LAPORAN TETAP

15

LAPORAN TETAP

PRAKTIKUM TEKNOLOGI BIOPROSES

IDENTITAS PRAKTIKAN

Nama

: Debi Putri SupraptoNIM

: 03121403045Kelompok

: 2 (Dua)I.NAMA PERCOBAAN

: Medium II.TUJUAN PERCOBAAN

Dapat membuat media untuk menumbuhkan dan mengembangbiakkan mikroba.

Mengetahui dan memahami fungsi, cara pengunaan, cara mensterilkan dan prinsip kerja dari alat-alat yang digunakan dalam laboratorium mikrobiologi.Mengetahui jenis-jenis medium yang tepat untuk pertumbuhan mikroba serta komposisinya masing-masing.Dapat menghitung banyaknya jumlah mikroba dengan menggunakan Haemacytometer.

III.DASAR TEORI

3.1. Medium

Dalam menumbuhkan dan mengembangbiakan mikroba diperlukan suatu substrat yang disebut media. Sedang media tersebut sebelum digunakan harus dalam keadaan steril. Artinya tidak trerdapat mikroba yang lain yang tidak diharapkan. Susunan bahan, baik berbentuk bahan alami (seperti tauge, daging, telur,wortel dan sebagainya) ataupun bahan buatan (berbentuk senyawa kimia, organik ataupun an organik) yang diperlukan untuk pertumbuhan dan pengembangbiakan mikroba dinamakan media.

Agar mikroba dapat tumbuh dan berkembang dengan baik maka didalam media diperlukan persyaratan tertentu yaitu :

Bahan didalam media harus terkandung semua unsu hara yang diperlukan untuk pertumbuhan dan pengembangbiakan mikroba.

Media harus mempunyai tekanan osmosa, tegangan permukaan dan PH sesauai dengan kebutuhan mikroba.

Media harus dalam keadaan steril, artinya sebelum ditanami mikroba yang dimaksud tidak ditumbuhi oleh mikroba lain yang tidak diharapkan.

Medium adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang sangat diperlukan oleh mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa molekul-molekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel. Dengan media pertumbuhan dapat dilakukan isolat mikroorganisme menjadi kultur murni dan juga memanipulasi komposisi media pertumbuhannya.

Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dan dikembangkan pada suatu substrat yang disebut medium. Medium yang digunakan untuk menumbuhkan dan mengembangbiakkan mikroorganisme tersebut harus sesuai susunanya dengan kebutuhan jenis mikroorganisme yang bersangkutan. Beberapa mikroorganisme dapat hidup baik pada medium yang sangat sederhana yang hanya mengandung garam anargonik di tambah sumber karbon organik seperti gula. Mikroorganime lainnya memerlukan suatu medium yang sangat kompleks yaitu berupa medium ditambahkan darah atau bahan-bahan kompleks lainnya.

3.2. Syarat dan Fungsi MediumUntuk menumbuhkan dan mengembangbiakkan mikroba diperlukan suatu substrat yang disebut medium. Medium yang dijadikan tempat menumbuhkan dan mengembangkan mikroba tersebut sebelum digunakan harus dalam keadaan steril, artinya tidak ditumbuhi oleh mikroba lain yang tidak diharapkan.

Susunan bahan, baik berbentuk bahan alami (seperti tauge, ekstrak daging, telur, wortel dan sebagainya) ataupun bahan buatan (berbentuk senyawa kimia, senyawa organik, maupun senyawa anorganik) yang diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembangbiakan mikroba, dinamakan medium. Fungsi dari medium adalah sebagai berikut :

Media basal dapat mendukung pertumbuhan berbagai jenis spesies tanpa syarat nutrisi

Medium penghambat merupakan medium yang memuat unsur pokok tertentu yang memiliki fungsi untuk menghambat pertumbuhan dari jenis mikroorganisme tertentu.

Medium pemeliharaan digunakan untuk pertumbuhan awal dan penyimpanan selanjutnya, mempersiapkan kultur organisme yang disimpan baik pada suhu ruang atau suhu dingin.3.3. Susunan, Bentuk, dan Sifat Medium3.3.1. Susunan Medium

Sesuai dengan fungsiologis dari masing-masing unsur hara yang terdapat dalam media, maka susunan media pada semua jenis-jenis mempunyai kesamaan isi, yaitu:

Kandungan air.

