L’UNIVERSITE DE BORDEAUXori-oai.u-bordeaux1.fr/pdf/2008/PORTE_YVES_2008.pdf · Ce travail de recherche a été effectué au sein du Centre de Neurosciences Intégratives et Cognitives

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N° d’ordre : 3737

THESE

PRESENTEE A

L’UNIVERSITE DE BORDEAUX

ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE

PAR

Yves PORTE

POUR L’OBTENTION DU GRADE DE

DOCTEUR

SPECIALITE NEUROSCIENCES

MECANISMES CELLULAIRES ET MOLECULAIRES

A L’ORIGINE DES DISSOCIATIONS DE LA MEMOIRE

SPATIALE CHEZ LA SOURIS.

Implication de la voie transcriptionnelle CREB

Soutenue le 12 décembre 2008

Après avis de :

Mme Catherine THINUS-BLANC (DR, CNRS UMR 6146, Univ. de Provence) M. Pascal ROULLET (MCU, CNRS UMR 5169, Univ. Toulouse 3)

Devant la commission d’examen formée de :

Mme Catherine THINUS-BLANC (DR, CNRS UMR 6146, Univ. de Provence) Rapporteur

M. Pascal ROULLET (MCU, CNRS UMR 5169, Univ. Toulouse 3) Rapporteur

Mme Catherine LEMOINE (DR, CNRS UMR 5227, Univ. Bordeaux) Examinateur M. Guillaume FERREIRA (CR, INRA UMR 6175, Univ. Tours) Examinateur Mme Nicole MONS (CR, CNRS UMR 5228, Univ. Bordeaux) Directeur de Thèse M. Jacques MICHEAU (Pr., CNRS UMR 5228, Univ. Bordeaux) Président du Jury

-------- 2008 2008 2008 2008 --------

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3

R em erciem ents

Mes tous premiers mots vont bien entendu aux Drs N. Mons et M.C. Buhot pour

m’avoir accompagné tant sur le point scientifique qu’humain tout au long de ces quatre

années de « MasThèse ». Un grand merci donc à toi cheffe Nicole ! Tu as su me guider, me

motiver, me faire rire… Je garderai un excellent souvenir de tous ces moments passés en ta

compagnie à la paillasse, à la « cafèt-bibliothèque », dans ton bureau ou dans le mien, et à la

pause clope bien que tu ne fumes pas. Un aussi grand merci à toi cheffe Marie-Christine : ta

constante bonne humeur, tes blagues, tes souvenirs de jeunesse, tes apports scientifiques et

tous ces moments dans notre 6m² du water maze me manqueront ! A quand votre prochaine

visite, toi et Luis, à la Bataille de Castillon ??

Je tiens à remercier en second lieu le Dr G. Di Scala, directeur de l’ancien Laboratoire

de Neurosciences Cognitives et de l’actuel Centre de Neurosciences Intégratives et

Cognitives, pour m’avoir accueilli dans l’unité quand je n’étais qu’un petit étudiant en

Master. Merci pour les quelques discussions que nous avons eues, tant sur le plan

professionnel que personnel, et désolé d’avoir un peu laissé tomber le journal club sur la fin…

mais de bonnes âmes l’ont repris avec encore beaucoup plus de cœur que moi, ce qui me fait

finalement moins culpabiliser !!

Voici maintenant venu le moment de remercier tous les membres de l’équipe 1 : Aline

Marighetto, cheffe de la célèbre équipe éponyme, Aline Desmedt, Jacques Micheau, Xavier

Noguès et Robert Jaffard, membres permanents et honorifiques… hihihi… Les réunions

d’équipe houleuses et interminables en votre compagnie, à vous expliquer le pourquoi du

comment du CREB dans cette foutue piscine où le hasard est bel et bien à 25%, resteront pour

moi un souvenir inoubliable… Merci d’avoir si bien joué les avocats du diable, ça m’aura

bien servi ! Au tour maintenant des étudiants de l’équipe…. D’abord, les anciens, ou futurs

anciens, partis ou sur le point de partir en de lointaines contrées pour post-Docker : merci à

Aurélie pour tous ces Vendredis après-midi craquage dans le bureau en compagnie de

François Poufsouffle et Stéph la hargneuse ! Merci à Pierre pour m’avoir enseigné l’art de

« blotter », et aussi à Julie, Stéphane et Ludo… Merci aux deux p’tits jeunes Pierre et

Mathieu, qui ont eu le plaisir (j’en suis sûr) d’effectuer un TER en ma compagnie, et qui font

maintenant une thèse : bon courage les gars c’est que du bonheur ! Une pensée agréable et

profonde pour saluer le courage, la bravoure, l’honnêteté, la sympathie, la gentillesse, la

persévérance et la simplicité de mes deux derniers mais non moins importants compagnons de

4

route, Nadia et Poto Laurent : un immense merci à mes deux amis !!!! Bon courage à vous

deux, je n’ai aucun doute sur le fait que vous nous pondrez une jolie théthèse !!

Je ne peux bien sûr pas citer tout le laboratoire dans ces quelques lignes, mais le cœur

y est. Ceux que j’aurai oubliés ne s’en offusqueront certainement pas… Je tiens toutefois à

nommer Delphine pour sa naturelle gentillesse, le Naneix pour sa promptitude à m’envoyer

des stylos au travers de la figure ou encore Maude pour la confiance qu’elle a su m’accorder !

En gros, merci à l’ensemble des étudiants…

Une pensée toute spéciale pour Dominique, Nathalie et Jennifer qui se sont si bien

occupées de mes petites souris (paix à leurs âmes) dans l’animalerie ; pour les mêmes raisons

(ou presque), je tiens à rendre hommage à Laurence et Angélique, qui m’ont si souvent assisté

pour tout ce qui est de l’histologie et de l’immuno ! Une pensée enfin pour tous les autres,

techniciens, chercheurs…

Pour terminer en beauté, un petit paragraphe spécial pour les gens qui m’entourent en

dehors du boulot…. Un grand merci notamment aux bénévoles de La Bataille de Castillon,

avec qui j’ai eu l’immense plaisir de me transporter en 1453 tous les étés. Parmi ces 700

personnes exceptionnelles je tiens à témoigner ma plus profonde gratitude à Stéfan, Josiane et

Bernard (à quand la prochaine journée promo à la Félibrée ???), Claudine (ma petite

costumière « aux doigts de fée »), Emilie et Vinciane (un p’tit karaoké ça vous dit ??)… et

une pensée profondément émue pour notre petite Carole, partie « rejoindre les étoiles »….

Enfin, pour m’avoir supporté et encouragé sans conditions pendant tout ce temps, je remercie

et embrasse bien fort toute ma petite famille : un gros bisou à toi ma petite maman, à vous

deux Nathalie et Caroline, merci Cyrille et Rami (un p’tit ramazzotti ??), Eric, t’inquiète, je

n’allais pas t’oublier ! Je vous aime tous et vous remercie d’avoir été présents. Et bien sûr, je

ne peux clore ce chapitre sans parler de mes p’tites bêbêtes, Dark le chien (mon Doudoubidou

adoré), Taram mon tit chat (« qu’est-ce qui le fait courir ? le jambon magique bien sûr ! »),

Gandalf le rat (un sage petit ratounet ayant acquis le magnifique surnom de Gandhi) et

Olympe, ma p’tite juju (quand accepteras-tu enfin de répondre à mes jambes ? snif !). A vous

et aux autres, je promets d’être un peu plus disponible dans les mois à venir…. En résumé, le

mot de la fin sera :

M E R CI !!!

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A vant-propos

Ce travail de recherche a été effectué au sein du Centre de Neurosciences Intégratives

et Cognitives (CNRS UMR 5228) de l’Université de Bordeaux, sous la direction du Dr Nicole

MONS (CR1) et a fait l’objet de 2 publications, 2 communications orales et 4

communications affichées.

� Publications avec comité de lecture :

Porte Y., Buhot M.C., Mons N.E. Spatial memory in the Morris water maze and activation of

cyclic AMP response element-binding within the mouse hippocampus. Learn. Mem. (2008)

15:885-894.

Porte Y., Buhot M.C., Mons N. Alteration of CREB phosphorylation and spatial memory

deficits in aged 129T2/Sv mice. Neurobiol Aging. (2008) 29:1533-1546.

Porte Y., Trifilieff P., Buhot M.C., Mons N. Distinct patterns of CREB phosphorylation after

spatial memory and extinction learning in mouse hippocampus. (en preparation).

� Communications orales :

Porte Y., Buhot M.C., Mons N. Implication du facteur de transcription CREB dans deux

formes de mémoire spatiale. Colloque NeuroMem. Lyon, 13-14 Septembre 2005

Porte Y., Buhot M.C., Mons N. CREB : marqueur de la mémoire spatiale à long terme.

Journée de l’IFR 8. Bordeaux, 14 Mars 2008

� Communications affichées :

Porte Y., Buhot M.C., Mons N. The reference and working memory versions of the water

maze task induce differential patterns of activation of CREB in mouse hippocampal and

prefrontal regions. Colloque IPSEN Memories: molecules and circuits. Paris, 8 Avril 2006.

Porte Y., Trifilieff P., Buhot M.C., Mons N. The reference and working memory versions of

the water maze task induce differential patterns of activation of CREB in mouse hippocampal

and prefrontal regions. Colloque GDR NeuroMem 2006. Talence, 27-28 Septembre 2006.

Porte Y., Buhot M.C., Mons N. Spatial reference and working memory tasks induce region-

specific patterns of cAMP Response Element Binding protein in mice. 8ème

colloque de la

Société des Neurosciences Française. Poster J25. Montpellier, 22-25 Mai 2007.

Porte Y., Buhot M.C., Mons N. Spatial reference and working memory tasks induce region-

specific patterns of cAMP Response Element Binding protein in mice. 2nd

France-Israel

Neuroscience Binational Conference. Bordeaux, 2-4 Juillet 2007.

