Upload
ferdiansyah-anugrah-r
View
39
Download
8
Embed Size (px)
DESCRIPTION
aaaaa
Citation preview
LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA
PERCOBAAN 4
MIKROBIOLOGI: ISOLASI DAN PENANAMAN MIKROBA
SERTA UJI ANTIBAKTERI
Disusun oleh:
Anis Komariah 24030110110022
Aswardi 24030110110066
Fatnawati Nur H 24030110130064
Khanang Eka P 24030110110000
Selfina Riska A 24030110120048
Zulfa Ifary Zain 24030110120000
JURUSAN KIMIA
FAKULTAS SAINS DAN MATEMATIKA
UNIVERSITAS DIPONEGORO
2010
ABSTRAK
Telah dilakukan percobaan yang berjudul “MIKROBIOLOGI: ISOLASI
DAN PENANAMAN MIKROBA SERTA UJI ANTIBAKTERI”, bertujuan untuk
mengenal dan membuat berbagai macam medium yang digunakan dalam bidang
mikrobiologi, mengenal dan melakukan teknik penanaman bakteri, menentukan
konsentrasi hambatan minimum (KHM) dan tingkat kemampuan anti bakteri dari
beberapa agen antibakteri. Metode yang digunakan adalah metode spread (Menyebar)
dan metode difusi cakram. Metode sebar atau spread plate merupakan metode
penanaman bakteri yang dilakukan dengan menyemprotkan suspensi ke atas medium
agar kemudian menyebarkannya secara merata dengan trigalski. Sedangkan metode
difusi cakram adalah metode yang untuk uji aktivitas antibakteri yang bahan ujinya
(ekstrak antibakteri) dijenuhkan ke dalam kertas cakram (cakram kertas). Prinsipnya
adalah aktivitas anti bakteri dalam menghambat pertumbuhan bakteri tertentu. Pada
percobaan ini sampel yang digunakan adalah ekstrak bunga bungur, dan
menggunakan kontrol positif berupa alkohol. Dimana zona bening yang terbentuk
pada konsentrasi ekstrak 20% sebesar 1,1 cm ; ekstrak 40% tidak terbentuk ; ekstrak
60% sebesar 1,5 cm ; ekstrak 80% sebesar 1,2 cm : ekstrak 100% sebesar 1,2 cm ;
dan control positif (alkohol) sebesar 1,3 cm. Ekstrak bunga bungur mengandung
senyawa tanin, triterpenoid, protein, dan asam amino yang berperan sebagai
antibakteri dimana mempunyai KHM yang dapat menghambat pertumbuhan
antibakteri E.coli pada konsentrasi 80% dengan diameter 1,5 cm; dan presentasi
KHMnya sebesar 115,38%.
PERCOBAAN 4
MIKROBIOLOGI : ISOLASI DAN PENANAMAN MIKROBA
SERTA UJI ANTIBAKTERI
I. TUJUAN
1.1. Mengenal dan membuat berbagai macam medium yang digunakan dalam
bidang mikrobiologi.
1.2. Mengenal dan melakukan teknik penanaman bakteri.
1.3. Mengisolasi bakteri untuk mendapatkan biakan murni.
1.4. Menentukan konsentrasi hambatan minimum (KHM) dan tingkat kemampuan
antibakteri dari beberapa agen antibakteri.
II. TINJAUAN PUSTAKA
II.1. Pengertian Mikrobiologi
Mikrobiologi adalah telah mengenai organisme hidup yang berukuran
mikroskopis. Dunia mikroorganisme terdiri dari 5 kelompok organisme yaitu
bakteri, protozoa, virus serta algae dan cendawan mikroskopis. Dalam bidang
mikrobiologi kita mempelajari banyak segi mengenai jasad-jasad renik ini
dimana adanya ciri-ciri kekerabatan antara sesamanya seperti juga dengan
kelompok organisme lainnya. Pengendalian dan peranannya dalam kesehatan
serta kesejahteraan kita. Mikroorganisme sangat erat kaitannya dengan
kehidupan. Beberapa diantaranya bermanfaat dan yang lainnya merugikan.
Banyak diantaranya menjadi penghuni dalam tubuh manusia. Beberapa
organisme menyebabkan penyakit dan yang lain terlibat dalam kegiatan
manusia seperti pembuatan anggur, keju, yogurt, produksi penicillin serta
proses-proses perlakuan yang berkaitan dengan pembuangan limbah.
(Michael, 1986)
Informasi yang diperoleh dari mikrobiologi memungkinkan kemajuan
besar dalam kemampuan kita untuk mengawasi banyak penyakit menular.
Disamping itu mikroorganisme telah digunakan untuk mempelajari berbagai
proses biokimia yang diketahui terjadi pada bentuk kehidupan yang lebih
tinggi. Jadi banyak fakta tentang metabolisme manusia yang diketahui
sekarang. Mula-mula diketahui terjadi pada mikroorganisme bidang baru
genetika molekuler yang menjelaskan bagaimana gen mengatur aktivitas sel
berasal dari studi tentang mikroorganisme. Oleh karena itu jelaslah bahwa
bidang mikrobiologi bukan hanya studi tentang mikroorganisme penyebab
penyakit tetapi merupakan studi tentang semua aktivitas hayati
mikroorganisme.
(Volk, 1993)
II.2. Identifikasi Sifat-sifat Mikroorganisme
II.2.1. Organisme Eukariot
1. Jamur
Fungsi bersel banyakyang dikenal sebagai jamur jauh lebih kompleks
dari pada khamir. Jamur secara khas berkembang sebagai
pertumbuhan bercabang seperti rambut dan sebagian besar
membentuk spora seksual dan aseksual. Beberapa jamur memberikan
rasa bagi keju yang baik (Roquefort, camembert dan brie). Dilain
pihak sedikit jamur menyebabkan penyakit gawat pada manusia.
2. Protozoa
Protozoa mempunyai bentuk dan ukuran, ada yang lonjong atau
berbentuk bola. ada yang memanjang dan ada yang berubah bentuk.
Sambil bergerak diatas permukaan. Beberapa jenis ada yang
berdiameter 1 sampai 2 mm, sehingga dapat dilihat dengan mata
telanjang. Kebanyakan protozoa dapat berkembang baik secara
seksual maupun aseksual.
(Volk, 1993)
2.2.2. Organisme Prokariot
1. Bakteri
Bersel tunggal, walaupun kadang ada gumpalan bersel banyak.
Bakteri lebih kecil ukurannya dari pada protozoa. Beberapa sel
bakteri yang umum panjangnya kira-kira 1 µm; 2000 bakteri
semacam ini akan mencapai liputan kepala jarum pentul pada titik
terlebar.
Bakteri adalah organisme sangat kecil yang mampu berada dimana
saja. Bakteri kadang menampakkan kehadirannya tetapi seelalu tidak
di sadari karena aktivitasnya yang tidak tampak karena terlalu kecil.
Bakteri dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop.
2. Algae
Dahulu dikenal dengan ganggang biru-hijau, tersebar diseluruh dunia
baik dalam air tawar/ air laut. Memperoleh energi dengan semacam
fotosintesis yang identik dilakukan oleh tumbuhan tingkat tinggi.
Klorofilnya tidak terdapat dalam kloroplas tetapi dalam lamella
disebut blakoid beberapa ganggang biru-hijau yang terbentuk benang
sewaktu-waktu menghasilkan sel yang menebal disebut heterosista.
Fungsi utama heterosista adalah mengubah nitrogen dalam atmosfer
menjadi ammonia dan menyediakan gas N2.
3. Virus
Virus adalah perantara yang terkecil dan dapat mengarahkan
pengadaannya sendiri. Bersifat ultra mikroskopis, terlampau kecil,
dapat dilihat dengan mikriskop cahaya konvensional. Klasifikasi
virus dipisahkan dalam suku berdasarkan bentuknya, ada tidaknya
membran, tipe asam nukleat dalam virion (DNA dan RNA) bentuk
asam nukleat (cabang ganda, benang tunggal, lurus, melingkar) dan
adanya asam nukleat multiple atau dalam virion.
