1

LAPORAN TETAP

PRAKTIKUM TEKNOLOGI BIOPROSES

IDENTITAS PRAKTIKAN

Nama : Debi Putri Suprapto

NIM : 03121403045

Kelompok : 2 (Dua)

I. NAMA PERCOBAAN : Medium

II. TUJUAN PERCOBAAN

1. Dapat membuat media untuk menumbuhkan dan mengembangbiakkan

mikroba.

2. Mengetahui dan memahami fungsi, cara pengunaan, cara mensterilkan dan

prinsip kerja dari alat-alat yang digunakan dalam laboratorium mikrobiologi.

3. Mengetahui jenis-jenis medium yang tepat untuk pertumbuhan mikroba serta

komposisinya masing-masing.

4. Dapat menghitung banyaknya jumlah mikroba dengan menggunakan

Haemacytometer.

III. DASAR TEORI

3.1. Medium

Dalam menumbuhkan dan mengembangbiakan mikroba diperlukan suatu

substrat yang disebut media. Sedang media tersebut sebelum digunakan harus

dalam keadaan steril. Artinya tidak trerdapat mikroba yang lain yang tidak

diharapkan. Susunan bahan, baik berbentuk bahan alami (seperti tauge, daging,

telur,wortel dan sebagainya) ataupun bahan buatan (berbentuk senyawa kimia,

organik ataupun an organik) yang diperlukan untuk pertumbuhan dan

pengembangbiakan mikroba dinamakan media.

Agar mikroba dapat tumbuh dan berkembang dengan baik maka didalam

media diperlukan persyaratan tertentu yaitu :

1. Bahan didalam media harus terkandung semua unsu hara yang diperlukan

untuk pertumbuhan dan pengembangbiakan mikroba.

2

2. Media harus mempunyai tekanan osmosa, tegangan permukaan dan PH

sesauai dengan kebutuhan mikroba.

3. Media harus dalam keadaan steril, artinya sebelum ditanami mikroba yang

dimaksud tidak ditumbuhi oleh mikroba lain yang tidak diharapkan.

Medium adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat makanan

(nutrisi) yang sangat diperlukan oleh mikroorganisme untuk pertumbuhannya.

Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa molekul-molekul kecil yang

dirakit untuk menyusun komponen sel. Dengan media pertumbuhan dapat

dilakukan isolat mikroorganisme menjadi kultur murni dan juga memanipulasi

komposisi media pertumbuhannya.

Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dan dikembangkan pada suatu substrat

yang disebut medium. Medium yang digunakan untuk menumbuhkan dan

mengembangbiakkan mikroorganisme tersebut harus sesuai susunanya dengan

kebutuhan jenis mikroorganisme yang bersangkutan. Beberapa mikroorganisme

dapat hidup baik pada medium yang sangat sederhana yang hanya mengandung

garam anargonik di tambah sumber karbon organik seperti gula. Mikroorganime

lainnya memerlukan suatu medium yang sangat kompleks yaitu berupa medium

ditambahkan darah atau bahan-bahan kompleks lainnya.

3.2. Syarat dan Fungsi Medium

Untuk menumbuhkan dan mengembangbiakkan mikroba diperlukan suatu

substrat yang disebut medium. Medium yang dijadikan tempat menumbuhkan dan

mengembangkan mikroba tersebut sebelum digunakan harus dalam keadaan steril,

artinya tidak ditumbuhi oleh mikroba lain yang tidak diharapkan.

Susunan bahan, baik berbentuk bahan alami (seperti tauge, ekstrak daging,

telur, wortel dan sebagainya) ataupun bahan buatan (berbentuk senyawa kimia,

senyawa organik, maupun senyawa anorganik) yang diperlukan untuk

pertumbuhan dan perkembangbiakan mikroba, dinamakan medium. Fungsi dari

medium adalah sebagai berikut :

1. Media basal dapat mendukung pertumbuhan berbagai jenis spesies tanpa

syarat nutrisi

3

2. Medium penghambat merupakan medium yang memuat unsur pokok tertentu

yang memiliki fungsi untuk menghambat pertumbuhan dari jenis

mikroorganisme tertentu.

3. Medium pemeliharaan digunakan untuk pertumbuhan awal dan penyimpanan

selanjutnya, mempersiapkan kultur organisme yang disimpan baik pada suhu

ruang atau suhu dingin.