Kandungan nitrogen.

Kandungan sumber energi atau unsur C.

Kandungan vitamin.

Berdasarkan pada persyaratan di atas tersebut, susunan medium dapat diklasifikasikan sebagai berikut:

Media alami, yaitu media yang disusun oleh bahan alami, seperti: kentang dan daging .Media Sintetik, yaitu media yang disusun oleh senyawa kimia, seperti media untuk pertumbuhan dan perkembangbiakkan bakteri Clostridium.

Media semisintetis, yaitu media yang tersusun oleh campuran bahan-bahan alami dan bahan-bahan sintetis, seperti kaldu nutrisi, touge agar, dan wortel agar.

3.3.2. Bentuk Medium

Dalam mengamati bakteri, bakteri harus dapat ditumbuhkan di dalam suatu biakan murni. Untuk melakukannya haruslah dimengerti jenis- jenis nutrient yang disyaratkan oleh bakteri dan juga macam lingkungan fisik yang mana dapat menyebabkan kondisi yang optimum bagi pertumbuhannya tersebut. Bentuk, susunan, dan sifat medium ditentukan oleh pemadat, seperti agar-agar, gelatin dan sebagainya. Bentuk medium diklasifikasikan menjadi 3 (tiga) jenis, yaitu:

Medium Cair

Apabila tidak ditambahkan zat pemadat, biasanya media cair digunakan untuk membiakkan mikroalga, mikroba lain seperti bakteri dan ragi dapat juga dikembangbiakkan pada medium cair.

Medium Padat

Tambahkan 12-15 gram tepung agar-agar per 1000 ml medium. Jumlah tepung agar-agar yang ditambahkan tergantung jenis atau kelompok mikroba yang ditanamkan. Ada yang memerlukan kadar air tinggi, sehingga jumlah tepung agar-agar harus rendah, tetapi ada pula yang memerlukan kandungan air rendah sehingga penambahan tepung agar-agar agak banyak. Media pada umumnya diperlukan untuk ragi, bakteri, jamur dan kadang-kadang juga mikroalga.

Medium Semi Padat dan Semi Cair

Penambahan zat pemadat hanya 50% atau kurang dari seharusnya. Ini umumnya diperlukan untuk mikroba yang banyak memerlukan kandungan air dan hidup anaerobik atau fakultatif.

3.3.3. Sifat Medium

Dalam penggunaannya, mikroba tidak hanya untuk pertumbuhan dan perkembangbiakkan mikroba, tetapi juga digunakan untuk tujuan lain, yakni untuk isolasi, seleksi, evaluasi, dan diferensiasi biakkan yang didapatkan. Adapun macam-macam media berdasarkan dari sifat-sifatnya adalah sebagai berikut:

Media Umum

Media ini digunakan untuk perkembangbiakkan dan pertumbuhan satu atau lebih mikroba secara umum, seperti kaldu nutrisi untuk bakteri. Contoh: agar nutrisi untuk bakteri, agar tauge atau agar kentang desktrose untuk jamur.

Media Penguji

Media untuk pengujian senyawa tertentu dengan bantuan mikroba, misalnya penguji vitamin.Media Differensial

Medium yang dapat ditumbuhi semacam mikroorganisme dengan memberikan ciri tertentu. Mikroorganisme tersebut mampu menguraikan salah satu bahan pembuat medium dimana mikroorganisme yang lain yang sama-sama tumbuh di situ tidak mampu. Contoh: agar darah, agar cesin metilen biru, dan lain-lain.Media Pengaya

Media ini dipergunakan dengan maksud memberi kesempatan kepada suatu jenis mikroba untuk tumbuh dan berkembang lebih cepat dari jenis lainnya yang sama berada dalam satu bahan, misalnya: kaldu lelenit.

Media Selektif

Media yang hanya ditumbuhi oleh satu atau lebih jenis mikroba tertentu tetapi mematikan untuk jenis-jenis lainnya. Contohnya adalah agar ENDO, agar SS, dan lain-lain.

