KINETIKA REAKSI ENZIM

I.Tujuan percobaan :

Diharapkan mahasiswa dapat memahami kinetika reaksi enzim dan faktor-faktor yang

mempengaruhi kondisi optimum suatu enzim

II.Teori dasar:

Enzim merupakan protein yang mengkatalisi reaksi biokimia yang secara kolektif

membentuk metabolism perantara dari sel. Enzim bekerja dengan urutan yang teratur, enzim

mengkatalisis ratusan reaksi yang menyimpang dan mengubah energy kimiawi dan yang

membuat makromolekul sel dari prekursor sederhana.

Enzim bekerja dengan menurunkan energi aktivasi suatu reaksi kimia tanpa mengubah

keseluruhan perubahan energi bebas reaksi atau letak kesetimbangan akhir. Enzim sebagai

katalisator menurunkan energi aktivasi reaksi-reaksi kimia dan meningkatkan fraksi molekul di

dalam suatu populasi molekul tertentu untuk lebih cepat bereaksi per satuan waktu di banding

dengan keadaaan tanpa katalisator. Enzim juga bergabung dengan substratnya selama siklus

katalitiknya.

Analisis kuantitatif kinetika reaksi enzim dapat dilakukan dengan dua asas pendekatan

yaitu asas keseimbangan menurut Michaelis-Menten dan asas teori keadaan tunak ( Steady state

theory) menurut Briggs-Haldone. Substrat tungal dapat dijelaskan dengan postulat reaksi berikut,

dimana E adalah enzim, S adalah substrat dan P adalah produk.

E+S k1 ES k3 E+P

Reaksi enzimatik berlangusng melalui pembentukan kompleks enzim substrat (ES). Bila

semua enzim dalam keadaan enzim keadaan ES ( system jenuh oleh substrat ), maka laju reaksi

akan mencapai nilai maksimum ( Vmaksimum).

Persamaan Michelis-Menten yang merupakan persamaan kecepatan bagi suatu reaksi

enzimatik substrat tunggal menyatakan mengenai hubungan kuantitatif diantara kecepatan reaksi

awal ( Vo), kecepatan reaksi maksimum ( v maksimum), konsentrasi substrat (S) dan konstanta

Michaelis Menten (Km) yang nilainya sama dengan ( k2+k3)/k1. Pendekatan dengan teori

keadaan tunak menurut Briggs-Haldane, dimana laju reaksi pembentukan kompleks ES sama

dengan laju reaksi penguraian ES menjadi P dan E juga akan menghasilkan persamaan yang

sama untuk berhubungan antara laju reaksi enzim dan konsentrasi substrat.

Persamaan Michelis-Menten dapat ditransformasikan/ di turunkan secara aljabar menjadi

bentuk lain yang lebih bermanfaat didalam pemetaan data percobaan menjadi persamaan

Lineweaver-burk, persamaan ini memiliki banyak manfaat karena menghasilkan penentuan V

maks secara lebih tepat yang hanya dapat di duga pada pemetaan Vo terhadap (S).

Dalam percobaan kinetika reaksi enzim kita bias mempelajari prinsip percobaannya :Laju

awal (V0) dari reaksi yang dikatalisis enzim meningkat dengan bertambahnya konsentrasi

substrat hingga di capai keadaan dimana penambahan substrat tidak lagi meningkatkan laju

reaksi dan bila semua enzim dalam keadaan ES ( jenuh oleh substrat) maka laju reaksi akan

mencapai nilai maksimum ( V maks).