6

7

Som m aireSom m aireSom m aireSom m aire

8

9

A bréviations 13

L iste des illustrations 15

P réam bule 17

Introduction générale 21

I : La mémoire : une entité multimodale 23

I.A : De la classification des systèmes de mémoires 23

I.A.1 : Le cas du patient H. M. : un pas vers l’étude systémique 23

I.A.2 : Une classification possible : présentation du modèle de L. Squire 25

I.A.3 : Notions d’interactions entre les systèmes de mémoire 26

I.B : Le système hippocampique : théories relatives à la mémoire déclarative 27

I.B.1 : Les théories unitaires de la mémoire déclarative 27

I.B.2 : Limites de la thèse unitaire : le modèle Serial Parallel Independent (SPI) de

Tulving comme alternative 28

I.C : De l’Homme à l’animal : tentatives de modélisation du système hippocampique déclaratif 30

I.D : Données neuroanatomiques : l’hippocampe, structure limbique mais centrale 32

I.D.1 : Situation et cytoarchitecture de l’hippocampe 32

I.D.2 : Les connexions intrahippocampiques : le circuit trisynaptique 33

I.D.3 : Les connexions extrinsèques de l’hippocampe 33

II : Comment une nouvelle trace mnésique initialement fragile est-elle stabilisée pour perdurer dans le temps ? 35

II.A : Définition des phénomènes de consolidation 35

II.B : Consolidation systémique et changement de support de la trace mnésique : hypothèse classique vs théorie des traces multiples 37

II.C : Modèles de la consolidation cellulaire 39

II.C.1 : La synapse de Hebb 39

10

II.C.2 : Mécanismes transcriptionnels liés à la potentialisation à long terme

(PLT) de l’activité synaptique 40

II.C.3 : Le modèle génétique de la Drosophile 42

II.C.4 : La mémoire chez l’Aplysie 43

II.D : Arguments impliquant les différentes Ser/Thr-kinases et Phosphatases dans la consolidation des mémoires dépendantes de l’hippocampe chez les vertébrés 44

II.E : Activation du facteur de transcription CREB et synthèse protéique 47

II.F : Mécanismes moléculaires et cellulaires des déficits mnésiques associés au vieillissement 50

III : Flexibilité et fragilité d’une trace consolidée 53

III.A : Mise en évidence et théorie de la reconsolidation 53

III.B : Formation d’une nouvelle trace inhibitrice au cours de l’extinction d’un comportement 55

III.B.1 : Aspects neuropsychologiques de l’extinction 55

III.B.2 : Mécanismes moléculaires et cellulaires de l’extinction 56

Objectifs généraux des travaux de thèse 58

M atériels et M éthodes 61

I : Animaux et procédures comportementales 63

I.A : Choix des lignées de souris 63

I.B : La piscine de Morris : un dispositif comportemental idéal pour étudier les aptitudes spatiales chez la souris 63

I.C : Procédure générale d’entraînement en piscine de Morris 65

I.D : Définition des différents protocoles utilisés 65

I.E : Paramètres comportementaux 67

II : Immuno-histochimie et Western-blotting 68

II.A : Procédures de marquage immunohistochimique 68

II.B : Western-blotts 70

11

Chapitre 1 : A ctivité cérébrale consécutive à un apprentissage en m ém oire spatiale de référence dans la piscine de M orris. 73 I : Introduction 75

II : Méthodologie 76

III : Principaux résultats et conclusions 76

Article 1 : Spatial memory in the Morris water maze and activation of cyclic AMP response element binding (CREB) protein within the mouse hippocampus. Porte Y., Buhot M.C., Mons N.E. 79

Chapitre 2 : A ltération des patrons d’activation de CR E B et déficits de m ém oire spatiale dus au vieillissem ent norm al. 91

I : Introduction 93



Article 2 : Alteration of CREB phosphorylation and spatial memory deficits in aged 129T2/Sv mice. Porte Y., Buhot M. C., Mons N. 97

Chapitre 3 : E ffet de l’extinction de la m ém oire spatiale à long term e en piscine de M orris sur les patrons d’activation de CR E B 111

I : Introduction 113



12

Article 3 : Distinct patterns of CREB phosphorylation after spatial memory and extinction learning in mouse hippocampus. Porte Y., Trifilieff P., Buhot M.C., Mons N. 119

D iscussion générale 153

1- Patron biphasique d’activité transcriptionnelle CREB dépendante, signalisation moléculaire et consolidation mnésique 155

i) Phase précoce de consolidation cellulaire 156

ii) Phase tardive de consolidation cellulaire 157

2- Origines possibles du patron biphasique 158

3- Altérations de la cinétique d’activation de la transcription et stabilité de la trace mnésique 160

4- Le patron d’activation de CREB varie en fonction de la structure étudiée : un pas vers l’étude systémique ? 162

5- Etude des régions cérébrales impliquées dans la navigation spatiale en piscine de Morris et leurs interactions à travers l’activité du facteur CREB 163

Conclusion et perspectives 166

R éférences bibliographiques 169

Résumé-Abstract 195

13

A bréviationsA bréviationsA bréviationsA bréviations

AC : adénylate cyclase

AMPc : adénosine monophosphate cyclique

ATF : Activating Transcription Factor

BDNF : Brain Derived Neurotrophic Factor

BSA : Bovin Serum Albumin

C/EBP : CCAAT Enhancer Binding Protein

CA1-2-3 : champs ammoniques 1-2-3

Ca2+

: calcium

CaM : calcium calmoduline

CBP : CREB Binding Protein

CRE : cAMP Responsive Element

CREB / pCREB : cAMP Responsive Element Binding protein / phospho-CREB

DAG : diacyl glycérol

DLT : dépression à long terme

ERK : Extracellular signal Regulated protein Kinase

GABA : acide-gamma-amino-butyrique

HPC : hippocampe

IEG : Immediate Early Gene

Ig : immunoglobuline

JNK : c-Jun terminal protein Kinase

LA : noyau latéral de l’amygdale

MEK : MAPK Kinase

MPMS : Multiple Parallel Memory Systems theory

NMDA : N-méthyl-D-aspartate

PB / TB / TBS : tampons phosphate, tris et tris salin

PFA : paraformaldéhyde

PFC / CPF : prefrontal cortex / cortex préfrontal

PI3 Kinase : Inositol triphosphate Kinase

PK - PP : protéines kinases - protéines phosphatases

PLT : potentialisation à long terme

Q : quadrant

R : récepteur

RE : réticulum endoplasmique

SC / SI : stimulus conditionné / stimulus inconditionnel

SDS-PAGE : sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (gel d'électrophorèse

en conditions dénaturantes)

Ser : sérine

SPI : Serial Parallel Independant

STR : striatum dorsal

Thr : thréonine

Tyr : tyrosine

VGCC : Voltage Gated Calcium Chanel

14

15

L iste des illustrations

Introduction Générale : Figure 1 : Classification dichotomique des systèmes de mémoire (d’après Squire).

Figure 2 : Modèle théorique de l’organisation structurelle et fonctionnelle des systèmes de

mémoires selon Tulving : le modèle Serial Parallel Independant.

Figure 3 : Connexions intra-hippocampiques du circuit tri-synaptique (scéma d’une coupe

para-sagittale).

Figure 4 : Deux types de consolidation définis par leur cinétique et leur niveau architectural.

Figure 5 : Modèle standard de la consolidation systémique.

Figure 6 : La théorie des traces multiples comme alternative à la théorie standard de la

consolidation.

Figure 7 : Induction expérimentale de la PLT sur une tranche d’hippocampe.

Figure 8 : Schéma simplifié des interactions entre les kinases impliquées dans la

consolidation cellulaire.

Matériels et Méthodes Généraux : Figure 9 : La piscine de Morris : un dispositif idéal pour étudier la mémoire spatiale chez le

rongeur.

Figure 10 : Description des différents protocoles comportementaux développés afin d’étudier

la formation, la consolidation et l’extinction de la mémoire spatiale à long terme dans la

piscine de Morris.

Figure 11 : Immuno-histochimie sur coupes flottantes.

Chapitre 1 : Figure 1: Schematic representation of the experimental procedure used in this study.

Figure 2: Acquisition and retention of the spatial reference memory task.

Figure 3: Differential learning-related changes in pCREB-ir during acquisition of the spatial

reference memory task across four brain structures.

Figure 4: Differential patterns of CREB phosphorylation within hippocampal CA1 and CA3

areas.

Figure 5: Extended training triggers sustained CREB phosphorylation and Zif268 up-

regulation in the hippocampus.

Figure 6: Region-specific patterns of CREB phosphorylation associated with spatial training

in the Ref-4T task.

Figure 7: Relationships between early patterns of CA1 CREB phosphorylation and

behavioral performance.

Chapitre 2 : Figure 1: Acquisition of spatial reference memory task.

Figure 2: Effects of age on spatial memory retrieval.

Figure 3: Effects of age on pCREB immunoreactive nuclei in the dorsal hippocampus.

Figure 4: Representative photomicrographs illustrating changes in pCREB immunoreactivity

in the hippocampal CA1 as a function of training and age.

Figure 5: Effects of aging on pCREB immunoreactive nuclei in the amygdale, striatum and

prelimbic cortex.

16

Figure 6: Effects of aging on t-CREB immunoreactivity in the CA1 region.

Figure 7: Effects of age on c-Fos immunoreactive nuclei after spatial training on Day 3.

Figure 8: Relashionships between learning index scores and mean number of pCREB

immunoreactive nuclei in CA1 region of individual young and aged mice.

Chapitre 3 : Figure 1: Experimental design.

Figure 2: Behavioural results.

Figure 3: Early levels of CREB phosphorylation after day 9.

Figure 4: Distinct patterns of pCREB following RM task and spatial extinction.

Figure 5: Western blots confirmed the early lack of activation of CREB in the hippocampus

of Random-PF group.

Figure 6: pCREB hippocampal levels of Random-PF mice were related to individual

performance.

P réam bule

17

Préam bulePréam bulePréam bulePréam bule

P réam bule

18

P réam bule

19

Les Neurosciences Cognitives désignent le domaine de recherche dans lequel sont

étudiés les mécanismes neurobiologiques qui sous-tendent la cognition (perception, motricité,

langage, mémoire...). C'est une branche des sciences cognitives qui fait appel pour une large

part aux neurosciences, à la neuropsychologie, à la psychologie cognitive, à l'imagerie

cérébrale ainsi qu'à la modélisation. Parmi les grands thèmes étudiés par ce domaine

pluridisciplinaire de recherche, la mémoire se trouve au carrefour de l’ensemble des

opérations cognitives décrites chez l’animal. Pascal disait d’ailleurs qu’elle « est nécessaire à

toutes les opérations de l'esprit ».

La mémoire représente en effet l'une des fonctions biologiques supérieures les plus

importantes. Chez l’Homme comme chez la plupart des animaux, elle régit l’ensemble des

comportements dans le sens où elle permet d’adapter ces derniers aux problèmes rencontrés

dans le quotidien de la vie. C’est parce que je me souviens avoir vécu un moment désagréable

à la fête foraine que je ne m’engage plus dans les attractions à sensations fortes. Ou encore,

c’est parce que je sais que la consommation de tabac nuit à la santé que j’ai décidé d’arrêter

de fumer après avoir soutenu ma thèse.

Lorsqu’une personne s’interroge naïvement sur la façon dont notre cerveau peut

emmagasiner et restituer des informations, très vite la question de la sélection pertinente de

ces informations se pose. Un point essentiel attenant à la compréhension du phénomène

mnésique est donc celui du tri des objets de mémoire. La définition de la mémoire ne peut

alors se faire qu’en prenant en compte un certain nombre de nuances neuropsychologiques

quant à l’infinie diversité des objets dont elle permet le stockage. Ces distinctions laissent à

penser que la mémoire ne saurait être considérée comme une entité unitaire et qu’il existe non

pas « une » mémoire mais « des » mémoires classifiables pour le moins en fonction du type

d’information à retenir.