(Volk, 1993)
2.3. Konsepsi Biakan Murni
Media agar merupakan substrat yang sangat baik untuk memisahkan
campuran mikroorganisme sehingga masing-masing jenisnya menjadi terpisah-
pisah. Teknik yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme pada
media agar memungkinkannya tumbuh dengan agak berjauhan dari sesamanya
juga memungkinkkan setiap selnya berhimpun membentuk koloni. Sekelompok
massa sel yang dapat dilihat dengan mata secara langsung. Semua sel dalam
koloni itu sama, dianggap kesemuanya itu merupakan keturunan (progeny) satu
mikroorganisme dan karena itu mewakili apa yang disebut mikrobiologi biakan
murni. Penggunaan agar pada media mikrobiologi yang semula diusulkan oleh
laboratorium Koch pada awal 1880-an tetap digunakan secara luas sampai kini.
(Michael, 1986)
Percobaan Koch dan penelitian di laboratorium membuktikan bahwa
jasad renik tertentu menyebabkan timbulnya penyakit tertentu. Postulat Koch
ialah:
1. Mikroorganisme tertentu selalu dapat dijumpai berasosiasi dengan penyakit
tertentu.
2. Mikroorganisme itu dapat diisolasi dan ditumbuhkan menjadi biakan murni
di laboratorium.
3. Biakan murni mikroorganisme tersebut akan menimbulkan penyakit itu bila
disuntikan pada hewan yang rentan (suseptibet)
4. Penggunaan prosedur laboratorium memungkinkan diperolehnya kembali
mikroorganisme yang disuntikan itu dari hewan yang dengan sengaja
diinfeksi dalam percobaan.
(Michael, 1986)
2.4. Teknik Biakan Murni
Untuk mendapatkan koloni bakteri sebagai sumber biakan murni ada dua
teknik yang dapat dipakai yakni :
2.4.1 Metode piringan goresan (streak-plate method)
Medium agar steril dicairkan, didinginkan 45°C, dituangkan
kedalam cawan petri steril dan dibiarkan menjadi padat, kemudian
dengan kawat penginokulasi yang penuh bakteri. Goresan dilakukan
diatas permukaan agar. Apabila sebaran dilakukan dengan menggerakan
kawat gelang. Kian kemari dari satu bagian ke bagian lain dari cawan
petri, bakteri yang tertinggal pada kawat gelang semakin berkurang. Jika
dilakukan dengan sempurna goresan akhir akan meninggalkan bakteri
individual cukup terpisah satu sama lain, sehingga setelah mengalami
pertumbuhan koloni dari bakteri individual akan benar-benar terpisah
satu sama lain, kemudian koloni tunggal dapat dipindahkan ke medium
steril dan tumbuhlah biakan murni.
2.4.2 Metode piringan tuangan (Pour Plate Method)
Metode ini terdiri atas penginokulasi bukan campuran kevdalam
tabung uvi yang mengandung agar mencair yang telah diinginkan
selama 450C. Isinya diaduk untuk memancarkan bakteri ke seluruh
medium. Campuran itu dituangkan kedalam cawan petri kosong dan
medium cair dituangkan diatasnya. Cawan diputar untuk mencampur
isinya sebelum medium menjadi padat.
Pertumbuhan koloni dalam medium. Tujuan kedua prosedur ialah
memisahkan sel-sel bakteri satu sama lain sehingga sel-sel itu tumbuh
menjadi koloni-koloni yang terpisah dari medium yang padat, kemudian
dapat diambil sel-sel dari koloni untuk mendapatkan biakan murni.
Dalam praktek sering piringan kedua digores kembali dengan organism
yang berrasal dari koloni yang diisolasi untuk menjamin bahwa hasil
yang diperoleh adalah biakan murni.
(Volk, 1993)
2.5. Macam-macam Media Biakan
Medium yang padanya bakteri ditumbuhkan akan beranak dalam
susunannya sesuai dengan kebutuhan jenis-jenis yang bersangkutan. Beberapa
bakteri dapat hidup pada medium yang sangat sederhana yang hanya
mengandung garam organik ditambah sumber karbon organik seperti gula.
Bakteri lain memerlukan suatu medium yang sangat kompleks yang kepadanya
ditambahkan darah atau bahan kompleks lain.
(Volk, 1993)
2.5.1. Media Saringan (Infusion media)
Salah satu media paling lazim yang digunakan untuk memelihara
bakteri sehari-hari disebut air kalolu, dibuat dengan merebus daging
cacah dengan air kemudian menyaring materi padat sehingga diperoleh
cairan jernih yang disebut air saringan pepton, yang merupakan protein
yang mengalami degradasi sebagian ditambahkan air saringan itu
sebagai sumber karbon, nitrogen dan zat anorganik tertentu guna
pertumbuhan bakteri.
(Volk, 1993)
2.5.2. Media Karbohidrat
Berbagai gula (karbohidrat) dapat ditambahkan pada dasar kaldu
yang mengandung makanan. Medium macam ini dipakai untuk
menentukan apakah jenis bakteri yang diidentifikasi itu mampu
menggunakan gula untuk pertumbuhannya. Dalam media jenis ini yang
lazim dipakai adalah gula seperti glukosa, monosa, galaktosa, sukrosa,
maltose dan laktosa. Disamping itu, digunakan pula alkohol-alkohol
gula seperti manitol, gliserol, dan duisitol.
(Volk, 1993)
2.6. Fase-fase pertumbuhan Bakteri
Jika keadaan baik, hampir semua bakteri mampu berkembang biak
dengan amat cepat. Waktu yang diperlukan bagi satu organisme untuk
membelah menjadi dua disebut waktu generasi. Dalam mempelajari laju
pertumbuhan biakan bakteri, hasilnya dapat di proyeksikan sebagai logaritma
jumlah sel terhadap waktu pertumbuhan. Terdapat 4 fasa pertumbuhan, yaitu :
2.6.1. Fasa tenggang (Lag)
Fasa tenggang adalah periode penyesuaian pada lingkungan dan
lamanya dapat 1 jam hingga beberapa hari. Lama waktu ini tergantung
pada macam bakteri, umur biakan dan nutrient yang terdapat dalam
medium yang disediakan. Fasa tenggang ini hanya tenggang dalam
pembiakan saja karena sebenarnya sel itu sangat aktif dalam
metabolisme inklusi dihabiskan. Dan ada sintesis enzim dan konsituen
penting secara aktif. Pada bagian belakang fasa tenggang terjadi
perbesaran ukuran keseluruhan.
(Volk, 1993)
2.6.2. Fasa Logaritma (log)
Fasa ini adalah periode pembiakan yang cepat dan merupakan
periode yang di dalamnya biasanya teramati cirri-ciri khas sel-sel yang
aktif selama fasa inilah waktu generasi tetap tak berubah jenis, jika
dibuat proyeksi logaritma jumlah organisme terhadap waktu, fasa log ini
muncul sebagai garis lurus, jadi waktu generasi dapat ditentukan dalam
fasa ini.
(Volk, 1993)
2.6.3. Fasa Stasioner
Sementara biakan menjadi tua dan mendekati populasi bakteri
maksimum yang ditunjang medium, laju pembiakan berkurang dan
beberapa sel mati. Apabila laju pembiakan sama dengan laju kematian,
jumlah keseluruhan bakteri akan tetap. Hal ini dinamakan fasa stasioner.
(Volk, 1993)
2.6.4. Fasa Kematian
Apabila laju kematian melampaui laju pembiakan, banyaknya
bakteri yang sebenarnya menurun. Fasa kematian ini biasanya
pembiakan berhenti.
(Volk, 1993)
2.7. Mikroorganisme
Sumber enzim yang paling banyak digunakan dibandingkan dengan
tanaman dan hewan. Mikroorganisme lebih menguntungkan karena
pertumbuhannya cepat, dapat tumbuh substrat yang murah lebih mudah
ditingkatkan hasilnya melalui pengaturan pertumbuhan dan rekayasa genetika.
Faktor yang menpengaruhi pertumbuhan bakteri adalah PH optimum dan suhu
yang sesuai untuk menumbuhkan bakteri digunakan suhu inkubasi 37°C.
(Akhdiya, 2003)
2.8. Penanaman mikroba
Pekerjaan memindahkan mikroba dari medium lama ke medium yang
baru harus dilaksanakan secara teliti. Terlebih dahulu harus diusahakan agar
semua alat-alat yang sangkut pautnya dengan medium dan pekerjaan inokulasi
(penanaman) itu benar-benar steril, hal ini untuk menghindarkan kontaminasi.
Beberapa langkah pada pekerjaan inokulasi mikroba adalah sebagai berikut :
1. Menyiapkan ruangan, ruangan tempat inokulasi harus bebas angin dan
bersih.
