaan dapat dilihat dari hasil uji kemumian radiokimia yang

mencapai lebih dari 95%, menunjukkan bahwa selain hasil reduksi yg cukup herhasil juga

metode penandaan dan metode analisis cukup baik.Dari uji stabilitas sediaan dalam tubuh

dapat disimpulkan bahwa sediaan ini cukup stabil dalam tubuh manusia. Dari pengamatan

selama kurang lebih 3 bulan dapat disimpulkan hasil reduksi WgG ini masih cukup stabil

sampai rentang waktu 3 bulan. Dari semua hasil analisis dan pengamatan tersebut dapat

diharapkan sediaan 99mTc_hIgG ini bisa digunakan untuk sediaall radiofarmaka penatah

infeksi/inflamasi. Untuk itu perlu dilanjutkan dengan uji biodistribusi dan uji klinis lebih

lanjut serta diharapkan pellelitian illi juga dapat mellyumbangkan tambahan illformasi dalam

pengembangan Radiofarmaka penatah infeksi/inflamasi.

91

prosIIIIIJJ portmnuan dan PrusontasllimIaII FWiDSlonaJToknls Non PonOUtl. 18 Dosombor 2006..-----

DAFT AR PUSTAKA

ISSN :1410 - 5381

1. H.J.J.M. RENEN,F.H.M.Corstens, W.J.G.Oyen, et al.,"New concepts infection! inflamation

imaging ", Q J Nucl Med 2001,45:167-73.

2. ROITT 1M. Essential immunology. 6th edn. Oxfort: Blackwell Scientifik 1989.

3. A. HUSSEN S KARTAMIHARJA. Peranan Teknik Kedokteran Nuklir dalam Penentuan

fokus Infeksi. Kumpulan Makalah Pertemuan Ilmiah Dwi tahunan PKBNI-PKNI-BATAN,

Jakarta, 2002, 103-111.

4. LOCKER JT,Seybold K, Andres RY, et al. Imaging of inflamantory and infectious lession

after injection of radioiodinated monoclonal antigranulocyte antibodies. Nuc/ Med

Commun. 1986;7:659-670.

5. RUSCKOWSKI M, Fitz B, Hnatowich DJ. Lokalization of infection using strepavidin and

biotin; an alternatiive to nonspesific polyclonal immunoglobulin. J Nuc/ Med.

1992;33: 1810-1815.

6. PALESTRO ,CJ, Weiland FL, Seabold JE et al. Localizing infection with a teclmetium ­

99m-Iabeled peptide: initial results. Nuc Med Commun 2001; 22(6):695-701.

7. FOGELMAN, 1., Bone scaning in clinical Nuclear Medicine,3d ed, Maisey, Britton and

Coiler Eds, Chapman & Hall Medical, London, 1991:147-150.

T~mya - Jawab :

1. Penanya : Anna R (PRR - BAT AN)

Pertanyaan

Pada proses pelabelan HigG- TC99m diperlukan Coligand kit MDP sebagai sumber Sn (II).

Apakah Sn (II) hanya dapat diperoleh dari kit MDP saja? Apakah kit MDP hanya sebagai

sumber Sn (II) saja atau ada yang lain?

Jawaban : Laksmi A (PRR - BAT AN)

Sebagai sumber Sn bisa dipakai kit pirostan (phirophospat). Selain sebagai sumber Sn kit

MDP dipakai juga sebagai co-ligand/chelator, yaitu untuk mengurangi kemungkinan

terhidrolisisnya Tc-99m menjadi TC02 yang berbentuk koloid yang membuat lambatnya

reaksi kompleksasinya Tc-99m - AB.

92