Avant de développer notre propos, il nous faut définir de façon simplifiée ce que nous

entendons lorsque nous parlons de mémoire. De façon générale, la mémoire est une fonction

cognitive permettant d’enregistrer des informations et de s’en servir dans deux perspectives

temporelles : soit pour se rappeler (mémoire orientée vers le passé) soit pour construire et

faire des projets (mémoire orientée vers l’avenir). Le processus de mémorisation peut alors

classiquement se diviser en trois phases :

(1) l’acquisition (phase d’encodage), durant laquelle les informations sensorielles

(visuelles, auditives, tactiles, odorantes, gustatives) agissent comme un ensemble de stimuli

P réam bule

20

détectés, traités, ordonnés dans le but d’en former une représentation cohérente encodée par le

cerveau.

(2) la rétention des informations (phase de stockage), qui permet de conserver, à plus

ou moins long terme, cette représentation sous forme d’une trace mnésique.

(3) la restitution (phase de rappel) permettant l’utilisation pertinente des informations

mémorisées dans le but d’adapter un comportement à une situation donnée.

Dans le cadre des travaux de thèse exposés dans ce manuscrit, notre intérêt s’est

essentiellement porté sur les mécanismes moléculaires sous-tendant les phases d’encodage et

de rappel de la mémoire spatiale chez la souris. Nous nous sommes tout particulièrement

intéressés à l’activité transcriptionnelle CREB dépendante dans le but notamment de

déterminer par quels mécanismes neurobiologiques peut s’effectuer l’engagement ou non

d’une structure cérébrale dans la résolution d’une tâche donnée.

Introduction générale

21

Introduction généraleIntroduction généraleIntroduction généraleIntroduction générale


22


23

La compréhension des mécanismes neurobiologiques qui régissent l’encodage et la

rétention de la mémoire dans le temps est un enjeu majeur des Neurosciences Cognitives. La

question de savoir comment un ensemble de neurones formant un réseau, peut fonctionner de

façon cohérente afin de constituer une trace mnésique stable fait l’objet d’intenses recherches

tant fondamentales qu’appliquées. Dans ce cadre, nous avons étudié les mécanismes

moléculaires qui sous-tendent la formation, la consolidation et l’extinction de la mémoire

spatiale chez la souris. Au cours de l’introduction, nous aborderons tout d’abord les

différentes théories neuropsychologiques de la mémoire. Dans un second temps, les bases

cellulaires et moléculaires de la consolidation de la mémoire seront détaillées, avant de

s’interroger sur la question de la stabilité de la trace mnésique.

I : La mémoire : une entité multimodale

Les études chez l’Homme et chez l’animal ont conduit à un grand nombre de débats quant

à l’organisation de la mémoire. Il est toutefois communément admis que la mémoire n’est pas

une sorte de super-entité unifiée capable de traiter et de stocker un nombre et une variété

infinis de données. Elle constitue plutôt un ensemble hétérogène de « modules de stockage »

caractérisés par diverses dissociations en fonction de la durée de rétention, la nature des

informations qu’ils permettent de traiter et les structures cérébrales impliquées dans ce

traitement. Un enjeu critique des Neurosciences comportementales a été de classifier ces

modalités, connues sous le nom de systèmes, dans le but de décrire précisément leur

fonctionnement en tant que modules unitaires, mais aussi et surtout en tant qu’éléments en

constante interaction pour le fonctionnement adapté d’un ensemble de fonctions.

I.A : De la classification des systèmes de mémoires

I.A.1 : Le cas du patient H. M. : un pas vers l’étude systémique

On ne peut parler de l’existence de systèmes de mémoire sans évoquer le cas du

patient H. M. dont l’épilepsie temporale fut traitée par ablation bilatérale d’une partie des

lobes temporaux médians (dont hippocampectomie totale). L’étude de ce cas (Scoville et

Milner, 1957) fut à l’origine d’un grand nombre de débats concernant le caractère spécifique


24

des troubles mnésiques post-lésionnels. Suite à son opération, H. M. développa une amnésie

antérograde totale l’empêchant de former de nouveaux souvenirs à long terme. Pourtant, il

conservait le souvenir d’événements passés très antérieurs à l’acte chirurgical (gradient

d’amnésie rétrograde d’une durée d’environ onze ans) ainsi que certaines aptitudes visuo-

motrices lui permettant d’apprendre de nouveaux gestes sans même se souvenir les avoir

appris (Gabrieli et al., 1993). Ce cas clinique mit donc en évidence deux points essentiels

relativement à l’organisation de la mémoire chez l’Homme :

(1) l’hippocampe, indispensable à la formation de nouveaux souvenirs, n’intervient

plus dans le rappel de souvenirs très anciens (rôle temporaire dans le stockage des

informations).

(2) il existe des systèmes de mémoire qui ne reposent pas sur l’intégrité des mêmes

structures anatomiques (l’ablation de l’hippocampe induit une amnésie antérograde pour une

mémoire « consciente », mais pas pour les aptitudes motrices « inconscientes »). Il est apparu

dès lors indispensable, sur la base de cette étude et d’autres cas cliniques, de classifier ces

systèmes et de comprendre leur fonctionnement dans une perspective d’interactivité.

I.A.2 : Une classification possible : présentation du modèle de L. Squire

Depuis des décennies, les scientifiques s’attachent à classifier les différents types de

mémoires, en se fondant sur des dichotomies variées (Shallice, 1979 ; Sherry et Schacter,

1987 ; Baddeley, 1988 ; Tulving, 1995 ; Squire, 2004). Aujourd’hui encore, aucune

classification ne fait l’unanimité. Pourtant, s’il est une idée sur laquelle chacun s’accorde,

c’est celle de la nécessité de mettre en place un système de classification simple auquel se

référer à tout instant pour faciliter la lisibilité des études sur la mémoire.

Dès 1992, et sur la base de nombreuses observations chez l’Homme comme chez

l’animal, Larry Squire propose un modèle dichotomique qui, s’il ne fait pas consensus, est

pour le moins largement utilisé comme référence en Neurosciences (Squire, 1992 ; Squire et

Knowlton, 1996). Il reprend l’idée qu’à une opération mentale X peut être associée une

structure cérébrale clé (ou un réseau de structures) Y dépositaire de la fonction X, l’ensemble

XY formant un « système » cognitif (système mnésique dans notre cas). La mémoire à long

terme est divisée en deux systèmes majeurs. La mémoire déclarative (explicite) est une

mémoire accessible à la conscience. Elle dépend essentiellement de l’intégrité du lobe

temporal médian et regroupe la mémoire sémantique (des faits publics) et la mémoire


25

épisodique (autobiographique). La mémoire non déclarative (implicite) représente quant à

elle un système très hétérogène qui regroupe un grand nombre d’apprentissages

« inconscients », sous-tendus par diverses opérations cognitives très différentes dont le seul

point commun est qu’elles ne dépendent pas de l’hippocampe (Figure 1).

Mémoire à long terme

Mémoire déclarative

(explicite)

Mémoire non déclarative

(implicite)

Episodique Sémantique

Lobe Temporal Médian

Diencéphale

Procédures

(aptitudes et

habitudes)

AmorçageConditionnement

classique

Apprentissages

non associatifs

Réponse

émotionnelle

Muscles

squelettiques

Striatum Néocortex Amygdale Cervelet Voies des

réflexes



(explicite)


(implicite)



Diencéphale

Procédures

(aptitudes et

habitudes)


classique

Apprentissages

non associatifs

Réponse

émotionnelle

Muscles

squelettiques


réflexes



(explicite)


(implicite)



Diencéphale

Procédures

(aptitudes et

habitudes)


classique

Apprentissages

non associatifs

Réponse

émotionnelle

Muscles

squelettiques


réflexes

Figure 1 : Classification dichotomique des systèmes de mémoire, d’après Squire et al., 2004 (Squire, 2004).

Cette classification hippocampo-centrée tente de rapprocher les domaines physiologiques et neuro-

psychologiques en associant à chaque type d’opération une structure cérébrale impliquée dans l’encodage de

l’information en question.

La majorité des critiques opposées au schéma de Squire tient en deux points :

(1) en accordant une grande importance au substrat neurobiologique des opérations

mentales considérées, Squire centre beaucoup son modèle sur une dépendance au

lobe temporal médian.

(2) très peu d’éléments sont donnés vis-à-vis des interactions possibles entre les

différents systèmes.

Cependant, cette classification, qui repose principalement sur les caractéristiques

psychologiques des informations à stocker et sur les structures dont l’intégrité est nécessaire

lors de l’encodage de ces informations, présente l’avantage de rapprocher des données

biologiques et neuropsychologiques et d’être assez souple. C’est d’ailleurs pour ces raisons

qu’elle reste actuellement l’une des références les plus citées.


26

I.A.3 : Notions d’interactions entre les systèmes de mémoire

L’existence de plusieurs systèmes de mémoire distincts a largement été mise en

évidence par un grand nombre d’études montrant une perte sélective d’aptitudes suite à des

lésions cérébrales locales. Cependant, s’il y a bien plusieurs systèmes de traitement des

informations, alors ceux-ci doivent pouvoir « communiquer » afin de fonctionner de manière

cohérente dans le but d’induire un comportement adapté à une situation donnée. Ces relations

ont été évoquées par un certain nombre d’auteurs (Jaffard et Meunier, 1993 ; White et

McDonald, 2002 ; Poldrack et Packard, 2003). Elles sont de trois types en fonction des effets

qu’induit la perturbation (pharmacologique ou lésionnelle) du fonctionnement d’un système

sur les capacités d’acquisition sous-tendues par un autre système (Kim et Baxter, 2001).

Lorsque deux systèmes X et Y sont indépendants, la lésion de X annihile les capacités

cognitives sous-tendues par cette structure mais n’a aucun effet sur celles de Y et inversement

(c’est la double dissociation classiquement décrite en psychologie expérimentale, voir Olton,

1991). De façon plus intéressante, lorsque X et Y interagissent en synergie lors d’un

apprentissage, alors celui-ci sera partiellement perturbé par la lésion de l’un ou l’autre des

deux systèmes. Par exemple, chez le rat, la lésion du striatum médian tout comme celle de

l’hippocampe, perturbe l’acquisition d’un apprentissage spatial en piscine de Morris (Morris

et al., 1982 ; Whishaw et al., 1987 ; Devan et al., 1999). Enfin, lorsque deux systèmes

interagissent par compétition, l’inactivation des fonctions de l’un facilite l’encodage par

l’autre. Des lésions hippocampiques peuvent par exemple faciliter l’acquisition de certains

apprentissages par ailleurs sévèrement perturbés par des lésions du système striatal ou

amygdalien (McDonald et White, 1993 ; White et McDonald, 1993).