2. Pemindahan dengan kawat inokulasi, ujung kawat inokulasi sebaiknya dari
platina atau dari nikram, lebih dahulu ujung kawat ini dipijarkan sebelum
mengambil inokulum.
3. Pemindahan dengan pipet.
(Waluyo,2005)
Untuk menanam suatu mikroba perlu diperhatikan faktor-faktor nutrisi
serta kebutuhan akan oksigen (gas O2 atau udara ). Cara menumbuhkan
mikroba anaerob sangat berbeda dengan aerob. Untuk semuanya itu ada cara-
cara tertentu yang harus diperhatikan. Menanam mikroba yang aerob relatif
lebih mudah daripada yang anaerob.
1. Penanaman mikroba aerob
Ada beberapa cara penanaman mikroba aerob, tergantung pada tujuan
penanaman. Berdasarkan atas bentuk medium dan cara penanaman dapat
dibedakan menjadi :
a. Biakan agak tegak
b. Biakan agak miring
c. Biakan air
2. Penanaman mikroba anaerob
Untuk mikroba anaerob, oksigen dari udara bersifat toksik, karena itu
oksigen harus dikeluarkan dari dalam medium. Ada beberapa cara untuk
menumbuhkan meikroba anaerob, yaitu:
a. Menggunakan metode yang paling sederhana dan paling banyak
digunakan. Medium yang digunakan Chioglycollate-cair, Chioglycollate-
agar, glukosa otak dan lain-lain. Medium-medium tersebut mengandung
bahan-bahan yang dapat menyerap oksigen sehingga dalam suasana
dalam medium menjadi anaerob,misalnya medium Chioglycollate-agar
dalam cawan petri yang ditutup dengan penutup brewer.
b. Menutup oksigen bebas dengan pembakaran.
Alat yang digunakan misalanya eksikator, kedalam eksikator ini
ditambahkan phosphor murni (P4). Selama ada oksigen, fosfor akan
teroksidasi dan membentuk fosforpentaoksida. Untuk mempercepat
peracunana fosfor, maka pada dasar eksikator ditambahkan air yang akan
menyerap atau melarutkan fosfor pentaoksida tersebut.
c. Absorpsi Oksigen secara Kimia
Yang diperlukan adalah eksikator, asam pirogalel dan kolt. Untuk setiap
liter eksikator diberi 12,5 ml larutan KOH 20% dan 10 ml larutan asam
pirogalol 40%.
d. Menggunakan anaerob jari, anaerob pack atau inkubator anaerob.
(Waluyo, 2005)
2.9. Isolasi Bakteri
Mengisolasi suatu mikroba adalah memisahkan mikroba tersebut dari
lingkungan di alam dan menumbuhkanya sebagai biakan murni dalam medium
buatan. Untuk isolasi harus diketahui cara-cara menanam dan menumbuhkan
mikroba pada medium biakan serta syarat-syarat lain untuk pertumbuhan.
(Kingsburg, 1985)
Untuk mengisolasi bakteri dari alam menjadi biakan murni pada
umumnya ada dua cara yaitu:
1. Metode cawan Gores (Streak Plate Method)
Dilakukan dengan cara menggoreskan jarum ose penginokulasian yang
berisi biakan campuran pada permukaan cawan petri steril berisi medium
yang telah padat. Ada beberapa cara yang digunakan namun kesemuanya
meletakkan sebagian besar organisme pada beberapa goresan pertama dan
menyisakan bakteri individual yang cukup terpisah satu sama lain pada
goresan terakhir. Bakteri individual ini yang terpisah tumbuh menjadi koloni
bakteri yang saling terpisahkan antara satu spesies dengan spesies lainnya.
(Volk,1991)
2. Teknik Piringan tuangan (Pour Plate Method)
Dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu:
a. Menginokulasikan biakan, campuran ke dalam tabung uji yang
mengandung agar mencair yang telah didinginkan sampai suhu 45°C.
tabung ini diketuk agar bakteri mencapai keseluruhan medium. Isi tabung
uji lalu dituangkan ke dalam cawan petri dan dibiarkan menjadi padat.
b. Dengan cara Shake Culture (cara penanaman mikroba melalui cara
piaraan adukan), yaitu dengan menuangkan inokulum kedalam cawan
petri kosong lalu ditambahakan medium agar cair ke atasnya dan
campuran ini diputar (wadah cawannya) untuk mencampur isinya
sebelum medium menjadi padat.
(Volk, 1973)
3. Disinfektan
Disinfektan atau yang sering disebut juga larutan sterilisasi dingin
yang dapat merusak mikroorganisme (virus, bakteri, kapang) tetapi tidak
dapat mematikan spora bakteri. Disinfektan ini tidak dapat menggantikkan
sterilisasi autoklaf.
Disinfektan dapat digunakan pada permukaan yang keras (baki, kursi,
meja dsb), alat-alat yang peka terhadap pemanasan seperti plastik, pipa
kapiler sebelum dan sesudah penggunaannya. Disinfektan dalam
penggunaannya harus memperhatikan prosedur yang dianjurkan. Beberapa
disinfektan bersifat toksik dan membutuhkan penanganan yang khusus
dalam pembuangannya.
(Pelczar, 1988)
4. Sterilisasi
Agar biakan bakteri dapat dibuat, maka medium dan alat-alat yang
diperlukan harus disterilsasi sebelum inokulasi. Sterilisasi yaitu proses untuk
mematikan semua organisme yang dapat menjadikan kontaminan. Metode
yang lazim digunakan untuk memsterilisasikan media dan alat-alat ialah
dengan pemanasan. Jika panas digunakan bersama-bersama dengan uap air
disebut sterilisasi basah (menggunakan autoklaf), sedangkan jika tanpa uap
air disebut Sterilisasai kering (menggunakan oven).
(Pelczar, 1988)
5. Inokulasi Bakteri
Menurut Pelezar dan Chan (1996), ada berbagai cara yang dapat
digunakan untuk penanaman bakteri, antara lain:
a. Pembiakan dengan Lempengan (Plate Culture atau Streak Culture)
Dibuat dengan menggeserkan sengkelit (ose) yang telah terinokulasi oleh
bakteri ke atas cawan Petri berisi media padat sampai meliputi seluruh
permukaan dengan gerakan ke kanan dan ke kiri, sehingga diperoleh
koloni yang menggerombol dan memenal.
(Salle, 1973)
b. Piaraan Agar Miring
Penanaman bakteri dapat dilakukan dengan cara menggerakkan ujung
kawat yang berisi bakteri satu kali dari ujung bawah ke ujung atas,
sehingga garis merupakan diameter memanjang pada permukaan miring
medium.
(Salle, 1973)
c. Piaraan Tusukan (Stab Culture)
Stab culture dibuat dengan cara menumbuhkan ose yang berisi bakteri
dari permukaan atas agar tegak, tegak lurus medium, tengah-tengah
medium. Bakteri yang tumbuh di dalam medium dapat berupa bakteri
yang memakan gelatin medium maupun tidak memakan gelatin medium.
(Salle, 1973)
d. Piaraan Adukan (Shake Culture)
Bakteri dari medium cair atau dari medium padat yang telah
diencerkan sehingga menjadi suspensi, dituangkan ke tengah-tengah
cawan petri kemudian ditambahkan gelatin atau agar-agar yang belum
beku, lalu cawan ditutup dan diputar sehingga suspensi bercampur
dengan medium. Jika bakteri telah tumbuh maka akan berupa koloni-
koloni yang berada pada permukaan medium yang pertama adalah
bakteri anaerob dan yang kedua adalah bakteri aerob.
(Salle, 1973)
2.10. Faktor yang Mempengaruhi Pertumbuhan Mikroba
Kehidupan mikroba umumnya sangat dipengaruhi dan tergantung oleh
keadaan lingkungannya. Secara garis besar ada tiga faktor lingkungan yang
mempengaruhi, yaitu:
1. Faktor Fisik, misalnya: suhu, pH, tekanan osmotik, kandungan oksigen, dll.
2. Faktor Kimia, misalnya: senyawa racun.
3. Faktor biolagik, misalnya: interaksi dengan mikroba lainnya.
2.10.1. Faktor fisik
1. Pengaruh suhu terhadap pertumbuhan bakteri
Berdasarkan kisaran suhu pertumbuhannya, mikroba dibagi tiga:
Psikofilik : tumbuh pada kisaran suhu -5˚C – 20˚C
Mesofilik : tumbuh pada kisaran suhu 20˚C – 45˚C
Termofilik : tumbuh di atas suhu 45˚C
2. Pengaruh pH
Setiap jenis mikroba memiliki kemampuan untuk hidup pada rentang
pH yang spesifik. Namun secara umum mikroba dapat tumbuh pada
kisaran pH antara 4–9 dengan pertumbuhan optimum pada pH 6.5–
7.5 selama pertumbuhan mikroba, pH medium akan berubah akibat
produk- produk metabolisme mikroba, yakni asam hasil degradasi
karbohidrat dan basa hasl penguraian protein.