Gambar:

V ---------------------------------------

kemiringan = Km/v maks

V= ½ V maks

--------

1/v masks

(S)=Km (S) -1/Km 1/(S)

III. Alat dan bahan:

Alat: Bahan:

1.Stop watch 1.Larutan TCA 20 %

2.Tabung reaksi 2.Larutan kasein 2 % ( b/v)

3.Pengaduk gelas 3.Larutan dapar fosfat 0.1 pH 8.0

4.Pipet ukur 1 ml, 5ml, 10 ml 4.Larutan NaOH 0.5 N

5.Water bath 350 C 5.Aquadest

6. Kertas saring 6.Reagen Folin-Ciocalteu

7. Kuvet 7.Larutan tripsin

8. Spektrofotometer/ kolorimeter

9.Corong kaca

IV. Prosedur Percobaan dan Hasil Pengamatan

Cara kerja

Tabung t= 0 menit

-Dalam tabung reaksi berpengaduk, masukkan

larutan buffer fosfat dan tripsin serta

tambahkan masing-masing 3 ml larutan TCA

20 % aduk perlahan, ingkubasi 30 menit dalam

water bath 35oC.

- Tambahkan larutan kasein sesuai table dan

diamkan selama 20 menit dalam air es

- Sentrifuga 10 menit dan saring melalui kertas

saring untuk diambil supernatanya.

- Filtrat diperlakukan lebih lanjut munurut

metode anson

Hasil pengamatan

Pada tabung I di masukan buffer fosfat di

tambah tripsin di tambah TCA hasil larutan

menjadi bening

Pada tabung II di masukan buffer fosfat di

tambah tripsin di tambah TCA hasil larutan

menjadi bening

Pada tabung III di masukan buffer fosfat di

tambah tripsin di tambah TCA hasil larutan

menjadi bening

Pada tabung IV di masukan buffer fosfat di

tambah tripsin di tambah TCA hasil larutan

menjadi bening

Pada tabung V di masukan buffer fosfat di

tambah tripsin di tambah TCA hasil larutan

menjadi bening

Setelah di ingkubasi dan di beri kasein

Pada tabung I terdapat endapan

Pada tabung II terdapat endapan

Pada tabung III terdapat endapan

Pada tabung IV terdapat endapan

Pada tabung V terdapat endapan

Keterangan:

Tabung 1 endapan (+++++)

Tabung II endapan (++++)

Tabung t= 20 menit

-Inkubasi masing-masing tabung berpengaduk

yang berisi kasein sesuai table selama 5 menit

pada water bath 350C sambil di aduk perlahan

( jarang sampai berbusa), kemudian

tambahkan berturut-turut larutan buffer fosfat

dan larutan tripsin

-Inkubasi selama tepat 20 menit dalam

incubator 350C di hitung setelah penambahan

tripsin.

-Hentikan reaksi dengan penambahan 3 ml

TCA 20 % ke dalam masing-masing tabung

dan aduk dengan kuat

-Diamkan selama 20 menit dalam air es untuk

menyempurnakan pengendapan

-Sentrifugasi selama 10 menit kemudian saring

untuk diambil supernatanya.

-Filtrat di perlakukan lebih lanjut dengan

metode anson.

No

I

II

III

IV

Tabun

g

t= 0

t= 20

t= 0

t= 20

t= 0

t= 20

t= 0

t= 20

Tripsin

(ml)

1

1

1

1

1

1

1

1

Kasein

(ml)

0.1

0.1

0.5

0.5

1.0

1.0

3.0

3.0

Buffer fosfat

(ml)

5.9

5.9

5.5

5.5

5.0

5.0

3.0

3.0

Tabung III endapan (+++)

Tabung IV endapan (++)

Tabung V endapan (+)