Selon Kim et Baxter, c’est la situation même dans laquelle se trouve l’individu qui

induit directement les interactions entre les systèmes, dont résulte une sortie comportementale

adaptée. Dans leur modèle, White et McDonald reconnaissent essentiellement l’existence de

trois systèmes définis par le type d’associations qu’ils effectuent : le système hippocampique

gérant les associations stimulus-stimulus, le système striatal encodant sur un mode stimulus-

réponse et le système amygdalien associant un stimulus à un renforcement. Selon la théorie

MPMS (Multiple Parallel Memory Systems) ces trois systèmes (et éventuellement d’autres

non décrits) sont activés en même temps au départ pour permettre l’encodage des items selon


27

les trois modes d’association. La sélection du système prépondérant dans la réponse se fait a

posteriori par évaluation de la pertinence du type d’association (White et McDonald, 2002).

L’un des points forts de l’ensemble de ces hypothèses est qu’elles sont appuyées par

une connectivité anatomique effective liant les trois systèmes principaux (hippocampe,

amygdale et striatum).

I.B : Le système hippocampique : théories relatives à la mémoire

déclarative.

Si l’on revient à la taxonomie de Squire, la mémoire déclarative peut être divisée en

deux sous-systèmes que sont la mémoire épisodique et la mémoire sémantique. L’une des

particularités de ces deux systèmes repose sur le fait que l’acquisition initiale des

informations épisodiques et sémantiques semble toujours requérir l’intégrité du lobe temporal

médian. Ceci laisse sous-entendre que ces deux versants de la mémoire déclarative sont

intimement liés. Ils sont d’ailleurs clairement reliés par un trait sur le schéma de Squire. C’est

cette relation étroite que nous allons tenter d’analyser dans un premier temps.

I.B.1 : Les théories unitaires de la mémoire déclarative

La mémoire déclarative, et particulièrement son versant épisodique, semble être par

définition le propre de l’Homme, puisqu’il est le seul à pouvoir verbaliser les épisodes dont il

fait l’expérience. L’un des buts principaux des neurosciences cognitives est la modélisation de

la mémoire déclarative chez l’animal. La question de savoir jusqu’à quel point les mémoires

épisodique et sémantique dépendent l’une de l’autre représente alors un intérêt majeur de

notre domaine de recherche. Dans ce cadre, la théorie unitaire du système déclaratif (Squire et

Knowlton, 1996) articule son argumentaire autour d’une très forte inter-dépendance du

sémantique vis-à vis de l’épisodique. Cette théorie se base sur un grand nombre de données

cliniques et part de la différence fondamentale qui existe entre les deux types de mémoire

déclarative : alors que la mémoire épisodique est assortie d’un contexte où l’événement

remémoré peut être précisément situé dans le temps et dans l’espace, les informations

contenues dans la mémoire sémantique sont par essence dénuées de tout contexte puisque

vraies quel que soit le contexte d’apprentissage. Selon Squire, un lien temporel/sériel unit ces


28

deux formes de mémoire. Toutes les informations sont dans un premier temps traitées sur un

mode épisodique. Par la suite, la répétition d’épisodes similaires voire identiques conduirait à

l’extraction des éléments congruents dans chaque situation (décontextualisation) et c’est ainsi

qu’à partir d’un ensemble d’informations épisodiques se formeraient les connaissances

générales du monde extérieur dites sémantiques. Le « vécu » devient donc un « savoir »

(Moscovitch et al., 2005 ; Moscovitch et al., 2006).

Cette idée d’unité est en partie reprise par Eichenbaum qui, à travers sa théorie de la

« mémoire relationnelle », redéfinit la mémoire déclarative dans une perspective qualitative

dans l’espoir d’en modéliser les caractéristiques opérationnelles chez l’animal de laboratoire.

Brièvement, il postule que chaque épisode de la vie est, au moment de son encodage, intégré

dans un réseau relationnel et comparé pour chacune des caractéristiques qui le compose, aux

épisodes antérieurs de l’individu. De manière schématique, chaque nœud du réseau ainsi

formé est une information valable pour plusieurs épisodes. Par extension, un nœud qui se

trouve à la croisée d’une multitude d’épisodes, finit par représenter une information toujours

vraie et donc sémantique (Eichenbaum, 2004). Cette théorie relationnelle permet de rendre

compte d’une grande flexibilité d’utilisation des informations déclaratives, caractéristique

essentielle de la formation hippocampique tant chez l’Homme que chez l’animal (Eichenbaum

et al., 1988 ; Eichenbaum et al., 1989 ; Eichenbaum et al., 1990 ; Compton et al., 1997 ;

Marighetto et al., 1999 ; Xavier et al., 1999 ; Van Elzakker et al., 2003). De plus, et nous y

reviendrons plus loin, la théorie de la mémoire relationnelle atteint son objectif principal en

permettant une application directe à l’animal. Celui-ci peut en effet aisément être interrogé sur

sa capacité à mettre en relation et contraster des items tels que des indices environnementaux

et une récompense (pastille alimentaire ou plate-forme d’échappement) grâce à des tests

comportementaux dans des paradigmes tels que le labyrinthe radiaire ou la piscine de Morris.

I.B.2 : Limites de la thèse unitaire : le modèle Serial Parallel Independent (SPI)

de Tulving comme alternative

Les théories unitaires supposent un traitement sériel des informations d’abord

épisodique puis sémantique. Une telle hypothèse implique que l’élaboration de nouvelles

connaissances sémantiques est impossible si la mémoire épisodique est altérée. Pourtant,

Vargha-Khadem et al. (1977) rapportent l’existence de trois cas dans lesquels de jeunes

patients précocement cérébro-lésés présentent de lourds déficits en mémoire épisodique sans


29

altération de la mémoire sémantique. Dans le même ordre d’idée, Tulving évoque à maintes

reprises le cas d’un patient, K.C., dont le lobe temporal médian est lésé et qui, bien que

présentant une amnésie antérograde majeure pour les deux versants de la mémoire déclarative,

a développé une nette asymétrie rétrograde dans laquelle la mémoire épisodique est beaucoup

plus touchée que la mémoire sémantique (Tulving et al., 1988 ; Tulving et al., 1991 ;

Rosenbaum et al., 2005). Ces données, associées à plusieurs autres études allant dans le même

sens, donnent lieu à deux remarques :

(1) le schéma sériel dans lequel les informations sémantiques sont acquises après

traitement épisodique est erroné : soit les deux systèmes fonctionnent sur un encodage en

parallèle, soit les informations déclaratives sont d’abord traitées sous un format sémantique

puis épisodique.

(2) une telle asymétrie entre épisodique et sémantique n’est possible que si les

supports anatomiques de ces deux systèmes ne coïncident pas exactement.

Figure 2 : Modèle théorique de l’organisation structurelle et fonctionnelle des systèmes de mémoires selon Tulving : le modèle Serial Parallel Independant.

Tulving propose alors un modèle structural de la mémoire (SPI : Serial Parallel

Independant, Fig. 2) dans lequel il décrit cinq systèmes bien distincts organisés de façon

hiérarchique, à la fois en termes d'origine phylogénétique et de prépondérance au sein du

système cognitif (Tulving, 1995). Dans ce modèle, quel que soit le système mnésique

considéré, l’encodage des informations est effectué de façon sérielle, item par item, dans un

système après l’autre, ce qui aboutit à un stockage en parallèle où les mêmes informations

peuvent être contenues dans plusieurs stocks différents. La récupération des items se ferait

Mémoire procédurale

Système de représentations perceptives

Mémoire sémantique

Régions parahippocampiques

Mémoire primaire

Mémoire épisodique

Hippocampe

Enco

dage

en sé

rie

Stockage en parallèle

Récupération

indépendante

Mémoire procédurale

Système de représentations perceptives

Mémoire sémantique

Régions parahippocampiques

Mémoire primaire

Mémoire épisodique

Hippocampe

Enco

dage

en sé

rie

Stockage en parallèle

Récupération

indépendante


30

alors dans le système le plus adapté de manière indépendante des autres systèmes. Pour ce qui

est de la mémoire déclarative, ce modèle postule qu’au moment de l’encodage le système

sémantique, dépendant des régions parahippocampiques, interviendrait antérieurement au

système épisodique, dépendant de l’hippocampe. Cette théorie permet ainsi d’expliquer les

cas d’amnésie rétrograde asymétrique.

Comme nous l’évoquions précédemment, les grandes théories de la mémoire

déclarative reposent essentiellement sur des données cliniques obtenues chez l’Homme et

sont, par définition, difficilement applicables à l’animal. De nombreux auteurs notent par

exemple que la mémoire épisodique, qui suppose un véritable « voyage spatio-temporel

mental » (Wheeler et al., 1997), ne peut exister chez l’animal qui ne possède pas de

conscience auto-noétique, i.e. conscience de l’objet de mémoire et du sujet propre en tant

qu’il perçoit cet objet comme faisant partie de son histoire (Roberts, 2002 ; Tulving, 2002 ;

Suddendorf et Busby, 2003).

I.C : De l’Homme à l’animal : tentatives de modélisation du système

hippocampique déclaratif

Dans le cadre de la modélisation du système déclaratif, de nombreux tests

comportementaux ont été mis au point. Dans l’équipe, un travail important a été fait en ce

sens par A. Marighetto et R. Jaffard en appliquant la théorie relationnelle d’Eichenbaum au

labyrinthe radiaire (Marighetto et al., 1993 ; Marighetto et al., 1999 ; Jaffard et al., 2000).

Deux protocoles ont notamment été développés afin d’évaluer de façon sélective chez la

souris les processus qui sous–tendent la mémoire relationnelle et ses dysfonctionnements au

cours du vieillissement. Dans le premier, les animaux doivent d’abord apprendre des

informations spatiales de façon séparées (présentation successive de six bras dont trois sont

toujours appâtés et trois jamais) puis sont interrogés sur leur capacité à former une

représentation globale de la situation en présentant les bras par paires composées d’un bras

appâté et un non appâté. Le second protocole consiste à apprendre la valence des bras aux

souris en leurs présentant par paires invariantes puis à tester la flexibilité de la représentation

mentale acquise en testant les sujets à l’aide de paires recombinées. Or, l’habilité à comparer

et contraster des données en mémoire et à supporter une utilisation inférentielle de ces

données dans une situation nouvelle (flexibilité) sont bien les composantes psychologiques


31

clés de la mémoire déclarative telles que décrites par Eichenbaum et les défenseurs de la

théorie relationnelle.