3.3. Susunan, Bentuk, dan Sifat Medium

3.3.1. Susunan Medium

Sesuai dengan fungsiologis dari masing-masing unsur hara yang terdapat

dalam media, maka susunan media pada semua jenis-jenis mempunyai

kesamaan isi, yaitu:

1. Kandungan air.

2. Kandungan nitrogen.

3. Kandungan sumber energi atau unsur C.

4. Kandungan vitamin.

Berdasarkan pada persyaratan di atas tersebut, susunan medium dapat

diklasifikasikan sebagai berikut:

1. Media alami, yaitu media yang disusun oleh bahan alami, seperti: kentang

dan daging .

2. Media Sintetik, yaitu media yang disusun oleh senyawa kimia, seperti

media untuk pertumbuhan dan perkembangbiakkan bakteri Clostridium.

3. Media semisintetis, yaitu media yang tersusun oleh campuran bahan-bahan

alami dan bahan-bahan sintetis, seperti kaldu nutrisi, touge agar, dan wortel

agar.

3.3.2. Bentuk Medium

Dalam mengamati bakteri, bakteri harus dapat ditumbuhkan di dalam suatu

biakan murni. Untuk melakukannya haruslah dimengerti jenis- jenis nutrient

yang disyaratkan oleh bakteri dan juga macam lingkungan fisik yang mana

dapat menyebabkan kondisi yang optimum bagi pertumbuhannya tersebut.

Bentuk, susunan, dan sifat medium ditentukan oleh pemadat, seperti agar-

4

agar, gelatin dan sebagainya. Bentuk medium diklasifikasikan menjadi 3 (tiga)

jenis, yaitu:

1. Medium Cair

Apabila tidak ditambahkan zat pemadat, biasanya media cair digunakan

untuk membiakkan mikroalga, mikroba lain seperti bakteri dan ragi dapat

juga dikembangbiakkan pada medium cair.

2. Medium Padat

Tambahkan 12-15 gram tepung agar-agar per 1000 ml medium. Jumlah

tepung agar-agar yang ditambahkan tergantung jenis atau kelompok mikroba yang

ditanamkan. Ada yang memerlukan kadar air tinggi, sehingga jumlah tepung agar-

agar harus rendah, tetapi ada pula yang memerlukan kandungan air rendah

sehingga penambahan tepung agar-agar agak banyak. Media pada umumnya

diperlukan untuk ragi, bakteri, jamur dan kadang-kadang juga mikroalga.

3. Medium Semi Padat dan Semi Cair

Penambahan zat pemadat hanya 50% atau kurang dari seharusnya. Ini

umumnya diperlukan untuk mikroba yang banyak memerlukan kandungan air

dan hidup anaerobik atau fakultatif.

3.3.3. Sifat Medium

Dalam penggunaannya, mikroba tidak hanya untuk pertumbuhan dan

perkembangbiakkan mikroba, tetapi juga digunakan untuk tujuan lain, yakni untuk

isolasi, seleksi, evaluasi, dan diferensiasi biakkan yang didapatkan. Adapun

macam-macam media berdasarkan dari sifat-sifatnya adalah sebagai berikut:

1. Media Umum

Media ini digunakan untuk perkembangbiakkan dan pertumbuhan satu

atau lebih mikroba secara umum, seperti kaldu nutrisi untuk bakteri. Contoh: agar

nutrisi untuk bakteri, agar tauge atau agar kentang desktrose untuk jamur.

2. Media Penguji

Media untuk pengujian senyawa tertentu dengan bantuan mikroba,

misalnya penguji vitamin.

3. Media Differensial

5

Medium yang dapat ditumbuhi semacam mikroorganisme dengan

memberikan ciri tertentu. Mikroorganisme tersebut mampu menguraikan salah satu

bahan pembuat medium dimana mikroorganisme yang lain yang sama-sama

tumbuh di situ tidak mampu. Contoh: agar darah, agar cesin metilen biru, dan lain-

lain.

4. Media Pengaya

Media ini dipergunakan dengan maksud memberi kesempatan kepada

suatu jenis mikroba untuk tumbuh dan berkembang lebih cepat dari jenis lainnya

yang sama berada dalam satu bahan, misalnya: kaldu lelenit.

5. Media Selektif

Media yang hanya ditumbuhi oleh satu atau lebih jenis mikroba tertentu

tetapi mematikan untuk jenis-jenis lainnya. Contohnya adalah agar ENDO, agar

SS, dan lain-lain.