3. Pengaruh Oksigen bebas(O2)
Pada berbagai mikroba sangat bervariasi, hal ini mencerminkan
adanya perbedaan sistem enzim beroksidatif yang terdapat dalam
mikroba tersebut.
Berdasarkan kebutuhan O2, mikroba dapat dikelompokkan menjadi:
Aerob : mikroba yang membutuhkan O2 untuk pertumbuhannya
Anaerob : mikroba yang tidak membutuhkan O2 untuk pertumbuhanya
Fakultatif : mikroba yang dapat tumbuh dengan maupun tanpa adanya O2
Mikroaerofilik : mikroba yang membutuhkan O2 sangat sedikit.
4. Pengaruh Tekanan Osmotik
Medium yang dipergunakan untuk menumbuhkan suatu mikroba
mempunyai persyaratan tertentu, salah satunya adalah medium harus
bersifat isotonis terhadap mikroba. Kondisi medium yang hipertonis
atau hipotonik akan mempengaruhi sel mikroba sehingga
mengganggu pertumbuhan.
2.10.2. Faktor Kimia
Pada prinsipnya mikroba ada yang bersifat menguntungkan
maupun merugikan bagi kehidupan manusia. Beberapa metode
dikembangkan untuk mengendalikan mikroba yang bersifat merugikan
dengan menggunakan agen fisika dan kimia. Metode kimia untuk
mengendalikan pertumbuhan mikroba menggunakan:
1. Antiseptik : senyawa kimia yang digunakan untuk jaringan hidup
untuk menghambat pertumbuhan mikroba.
2. Disinfektan : senyawa kimia yang menghambat pertumbuhan pada
bahan yang tak hidup.
Untuk mengatur pengaruh senyawa kimia terhadap suatu bakteri
dapat dilakukan dengan menggunakan silinder kaca yang diletakkan
diatas medium yang telah diinokulasi dengan bakteri uji.
Penghambatan terhadap pertumbuhan bakteri ditunjukkan dengan
timbulnya daerah bening disekitar cakram uji. Daerah bening
merupakan daerah yang tidak ditumbuhi mikroba. Hal ini terjadi
akibat adanya difusi senyawa kimia ke dalam media akan
menyebabkan penghambatan ukuran daerah bening sangat
dipengaruhi oleh variabel- variable teknis yaitu jumlah inokkulum,
waktu inokulasi, komposisi medium, pH, gas- gas udara, stabilitas
antimikroba, dsb.
3. Faktor Biologis
Beberapa jenis mikroba mampu menghasilkan suatu metabolit yang
dapat bersifat racun bagi mikroba lain, misalnya antibiotik. Pengaruh
terhadap metabolik mikroba terhadap mikroba lain dapat dilakukan
dengan teknik bioassay yang “melawankan” mikroba penghasil
metabolit dengan mikroba lain yang sensitif.
(Guchanan, 1992)
2.11. Kurva Pertumbuhan Jasad renik
Pada gambar diatas ,jika suatu bakteri memperbanyak diri menjadi dua
dalam waktu 20 menit. Bila sel tersebut diingkubasikan pada medium dengan
kondisi optimum untuk pertumbuhanya maka dalam waktu 40 jam sel tersebut
akan mengalami pembelahan sebanyak 48(60)/20 kali atau 144 generasi.
Jumlah sel setelah 40 jam secara teoritis mencapai 2^144 sel. Jika setiap sel
mempunyai berat 10-12 gram, maka secara teoritis berat sel setelah 48 jam akan
mencapai 2^144 X 10-12 gram atau 2.2 X 1031 gram , atau sama dengan 4000
kali berat bumi. Pada kenyataanya tidaklah demikian keadaanya, karena tidak
semua sel yang terbentuk terus hidup.
(Waluyo,2005)
2.12. Bakteri
Bakteri merupakan organism bersel tunggal tanpa klorofil, memiliki DNA
dan RNA, mampu menunjukkan proses dasar kehidupan misalnya tumbuh,
melakukan metabolism dan berkembang biak.
Berdasarkan komposisi selnya, bakteri dibedakan menjadi bakteri gram
positif dan bakteri gram negative bakteri gram positif cenderung lebih sensitive
terhadap komponen anti bakteri untuk masuk kedalam sel dan menemukan
sasaran untuk bekerja, sedangkan susunan struktur dinding bakteri gram
negative lebih kompleks dan berlapis tiga, yaitu lapisan luar yang berupa
lipoprotein, lapisan tengah yang berupa peptidoglikan dan lapisan dalam
lipopolisakarida.
(Chan, 1988)
2.13. Antibakteri
Substansi antibakteri atau mikroba merupakan suatu substansi yang
mempunyai pengaruh merusak atau mengganggu mikroorganisme. Substansi
antimikroba dibagi menjadi dua kelompok berdasarkan daya kerjanya terdapat
bateriostatik dan bakteriosidik. Bakteriostatik merupakan zat yang hanya
menghambat pertumbuhan bakteri, sedangkan bakteriosidik merupakan zat
yang dapat mematikan bakteri.
(Chan, 1988)
Substansi antibakteri berpengaruh terhadap sel dengan mekanisme:
1. Menghambat sintesis dinding sel
Kerusakan terhadap dinding sel akibat terhambat pembentukannya
dapat mengakibatkan kepekaan antara bakteri gram positif dan gram
negative terhadap zat bakteri berbada dimana kepekaan ini bergantung pada
perbedaan susunan dinding sel.
2. Menghambat fungsi membrane sel
Sitoplasma merupakan pengendali susunan dalam sel. Adanya zat
antibakteri akan mengganggu integritas fungsi membrane sitoplasma yang
dapat menimbulkan kerusakan atau kematian sel.
3. Menghambat kerja enzim
Zat antibakteri mampu menggangu reaksi biomolekul yang
menyebabkan terganggunya metabolisme.
(Chan, 1988)
2.14. Uji Antibakteri
Pengukuran aktivitas antibakteri dapat dilakukan dengan beberapa metode
yaitu metode difusi dan metode pengenceran. Salah satu metode yang paling
umum digunakan adalah metode difusi.
Metode difusi dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu:
1. Metode silinder
Silinder steril dengan diameter 8 mm. ditetesi larutan uji dan ditempatkan
pada permukaan agar yang telah ditanami bakteri, daerah lambat yang
terbentuk terlihat sebagai daerah bening disekeliling silinder
2. Metode difusi cakram
Sejumlah mikroba uji difokuskan pada media agar dan cakram yang
mengandung larutan uji atau antibakteri tertentu diletakkan pada permukaan
media agar yang telah memadai setelah diinkubasi terlihat daerah hambatan
sebagai daerah bening yang tidak ditumbuhi. Mikroba dikelilingi cakram.
3. Senyawa Antibakteri dan Spektrum Aktivitasnya
Senyawa antibakteri merupakan suatu senyawa kimia yang mampu
membunuh atau menghambat pertumbuhan bakteri, dan berasal dari
mikroba, tumbuhan, atau disintesis secara kimiawi. Berdasarkan aktivitas
antibakterinya, maka senyawa antibakteri dapat dikelompokkan menjadi 2
kelompok, yaitu bakteriostatik dan bakteriosidal.
(Chan, 1988)
2.15. Spektrum aktivitas antibakteri
Spektrum aktivitas antibakteri dibagi menjadi dua macam :
a. Spektrum Luas (Brodd Spectrum)
Senyawa antibakteri memiliki aktivitas antibakteri yang aktif terhadap
berbagai jenis mikroba.
b. Spektrum Tak Luas (Narrow Spectrum)
Senyawa antibakteri hanya aktif terhadap satu atau beberapa jenis mikroba.
(Levinson, 2004)
2.16. Bakteri Eschericia coli
Bakteri E. Coli berbentuk batang pendek berukuran 1,1 sampai 1,4
mikrometer, gram negatif, anaerob fakultatif, tidak berspora, katalase positif,
terdapat dalam bentuk tunggal atau berpasangan. Koloni pada media agar
nutrien umumnya agak cembung, halus, permukaan licin, dan berwarna abu –
abu. Beberapa galus memiliki kapsul.