Différentes tentatives ont par ailleurs été effectuées pour mettre en évidence et

dissocier les deux composantes de la mémoire déclarative humaine chez l’animal. Afin de

modéliser le plus fascinant des versants déclaratifs, la mémoire épisodique, plusieurs études

l’ont redéfinie en la réduisant à ses caractéristiques les plus basiques, les auteurs parlant alors

de mémoire « episodic-like » (Morris, 2001). Ainsi, l’étude de la mémoire épisodique chez

l’animal tente de tester la capacité de certaines espèces à manipuler le « quoi » ?, le « où ? » et

le « quand ? » d’un épisode récemment vécu. Les travaux les plus cités dans ce domaine sont

ceux de l’équipe de Clayton et al. concernant le comportement de cache de la nourriture chez

le geai, qui semble empreint de l’intégration de ces trois éléments (Clayton et Dickinson,

1998 ; Griffiths et al., 1999 ; Clayton et al., 2003). Cette étude montre avec brio la capacité

des geais à manifester un comportement flexible à partir de plusieurs données qualitatives,

spatiales et temporelles mises en mémoire. Récemment, le même type d’expérience fut adapté

chez le rat qui semble capable, dans un labyrinthe radiaire, de manipuler le « quoi » ? et le

« où » ? mais pas le « quand » ? de l’épisode mémorisé (Bird et al., 2003).

Pour simplifier l’étude de la mémoire déclarative, elle peut être appréhendée plus

généralement en s’interrogeant sur le rôle de la structure majoritairement dépositaire de ce

système chez l’Homme. La découverte chez le rat des cellules de lieu hippocampiques

(O'Keefe et Dostrovsky, 1971) permit de formuler, dès 1978, l’hypothèse selon laquelle

l’hippocampe serait nécessaire à l’encodage et au stockage des informations spatiales sous

une forme proche de celle d’une carte (carte cognitive spatiale) (O'Keefe et Nadel, 1978).

Bien que les amnésies temporales chez l’Homme ne se cantonnent pas aux aspects spatiaux

des épisodes, si l’on considère la théorie des cartes spatiales de façon conjointe avec les

théories de mémoire relationnelle et episodic-like, il apparaît raisonnable d’étudier plus

largement la mémoire déclarative, à l’aide de protocoles expérimentaux visant à vérifier la

capacité des animaux à comparer et contraster des items dans un cadre spatial invariant. Dans

ces conditions, l’étude de la mémoire spatiale chez le rongeur, dans un dispositif tel que la

piscine de Morris, qui associe une récompense (la plate-forme refuge = « quoi » ?) à un

emplacement au sein d’un environnement (« où » ?), représente un bon modèle d’étude du

système hippocampique.


32

I.D : Données neuroanatomiques : l’hippocampe, structure limbique

mais centrale.

Le lobe temporal médian se trouve donc au cœur de la dichotomie « déclaratif vs non

déclaratif ». L’ensemble des travaux qui seront présentés dans ce manuscrit sont à ce titre

largement centrés sur l’hippocampe. Nous proposons ici de décrire les bases neuro-

anatomiques du lobe temporal médian dans la perspective de montrer son fonctionnement

interne ainsi que ses liens avec l’ensemble des structures cérébrales impliquées dans les

phénomènes mnésiques.

I.D.1 : Situation et cytoarchitecture de l’hippocampe.

Le lobe temporal médian est composé d’une structure centrale, la formation

hippocampique, et des cortex parahippocampique et périrhinal, principales structures d’entrée

des informations provenant des aires associatives néocorticales. La formation hippocampique

se compose de trois régions distinctes : le cortex entorhinal, l’hippocampe (Gyrus denté et

Corne d’Ammon) et le subiculum. Nous ne détaillerons ici que l’hippocampe, dont la

situation tridimensionnelle dans le cerveau est complexe. Il apparaît grossièrement comme

une structure oblongue dont l’axe long (dit septotemporal) « s’étend, à la manière d’un C, du

noyau septal basal en rostro-dorsal, par-dessus et devant le diencéphale, jusqu’au lobe

temporal en caudo-ventral» (Amaral et Witter, 1995). Structure sous-corticale du système

limbique, l’hippocampe est donc situé à la croisée des structures néocorticales et

diencéphaliques, lui conférant une position stratégique dans l’intégration des signaux

extérieurs.

D’un point de vue architectonique, le gyrus denté se compose de 3 couches. La couche

moléculaire (essentiellement constituée de prolongements dendritiques et axonaux, et

d’interneurones GABAergiques), la couche granulaire (couche principale, constituée

principalement de cellules granulaires et de neurones GABAergiques contrôlant les sorties du

GD) et la couche polymorphique (ou hilus) de composition cellulaire hétérogène

La corne d’Ammon se subdivise quant à elle en différents champs ammoniques dits

CA3, CA2 et CA1. Son organisation en couches est dans l’ensemble la même pour tous les

champs et comprend une couche principale de cellules pyramidales, juste en-dessous de


33

laquelle se trouve le stratum oriens et au dessus le stratum radiatum où se font les connexions

associationnelles CA3-CA3 (fibres récurrentes) ainsi que les connexions collatérales CA3-

CA1 via les fibres de Schaffer.

I.D.2 : Les connexions intrahippocampiques : le circuit trisynaptique.

Ce circuit fut initialement décrit par Ramon Y. Cajal en 1911 (Ramon Y. Cajal, 1911)

et possède la particularité de n’être composé que de connexions unilatérales (Fig. 3). Les

cellules granulaires du GD reçoivent des entrées du cortex entorhinal et projettent sur les

pyramidales du CA3. Celui-ci projette à son tour sur les cellules principales du CA1 via les

collatérales de Schaffer. En marge de ce système, des connexions locales sont régies par de

nombreux interneurones, auxquelles s’ajoutent des connexions CA3-CA3 via des fibres

récurrentes. Enfin, on notera que le cortex entorhinal projette aussi directement sur le CA3

puis le CA1 qui est le seul à projeter directement en retour sur le cortex entorhinal.

Figure 3 : Connexions intra-

hippocampiques du circuit tri-synaptique (schéma d’une coupe para-sagittale). LEC/MEC : cortex

entorhinal latéral et médial ; DG : gyrus

denté ; PP : voie perforante ; MF : fibres

moussues ; SC : collatérales de

Schaffer ; AC : voie d’association

commissurale ; Sb : subiculum.

I.D.3 : Les connexions extrinsèques de l’hippocampe.

Afférences : l’hippocampe reçoit ses afférences corticales essentiellement via le cortex

entorhinal qui reçoit lui-même des projections des cortex périrhinal, piriforme, insulaire,

préfrontal et rétrosplénial. Les champs CA3 et CA1 reçoivent directement un certain nombre

d’entrées sous-corticales : GABAergiques et cholinergiques provenant du septum,

noradrénergiques du locus coeruleus, sérotoninergiques des noyaux du raphé. De manière

plus spécifique, le CA1 reçoit des afférences thalamiques et amygdaliennes (noyau baso-

latéral).


34

Efférences : la principale sortie de l’hippocampe se trouve être le subiculum qui projette sur

diverses aires corticales tels les cortex rétrosplénial, orbito-frontal, préfrontal médian et

entorhinal. Cependant, le champ CA1 projette aussi directement sur un certain nombre de

structures sous-corticales que sont le noyau septal latéral (en ipsi- et en controlatéral, c’est

aussi le cas du CA3), les noyaux et bulbes olfactifs, le noyau accumbens, l’hypothalamus ou

encore l’amygdale.

En conclusion, la connectivité intrinsèque de l’hippocampe et notamment l’existence de fibres

récurrentes, lui confère la propriété toute particulière de pouvoir maintenir une activité « en

boucle » (réverbérante) dans le temps. De plus, sa position centrale dans le cerveau ainsi que

ses connexions extrinsèques avec des structures telles que l’amygdale, le cortex préfrontal et

le striatum, laissent à penser que l’hippocampe pourrait jouer un rôle important

d’administrateur ou de lien entre les différents systèmes de mémoire déjà décrits.


35

II : Comment une nouvelle trace mnésique initialement fragile est-

elle stabilisée pour perdurer dans le temps ?

La dichotomie entre la mémoire à court terme et la mémoire à long terme est

aujourd’hui universellement reconnue (James, 1890 ; Waugh et Norman, 1965 ; Glanzer et

Cunitz, 1966). Dès les années 1960, des études relataient des cas de lésions cérébrales

induisant des déficits sévères de mémoire à long terme qui laissaient possible la rétention

d’informations à court terme (Drachman et Arbit, 1966 ; Baddeley et Warrington, 1970 ; Cave

et Squire, 1992). Dès lors, le mode d’articulation de ces deux stocks fut au centre de

nombreux débats. L’hypothèse d’un schéma sériel fut rapidement préférée, et dès 1968,

Atkinson et Shiffrin proposent un modèle où les informations passeraient d’un stock à court

terme vers un stock à long terme grâce à une étape de consolidation (Atkinson et Shiffrin,

1968). Une étape majeure de l’évolution des théories concernant les phénomènes mnésiques

fut la mise en évidence de cette phase de consolidation. L’étude des bases neurobiologiques

de ce processus est ainsi devenue l’un des plus excitants domaines de recherche en

Neurosciences.

II.A : Définition des phénomènes de consolidation

Nos souvenirs de la vie quotidienne ne se forment pas instantanément. Une mémoire

récente est progressivement transformée, passant d’un état initial fragile, dit labile (sensible à

l’interruption), à un état plus stable, permanent (insensible à l’interruption). Cette étape est

appelée consolidation. En 1881, Ribot remarquait que les pertes de mémoire consécutives à

une lésion cérébrale étaient toujours dépendantes de l’âge de la mémoire en question (Ribot,

1881/2005). Ce gradient d’amnésie rétrograde, connu sous le nom de « loi de Ribot »,

suppose l’existence d’une réorganisation temporelle de la mémoire au fil du temps, au cours

de laquelle la trace mnésique changerait de « support anatomique ». Cette hypothèse ne fut

reprise et précisée que beaucoup plus tard, en particulier grâce aux travaux de Scoville et

Milner à propos du cas H.M. (cf. section I-A-1). Toutefois, les premiers à adopter le terme de

consolidation furent Müller et Pilzecker, qui notèrent que le souvenir différé d’une

information récemment acquise peut être perturbé par interférence avec un nouvel

apprentissage dans les minutes suivant cette acquisition (Müller et Pilzecker, 1900 ; Lechner


36

et al., 1999). Ceci suggéra qu’à la suite d’une expérience vécue, des événements moléculaires

et cellulaires ont lieu, permettant la consolidation de la trace mnésique.

Si l’on considère conjointement ces deux données historiques, une constatation

frappante vient à l’esprit : alors que Müller et Pilzecker définissent la consolidation sur la

base d’une interruption dans les minutes suivant l’apprentissage, la loi de Ribot repose sur

l’existence d’un gradient d’amnésie rétrograde sur plusieurs jours (voire des années). Afin

d’éviter toute confusion entre ces deux phénomènes, Dudai (Dudai et Morris, 2000 ; Dudai,

2004) distingue une consolidation « systémique » faisant référence à des phénomènes lents

(jours, années) décrits au niveau structural, d’une consolidation dite « cellulaire » (ou

« moleculaire ») faisant référence à des phénomènes plus rapides (dans les heures suivant

l’acquisition) et survenant à l’échelle du neurone (Fig. 4).