Setelah di ingkubasi

Hasil pengamatan kasein di tambah buffer

fosfat

Tabung I warna bening

Tabung II warna bening

Tabung III warna bening ada sedikit endapan

Tabung IV warna keruh terdapat endapan

Tabung V warna keruh terdapat endapan

Setelah penambahan tripsin

Tabung I terjadi sedikit endapan/agak putih

Tabung II terjadi sedikit endapan /agak keruh

Tabung III terjadi endapan/keruh

Tabung IV terjadi endapan/putih

Tabung V terjadi endapan/putih banyak

Setelah di dinginkan dengan es 20 menit

Tabung I warna agak putih/ endapan sedikit

Tabung II warna agak putih/endapan sedikit

Tabung III warna putih/endapan sedikit

Tabung IV warna putih/ endapan sedikit

Tabung V warna putih/ endapan banyak

Setelah di sentrifugasi

V

t= 0

t= 20

1

1

5.0

5.0

1.0

1.0

Metode anson

-Campurkan 2 ml TC-filtrat di atas dengan 4 ml NaOH 0.5 M-Tambahkan 1 ml larutan Folin-Ciocalteu ( 1 volume reagen di tambah 1 volume aquades sehingga mengandung 1 N asam).-Diamkan 10 menit kemudian tetapkan serapannya pada 650 nm( pengukuran harus dilakukan tepat setelah 10 menit).

Pengolahan dataAbsorbansi ( A) = A = At20-At0 T= t20-t0 V= A/ t

S= (aliquot/Vtotal)x 2%

Buat grafik yang menggambarkan antara 1/V terhadap 1/S (grafik lineweaver-Burk) dan tentukan nilai maks dan Km!

Tabung I warna bening

Tabung II warna bening

Tabung III warna bening

Tabung IV warna bening

Tabung V warna bening

V. Pembahasan

Pada percobaan T=O . Larutan fosfat dan tripsin ditambahkan secara bersamaan di

karenakan agar enzim dapat bekerja secara optimum , dan dalam praktikum ini menggunakan

TCA, TCA merupakan larutan yang dapat menghentikan rekasi enzimatik sehingga enzim

emnjadi in aktiv dan enzim akan kehilangan fungsi katalitiknya sehingga fungsi dari TCA

tersebut yaitu untuk mengehentikan reaksi enzim

Dan dalam praktikum ini juga menggunakan buffer fosfat yang berfungsi agar larutan

tripsin bekerja secara optimal.Enzim bekerja pada suhu 250-300C, pada hewan enzim bekerja

pada suhu 250C dan pada manusia ezim bekerja pada suhu 300C, PH enzim 6-8

Dan setelah larutan tripsin di campur dengan buffer fosfat dan di tambah larutan TCA

dan langsung di waterbath lalu di simpan di ingkubator yang bertujuan agar enzim bias bekerja

mengkatalisis substrat. Dan setelah di ingkubator di beri larutan kasein di akhir karena enzim

pada t=0 sudah di nonaktivkan

Lalu di diamkan di dalam es bertujuan agar larutan mengendap karena air dingin akan

menurunkan larutan . Lalu setelah itu di sentrifugasi supaya larutan/endapan terpisah menjadi

bening dan terdapat endapan dari campurannya. Dan filtrate nya utuk di uji dengan metoda anson

Pada percobaan T=20 enzim bekerja sebagai katalisis jadi tidak diaktivasi jadi enzim dan

substrat bekerja, membentuk kompleks enzim substrat. Dan dalam percobaan ini larutan di

ingkubasi menyebabkan enzim bekerja optimum/ aktif. Lalu di tambahkan TCA sehingga enzim

tidak bekerja, lalu didiamkan dalam air es agar lautan mengendap lalu di setrifugasi supaya

larutan atau endapan terpisah menjadi bening dan terdapat endapan dari campurannya . Dan

filtartnya nya untuk di uji dengan metode anson.

Lalu setelah itu T=0 dan T=20 di uji dengan menggunakan metode anson, metode ini

bertujuan supaya jumlah substrat bias di ketahui yang di katalisis oleh enzim, di tambahkan

NaOH untuk menetralkan filtrate TCA dan di tambahkan folin berfungsi memberikan warna.

Dan lalu didiamkan serapannya pada 650nm yaitu spekto tampak.