(Orskov, 1987)
2.16.1. Regenerasi E. Coli
Dari stock E. Coli diambil satu masa ose dan diinokulasikan ke
erlenmeyer yang berisi 40 ml media nutrienth broth (NB) steril.
Selanjutnya tabung tersebut diinkubasi ke dalam inkubator bergoyang
(shater) selama 24 jam pada suhu 37oC.
(Hidayanti, 2004)
2.16.2. Pengujian Antibakteri
Ekstrak sampel diuji konsentrasi berbeda (0%, 20%, 40%, 60%,
80%, 100%) terhadap pertumbuhan bakteri E. Coli. Biakan bakteri E.
Coli yang akan diuji dengan cara mencelupkan cakram kertas saring
berdiameter 0,5 cm. Kemudian cakram basah tersebut diletakkan di
atas media petridish yang sebelumnya sudah diinokulasikan bakteri E.
Coli dengan metode sebar. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37oC
selama 24 jam. Zona terbentuk di sekeliling cakram kertas diukur
diameter rata – ratanya menggunakan penggaris.
(Hidayanti, 2004)
2.17. Antibiotik
Antibiotik adalah zat yang membunuh atau menghambat pertumbuhan
bakteri. Ada banyak cara menggolongkan antibiotik, salah satunya adalah
berdasarkan struktur kimianya. Berdasarkan struktur kimianya, antibiotik
dikelompokkan sebagai berikut :
a. Golongan aminoglicosida
Diantaranya, amikasin, dibekasin, gentamisin, kanamisin.
b. Golongan betalactam
Diantaranya golongan karbapenem (ertapenem, imipenem), golongan
sepalosporim (sepalepsim, sepazolim), golongan betalactam mono siplic,
dan golongan penisilin.
Antibiotik yang lain yang penting seperti asam fusidat, berdasarkan
mekanisme aksinya, yaitu mekanisme bagaimana antibiotik secara selektif
meracuni sel bakteri.
(Anonim, 2008)
2.18. Pewarnaan Gram
Pewarnaan gram atau metode gram adalah salah satu metode empiris
untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, gram positif
dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan sifat fisik dinding sel mereka.
Untuk mempelajari sel – sel makhluk hidup lainnya menggunakan mikroskop,
bahan yang aka diperiksa terlebih dahulu dinamai dengan suatu metode
pewarnaan gram. Metode pewarnaan gram memberi hasil ada dua kelompok
bakteri. Bakteri – bakteri pada pewarnaan gram tampak berwarna biru disebut
gram positif dan bakteri yang nampak berwarna kemerahan disebut gram
negatif.
(Anonim, 2008)
2.19. Konsentrasi Hambatan Minimum (KHM)
Konsentrasi hambatan minimum adalah konsentrasi terendah dari sebuah
antimicrobial yang akan menghambat pertumbuhan yang tampak dari sebuah
mikroorganisme setelah diinkubasi semalaman, konsentrasi hambatan minimum
sangat penting dalam diagnosis laboratorium untuk mengkonfirmasi ulang
resistensi dari mikroorganisme pada agen microbial antibacterial dan untuk
memantau aktivitas agen anti microbial.
(Anonim, 2008)
2.20. Analisa bahan
2.20.1. Agar
Ekstrak dari sejenis rumput laut merat yang digunakan sebagai
bahan pembuat gel (gelling agent) dalam media biakan
mikroorganisme, makanan, obat-obatan dank krim kosmetik serta jelli.
Agar nutrient terdiri dari kalau yang terbuat dari ekstrak daging, darah
sapi, yang menjadi gel bersama agar kemudian digunakan untuk
membiakan bakteri, jamur, dan beberapa alya.
(Daintith, 1994)
2.20.2. Bakteri
Berbentuk batang pendek, berukuran 1,1 – 1,4 mikrometer, gram
negatif, anaerob fakultatif, tidak berspora, katalase positif, terdapat
dalam bentuk tunggal atau berpasangan.
(Orskov, 1997)
2.20.3. Pepton
Fragmen belgar yang dihasilkan pada awal proses hirolisis protein,
pencemaran bahan protein dicapai dengan asam atau enzim, sumber
utama nitrogen organik.
(Chan, 1988)
2.20.4 Ragi (Ekstrak yeast)
Jamur bersel 1 yang tersebar luas; sebagian besar masuk
ascomycorina; berkembang biak dengan proses pertunasan; digunakan
untuk industry pembuatan minuman beralkohol dan roti; juga
digunakan secara komersial sebagai sumber protein dan vitamin;
sebagai inang pada beberapa tekhnik bioteknologi untuk pengklonan
DNA.
(Abercrombie, 1997)
2.20.5 Aquadest
Air murni dari penyulingan; titik didih 1000C; titik bekunya 00C;
rumus molekul H2O; tidak berwarna (bening); tidak berasa; tidak
berbau; biasanya sebagai pelarut.
(Amiruddin, 1993)
2.20.6 NaCl
Padatan Kristal tanpa warna; larut dalam air dan sedikit larut
dalam etanol; titik didih 14130C; sebagai bahan pengawet dan bumbu
masakan.
(Daintith, 1994)
2.20.7 Alkohol
Dibuat melalui fermentasi gula, larutan tidak berwarna, c : 0,6
gr/ml, titik didih : -102oC, titik leleh : -169oC.
(Basri, 1996)
III. METODE PERCOBAAN
III.1. Alat dan Bahan
III.1.1. Alat
1. Cawan petri steril 9. Kompor listrik
2. Tabung reaksi 10 ml 10. Tutup kapas
3. Erlenmeyer 100 ml 11. Kertas coklat
4. Autoklaf 12. Benang kasur
5. Inkubator 13. Pengaduk
6. Jarum Ose 14. Mixer
7. Alumunium foil 15. Plastik
8. Penangas air
III.1.2. Bahan
1. Ekstrak ragi
2. Pepton
3. NaCl
4. Bubuk agar
5. Akuadest
6. Bakteri E. Coli
III.2. Skema Kerja
III.2.1. Pembuatan Medium Nutrien Broth
Penambahan 50 ml aquadest
Pengadukan
Pensterilan dengan autoklaf selama 20 menit
Pendinginan
III.2.2. Regenerasi bakteri E. Coli
Pengambilan satu mata ose stok biakan E. Coli
Penginkubasian selama 24 jam pada suhu 37oC
0,15 g ragi + 0,25 g pepton + 0,25 g NaClErlenmeyer
Hasil
50 ml biakan nutrien broth
Erlenmeyer
Hasil
III.2.3. Pembuatan media nutrien agar
Penambahan 50 ml aquadest
Pengadukan
Pensterilan dengan autoklaf
Pendinginan hingga 50oC
Penuangan secara aseptik ke dalam
petridish
Pendiaman hingga memadat
0,15 g ragi + 0,25 g pepton + 0,25 g Erlenmeyer
Hasil
III.2.4. Pengujian antibakteri
Variasi konsentrasi (20%, 40%, 60%, 80%,
100%)
Alkohol 70% 4ml sebagai kontrol positif
Pengambilan 20 mml bakteri E. Coli dari media
broth dengan pipet mikro secara aseptik.
Penyemprotan bakteri E. Coli ke dalam
permukaan medium agar dalam petridish.
Penyebaran bakteri menggunakan spreadtor
Pencelupan cakram kertas saring (diameter 0,5
cm) ke masing masing sampel.
Peletakkan cakram ke permukaan media agar
dan diberi label.