Media Perhitungan

Media untuk menghitung jumlah mikroba pada suatu bahan media ini dapat berbentuk media umum, selektif, diferensial dan penguji.Adapun beberapa jenis bahan kompleks yang digunakan sebagai pembuat medium menurut Pelczar (1986):

Ekstrak daging sapi

Suatu ekstrak cair jaringan daging sapi yang empuk dikonsentrasikan menjadi pasta. Mengandung substansi jaringan hewan yang dapat larut dalam air, meliputi karbohidrat, senyawa nitrogen organik, vitamin yang dapat larut dalam air dan garam-garaman.

Pepton

Produk yang dihasilkan dari bahan-bahan yang mengandung protein, seperti daging, kasein, dan gelatin. Pencernaan bahan-bahan protein dicapai dengan asam atau enzim. Banyak peptone yang berbeda-beda (bergantung pada protein yang digunakan dan metode pencernaannya) tersedia utnuk digunakan dalam media bakteriologis. Pepton berbeda-beda sebagai sumber utama nutrien organik dapat pula mengandung vitamin dan kadang-kadang karbohidrat.

Agar

Agar merupakan suatu karbohidrat kompleks yang diperoleh dari algaemarine tertentu, diolah untuk membuang substansi yang tidak dikehendaki digunakan sebagai bahan pemadat media, agar yang lebur dalam larutan cair akan membentuk gel bila suhu dikurangi sampai dibawah 450C agar tidak merupakan sumber nutrient bagi bakteri.

3.4. Metode Sterilisasi Medium

3.4.1. AutoklafAutoklaf adalah alat serupa tangki yang diisi dengan uap. Medium yang akan disterilkan ditempatkan dalam autoklaf selama 15-20 menit, tergantung banyaknya medium. Medium yang akan disterilkan sebaiknya diletakkan dalam botol berukuran agak kecil, setelah pintu autoklaf ditutup rapat, baru kran pipa uap dibuka dan temperatur akan naik sampai 121oC. Setelah cukup waktu untuk proses sterilisasi, kran uap ditutup, temperatur di dalam autoklaf mulai turun sedikit demi sedikit.

3.4.2. Pemanasan Mencapai Titik Didih

Mensterilkan medium cukup dengan mendidihkan medium tersebut selama beberapa jam, maka semua benih kehidupan akan mati, hal ini dilakukan oleh Spallanzani (17291788) untuk membuktikan tidak mungkinnya teori abiogenesis.

3.4.3. Penyaringan (Filtrasi)

Medium disaring dengan saringan porselin, maka zat organik tidak mengalami penguraian sama sekali, sehabis penyaringan medium masih perlu dipanasi dalam autoklaf meskipun tidak selama 15 menit dan temperatur 121 oC. Penyaringan dilakukan dengan saringan yang terbuat dari asbes karena mudah untuk dibersihkan.

3.4.4. TyndallisasiPensterilan medium dengan cara tyndallisasi yakni dengan mendidihkan medium dengan uap air beberapa menit. Diamkan 1 hari, setelah itu, maka akan dapat teramati spora yang tumbuh menjadi bakteri vegetatif dan kemudian medium dididihkan lagi dalam waktu beberapa menit. Pada hari ketiga medium tersebut dididihkan kembali, dan diperoleh medium yang steril.

Sebelum digunakan, medium yang sudah disterilkan, baik medium cair maupun medium padat bisa disimpan didalam tabung-tabung gelas berupa erlenmeyer atau tabung reaksi sebanyak 10-15 ml untuk agar diri yang nantinya diperlukan untuk mengisi cawan petri, atau sebanyak 5-7 ml untuk membuat agar miring yang nantinya diperlukan untuk menanam biakkan. Agar miring dibuat dengan memiringkan tabung reaksi berisi medium setelah disterilkan sebelum medium menjadi padat.