Figure 4 : Deux types de consolidation définis par leur cinétique et leur niveau architectural. A gauche, la consolidation

cellulaire, présente une cinétique de l’ordre de

la minute, déterminée par sa sensibilité aux

inhibiteurs de synthèse protéique. A droite, la

consolidation systémique, déterminée par

rappel différé après lésion hippocampique à

différents délais, fait référence à des

événements beaucoup plus lents, de l’ordre de

plusieurs jours (d’après Dudai, 2004)

Dans les paragraphes suivants, nous nous attacherons à décrire ces deux phénomènes

en portant un intérêt tout particulier à la consolidation cellulaire, point central des études

présentées dans cette thèse.

Niv

ea

u d

e c

on

so

lid

ati

on

(%

)

Temps

Minutes Jours

0 0

100 100

0 90 280

Synaptique Systémique

Niv

ea

u d

e c

on

so

lid

ati

on

(%

)

Temps

Minutes Jours

0 0

100 100

0 90 280


Niv

ea

u d

e c

on

so

lid

ati

on

(%

)

Temps

Minutes Jours

0 0

100 100

0 90 280

Niv

ea

u d

e c

on

so

lid

ati

on

(%

)

Temps

Minutes Jours

0 0

100 100

0 90 280



37

II.B : Consolidation systémique et changement de support de la trace

mnésique : hypothèse classique vs théorie des traces multiples

La consolidation systémique est un processus graduel, plus ou moins long (de

quelques jours à plusieurs mois), très conservé dans le règne animal, des insectes (Menzel,

2001 ; Liu et Davis, 2006) à l’Homme. Cependant, la majorité des études menées sur ce

phénomène se centre sur le système déclaratif (hippocampique) chez les mammifères

supérieurs.

La théorie classique (ou standard) de la consolidation systémique (Alvarez et Squire,

1994 ; Squire et Alvarez, 1995) stipule que la représentation de l’événement vécu et rappelé

est initialement supportée par des circuits hippocampo-corticaux activés lors de l’encodage

(Dudai, 2004) mais qu’avec le passage du temps, elle devient dépendante de l’intégrité de

certains cortex cérébraux ayant pris en charge la trace mnésique. En d’autres termes, lors de

l’acquisition d’une information, un certain nombre de réseaux neuronaux corticaux

s’activeraient sous l’égide de l’hippocampe. Au cours de la consolidation, une réorganisation

des réseaux corticaux renforçant leurs inter-connexions rendrait l’activation de ces derniers

indépendante de l’hippocampe lors du rappel (Fig. 5). L’une des propriétés essentielles

décrites par le modèle standard repose sur la rapidité des modifications sous-tendues par les

interactions hippocampo-corticales qui permet la mémorisation d’un événement unique (non

répété).

Figure 5 : Modèle standard de la consolidation systémique. L’hippocampe permet initialement une

intégration rapide des informations sensorielles,

motrices et cognitives d’un épisode, encodées dans

différents circuits corticaux. Avec le temps, les

réactivations successives du réseau HPC-cortex

permettent un renforcement des interconnexions

corticales au détriment des connexions hippocampo-

corticales : la trace mnésique devient indépendante

de l’hippocampe, on dit qu’elle se corticalise

(source : Frankland et Bontempi, 2005).


38

Cette théorie a initialement permis d’expliquer le gradient d’amnésie rétrograde

observé chez les patients atteints de lésions hippocampiques (MacKinnon et Squire, 1989 ;

Squire et Alvarez, 1995) et de nombreuses études lésionnelles chez le primate non humain

(Zola-Morgan et Squire, 1990) ou chez le rongeur (Ramos, 1998 ; Clark et al., 2001 ; pour

revues : Nadel et Bohbot, 2001 ; Moscovitch et al., 2006 ; Squire et Bayley, 2007) sont

venues la soutenir par la suite. De même, de nombreuses études d’imagerie intracérébrale

rendent compte d’un désengagement de l’hippocampe et d’une corticalisation de la trace

mnésique au cours du temps. Par exemple, Maviel et al. (2004) montrent, par imagerie des

gènes précoces Fos et Zif268, qu’une tâche spatiale en labyrinthe radiaire à cinq bras dépend

à court terme de l’activité hippocampique, alors qu’elle engage plutôt l’activité de structures

corticales (préfrontal et cingulaire antérieur) à long terme.

Cependant, la théorie classique, reposant sur une conception structurale de la mémoire

déclarative, ne rend pas compte des dissociations épisodiques/sémantiques observées en

clinique lors de lésions temporales internes (Vargha-Khadem et al., 1997 ; Gadian et al.,

2000). Par ailleurs, s’il explique bien les cas d’amnésie rétrograde avec gradient limité dans le

temps, ce modèle rend difficilement compte des cas pour lesquels le gradient s’étend sur

plusieurs décennies voire toute une vie (Warrington et Duchen, 1992 ; Kartsounis et al., 1995

; Nadel et Moscovitch, 1997 ; Cipolotti et al., 2001).

La théorie des traces multiples (Nadel et al., 2000 ; Nadel et Bohbot, 2001) répond

notamment à ces objections (Fig. 6) en postulant que lors de la consolidation d’informations à

fort caractère contextuel, les interactions hippocampo-corticales ont pour conséquence la

multiplication des traces mnésiques mettant en jeu des neurones hippocampiques.

Figure 6 : La théorie des traces multiples comme alternative à la théorie standard de la consolidation. Alors que la théorie standard

suppose un désengagement total de

l’hippocampe dans le stockage des

informations déclaratives au cours de la

consolidation (A), la théorie des traces

multiples (B) tient compte des dissociations

observées entre mémoires épisodique et

sémantique (gradients d’amnésie rétrograde

plats) (source : Frankland et Bontempi, 2005).

A BA B


39

Lors d’un rappel, la trace serait réactivée et renforcée par multiplication des circuits

hippocampo-corticaux la définissant. Ici, l’hippocampe serait donc, autant que les cortex, une

structure de stockage à long terme, nécessaire au rappel de l’information épisodique. Les

traces hippocampiques procureraient le contexte spatio-temporel de l’information alors que

les traces corticales seraient « libres de tout contexte ». Notons que bien qu’elle permette

d’expliquer les dissociations sémantique/épisodique déjà décrites ainsi que les gradients plats

d’amnésie rétrograde, la théorie des traces multiples présente notamment le défaut de

conduire à une redondance des informations et par là même, à une dépense énergétique

considérablement accrue pour le système nerveux central.

Quoi qu’il en soit, dans la théorie classique comme dans la théorie des traces

multiples, l’hippocampe semble donc jouer un rôle crucial dans des phénomènes de « liage »

et d’ « indexation » des représentations multimodales (contexte spatio-temporel, sensoriel et

émotionnel) d’un événement.

II.C : Modèles de la consolidation cellulaire

La consolidation cellulaire se réfère plus particulièrement aux événements

moléculaires et cellulaires post-apprentissage à l’origine du renforcement du réseau neuronal

sous-tendant la trace mnésique. Grâce au développement des techniques de transgénèse et de

pharmacologie, de grandes avancées ont été effectuées quant à la compréhension de ces

mécanismes. De manière générale, elle implique un ensemble de cascades moléculaires

activant toute une machinerie transcriptionnelle et traductionnelle, nécessaire à l’induction et

à la stabilisation de modifications durables au sein du réseau sous-tendant la trace mnésique

(McGaugh, 1966 ; Davis et Squire, 1984 ; McGaugh, 2000 ; Bozon et al., 2002 ; Izquierdo et

al., 2002 ; Bozon et al., 2003b ; Davis et al., 2003 ; Kelly et al., 2003).

II.C.1 : La synapse de Hebb

Les premières hypothèses concernant la consolidation de la mémoire au niveau

neuronal remontent à la publication d’un livre dans lequel Donald Hebb (Hebb, 1949) tente

d’expliquer le comportement au travers du fonctionnement de l’ensemble du système

nerveux. Dans son hypothèse de la trace duale, Hebb prédit que « la persistance ou la


40

répétition d’une activité réverbérante (ou "trace") tend à induire des changements cellulaires

qui ajoutent à sa stabilité ». A partir de cette hypothèse, il formule un postulat concernant

l’activité synaptique comme garante de la trace mnésique résumé en trois points :

(1) une activité réverbérante et simultanée permettant le maintien d’une

représentation mentale d’un événement dans le temps peut être déclenchée au

sein d’une population neuronale suite à une expérience vécue.

(2) des changements structuraux faisant suite à l’activation récurrente du système

se produisent dans l’une ou l’autre des cellules formant une synapse.

(3) une réduction de la résistance synaptique ou, à l’inverse, une augmentation de

l’efficacité de la synapse sont les fruits des changements structuraux ayant pris

place.

Bien que reformulés et précisés d’un point de vue moléculaire, ces trois points restent vrais

dans notre conception actuelle des modifications d’activité synaptique sous-tendant la

consolidation cellulaire. Ils sont en effet regroupés dans un modèle physiologique dit de

« Potentialisation à Long Terme » (PLT) de l’efficacité synaptique, considéré aujourd’hui

comme un modèle proche des événements qui sous-tendent la consolidation cellulaire.

II.C.2 : Mécanismes transcriptionnels liés à la potentialisation à long terme

(PLT) de l’activité synaptique

La PLT fut décrite pour la première fois dans l’hippocampe par Bliss et Lomo (Bliss et

Lomo, 1973 ; voir Fig. 7) et par la suite, son existence fut vérifiée dans de nombreuses

structures cérébrales impliquées dans les phénomènes de mémorisation (Racine et al., 1983 ;

Voronin, 1984 ; Sakamoto et al., 1987 ; Alonso et al., 1990 ; Chapman et al., 1990 ; Jung et

al., 1990 ; Keller et al., 1990 ; Laroche et al., 1990 ; Uno et Ozawa, 1991) et dans de

nombreuses espèces (des céphalopodes : Shomrat et al., 2008, aux primates non humains :

Urban et al., 1996). De manière générale, la PLT peut être décrite comme une réponse

neuronale d’amplification du potentiel post-synaptique excitateur suite à une stimulation

répétée haute fréquence. Cette amplification du potentiel excitateur confère alors à la cellule

la capacité de répondre, par émission de potentiels d’actions, à des stimulations d’intensités

plus faibles qu’auparavant. La possibilité de potentialiser une réponse neuronale par des

mécanismes de plasticité fut, à l’instar du postulat de Hebb, rapidement rapprochée d’une


41

capacité à stocker des informations (pour revues : Teyler et Discenna, 1984 ; Eccles, 1986 ;

Greenough, 1987 ; Miller et Mayford, 1999 ; Lynch et al., 2007).