6. Media Perhitungan

Media untuk menghitung jumlah mikroba pada suatu bahan media ini

dapat berbentuk media umum, selektif, diferensial dan penguji.

Adapun beberapa jenis bahan kompleks yang digunakan sebagai

pembuat medium menurut Pelczar (1986):

1. Ekstrak daging sapi

Suatu ekstrak cair jaringan daging sapi yang empuk dikonsentrasikan

menjadi pasta. Mengandung substansi jaringan hewan yang dapat larut dalam air,

meliputi karbohidrat, senyawa nitrogen organik, vitamin yang dapat larut dalam

air dan garam-garaman.

2. Pepton

Produk yang dihasilkan dari bahan-bahan yang mengandung protein,

seperti daging, kasein, dan gelatin. Pencernaan bahan-bahan protein dicapai

dengan asam atau enzim. Banyak peptone yang berbeda-beda (bergantung pada

protein yang digunakan dan metode pencernaannya) tersedia utnuk digunakan

dalam media bakteriologis. Pepton berbeda-beda sebagai sumber utama nutrien

organik dapat pula mengandung vitamin dan kadang-kadang karbohidrat.

3. Agar

6

Agar merupakan suatu karbohidrat kompleks yang diperoleh dari

algaemarine tertentu, diolah untuk membuang substansi yang tidak dikehendaki

digunakan sebagai bahan pemadat media, agar yang lebur dalam larutan cair akan

membentuk gel bila suhu dikurangi sampai dibawah 450C agar tidak merupakan

sumber nutrient bagi bakteri.

3.4. Metode Sterilisasi Medium

3.4.1. Autoklaf

Autoklaf adalah alat serupa tangki yang diisi dengan uap. Medium yang

akan disterilkan ditempatkan dalam autoklaf selama 15-20 menit, tergantung

banyaknya medium. Medium yang akan disterilkan sebaiknya diletakkan dalam

botol berukuran agak kecil, setelah pintu autoklaf ditutup rapat, baru kran pipa

uap dibuka dan temperatur akan naik sampai 121oC. Setelah cukup waktu untuk

proses sterilisasi, kran uap ditutup, temperatur di dalam autoklaf mulai turun

sedikit demi sedikit.

3.4.2. Pemanasan Mencapai Titik Didih

Mensterilkan medium cukup dengan mendidihkan medium tersebut

selama beberapa jam, maka semua benih kehidupan akan mati, hal ini dilakukan

oleh Spallanzani (1729–1788) untuk membuktikan tidak mungkinnya teori

abiogenesis.

3.4.3. Penyaringan (Filtrasi)

Medium disaring dengan saringan porselin, maka zat organik tidak

mengalami penguraian sama sekali, sehabis penyaringan medium masih perlu

dipanasi dalam autoklaf meskipun tidak selama 15 menit dan temperatur 121 oC.

Penyaringan dilakukan dengan saringan yang terbuat dari asbes karena mudah

untuk dibersihkan.

3.4.4. Tyndallisasi

Pensterilan medium dengan cara tyndallisasi yakni dengan mendidihkan

medium dengan uap air beberapa menit. Diamkan 1 hari, setelah itu, maka akan

dapat teramati spora yang tumbuh menjadi bakteri vegetatif dan kemudian

medium dididihkan lagi dalam waktu beberapa menit. Pada hari ketiga medium

tersebut dididihkan kembali, dan diperoleh medium yang steril.

7

Sebelum digunakan, medium yang sudah disterilkan, baik medium cair

maupun medium padat bisa disimpan didalam tabung-tabung gelas berupa

erlenmeyer atau tabung reaksi sebanyak 10-15 ml untuk agar diri yang nantinya

diperlukan untuk mengisi cawan petri, atau sebanyak 5-7 ml untuk membuat agar

miring yang nantinya diperlukan untuk menanam biakkan. Agar miring dibuat

dengan memiringkan tabung reaksi berisi medium setelah disterilkan sebelum

medium menjadi padat.