Penginkubasian selama 24 jam pada suhu 37oC
Pengamatan dan analisis data
Ekstrak sampel bunga bungur
Botol vial
Medium agar dalam petridish
Hasil
IV. DATA PENGAMATAN
No. Perlakuan Hasil
1. Pembuatan Media Nutrien Broth
- 0,5g ragi + 0,25g pepton + 0,25g NaCl dalam
erlenmeyer
- Penambahan 50 ml aquadest
- Pengadukan
- Pensterilan dengan autoklaf
- Pendinginan
Larutan berwarna kuning
jernih
2. Regenerasi Bakteri E.Coli
- 50 ml biakan notrien broth dalam Erlenmeyer
- Pengambilan satu mata ose stok biakan E.Coli
- Pengingkubasian selama 24 jam, suhu 37 0 C
Larutan berubah menjadi
kuning keruh yang
menunjukkan adanya
pertumbuhan bakteri E.coli
3. Pembuatan Media Nutrien Agar
- 0,5g ragi + 0,75g pepton + 0,75g NaCl + 2,25g bubuk
agar dalam Erlenmeyer
- Penambahan 50 ml aquadest
- Pengadukan
- Pensterilan dengan autoklaf
- Pendinginan hingga 50 0C
- Tuangkan secara aseptik kedalam petri dish
- Diamkan hingga memadat
Terbentuk medium nutrien
agar yang memadat berwarna
kuning jernih
4. Pengujian Antibakteri
- Pembuatan ektrak sampel bunga bungur dengan
konsentrasi berbeda (20% ,40% ,60%, 80%, 100%)
- Mencelupkan 5 kertas cakram dalam ekstrak sampel
untuk masing-masing konsentrasi
- Meletakkan kertas cakram diatas media nutrien agar
petridish yang sebelumnya sudah diinokulasi bakteri
E.coli dengan metode sebar (spread)
- Inkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC
- Pengamatan
Terbentuk zona bening pada
masing-masing cakram.
5. Analisis Data
- Konsentrasi 20%
- Konsentrasi 40%
- Konsentrasi 60%
- Konsentrasi 80%
- Konsentrasi 100%
- Kontrol (alkohol)
Diameter
- 1,1 cm
- tidak terbentuk
- 1,5 cm
- 1,2 cm
- 1,2 cm
- 1,3 cm
IV. HIPOTESA
Akan dilakukan percobaan yang berjudul “Mikrobiologi: Isolasi dan
Penanaman Bakteri Serta Uji Antibakteri”, bertujuan untuk membuat berbagai
macam medium yang digunakan dalam bidang mikrobiologi, mengenal dan
melakukan teknik penanaman bakteri, mengisolasi bakteri untuk mendapatkan biakan
murni, dan menentukan konsentrasi hambatan minimum (KHM) dan tingkat
kemampuan antibakteri dari beberapa agen antibakteri. Prinsip yang mendasari
adalah aktivitas antibakteri dalam menghambat pertumbuhan bakteri tertentu. Metode
yang digunakan dalam percobaan ini yaitu metode spread (sebar) dan metode difusi
cakram. Teknik percobaan penanaman bakteri menggunakan media biakan yaitu
medium nutrien cair dan medium nutrien agar, kemungkinan yang terjadi bakteri
akan lebih mudah diamati pada medium nutrien agar karena agar merupakan media
padat. Berdasarkan data, akan diketahui perbandingan diameter rata – rata dari zona
bening yang terbentuk pada hasil percobaan dengan variasi konsentrasi ekstrak
sampel. Penentuan konsentrasi hambatan minimum dari ekstrak sampel diukur
berdasarkan diameter terbesar dari zona bening yang terbentuk.
VI. PEMBAHASAN
Percobaan yang berjudul “MIKROBIOLOGI: ISOLASI DAN
PENANAMAN MIKROBA SERTA UJI ANTIBAKTERI” bertujuan untuk
mengenal dan membuat berbagai macam medium yang digunakan dalam bidang
mikrobiologi, mengenal dan melakukan teknik penanaman bakteri, menentukan
konsentrasi hambatan minimum (KHM) dan tingkat kemampuan anti bakteri dari
beberapa agen antibakteri. Metode yang digunakan adalah metode spread (Menyebar)
dan metode difusi cakram. Metode sebar atau spread plate merupakan metode
penanaman bakteri yang dilakukan dengan menyemprotkan suspensi ke atas medium
agar kemudian menyebarkannya secara merata dengan trigalski. Dengan ini
diharapkan bakteri terpisah secara individual, kemudian dapat tumbuh menjadi koloni
tunggal. Kelebihan teknik ini adalah mikroorganisme yang tumbuh dapat trsebar
merata pada bagian permukaan media agar (Ghoni, 2012). Sedangkan metode difusi
cakram adalah metode yang untuk uji aktivitas antibakteri yang bahan ujinya (ekstrak
antibakteri) dijenuhkan ke dalam kertas cakram (cakram kertas). Prinsipnya adalah
aktivitas anti bakteri dalam menghambat pertumbuhan bakteri tertentu.
Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dan dikembangkan pada suatu substrat
yang disebut medium. Medium yang digunakan untuk menumbuhkan dan
mengembangbiakkan mikroorganisme tersebut harus sesuai susunanya dengan
kebutuhan jenis-jenis mikroorganisme yang bersangkutan. Beberapa mikroorganisme
dapat hidup baik pada medium yang sangat sederhana yang hanya mengandung
garam anargonik di tambah sumber karbon organik seperti gula. Sedangkan
mikroorganime lainnya memerlukan suatu medium yang sangat kompleks yaitu
berupa medium ditambahkan darah atau bahan-bahan kompleks lainnya (Volk, dan
Wheeler,1993).
Akan tetapi yang terpenting medium harus mengandung nutrien yang
merupakan substansi dengan berat molekul rendah dan mudah larut dalam air.
Nutrien ini adalah degradasi dari nutrien dengan molekul yang kompleks. Nutrien
dalam medium harus memenuhi kebutuhan dasar makhluk hidup, yang meliputi air,
karbon, energi, mineral dan faktor tumbuh (Label, 2008).
Untuk menelaah bakteri di dalam laboratorium , pertama- tama kita harus
dapat menumbuhkan bakteri tersebut di dalam suatu biakan murni. Untuk
melakukannya haruslah dimengerti jenis- jenis nutrient yang disyartakan oleh bakteri
dan juga macam lingkungan fisik yang mana dapat menyebabkan kondisi yang
optimum bagi pertumbuhannya tersebut (Pelczar, 1986).
Pada percobaan ini, sebelum dilakukan pengujian antibakteri, dilakukan
beberapa perlakuan terlebih dahulu, diantaranya:
6.1 Pembuatan Medium Nutrient Cair (Broth)
Tujuan percobaan ini adalah sebagai tempat atau media untuk
menumbuhkan bakteri E.Coli yang di dalamnya terdapat nutrisi yang
memenuhi kebutuhan perkembangbiakan bakteri tersebut. Pada pembuatan
medium nutrient cair digunakan nutrien-nutrien berupa ekstrak ragi, pepton,
dan NaCl. Ekstrak ragi digunakan karena ekstrak ragi mengandung natrium
karbinat dan natrium bikarbonat yang berfungsi sebagai sumber karbon
(Tarigan, 1988 ). Ragi disini juga berfungsi sebagai sumber makanan bagi
bakteri. Hal ini karena sejumlah mikroorganisme membutuhkan sejumlah
karbon dalam bentuk karbondioksida tetapi kebanyakan diantaranya juga
membutuhkan beberapa senyawa karbon organik, seperti gula, dan karbohidrat
(Waluyo, 2005 ). Pepton juga berfungsi sebagai protein karena pepton
merupakan senyawa organic dalam bentuk asam-asam amino yang merupakan
sumber nitrogen (N), yang penting bagi pertumbuhan bagi bakteri (Waluyo,
2005 ). NaCl berfungsi sebagai sumber ion logam Natrium karena semua
organisme hidup membutuhkan beberapa unsure logam seperti natrium, kalium,
magnesium, mangan, besi, tembaga, dan kobalt. Berbagai sumber tersebut
digunakan untuk pertumbuhan yang normal, tidak terkecuali kuman (Waluyo,
2005). Ketiganya merupakan nutrien-nutien atau unsur hara yang diperlukan
bakteri agar dapat tumbuh dengan baik. Ketiga nutrien ini lalu dicampur dengan
akuades didalam erlenmeyer yang berfungsi sebagai pelarut.
Medium nutrien cair (broth) ini kemudian disterilkan dengan dimasukkan
kedalam autoklaf. Sebelum medium-medium tersebut dimasukkan kedalam
autoklaf, erlenmeyer yang berisi bahan untuk nutrien cair tersebut harus
tertutupi dengan aluminium foil untuk mencegah kontaminasi dari udara luar,
kemudian dibungkus juga dengan plastik. Hal ini dimaksudkan agar erlenmeyer
tidak basah karena terkena uap air dari autoklaf karena erlenmeyer harus berada
dalam kondisi tetap kering dan steril.
Sterilisasi dilakukan dengan memanaskan seluruh alat, seperti cawan
petri, ose, tabung reaksi, dll di dalam autoklaf. Hal ini dilakukan agar sel-sel
vegetatif bakteri mati, sehingga dapat menurunkan resiko kontaminasi.