Figure 7 : Induction expérimentale de la PLT sur une tranche d’hippocampe. (A) Protocole

expérimental. L’induction s’effectue par

stimulation haute fréquence d’une fibre afférente

(ici pyramidale CA3) et l’enregistrement est

effectué à l’aide d’une micro-électrode placée en

post-synaptique (pyramidales CA1). (B)

L’enregistrement en post-synaptique montre que

le stimulus tétanisant induit une potentialisation

durable de la réponse neuronale (potentiel post-

synaptique excitateur) suite à toute stimulation

sub-séquente de la fibre afférente.

(http://www.mona.uwi.edu/fpas/courses/physiolo

gy/neurophysiology/Learning&Disorders.htm)

La PLT possède trois principales propriétés physiologiques. Tout d'abord la propriété

d'associativité qui indique que les synapses formées sur un neurone post-synaptique par un

ensemble de neurones trop faiblement actifs pour entraîner une potentialisation peuvent

cependant être potentialisées si ces voies nerveuses sont actives dans la même fenêtre

temporelle qu'une autre voie nerveuse convergente stimulée à forte intensité (Levy et

Steward, 1979). Bien qu'assez similaire, la propriété de coopération stipule que, pour observer

une PLT, il est nécessaire d'avoir un nombre minimal de synapses simultanément actives, ce

qui suggère la présence d'un seuil minimal d'intensité pour l'induction (McNaughton, 1978).

Enfin, seules les synapses actives lors de la stimulation à haute fréquence pourront développer

une PLT, c'est la propriété de spécificité (Andersen et al., 1977 ; Lynch et al., 1977).

Dans un neurone, la transduction d’un signal de la membrane au noyau dépend

notamment de l’équilibre entre des protéines Ser/Thr-kinases (phosphorylations) et

phosphatases (déphosphorylations), qui sont activées par divers seconds messagers (AMPc,

Ca2+

, Diacyl Glycérol (DAG)) et en constante interaction. De cet équilibre dépendent

l’activation ou la répression de facteurs de transcription inductibles et donc la synthèse

protéique. De manière générale, dans le cas de la PLT hippocampique, une entrée massive de

Ca2+

dans le neurone post-synaptique suite à l’activation de récepteurs de type NMDA, initie


42

un ensemble de mécanismes de transduction (activation de protéines kinases) conduisant à

l’initiation de la transcription génique et la synthèse de nouvelles protéines. Ces protéines

néoformées permettent alors un remodelage et un renforcement de la synapse en deux temps

(court et long terme). Ces deux temps s’accompagnent de deux phases de

transcription/traduction génique sous le contrôle notamment du facteur de transcription CREB

(cAMP Response Element Binding protein). Ainsi, l’étude de doubles mutants

hypomorphiques pour CREB (α-/β-) (Bourtchuladze et al., 1994) ou exprimant un dominant

négatif KCREB (Pittenger et al., 2002) a montré que ce facteur est nécessaire pour le

maintien à long terme de la PLT. Corroborant ces données, l’induction d’une PLT persistante

in vivo induit deux pics de phosphorylation de CREB (un pic précoce à 30min et un second

pic tardif aux alentours de 2h maintenu jusqu’à 24h) et l’initiation de la transcription des

gènes précoces dans le CA1 et le gyrus dentelé (Bito et al., 1996 ; Deisseroth et al., 1996 ;

Impey et al., 1996 ; Lu et al., 1999 ; Schulz et al., 1999). Ces données sous-entendent la

nécessité d’un patron transcriptionnel précis caractérisé par deux vagues successives

d’activation de la synthèse protéique, la première permettant l’initiation de la potentialisation,

et la seconde sa « consolidation » (maintien à long terme). L’amplitude et la cinétique de

l’activation de ces deux phases repose sur un recrutement différentiel des protéines kinases en

fonction (1) des concentrations intracellulaires en Ca2+

et AMPc ; (2) de leur distribution

dans les compartiments subcellulaires (comme la densité post-synaptique) ; (3) de leur

capacité d’auto-phosphorylation (ex. CaMK II) ; (4) d’une régulation directe par les protéines

phosphatases. A partir de ces constatations, un modèle a été proposé suggérant l’existence

d’un équilibre entre phosphatases et kinases, qui entreraient en balance pour le contrôle de la

force et de la plasticité des synapses (Wang et Kelly, 1996 ; Hedou et Mansuy, 2003).

II.C.3 : Le modèle génétique de la Drosophile

L’étude des mécanismes biologiques sous-tendant la consolidation mnésique fut

initiée par l’observation d’organismes simples. Le fait que les mécanismes de signalisation

cellulaire de base sont très largement conservés des invertébrés aux vertébrés a notamment

fait de la Drosophile un modèle de choix pour la dissection des événements moléculaires

sous-tendant la formation et la rétention de la mémoire. Ce modèle fut alors très largement

utilisé pour la génération de mutants testés dans des paradigmes pavloviens d’évitement

d’odeurs. Dans ce cadre, il a par exemple été montré que la perturbation de gènes codant des


43

protéines de la voie de signalisation adénylate cyclase-AMPc-PKA-CREB, induit un déficit

sélectif de conditionnement (pour revues : Tully, 1996 ; Yin et Tully, 1996 ; Dubnau et Tully,

1998). Les études manipulant cette voie de signalisation, et notamment la surexpression d’un

dominant négatif de CREB (Yin et al., 1994) ou au contraire d’un activateur de l’isoforme

dCREB2 (Yin et al., 1995), conduisirent à la conclusion que l’activation de ce facteur de

transcription représente un switch essentiel dans le passage d’une mémoire à court terme vers

une mémoire à long terme chez les insectes. Cette découverte fut déterminante dans

l’orientation des travaux concernant la mémoire chez les vertébrés.

II.C.4 : La mémoire chez l’Aplysie

Un autre modèle d’étude de la mémoire des plus cités est celui du réflexe de retrait du

siphon chez l’Aplysie, obtenu par stimulation tactile. Ce réflexe peut subir une facilitation

(apprentissage) à court, moyen ou long terme, lorsqu’un stimulus électrique est appliqué au

niveau de la queue de l’animal de manière concomitante à la stimulation tactile. Kandel et al.

rapportèrent tout d’abord que la sensibilisation à court terme nécessite l’activation de

récepteurs sérotoninergiques (Cedar et Schwartz, 1972 ; Glanzman et al., 1989) suivi du

recrutement de la PKA (Schwartz et al., 1971). Une fois activée, celle-ci phosphoryle des

canaux potassiques présynaptiques (Castellucci et al., 1982), ce qui réduit leur courant

spécifique, et permet une entrée plus massive de Ca2+

à chaque potentiel d’action et donc une

plus forte libération de neurotransmetteurs sur le motoneurone (Byrne et Kandel, 1996). Dans

un second temps, le passage d’une mémoire à court terme vers une mémoire à long terme

dépend spécifiquement de la synthèse de nouvelles protéines au sein du neurone sensitif

impliqué dans le réflexe (Castellucci et al., 1989). Ceci permet l’établissement de nouvelles

connexions synaptiques et donc le renforcement durable du réflexe de retrait (Bailey et Chen,

1988a et b ; Kaang et al., 1993 ; Hegde et al., 1997 ; Martin et al., 1997a et b). Cette synthèse

est initiée par l’activation des voies PKA à court et moyen terme puis PKC à plus long terme

(Byrne et Kandel, 1996). La convergence de ces signaux vers l’activation des MAPK qui

transloquent au noyau, permet la phosphorylation du facteur de transcription CREB1 et

l’inhibition de son répresseur CREB2 (Bartsch et al., 1995), ce qui conduit à la transcription

de gènes précoces puis tardifs (Byrne et Kandel, 1996). L’injection d’oligonucléotides CRE

(éléments de réponse du facteur CREB sur l’ADN), directement dans le noyau des neurones

sensoriels, bloque alors sélectivement la facilitation à long terme (Dash et al., 1990).


44

II.D : Arguments impliquant les différentes Ser/Thr-kinases et

Phosphatases dans la consolidation des mémoires dépendantes de

l’hippocampe chez les vertébrés

Une accumulation de données révèle que chez les vertébrés, de la même manière que

chez la Drosophile ou l’Aplysie, la consolidation d’une mémoire à court terme en une

mémoire à long terme requiert des mécanismes de plasticité neuronale dépendants de la

synthèse protéique (McGaugh, 1966 ; Davis et Squire, 1984 ; McGaugh, 2000 ; Guzowski,

2002). Cette synthèse se trouve sous le contrôle des différentes voies de signalisation

impliquant des protéines kinases et phosphatases dépendantes des signaux Ca2+

et AMPc. Les

paragraphes à suivre donnent quelques exemples démontrant l’implication de ces enzymes

dans la formation et la consolidation des mémoires dépendantes de l’hippocampe.

PKA : Au laboratoire, des études ont montré que, selon leur mode de régulation par le Ca2+

,

les adenylate cyclases (qui permettent l’activation de la PKA en augmentant l’AMPc) jouent

un rôle différentiel dans des tâches d’apprentissage spatial (pour revue, Mons et al., 1999 ;

Mons et al., 2004 ; Martel et al., 2006). L’activation de la voie AMPc/PKA dans le CA1 est

nécessaire à la consolidation de la trace mnésique dans différentes tâches hippocampo-

dépendantes, telles que l’apprentissage spatial ou la peur conditionnée au contexte (pour

revue : Abel et Nguyen, 2008). D’un point de vue temporel, la fenêtre d’activation effective

de la PKA dans l’hippocampe semble être de 90min après l’apprentissage dans la

consolidation de mémoires associées à la peur conditionnée (Wallenstein et al., 2002).

Toutefois, l’utilisation d’inhibiteurs de la PKA dans l’hippocampe à des délais précoces

(0min) mais aussi tardifs (3-6h) après l’acquisition perturbe la consolidation de tâches

d’évitement (Bernabeu et al., 1997a ; Bourtchouladze et al., 1998) alors que son activation

directe ou indirecte facilite la rétention à long terme et induit une activation biphasique de

CREB (Bernabeu et al., 1997b).

CaMK II-IV : De nombreuses études ont montré que la phosphorylation de la CaMKII est

nécessaire à la consolidation de la trace mnésique. Chez la souris, la délétion du gène de la

CaMK II (Silva et al., 1992) et les mutations empêchant son adressage au niveau des

dendrites (Miller et al., 2002) induisent des déficits dans des apprentissages spatiaux. Des


45

études ont également montré que la surexpression d’une forme mutée de la CaMK II, active et

insensible aux phosphatases, perturbe les apprentissages dépendants de l’hippocampe (Bach

et al., 1995 ; Mayford et al., 1996) et rend impossible leur rappel à long terme différé à 1

mois (Wang et al., 2003). La CaMK IV, quant à elle, exerce essentiellement son action au

niveau nucléaire en activant directement CREB. L’expression d’un dominant négatif de la

CaMK IV ou la mutation de la CaMK Kinase β (dont la cible principale est la CaMK IV),

induit une diminution d’activation des deux cibles en aval, CREB et c-fos, ainsi qu’un déficit

d’apprentissage spatial et de rappel à long terme, mais pas à court terme, en piscine de Morris

(Kang et al., 2001 ; Peters et al., 2003).