3.5. Macam Medium

Sifat-sifat suatu koloni adalah sifat yang ada hubungannya dengan

bentuk susunan, permukaan, dan pengkilatan. Pengamatan sifat ini dapat

dilakukan dengan pandangan mata tanpa menggunakan mikroskop. Pengamatan

jenis ini disebut pengamatan Makroskopis. Supaya sifat-sifat tersebut tampak jelas

teramati, mikroorganisme perlu ditumbuhkan pada media padat. Terdapat 4

(empat) metode untuk menumbuhkan mikroorganisme pada medium padat, yaitu :

1. Piaraan Lempengan (Plate Streak Culture)

Pada metode plate streak culture, biakan mikroorganisme diperoleh

dengan menggesek-gesekkan ujung kawat inokulasi yang membawa jamur pada

permukaan agar-agar lempengan dalam cawan petri sampai meliputi seluruh

permukaan.

2. Piaraan Miring (Slant Culture)

Pada metode ini biakan diperoleh dengan menggesek-gesekkan ujung

kawat inokulasi yang membawa jamur pada permukaan agar-agar miring.

3. Piaraan Tusukan (Stab Culture)

Pada metode stab culture, biakan mikroorganisme diperoleh dengan cara

menusukkan ujung kawat inokulasi yang membawa jamur dalam agar-agar pada

tabung reaksi sedangkan permukaan agar ini tidak miring.

4. Piaraan Adukan (Shake Culture)

Pada metode shake culture, mikroorganisme diperoleh dengan cara

mencampuraduk setetes suspensi jamur ke dalam medium yang masih cair (belum

membeku).

8

3.6. Metode Perhitungan Mikroorganisme

Penentuan atau pengukuran jumlah sel biasanya dilakukan untuk organisme

bersel tunggal (misalnya bakteri), sedangkan penentuan massa sel dapat dilakukan

bukan hanya untuk organisme bersel tunggal, tetapi juga untuk organisme

berfilamen (misalnya kapang). Ada berbagai cara untuk mengukur jumlah sel

antara lain:

1. Hitungan cawan (palt count) atau pengenceran

2. Hitungan mikroskopis langsung (direct microscopic count) atau penggunaan

ruang hitung

3. Secara elektronis dengan bantuan alat yang disebut penghitung coulter (coulter

Counter)

4. Penggunaan turbidometer / nefelometer

Pengukuran kuantitatif populasi mikroba seringkali sangat diperlukan

dalam berbagai macam penelahaan mikroorganisme. Pada hakekatnya terdapat

dua macam pengukuran dasar, yaitu dengan penentuan jumlah sel dan penentuan

massa sel.

Cara lain untuk mengukur jumlah sel antara lain dengan penyaring

sampel dengan suatu saringan membran, lalu diinkubasikan pada permukaan

medium yang sesuai. Jasad-jasad renik yang tertahan pada permukaan saringan

menyerap nutrien dari medium dan menghasilkan koloni-koloni yang masing-

masing berasal dari satu sel tunggal yang dapat hidup.

Massa sel juga dapat ditentukan dengan beberapa metode. Salah satu

yang paling umum digunakan adalah pengukuran kekeruhan suspensi sel. Cara

lain adalah mengukur berat kering sel atau filamen miselum sampel dalam volume

tertentu. Dalam penentuan yang disebutkan terakhir ini sampel mula-mula

disentrifugal atau disaring, dicuci, dikeringkan lalu beratnya ditimbang.

3.6.1. Hitungan Cawan (Pengenceran)

Dengan pengenceran, disiapkan beberapa buah tabung berisi aquadest

steril sebanyak 9 ml. Masing-masing tabung kemudian ditambahkan 1 ml sampel

yang akan diperiksa secara bertahap, yaitu :

9

1. 1 ml sampel ke dalam tabung pertama, sehingga konsentrasi larutan di dalam

tabung pertama menjadi 10-1.

2. 1 ml dari tabung pertama ke tabung kedua, sehingga konsentrasi tabung kedua

menjadi 10-2.

3. Dan seterusnya sampai mencapai larutan dengan konsentrasi terendah.

Dari tiap-tiap tabung kemudian diambil 1 ml larutan dan ditanamkan ke

dalam cawan petri berisi media padat. Pertumbuhan koloni yang kemudian timbul

pada tiap-tiap cawan dihitung. Cara perhitungan ini harus memperhitungkan

faktor kerapatan pertumbuhan koloni, karena jika pertumbuhan koloni terlalu

rapat sulit untuk memvalidasi hasilnya.