3.5. Macam MediumSifat-sifat suatu koloni adalah sifat yang ada hubungannya dengan bentuk susunan, permukaan, dan pengkilatan. Pengamatan sifat ini dapat dilakukan dengan pandangan mata tanpa menggunakan mikroskop. Pengamatan jenis ini disebut pengamatan Makroskopis. Supaya sifat-sifat tersebut tampak jelas teramati, mikroorganisme perlu ditumbuhkan pada media padat. Terdapat 4 (empat) metode untuk menumbuhkan mikroorganisme pada medium padat, yaitu :

Piaraan Lempengan (Plate Streak Culture)

Pada metode plate streak culture, biakan mikroorganisme diperoleh dengan menggesek-gesekkan ujung kawat inokulasi yang membawa jamur pada permukaan agar-agar lempengan dalam cawan petri sampai meliputi seluruh permukaan.

Piaraan Miring (Slant Culture)

Pada metode ini biakan diperoleh dengan menggesek-gesekkan ujung kawat inokulasi yang membawa jamur pada permukaan agar-agar miring.

Piaraan Tusukan (Stab Culture)

Pada metode stab culture, biakan mikroorganisme diperoleh dengan cara menusukkan ujung kawat inokulasi yang membawa jamur dalam agar-agar pada tabung reaksi sedangkan permukaan agar ini tidak miring.

Piaraan Adukan (Shake Culture)

Pada metode shake culture, mikroorganisme diperoleh dengan cara mencampuraduk setetes suspensi jamur ke dalam medium yang masih cair (belum membeku).

3.6. Metode Perhitungan Mikroorganisme

Penentuan atau pengukuran jumlah sel biasanya dilakukan untuk organisme bersel tunggal (misalnya bakteri), sedangkan penentuan massa sel dapat dilakukan bukan hanya untuk organisme bersel tunggal, tetapi juga untuk organisme berfilamen (misalnya kapang). Ada berbagai cara untuk mengukur jumlah sel antara lain:

Hitungan cawan (palt count) atau pengenceran

Hitungan mikroskopis langsung (direct microscopic count) atau penggunaan ruang hitung

Secara elektronis dengan bantuan alat yang disebut penghitung coulter (coulter Counter)Penggunaan turbidometer / nefelometerPengukuran kuantitatif populasi mikroba seringkali sangat diperlukan dalam berbagai macam penelahaan mikroorganisme. Pada hakekatnya terdapat dua macam pengukuran dasar, yaitu dengan penentuan jumlah sel dan penentuan massa sel.

Cara lain untuk mengukur jumlah sel antara lain dengan penyaring sampel dengan suatu saringan membran, lalu diinkubasikan pada permukaan medium yang sesuai. Jasad-jasad renik yang tertahan pada permukaan saringan menyerap nutrien dari medium dan menghasilkan koloni-koloni yang masing-masing berasal dari satu sel tunggal yang dapat hidup.

Massa sel juga dapat ditentukan dengan beberapa metode. Salah satu yang paling umum digunakan adalah pengukuran kekeruhan suspensi sel. Cara lain adalah mengukur berat kering sel atau filamen miselum sampel dalam volume tertentu. Dalam penentuan yang disebutkan terakhir ini sampel mula-mula disentrifugal atau disaring, dicuci, dikeringkan lalu beratnya ditimbang.

3.6.1. Hitungan Cawan (Pengenceran)

Dengan pengenceran, disiapkan beberapa buah tabung berisi aquadest steril sebanyak 9 ml. Masing-masing tabung kemudian ditambahkan 1 ml sampel yang akan diperiksa secara bertahap, yaitu :

1 ml sampel ke dalam tabung pertama, sehingga konsentrasi larutan di dalam tabung pertama menjadi 10-1.

1 ml dari tabung pertama ke tabung kedua, sehingga konsentrasi tabung kedua menjadi 10-2.

Dan seterusnya sampai mencapai larutan dengan konsentrasi terendah.

Dari tiap-tiap tabung kemudian diambil 1 ml larutan dan ditanamkan ke dalam cawan petri berisi media padat. Pertumbuhan koloni yang kemudian timbul pada tiap-tiap cawan dihitung. Cara perhitungan ini harus memperhitungkan faktor kerapatan pertumbuhan koloni, karena jika pertumbuhan koloni terlalu rapat sulit untuk memvalidasi hasilnya.

