Lambda. Cuestións de aplicación.

ANALIZAREMOS LA SERIE “S”.

Lección 1. Enzimas de restricción. Un par de cuestións traballando cos datos das bases de datos moleculares. Accede á páxina do NCBI coa secuencia completa do fago lambda: (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/215104) e contesta ás seguintes preguntas:

1. Localiza as secuencias palíndromicas de corte das enzimas: EcoRI (GAATTC/CTTAAG) HindIII (AAGCTT/TTCGAA) PstI (CTGCAG/GACGTC). Cantos fragmentos se espera que produzan os ataques sobre o xenoma completo do fago lambda con cada un deses enzimas? EcoRI (GAATTC/CTTAAG). Se producen 5 cortes de enzimas entonces tendremos 6 fragmentos. HindIII (AAGCTT/TTCGAA). Se producen 6 cortes de enzimas entonces tendremos 7 fragmentos. PstI (CTGCAG/GACGTC). Se producen 28 cortes de enzimas entonces tendremos 29 fragmentos.

2. Cantos pares de bases ten cada un deses fragmentos? Se non es quen de resolver esta pregunta na páxina do NCBI, podes usar o geneboy (http://www.dnai.org/geneboy/) para resolver esta cuestión.

EcoRI (GAATTC/CTTAAG): (21226// 4878// 5643// 7421// 5804// 3530) HindIII (AAGCTT/TTCGAA):( 23130//2027//2322/9416//564//6682//4361) PstI (CTGCAG/GACGTC): (2560// 264// 805//15// 216// 514// 339// 200// 211// 94// 468// 2838// 1093// 164// 1986// 72// 2459// 87// 1700// 150// 1159// 2443// 448//2140//4507//5077//248//4749//11497)

Unhas cuestións sobre o realizado no laboratorio.

1. Describe o aspecto macroscópico do ADN en disolución. É visible o ADN? (Podes tomar como referencia para comparar o que

viches na práctica “genética a domicilio”). Se pensas que hai

algunha diferencia entre as dúas observacións, a que se pode deber?

No podemos apreciarlo ya que el ADN en disolución acuosa no es visible, es incoloro. También influye el poco volumen que teníamos en los viales.

2. Enche a táboa seguinte cos volumes usados na práctica.

Tubo Lambda Tampón PstI EcoRI HindIII

P 4μL 5μL 1μL - -

E 4μL 5μL - 1μL -

H 4μL 5μL - - 1μL

L 4μL 6μL - - -

3. En que tubo pensas que non vai a haber cambios, que non se

van a producir fragmentos de restricción do ADN? No se aprecian cambios en el tubo L ya que no lleva enzimas de restricción que puedan cortar la secuencia de ADN. 4. Compara o tubo P e o tubo L, qué pensas que pasará no tubo P

comparado co tubo L? Xustifica a resposta. En el tubo P se produce la fragmentación del ADN ya que en ese tubo añadimos 1μL de enzima de restricción Pstl que corta la secuencia; mientras, en el tubo L no se producen fragmentaciones ya que no lleva este encima ni ningún otro enzima de restricción que fragmente la secuencia. 5. Se o ADN aparecese fragmentado ó final da reacción no tubo L,

que teríamos que concluir? Concluiríamos que la muestra está contaminada ya que no supuestamente no lleva ningún enzima de restricción lo que implica que no pueden aparecer fragmentos de ADN.

Lección 2. Electroforese en xel de agarosa 1. Indica cal será o ordenamento relativo dos fragmentos de

ADN segundo o seu tamaño, dentro do xel de agarosa. Indica cal é a causa de ese ordenamento.

Se colocan porciones de ADN sobre un gel de agarosa y se les permite que migren hacia los polos del campo magnético (siendo los grupos fosfato del ADN que tienen carga negativa, migrarán hacia el polo positivo; los fragmentos más pequeños lo harán más rápido y más lejos que las grandes debido a su peso molecular.

2. Supoñendo que tiveramos 500 pequenos anacos de cada un

dos catro fragmentos logo dun tratamento con enzimas de restricción, cantas bandas aparecerían no xel de agarosa?

Aparecerían 4 bandas ya que son 4 fragmentos, todos con 500 trozos de ADN.

3. Enche a seguinte táboa cos datos obtidos na práctica:

Curva de calibrado del patrón

1000

10000

100000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33

M(mm)

M (

pb

)

M M L L PstI PstI EcoRI EcoRI HindIII HindIII

mm pb mm pb mm pb mm pb mm pb

Banda

1 16

23130 15 10050 15 10050 14 10100 15 10050

Banda

2 17 9416 - - 22 5250 16 9800 17 9416

Banda

3 20 6557 - - - - 21

5700 19 7500

Banda

4 23.5 4361 - - - - - - 22 5250

Banda

5 29 2322 - - - - - - - -

Banda

6 31 2027 - - - - - - - -

mm= distancia en mm; pb= número de pares de bases do fragmento

Lección 3. Cómo se fai para converter en visible o ADN migrado nun xel de agarosa.

1. Indica a utilidade do tampón de carga e da tinción Fast Blast. El tampón hace que en el gel de agarosa se pueda ver el recorrido de ADN. Esto se produce gracias a la tinción del tampón con el Faste blast que tiñe el tampón que es el que determina el carril por donde se crean las bandas de ADN.