3.6.2. Hitungan Mikroskopis Langsung

Pada metode mikroskopis langsung, sampel diletakkan di ruang hitung

(seperti hemasiotomeyer) dan jumlah sel dapat ditentukan secara langsung dengan

bantuan mikroskop. Pada metode ini, hasil pengenceran tidak ditanamkan pada

media, tetapi diteteskan ke dalam ruang hitung. Selanjutnya diperiksa di bawah

mikroskop terhadap mikroba yang terdapat pada kolom perhitungan.

Keuntungan metode ini adalah pelaksanannya yang cepat dan tidak

memerlukan banyak peralatan. Namun kelemahannya adalah tidak dapat

membedakan sel-sel yang hidup dan yang mati. Dengan kata lain hasil yang

diperoleh adalah jumlah total sel yang ada dalam populasi. Sel mati akan

menyerap warna biru, sedangkan sel hidup mereduksi zat warna tersebut secara

enzimatif menjadi tidak berwarna, jadi sel-sel akan tampak biru.

Kelemahan lain dari metode hitungan mikroskopis langsung adalah

sulitnya menghitung sel yang berukuran kecil seperti bakteri, karena ketebalan

hemasitometer tidak memungkinkan. Hal ini biasanya dapat diatasi dengan

mewarnai sel sehingga mudah dilihat. Kelemahan lainnya adalah kadang-kadang

sel cenderung bergumpal, sehingga sukar untuk membedakan sel-sel individu.

Cara mengatasinya adalah dengan menceraiberaikan gumpalan sel tersebut

dengan menambahkan bahan anti gumpal, seperti Dinatrium etilamina tetra asetat

dan tween sebanyak 0,1 %.

3.6.3. Penggunaan Nefelometer / Turbidometer

10

Cara ini merupakan perhitungan kerapatan materi (sel) di dalam larutan,

yang diberi cahaya. Kualitas bias cahaya yang dilkakukan identik dengan

kerapatan materi sel yang berada dalam larutan.

22

IV. ALAT DAN BAHAN

I.1.Alat yang digunakan:

1. Autoklaf

2. Tabung reaksi

3. Kapas

4. Cawan petri.

5. Jarum oase.

6. Burner.

I.2.Bahan yang digunakan:

1. Kentang (200 g).

2. Desktrose (10 g)

3. Agar-agar (15 g).

4. Air Suling (1 liter).

5. Kultur murni.

6. Jarum/ kawat.

7. Alkohol.

V. PROSEDUR

5.1. Prosedur Pembuatan Medium

1. Agar Kentang Desktrosa (AKD)/ Potato Desktrosa Agar (PDA) untuk

menumbuhkan jamur.

a. Cucilah kentang, kemudian di potong-potong kecil dan masak selama1

jam.Volume air dijaga supaya tetap dengan menambahkan air suling.

b. Saringlah kentang yang telah dimasak tadi dan masukkan desktrose kedalam

filtrat kentang serta agar-agar sampai larut dengan baik.

c. Tuangkan kedalam tabung sesuai dengan kebutuhan, sumbatlah dengan

kapas.

d. Sterilkan dalam autoklaf ( 121 oC/ 15 lbs) selama 15 menit.

2. Sterilisasi Dengan Autoklaf

a. Isi Autoklaf dengan air suling sebanyak 3-5 liter, panaskan sampai semua

udara keluar dari autoklaf.

b. Siapkan alat/bahan yang akan disterilkan dan letakkan pada rak di autoklaf.

22

c. Masukkan rak tersebut kedalam autoklaf, tutup rapat kecuali klep udara

supaya udara yang mungkin masih ada dalam autoklaf dapat keluar, karena

jika dalam autoklaf masih ada udara sedangkan klep sudah ditutup rapat,

maka strerilisasi tidak dapat mencapai suhu dan tekanan yang diharuskan.

(121oC/ 15 lbs).

VIII.DAFTAR PUSTAKA

Ghoni, Achmad. 2012. Isolasi dan Inokulasi Bakteri.

http://www.achmadghoni .com/2012/05/isolasi-dan-inokulasi-bakteri.html.

Diakses pada 1 April 2014

22

Nurhaeria. 2013. Isolasi dan Inokulasi. http://nurhaeria99.blogspot.

com/2013/10/mikrobiologi-isolasi-dan-inokulasi.html. Diakses pada 1 April

2014

Syaputra, Surya Edma. 2012. Inokulasi dan Pemurnian Bakteri. http://

sursursursur25.blogspot.com/2012/10/inokulasi-dan-pemurnian-bakteri.html.

Diakses pada 1 April 2014