Autoklaf merupakan alat serupa tangki minyak yang dapat diisi dengan
uap air. Autoklaf memiliki suatu ruangan yang dapat menahan tekanan diatas 1
atm. Dalam autoklaf, yang mensterilkan adalah panas basah, bukan pada
tekanannya. Oleh karena itu, setelah air di dalam tangki mendidih dan mulai
terbentuk uap air maka uap air ini akan mengalir keruangan pensterilan guna
mendesak keluar semua udara di dalamnya. Bila masih ada udara yang tersisa,
maka udara ini akan menambah tekanan didalam ruangan pensteril yang akan
mengganggu naiknya suhu dalam ruangan tersebut (Waluyo, 2005 ).
Medium tempat penginokulasian bakteri memiliki fungsi masing-masing.
Medium cair ini digunakan untuk menumbuhkan bakteri. Medium agar
digunakan untuk memperoleh biakan murni dan medium agar miring digunakan
untuk menyimpan (stock) bakteri untuk digunakan lagi di lain waktu.
Setelah pengautoklafan, didapatkan hasil cairan kuning bening berupa
medium nutrien broth/ cair didalam Erlenmeyer.
6.2 Regenerasi Bakteri E.coli
Tujuan pada percobaan ini adalah untuk mengaktifkan kembali bakteri
E.coli yang inaktif karena penyimpanan dalam suhu dingin dan mengembang
biakan bakteri E.coli. Dilakukan dengan pengambilan stok biakan E.coli
dengan jarum ose dan diinokulasi ke erlenmeyer yang telah berisi medium
nutrient broth (NB) steril. Pada saat diinokulasi semua alat maupun media yang
digunakan harus steril, dikarenakan agar tidak terkontaminasi dengan unsur-
unsur lain ataupun mikroorganisme lain yang nantinya akan mempengaruhi
perkembangbiakan bakteri E.coli. Pensterilan ini dilakukan didalam inkas
dengan cara membakar ujung jarum ose yang digunakan untuk mengambil
bakteri E.coli dan menanamnya di medium Nutrient Broth yang terdapat
erlenmeyer, dimana erlenmeyer ini ujung mulut erlenmeyer juga dibakar agar
steril. Setelah itu medium nutrient cair yang telah ditanam bakteri E.coli di
inkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC dalam inkubator. Hal ini dikarenakan
agar E.coli tumbuh dan berkembang biak dimana E.coli mengalami fasa
tenggang (lag).
Fasa tenggang (lag) merupakan fasa penyesuaian pada lingkungan dan
lamanya dapat 1 jam hingga beberapa hari. Lama waktu ini tergantung pada
macam bakteri, umur biakan dan nutrient yang terdapat dalam medium yang
disediakan. Fasa tenggang ini hanya tenggang dalam pembiakan saja karena
sebenarnya sel itu sangat aktif dalam metabolisme inklusi dihabiskan. Dan ada
sintesis enzim dan konsituen penting secara aktif. Pada bagian belakang fasa
tenggang terjadi perbesaran ukuran keseluruhan (Volk, 1993).
Proses inokulasi dilakukan pada suhu 37oC , karena suhu yang sesuai
untuk menumbuhkan bakteri E.coli digunakan suhu inkubasi yaitu 37°C
(Akhdiya, 2003).
Inkubator merupakan alat dimana proses inkubasi dilakukan.
Peninkubasian adalah proses memelihara kultur bakteri pada suhu tertentu
dalam jangka waktu tertentu untuk memantau pertumbuhan bakteri.
6.3. Pembuatan Medium Nutrient Agar (padat)
Tujuan dilakukan percobaan ini adalah sebagai media untuk melakukan
uji antibakteri. Media agar ini dibuat dengan menggunakan pepton, ekstrak ragi,
NaCl, dan bubuk agar. Semua bahan dicampur dalam erlenmeyer dan dilarutkan
dengan aquades agar bahan-bahan tersebut menjadi larutan yang homogen.
Ekstrak ragi digunakan karena ekstrak ragi mengandung natrium karbinat
dan natrium bikarbonat yang berfungsi sebagai sumber karbon (Tarigan, 1988).
Ekstrak ragi disini juga berfungsi sebagai sumber makanan bagi bakteri. Hal
ini karena sejumlah mikroorganisme membutuhkan sejumlah karbon dalam
bentuk karbondioksida tetapi kebanyakan diantaranya juga membutuhkan
beberapa senyawa karbon organik, seperti gula, dan karbohidrat (Waluyo,
2005). Pepton juga berfungsi sebagai protein karena pepton merupakan
senyawa organic dalam bentuk asam-asam amino yang merupakan sumber
nitrogen (N), yang penting bagi pertumbuhan bagi bakteri (Waluyo, 2005).
NaCl berfungsi sebagai sumber ion logam Natrium karena semua organisme
hidup membutuhkan beberapa unsure logam seperti natrium, kalium,
magnesium, mangan, besi, tembaga, dan kobalt. Berbagai sumber tersebut
digunakan untuk pertumbuhan yang normal, tidak terkecuali kuman (Waluyo,
2005). Ketiganya merupakan nutrien-nutien atau unsur hara yang diperlukan
bakteri agar dapat tumbuh dengan baik. Sedangkan penambahan bubuk agar
yang berasal dari alga berfungsi sebagai bahan pemadat media.
Setelah larutan homogen, kemudian larutan dan alat-alat lainnya seperti
petridish, trigalski, ujung pipet volume, kertas cakram dan lain-lain di sterilkan
menggunakan autoklaf. Hal ini dilakukan agar sel-sel vegetatif bakteri mati,
sehingga dapat menurunkan resiko kontaminasi. Ketika di autoklaf, alat-alat
atau media di dibalut dengan aluminium foil dan dibungkus dengan plastik.
Hal ini bertujuan agar media tidak basah dan tidak mengkontaminasi medim
yang telah dibuat.
Setelah itu medium di diamkan sebentar sampai hangat, kemudian
dituang ke dalam petridish. Hal ini dikarenakan agar penuangan tidak terlalu
panas dan tidak memadat jika dalam keadaan dingin. Penuangan dilakukan
didalam inkas, agar terhindar dari bakteri atau unsur-unsur lain yang tidak
diinginkan. Lalu medium dibiarkan memadat didalam inkas, hal ini untuk
memudahkan penanaman bakteri dan pengujian antibakteri dalam medium agar
(padat).
6.4 Pengujian Antibakteri
Tujuan dari pecobaan ini adalah untuk mengetahui tingkat kemampuan
antibakteri yang berasal dari ekstrak bunga bungur terhadap bakteri E.coli.
Dalam percobaan ini terlebih dahulu dipersiapkan zat antibakteri yang
berasal dari sampel bunga bungur. Digunakan tanaman bungur karena
mengandung zat aktif utama meliputi senyawa tanin, triterpenoid, protein, dan
asam amino (Ambujakshi, 2009).
Tanin merupakan salah satu jenis senyawa yang termasuk ke dalam
golongan polifenol. Senyawa tanin ini banyak di jumpai pada tumbuhan. Tanin
dapat mengikat alkaloid dan glatin. Tanin secara umum didefinisikan sebagai
senyawa polifenol yang memiliki berat molekul cukup tinggi (lebih dari 1000)
dan dapat membentuk kompleks dengan protein. Tanin memiliki peranan
biologis yang kompleks. Hal ini dikarenakan sifat tannin yang sangat kompleks
mulai dari pengendapan protein hingga pengkhelat logam. Tanin juga dapat
berfungs isebagai antioksidan biologis.
Triterpenoid adalah senyawa yang kerangka karbonnya berasal dari enam
satuan isoprena dan secara biosintesis diturunkan dari hidrokarbon C-30 asiklik,
yaitu skualena, senyawa ini tidak berwarna, berbentuk kristal, bertitik leleh
tinggi dan bersifat optis aktif (Harborne,1987).