Pada enzim faktor-faktor yang mempengaruhi konduksi optimum enzim ialah

1.PH

2.Suhu

3.Konsentrasi

4.Inhibitor

5.aktivator

Pada Metode Anson

T=0

Tabung I warna hitam bening

Tabung II warna bening kebiruan

Tabung III warna bening kebiruan

Tabung IV warna bening kebiruan

Tabung V warna bening kebiruan

T=20

Tabung I warna biru

Tabung II warna biru

Tabung III warna biru

Tabung IV warna hijau

Absorbansi

T= 0

Tabung I hasilnya A=0.113

Tabung II hasilnya A=0.041

Tabung III hasilnya A= 0.037

Tabung IV hasilnya A=0.128

Tabung V hasilnya A= 0.010

T=20

Tabung I hasilnya A=0.193

Tabung II hasilnya A=0.169

Tabung III hasilnya A=0.204

Tabung IV hasilnya A=0.364

Tabung V hasilnya A=0.058

A A= At20-At0

Tabung I= 0.193-0.041=0.152

Tabung II= 0.169-0.113=0.056

Tabung III= 0.204-0.037=0.167

Tabung IV= 0.364-0.128=0.236

Tabung V= 0.058-0.010=0.048

t = t20-t0

Semua tabung 1 sampai 5

t= 20-0 = 20

V= A/ t

Tabung I : 0.152/20= 7.60x10-3

Tabung II : 0.056/20=2.80x10-3

Tabung III : 0.167/20=8.35x10-3

Tabung IV : 0.236/20=1.18x10-2

Tabung V : 0.048/20=2.40x10-3

S= (aliquot/Vtotal)x 2 %

Tabung I : (0.1/7)x2%=2.85x10-4

Tabung II : (0.5/7)x2%=1.42x10-3

Tabung III : (1.0/7)x2%=2.85x10-3

Tabung IV : (3.0/7)x2%=8.57x10-3

Tabung V : (5.0/7)x2%=1.42x10-2

Grafik yang menggambarkan antara 1/V terhadap 1/S

(Grafik lineweaver-Burk)

0 0.005 0.01 0.015 0.020

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

0.012

0.014

0.016

Series2Linear (Series2)

Diketahui

1/v:

Tabung I= 131,57

Tabung II= 357,14

Tabung III= 119,7

Tabung IV= 84,74

Tabung V= 416,6

1/S

Tabung I= 3508,77

Tabung II= 704,22

Tabung III= 350,87

Tabung IV= 116,68

Tabung V= 70,42

Grafik yang menggambarkan antara V terhadap S

Grafik Michelis-Menten

0 0.005 0.01 0.015 0.020

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

0.012

0.014

0.016

Series2Linear (Series2)

Diketahui:

V

Tabung I =0.0076

Tabung II =0.0028

Tabung III =0.00835

Tabung IV =0.018

Tabung V =0.0024

S

Tabung I =0.000285

Tabung II =0.00142

Tabung III =0.00285

TabungIV =0.00857

Tabung V =0.0142

VI. Kesimpulan

Enzim merupakan protein yang mengkatalisis reaksi kimiawi spesifik. Enzim mengikat

molekul substrat membentuk komplek enzim substrat yang bersifat sementara yang terurai

membentuk enzim bebas dan produknya.

Konsentrasi Substrat mencapai setengah Vmaks adalah tetapan Michelis Menten yang

bersifat khas bagi masing-masing enzim yang bekerja pada substrat tertentu.

Enzim menyebabkan berlangsungnya reaksi kimia dengan mengarahkan substrat dengan

sisi karakteristik.

Pada T=0 . setelah melakukan percobaaan yaitu absorbansi di hasilkan pada tabung 1

adalah 0,113 , tabung II adalah 0,041, tabung III 0,037, tabung IV 0,128, tabung V 0,110.

Pada T=20 hasilnya pada tabung I 0,193 tabung II 0,169,tabung III 0,204,tabung IV

0,364, tabung V 0,058.

VII. Daftar Pustaka

1. Feseenden dan Fessenden. 1997. Dasar-Dasar Kimia Organik. Binarupa Aksara. Jakarta.

2.Lehninger Maggy Thenawijaya.1982.Dasar-Dasar Biokimia.Erlangga .Jakarta.

3.Poedjiaji,Anna. 1994.Dasar-Dasar Biokimia. Universitas Indonesia.Jakarta.