1

PEMBUATAN GEL AGAROSE DAN PENGENALAN

ELEKTROFORESIS Juwita Raditya Ningsih

(07/252184/KG/8196)

Fakultas Kedokteran Gigi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta

_____________________________________________________________

ABSTRACT

Deoxyribonuklease acid (DNA) is carrier genetic information. Electrophoresis

can be applied to the separation of different size fragments of DNA or RNA chains. In

this lab work we made agarose gel with concentration 2 %. The aim of this lab work is to

study about process of DNA identification and to recognize electrophoresis. We use 500

mg agarose powder and added sterilized aquadest until 25 ml. In electrophoresis we use

DNA sample, agarose gel, micropipette, and apparatus electrophoresis with 220

voltages. Smaller molecules migrate at a faster rate through the gel than larger

molecules. The principal of agarose gel electrophoresis is separate DNA based on its

molecule size. Each fragment of DNA will appears as band colored in blue represent its

staining using ethidium bromide after exposed by UV light. Electrophoresis is a choice to

analyze DNA in small molecule.

Keyword: DNA, electrophoresis, agarose gel

Pendahuluan

Deoxyribonuklease acid (DNA) atau asam deoksiribosanukleat dikenal

sebagai bahan kimia pembawa informasi genetik. RNA adalah riboukleic aIcd atau asam

ribonukleat sebagai hasil transkripsi DNA (Goodenough, 1988). DNA merupakan

polimer terdiri dari rangkaian subunit yang disebut nukleotida. Setiap nukleotida terdiri

dari 3 bagian: basa nitrogen, gula pentosa dan gugus fosfat. Kombinasi basa-gula disebut

nukleosida sedangkan kombinasi basa-gula-fosfat disebut dengan nukleotida. Baik DNA

maupun RNA mengandung basa purin yang sama yakni adenine dan guanine. Sedangkan

basa pirimidin untuk DNA adalah cytosine dan thiamin dan pada RNA adalah cytosine

dan urasil (Recee, 2004). Suatu gena adalah sepotong DNA yang mengandung beberapa

ratus atau ribu pasang basa (Harris H, 1980).

Umumnya, DNA terdapat di dalam kromosom sel-sel hidup. Pada sel prokariotik

terdapat banyak DNA ekstrakromosomal yang disebut dengan plasmid (Recee, 2004).

Salah satu cara yang paling umum dilakukan untuk mengetahui sekuen DNA

spesifik adalah dengan memasukkan protein α- heliks pada groove mayor DNA. Protein

2

α- heliks adalah protein sekunder dengan struktur right-handed heliks dari asam amino

pada ikatan polipeptida. Penelitian pertama dalam memotong dan menggabungkan

molekul DNA dapat dimonitor dengan kecepatan sedimentasi pada gradient sukrosa.

Namun teknik ini membutuhkan DNA yang cukup banyak dan kurang sensitif dalam

mengetahui adanya sedikit perubahan pada ukuran molekul DNA. Teknik separasi yang

diperlukan dalam penelitian genetika yang efektif adalah yang hanya membutuhkan

sedikit material dan separasi derajat tinggi (Recee, 2004).

Elektroforesis adalah teknik yang memberikan kontribusi yang besar dalam

analisis asam nukleat (Klug WS, dkk, 2009). Elektroforesis gel medan listrik bergetar

juga dapat digunakan untuk interpretasi pola sidik jari (Matsumoto,dkk, 2005). Gugus

fosfat pada ikatan gula-fosfat memberikan muatan negatif pada DNA. DNA yang panjang

akan lebih negatif dibandingkan dengan rantai pendek karena memiliki gugus fosfat yang

lebih banyak. Sehingga apabila aliran listrik dikenakan pada sampel DNA baik rantai

pendek maupun panjang pada larutan netral makan keduanya akan bergerak menuju

kutub positif (anoda) dengan asumsi mengabaikan adanya gesekan. Sehingga molekul

DNA yang pendek akan bergerak lebih cepat karena gesekkannya juga lebih kecil

daripada molekul DNA yang panjang. Menggerakkan molekul DNA pada gel akan

menyediakan gesekan yang dibutuhkan untuk memisahkan molekul DNA yang memiliki

ukuran berbeda-beda. (Recee, 2004). Elektroforesis dengan bidang listrik bergetar

merupakan metode yang paling efektif dalam metode typing tetapi tidak dilakukan secara

rutin di laboratorium (Chomvarin C,dkk, 2005).

Gel yang digunakan pada elektroforesis terdiri atas poliakrilamida atau

agarose. Agarose paling baik digunakan untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA yang

mempunyai ukuran rentang bberapa ratus hingga 20.00 pasangan basa. Poliakrilamida

lebih disukai untuk fragmen-fragmen DNA yang lebih kecil (Old RW dan Primrose SB,

1989). Gel agarose, merupakan protein alami yang di ekstrak dari rumput lain. Gel

agarose dibuat dalam bentuk suspense dari agarose serbuk dengan konsentrasi 1-3%

dengan larutan buffer kemudian dididihkan hingga larut. Gel yang telah larut dituangkan

pada cetakkan yang telah ditempatkan comb sebelumnya untuk membuat wells dan

dibiarkan dingin hingga membentuk gel.