Gambar Struktur Triterpenoid (Joseph, 2008)
Bunga bungur diambil ekstraknya dengan cara ditumbuk untuk
penghomogenasian dengan memecah sel – sel bunga bungur. Ekstrak yang
telah diperoleh dibuat variasi konsentrasi sebesar 20%, 40%, 60%, 80%, dan
100%. Variasi konsentrasi ini bertujuan untuk mengetahui Konsentrasi
Hambatan Minimum (KHM) ekstrak bunga bungur terhadap pertumbuhan
bakteri E. Coli. Konsentrasi hambatan minimum adalah konsentrasi terendah
dari sebuah antimikrobial yang akan menghambat pertumbuhan yang tampak
dari sebuah mikroorganisme. Konsentrasi Hambatan Minimum (KHM) sangat
penting dalam diagnosis laboratorium untuk mengonfirmasi ulang resistansi
dari mikroorganisme pada agen mikroba antibakterial dan untuk memantau
aktivitas agen anti mikrobial (Anonim, 2008). Kontrol positif yang digunakan
pada percobaan ini adalah alkohol 70%. Kontrol ini berfungsi sebagai
pembanding senyawa antibakteri yang sesuai dalam menghambat pertumbuhan
E. Coli karena alkohol merupakan senyawa antibiotik yang dapat membunuh
atau menghambat pertumbuhan bakteri.
Sebelum dilakukan pengujian anti bakteri, terlebih dahulu dilakukan
penanaman bakteri E.coli dengan metode spread (sebar). Metode sebar atau
spread plate merupakan metode penanaman bakteri yang dilakukan dengan
menyemprotkan suspensi ke atas medium agar kemudian menyebarkannya
secara merata dengan trigalski. Dengan ini diharapkan bakteri terpisah secara
individual, kemudian dapat tumbuh menjadi koloni tunggal. Kelebihan teknik
ini adalah mikroorganisme yang tumbuh dapat tersebar merata pada bagian
permukaan media agar.
Pengujian antibakteri dilakukan dengan metode difusi cakram kertas.
Kertas cakram secara steril dicelupkan pada zat antibiotik dengan variasi
konsentrasi yang telah dibuat, lalu diletakkan pada petridish yang berisi media
nutrient agar yang telah ditanami bakteri E. Coli dengan metode spread (sebar).
Kontrol positif (alkohol 70%) juga dicelupkan cakram kertas dan
kemudian diletakkan di tengah – tengah permukaan media agar dengan tujuan
untuk mempermudah proses pembandingan hasilnya. Petridish diletakkan
dalam inkubator guna untuk proses inkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC.
Proses inkubasi ini bertujuan agar bakteri dapat berkembang biak. Petridish
diletakkan secara terbalik dengan tujuan untuk mencegah terjadinya tetesan air
pada permukaan agar dari hasil kondensasi. Hasil positif yang diperoleh yaitu
tebentuk lapisan bening pada bagian luar kertas cakram yang merupakan zona
antibakteri.
Dari data hasil percobaan menunjukkan terbentuknya daerah (zona)
bening di sekitar cakram. Pada konsentrasi KHM ekstrak bunga bungur 60%
menghasilkan zona bening dengan diameter 1,5 cm, yang merupakan diameter
terbesar dari konsentrasi KHM yang lain. Ekstrak bunga bungur dengan
konsentrasi 20%, 40%, 80%, dan 100% menghasilkan zona bening dengan
diameter 1,1; tidak terbentuk; 1,2; dan 1,2 cm. Kontrol positif (alkohol 70%)
menghasilkan zona bening dengan diameter 1,3 cm. Adanya zona bening pada
agen bakteri tersebut menunjukkan bahwa agen bakteri tersebut mengandung
senyawa yang dapat bertindak sebagai antibakteri, seperti tanin dan triterpenoid
(Ambujakshi, 2009).
Dari data di atas pada %KHM ekstrak bunga bungur didapatkan hasil
115,38%. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak bunga bungur ini mempunyai
kandungan senyawa antibakteri yang lebih baik dari kontrol positif (alkohol
70%).
6.5 Analisis Data
Untuk menganalisis data hasil percobaan dilakukan dengan membandingkan
diameter rata-rata dari zona bening yang terbentuk pada hasil percobaan dengan variasi
konsentrasi ekstrak sampel (20% ,40% ,60%, 80%, 100%). Penentuan Konsentrasi
Hambat Minimum (KHM) dari ekstrak sampel diukur berdasarkan konsentrasi
terkecil ekstrak sampel yang mampu menghambat secara signifikan
pertumbuhan bakteri E.coli . Hal ini dapat ditentukan berdasarkan terbentuknya
zona bening yang nyata (viable) pada konsentrasi ekstrak terkeceil tersebut.
Untuk menentukan tingkat kemampuan antibakteri, dilakukan dengan
membandingkan diameter rata-rata zona bening dari ekstrak sampel dengan
antibiotik.
Pada percobaan ini sampel yang digunakan adalah ekstrak bunga bungur,
dan menggunakan kontrol positif berupa alcohol. Dimana zona bening yang
terbentuk pada konsentrasi ekstrak 20% sebesar 1,1 cm ; ekstrak 40% tidak
terbentuk ; ekstrak 60% sebesar 1,5 cm ; ekstrak 80% sebesar 1,2 cm : ekstrak
100% sebesar 1,2 cm ; dan control positif (alcohol) sebesar 1,3 cm.
VII. Penutup
7.1. Kesimpulan
7.1.1. Percobaan isolasi dan penanaman bakteri E.coli dapat digunakan dengan
menggunakan medium Nutrient Broth dan medium Nutrient Agar dengan
metode spread (sebar).
7.1. 2. Pengujian antibakteri dapat dilakukan dengan menggunakan metode difusi
cakram.
7.1.3. Ekstrak bunga bungur mengandung senyawa tanin, triterpenoid, protein,
dan asam amino yang berperan sebagai antibakteri dimana mempunyai KHM
yang dapat menghambat pertumbuhan antibakteri E.coli pada konsentrasi 80%
dengan diameter 1,5 cm; dan presentasi KHMnya sebesar 115,38%.
7.2 Saran
7.2.1. Perhatikan langkah kerja dengan baik dan teliti.
7.2.2. Sebaiknya mengetahui tujuan dari masing-masing bahan yang digunakan.
7.2.3. Sebaiknya alat yang akan digunakan sebelum dan sesudah percobaan
diautoklaf terlebih dahulu.
DAFTAR PUSTAKA
Anantharayan dan R.P. Jayaran.1979. ”Textbook of Microbiology”.Bombay Calcuta :
New Delhi
Arsyad, M.2001.”Kamus Kimia”.Gramedia : Jakarta
Basri, Sarjoni.1996.”Kamus Kimia”. Rineka Cipta : Jakarta
Burrows, W. 1961.”Textbook of Microbiology”. WB Soundeng Company:
Phyladelphhia
Daintith, John.1994.”Kamus Lengkap Kimia”. Erlangga : Jakarta
Ghoni, Achmad, 2012, “Isolasi dan Inokulasi Bakteri”, dalam
http://www.achmadghoni.com/2012/05/isolasi-dan-inokulasi-bakteri.html.,
diakses 27 Desember 2012
Guchanon, E.R dan E.N Gibsons.1992.”Bergeys Manual of Deteminate
Bacteriology,8 th Edition” . The Willians and Wilkins Company : New York
Handoko, Sriani.2000. “ Mikrobiology Dasar “. Universitas Diponegoro : Semarang
Joseph D. Connolly and Robert A. Hill, Nat. Prod. Rep., 2008, 25, 794, dalam situs
http://www.rsc.org/Publishing/Journals/NP/article.asp?
Type=Issue&Journalcode=NP&Issue=4&SubYear=2008&Volume=25&GA=o
n, diakses 27 Desember 2012
Kingsburd, Dtetal.1985.” Microbiology “. John Willey & Sons : New York
Mulyono.2005.” Kamus Kimia”. Ganessa Siratama: Bandung
Pelezar, J.M and E.C.S. Chan.1996.” Dasar-dasar Mikrobiology”. UI Press : Jakarta
Pudjaatmaka, Hadyana.2002.”Kamus Kimia”. Balai Pustaka : Jakarta
Robinson, T. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Penerjemah: Kosasih
Padmawinata. Bandung: ITB
Salle,A.J.1973. “Fundamental Principle of Bacteriology”. Mc Graw Hills : USA
Sutedjo, M. 1996. “Mikrobiology Tanah”. Rineka Cipta: Jakarta
Volk, W.A.1991. “Microboilogy Dasar alih bahasa”. Erlangga : Jakarta
Waluyo, L. 2004. “Microbology Umum”. UMM Press : Malang
Lampiran Perhitungan
Menghitung KHM ekstrak bunga bungur sebagai sampel antibakteri dalam menghambat
aktivitas bakteri.
KHM sampel Lagerstromeia yaitu:
= 115,38 %