3.6.2. Hitungan Mikroskopis Langsung

Pada metode mikroskopis langsung, sampel diletakkan di ruang hitung (seperti hemasiotomeyer) dan jumlah sel dapat ditentukan secara langsung dengan bantuan mikroskop. Pada metode ini, hasil pengenceran tidak ditanamkan pada media, tetapi diteteskan ke dalam ruang hitung. Selanjutnya diperiksa di bawah mikroskop terhadap mikroba yang terdapat pada kolom perhitungan.

Keuntungan metode ini adalah pelaksanannya yang cepat dan tidak memerlukan banyak peralatan. Namun kelemahannya adalah tidak dapat membedakan sel-sel yang hidup dan yang mati. Dengan kata lain hasil yang diperoleh adalah jumlah total sel yang ada dalam populasi. Sel mati akan menyerap warna biru, sedangkan sel hidup mereduksi zat warna tersebut secara enzimatif menjadi tidak berwarna, jadi sel-sel akan tampak biru.

Kelemahan lain dari metode hitungan mikroskopis langsung adalah sulitnya menghitung sel yang berukuran kecil seperti bakteri, karena ketebalan hemasitometer tidak memungkinkan. Hal ini biasanya dapat diatasi dengan mewarnai sel sehingga mudah dilihat. Kelemahan lainnya adalah kadang-kadang sel cenderung bergumpal, sehingga sukar untuk membedakan sel-sel individu. Cara mengatasinya adalah dengan menceraiberaikan gumpalan sel tersebut dengan menambahkan bahan anti gumpal, seperti Dinatrium etilamina tetra asetat dan tween sebanyak 0,1 %.

3.6.3. Penggunaan Nefelometer / Turbidometer

Cara ini merupakan perhitungan kerapatan materi (sel) di dalam larutan, yang diberi cahaya. Kualitas bias cahaya yang dilkakukan identik dengan kerapatan materi sel yang berada dalam larutan.

IV. ALAT DAN BAHANAlat yang digunakan:

Autoklaf

Tabung reaksi

Kapas

Cawan petri.

Jarum oase.

Burner.

Bahan yang digunakan:

Kentang (200 g).

Desktrose (10 g)

Agar-agar (15 g).

Air Suling (1 liter).

Kultur murni.

Jarum/ kawat.

Alkohol.

V. PROSEDUR

5.1. Prosedur Pembuatan Medium

Agar Kentang Desktrosa (AKD)/ Potato Desktrosa Agar (PDA) untuk menumbuhkan jamur.

Cucilah kentang, kemudian di potong-potong kecil dan masak selama1 jam.Volume air dijaga supaya tetap dengan menambahkan air suling.

Saringlah kentang yang telah dimasak tadi dan masukkan desktrose kedalam filtrat kentang serta agar-agar sampai larut dengan baik.

Tuangkan kedalam tabung sesuai dengan kebutuhan, sumbatlah dengan kapas.

Sterilkan dalam autoklaf ( 121 oC/ 15 lbs) selama 15 menit.

Sterilisasi Dengan Autoklaf

Isi Autoklaf dengan air suling sebanyak 3-5 liter, panaskan sampai semua udara keluar dari autoklaf.

Siapkan alat/bahan yang akan disterilkan dan letakkan pada rak di autoklaf.

Masukkan rak tersebut kedalam autoklaf, tutup rapat kecuali klep udara supaya udara yang mungkin masih ada dalam autoklaf dapat keluar, karena jika dalam autoklaf masih ada udara sedangkan klep sudah ditutup rapat, maka strerilisasi tidak dapat mencapai suhu dan tekanan yang diharuskan. (121oC/ 15 lbs).

DAFTAR PUSTAKA

Ghoni, Achmad. 2012. Isolasi dan Inokulasi Bakteri. http://www.achmadghoni .com/2012/05/isolasi-dan-inokulasi-bakteri.html. Diakses pada 1 April 2014

Nurhaeria. 2013. Isolasi dan Inokulasi. http://nurhaeria99.blogspot. com/2013/10/mikrobiologi-isolasi-dan-inokulasi.html. Diakses pada 1 April 2014

Syaputra, Surya Edma. 2012. Inokulasi dan Pemurnian Bakteri. http:// sursursursur25.blogspot.com/2012/10/inokulasi-dan-pemurnian-bakteri.html. Diakses pada 1 April 2014