3

Setelah gel menjadi setting, makan sampel DNA dimasukkan ke dalam

sumuran atau wells. Kemudian gel dialiri dengan arus listrik konstan ( 10V/ cm gel) dan

DNA akan bergerak ke anoda (kutub positif). Setelah di separasi maka harus dilakukan

pengecatan agar DNA dapat diamati. Cara yang paling umum untuk pengecatan gel

agarose adalah dengan merendam di dalam ethidium bromide (Klug WS, dkk, 2009).

Iluminasi sinar UV yang digunakkan untuk menampakkan pita fluoresense DNA ialah

sebesar 260-300 nm.

Tujuan praktikum ini dilakukan adalah agar mahasiswa mampu memahami

proses identifikasi suatu DNA dan mengenal penggunaan alat serta bahan yang

berhubungan dengan elektrophoresis.

Cara Kerja

Dalam praktikum praktikan melakukan prosedur pembuatan gel agarose dan

elektroforesis. Alat-alat dan bahan yang digunakan dalam pembuatan gel agarose 2 %

adalah bubuk agarose, aquades, cetakan gel, sisir gel, tabung erlenmeyer, dan microwave.

Sedangkan untuk elektroforesis alat dan bahan yang digunakan antara lain sampel DNA,

gel agarose 2 %, buffer TBE, gel loading buffer dan apparatus elektroforesis horisontal.

Dalam pembuatan 2 % gel agarose, 500 mg bubuk agarose dimasukkan ke

dalam tabung enlemeyer yang berisi 25 ml aquades. Kemudian tabung tersebut

dipanaskan dalam microwave sampai hampir mendidih (baru timbul sedikit letupan air)

kemudian tabung dikeluarkan dan digoyangkan agar gel tercampur. Setelah semua gel

larut kemudian dituangkan dalam cetakan. Selanjutnya sisir gel diinsersikan pada

tempatnya dan ditunggu sampai larutan gel tersebut membeku. Setelah membeku sisir gel

diangkat.

Pada elektroforesis, cara kerjanya adalah sebagai berikut sampel DNA diambil

8 mikroliter dan diletakkan di atas parafilm. Kemudian ditambahkan 2 mikroliter larutan

gel loading buffer yang mengandung bromphenol blue. Lalu campuran tersebut diaspirasi

dengan mikropipet sebanyak 3-4 kali, kemudian dimasukkan dalam sumuran gel agarose

2 % yang terendam oleh buffer TBE. Elektriforesis dilakukan dengan sumber daya 100

mA. Pergerakan pita DNA tersebut diamati, setelah pita DNA berada pada bagian bawah

maka elektroforesis dinyatakan selesai, dicatat berapa waktu yang dibutuhkan untuk

proses tersebut.

4

Hasil Pengamatan

Gb.1 H2O di dalam tabung Erlenmeyer

Gb. 2 Serbuk Agarose

Gb.3 Timbangan Analitik

Gb. 4 Elektrofosesis

Gb.5 Agarose gel di dalam perangkat

elektroforesis

Pembahasan

Gel agarose konsentrasi 2% dibuat dengan mencampurkan 500 mg serbuk agarose

dengan aquades steril hingga mencapai volume 25 ml. Pertama-tama serbuk dimasukkan

ke dalam tabung erlenmeyer kemudian ditambahkan aquades steril hingga 25 ml. Hal ini

dilakukan agar volume dan konsentrasi yang diperoleh bisa tepat dan akurat.

Memasukkan aquades 25 ml terlebih dahulu baru kemudian memasukkan serbuk agarose

500 mg akan menghasilkan suspensi dengan konsentrasi yang tidak tepat 2% seperti yang

diharapkan. Setelah serbuk tercampur di dalam aquades maka kemudian dipanaskan di

5

dalam microwave hingga terjadi letupan ”pulp” pada gel agarose agar campuran tersebut

bisa terlarut dan menjadi homogen. Tidak diperkenankan untuk memanaskan campuran

agasrose hingga mendidih karena akan meningkatkan penguapan sehingga konsentrasi

gel bisa berubah.

Gel agarose yang telah dipanaskan kemudian dituangkan ke dalam cetakkan agar

yang telah di tempatkan comb sebelumnya untuk membentuk wells atau sumuran. Wells

inilah yang nantinya akan menjadi tempat untuk meletakkan DNA sampel ke dalam

agarose. Ketebalan gel kurang lebih 1 cm, jangan tidak terlalu berlebih dan tidak terlalu

kurang. Jika kurang, maka DNA yang diletakkan ke dalam sumuran akan keluar.

Sedangkan jika terlalu tebal maka sumuran atau wells tidak akan terbentuk dengan baik

karena ukuran comb juga tidak terlalu tinggi, sehingga saat diangkat akan menjadikan gel

agarose menjadi rusak atau luka.

Setelah gel menjadi kenyal, maka gel tersebut segera dimasukkan ke dalam

perangkat elektroforesis sehingga gel terendam dalam aquades yang netral. Sampel DNA

sebesar 8 µl yang telah dicampur dengan loading buffer sebesar 2 µl yang mengandung

bromphenol blue dimasukkan ke dalam sumuran menggunakan mikropipet. Aparatus

elektroforesis kemudian dikenakan aliran listrik sebesar 100 mA, 220 volt selama kurang

lebih 15 menit sampai DNA bergerak sejauh ¾ dari panjang gel. Apabila arus listrik tetap

diberikan sementara sampel DNA sudah hampir mendekati ujung gel agarose maka

sampel DNA tersebut akan terus bergerak hingga keluar dan meninggalkan gel agarose

yang menjadi kosong. Prinsip utama pergerakkan DNA di dalam aparatus elektroforesis

adalah bergeraknya muatan negatif ke kutub positif. DNA bermuatan negatif karena

kandungan basa nitrogen, sehingga cenderung bergerak ke anoda ketika dialiri listrik.

DNA yang telah di elektroforesis telah terpisah-pisah berdasarkan berat molekul

dan ukurannya, namun belum dapat dapat diamati sebelum dilakukan pengecatan dengan

ethidium bromida dan diamati menggunakan UV light di ruangan yang gelap. Ekspresi

DNA yang sudah dipisahkan, akan tampak sebagai pita-pita berwarna biru yang memiliki

ketebalan tertentu sesuai dengan adanya nicked, coiled dan supercoiled dari DNA. Pita

yang berada di ujung gel merupakan fragmen DNA yang paling kecil sedangkan pita

yang berada di pangkal yaitu yang paling dekat dengan sumuran adalah fragmen DNA

yang paling besar.

6

Kesimpulan

- Dalam prosedur pembuatan gel agarose diperlukan ketelitian dalam menghitung

w/p ratio dan memperkirakan ketebalan gel

- Metode Elektroforesis melibatkan aliran listrik untuk memindahkan molekul

DNA melewati gel agarose

- Agarose gel elektroforesis mampu mendeteksi adanya DNA dengan

memisahkannya berdasarkan ukuran atau berat molekul DNA

Daftar Pustaka

Chomvarin, Chariya; Tishyaadhigama, Prapawadee; Siripornmongcolchai, Taweeporn;,

Wongwanich, Siripan; Limpaiboon, Temduang; dan Chaicumpar, Kunyaluk.

2005. Analysis of Phenotyping Methods amd Pulses-Field Gel Electrophoresis for

Differentiation of Methicillin Resistant Staphyloicoccus aureus Isolated from two

Hospitals in Thailand, The Southeast Asian Journal of tropical Medicine and

Public Health. Volume 36 no. 5 September 2005, Hal 1227.

Goodenough, Ursula. 1988. Genetika edisi ketiga Jilid I, Erlangga Jakarta, hal 1- 13 dan

Hal 64 – 66.

Harris, Harry. 1980. Dasar – Dasar Genetika Biokemis Manusia edisi 3. Gadjah Mada

University Press. Yogyakarta. Hal: 2 – 4.

Klug, William S; Cummings, Michael R; Spencer, Charlotte A; dan Palladino, Michael

A. 2009. Concept of Genetic Ninth edition. Pearson Benjamin Cummings. San

Francisco. Hal: 270.

Matsumoto Masakado and Suzuki Yasumoto., 2005, Evaluation of Pulsed-Field Gel

Electrophonesis Analysis Performed at Selected Prefectural Institutes of Public

Health for use in Pulse Net Japan, Japanese journal of Infectious Disease, volume

58, hal 182.

Old, RW; Dan, Primrose S. B. 1989. Prinsip – Prinsip Manipulasi Gen Suatu Pengantar.

Rekayasa Genetika. Blackwell Scientific Publication. Oxford. Hal: 5 – 7.

Seashore, Margretta Reed dan Wappner, Rebecca S. 1996. A Large Medical Book

Genetic in Primary Care & Clinical Medicine First edition, Prentice – Hall

International. Stainford.

Recce, Richard J. 2004. Analysis Genes and Genomes. John Wiley and Sons. West

Sussex, UK.

7

LAPORAN PRAKTIKUM

BIOLOGI MULUT III

PEMBUATAN GEL AGAROSE DAN PENGENALAN

ELEKTROFORESIS

Disusun oleh :

Nama : Juwita Raditya Ningsih

N I M : 07/252184/KG/8196

Kelompok : C3

Hari/tanggal : Rabu, 24 Maret 2010

BAGIAN BIOLOGI MULUT

FAKULTAS KEDOKTERAN GIGI

UNIVERSITAS GADJAH MADA

YOGYAKARTA

2010