PKC : L’utilisation d’inhibiteurs de la PKC dans la région CA1 a permis de montrer

l’implication de cette kinase dans les phases d’acquisition, de consolidation et/ou de

reconsolidation de la mémoire spatiale (Douma et al., 1998 ; Bonini et al., 2007). Au

contraire, l’injection locale d’un activateur de la PKC améliore les performances spatiales

(Paylor et al., 1991 ; Nogues et al., 1996). Il a été montré que l’activité PKC hippocampique

est corrélée à l’amélioration des performances spatiales en piscine de Morris chez le rat (Olds

et al., 1990 ; Paylor et al., 1992) et la souris (Wehner et al., 1990 ; Fordyce et Wehner, 1993).

D’un point de vue cinétique, un pic précoce d’activité PKC intervient dans l’hippocampe

30min après apprentissage d’une tâche d’évitement (Bernabeu et al., 1995). Des études

récentes ont démontré le rôle majeur joué par la PKMζ, isoforme constitutivement active et

spécifiquement exprimée dans le cerveau (hippocampe et cortex) dans le maintien de la phase

tardive de la PLT (Sacktor et al., 1993 ; Osten et al., 1996), et la persistance de la mémoire à

long terme chez la Drosophile (Drier et al., 2002). De plus, une étude récente montre que la

PKMζ exerce un rétro-contrôle positif sur sa propre activation, ce qui permet le maintien de la

mémoire spatiale à long terme durant au moins un mois chez le rat (Pastalkova et al., 2006).

MAPK : Il est important de noter que les MAP-kinases de type ERK consituent un point de

convergence majeur pour les autres voies de signalisation. De nombreuses études ont

démontré le rôle crucial joué par les ERK1 et 2 dans l’établissement de la PLT dans la région

hippocampique CA1 (Deisseroth et al., 1996 ; English et Sweatt, 1997). L’utilisation d’un

inhibiteur de la kinase MEK bloque la phosphorylation des ERK1/2 et par voie de

conséquence celle des cibles telles que RSK2, Elk-1 (Ahi et al., 2004) ou les histones H3

(Levenson et al., 2004). Par ce type d’approche, de nombreuses études ont montré

l’implication des MAPK/ERK dans la consolidation d’apprentissages hippocampe-


46

dépendants, tels que l’apprentissage en piscine de Morris (Blum et al., 1999 ; Selcher et al.,

1999) et l’apprentissage de peur conditionnée à un contexte (Atkins et al., 1998 ; Schafe et

al., 1999 ; Sananbenesi et al., 2002 ; Revest et al. , 2005 ; Trifilieff et al., 2006 ; Trifilieff et

al., 2007). De façon intéressante, les souris knock-out ERK1 n’ont aucun déficit de la PLT

dans l’hippocampe, ni de déficits de conditionnement à un son ou au contexte (Selcher et al.,

2001), mais présentent une augmentation stimulus-dépendante de ERK2 (Mazucchelli et al.,

2002). Des travaux ont montré que la cinétique d’activation des MAPK/ERK, et en aval de

CREB, dans le CA1 était biphasique (entre 0-1h et 9-12h) lors d’un conditionnement de type

contextuel (hippocampo-dépendant) versus immédiate et transitoire lors d’un

conditionnement de type élémentaire (amygdalo-dépendant) (Trifilieff et al., 2006 ; 2007).

Ainsi, le recrutement différentiel de la voie MAPK/ERK-CREB dans une structure donnée

semble dépendre de la nature de l’information à consolider et du degré d’implication de la

structure considérée dans le réseau qui sous-tend la trace mnésique.

Phosphatases : Les phénomènes de phosphorylation qui entrent en jeu dans la consolidation

impliquent un contrôle très fin au niveau cellulaire et subcellulaire. Ce contrôle s’effectue

notamment grâce au recrutement simultané de protéines kinases et phosphatases (pour revue :

Mansuy et Shenolikar, 2006). Des travaux récents chez la souris ont démontré que les

protéines phosphatase PP1, PP2A et la calcineurine (PP2B) sont impliquées dans l’acquisition

et la consolidation mnésique. Ainsi, la diminution de l’expression et de l’activité de la

calcineurine dans l’hippocampe facilite l’acquisition initiale d’un conditionnement de peur à

un contexte mais perturbe l’acquisition de son extinction (Havekes et al., 2008). De manière

générale, l’inactivation génétique de la calcineurine ou de la PP1 améliore la mémoire et

l’apprentissage (Ikegami et Inokuchi, 2000 ; Malleret et al., 2001 ; Sharma et al., 2003) et

prévient le déclin cognitif associé à l’âge dans des tâches spatiales (Genoux et al., 2002).

Pourtant, une répression plus drastique ou une élimination plus précoce de ces enzymes par

manipulation génétique perturbent l’apprentissage de diverses tâches comportementales

(Bennett et al., 2001 ; Stafstrom-Davis et al., 2001), notamment en piscine de Morris (Zeng et

al., 2001).


47

II.E : Activation du facteur de transcription CREB et synthèse

protéique

CREB (cAMP Response Element Binding protein) est un facteur de transcription de la

famille des "CREB/ATF-activating transcription factors", très conservé phylogénétiquement

et ubiquitaire dans le cerveau des mammifères. La phosphorylation de son résidu Ser133

induit

le recrutement de son co-activateur CBP (CREB Binding Protein) et la formation de ce

complexe permet de stimuler la transcription de gènes dits précoces (IEG, Immediate Early

Genes) tels que c-fos et zif268 (Mayr et Montminy, 2001). Au contraire, la phosphorylation

de ses résidus Ser142-143

induit la monomérisation de CREB et la dissociation du complexe

CREB/CBP, inhibant ainsi son activité trans-activatrice. Enfin, le résidu Ser133

est aussi une

cible des phosphatases (PP1, PP2A, calcineurine) qui inhibent l’activité de CREB par

déphosphorylation (pour une revue de la régulation de CREB, voir Lonze et Ginty, 2002 ; Fig.

8). Ce facteur de transcription apparaît donc comme le point de convergence de multiples

voies de signalisation Ca2+

et AMPc dépendantes (Izquierdo et Medina, 1997 ; Roberson et

al., 1999 ; Josselyn et Nguyen, 2005) dont les niveaux d’activité (balance

kinases/phosphatases) régissent de manière extrêmement fine la réponse cellulaire de synthèse

protéique. La convergence des signaux vers l’activation nucléaire de CREB fait alors de ce

facteur un parfait représentant de l’activité neuronale.

De nombreuses études corrélatives rapportent une augmentation du niveau

d’activation de CREB dans l’hippocampe suite à des apprentissages dépendants de cette

structure (Kida et al., 2002 ; Mizuno et al., 2002 ; Colombo et al., 2003 ; Goldbart et al., 2003

; Alvarez-Jaimes et al., 2005 ; Countryman et al., 2005 ; Martel et al., 2006 ; Moncada et

Viola, 2006 ; Martel et al., 2007). Concordant avec ces observations, l’étude de souris

mutantes pour les isoformes α et δ a montré que CREB est essentiel au rappel d’informations

spatiales à long terme acquises en piscine de Morris (Bourtchuladze et al., 1994). De plus,

l’interruption de la fonction CREB dans des structures cérébrales clés par injection

d’oligonucléotides antisens (Guzowski et McGaugh, 1997 ; Lamprecht et al., 1997 ; Zhang et

al., 2003 ; Florian et al., 2006) ou surexpression d’un dominant négatif KCREB (Yin et al.,

1994 ; Brightwell et al., 2008), perturbe la mémoire à long terme mais pas à court terme dans

de nombreuses tâches. Au contraire, l’augmentation des niveaux de CREB par transfert

somatique de gène améliore les performances spatiales dans un labyrinthe en croix aquatique

(Brightwell et al., 2007).


48

D’un point de vue temporel, lors d’un conditionnement classique de peur, la cinétique

d’activation de CREB dans l’hippocampe varie en fonction du type d’association à effectuer.

Ainsi, un conditionnement contextuel (hippocampo-dépendant), induit une activation

biphasique de CREB dans le CA1 (un pic précoce 0-60min et un pic tardif aux alentours de

6h). Au contraire un conditionnement élémentaire (amygdalo-dépendant), induit une

activation de CREB monophasique et transitoire dans ce même champ (un seul pic aux

alentours de 15min) (Trifilieff et al., 2006). Dans le cas du conditionnement classique, la

cinétique d’activation de CREB semble donc refléter le niveau d’engagement d’une structure

dans la mémorisation des informations. L’exploration détaillée de deux questions restant

encore en suspens a fait l’objet de ce travail de thèse :

(1) la cinétique différentielle observée par Trifilieff, Micheau et al. est-elle spécifique

du conditionnement classique, ou peut-on la retrouver dans d’autres formes d’apprentissages

de type déclaratif comme les apprentissages spatiaux ?

(2) si l’activation biphasique de CREB observée dans le CA1 lors du conditionnement

contextuel est spécifique de la consolidation de l’association contexte-choc, la perturbation de

la consolidation, lorsque l’animal est placé dans une situation conflictuelle (i.e. extinction) ou

lors d’une altération physiologique (i.e. vieillissement normal), s’accompagne t-elle d’une

modification du patron de CREB ?


49

AC

Ca2+

RNMDA

Ca2+/CaM

R

α

ATP

AMPc

RAMPA

Na+

K+

PKA

TyrK

PLC CaMK II

PIP2

PKC

RE

DAG

IP3

ERK1/2

Noyau

Site CRE Gènes précoces

ARNm

VGCC

Ras/Raf-1

CaMK IV

B-Raf

Rap-1

CaMKK

Calcineurine

PP1/2A

P P

CBP

CR

EB

CR

EB

Ca2+/CaM

AC

Ca2+

RNMDA

Ca2+/CaM

R

α

ATP

AMPc

RAMPA

Na+

K+

PKA

TyrK

PLC CaMK II

PIP2

PKC

RE

DAG

IP3

ERK1/2

Noyau


ARNm

VGCC

Ras/Raf-1

CaMK IV

B-Raf

Rap-1

CaMKK

Calcineurine

PP1/2A

P P

CBP

CR

EB

CR

EB

Ca2+/CaM

ACAC

Ca2+

RNMDA

Ca2+/CaMCa2+/CaM

R

α

ATP

AMPc

RAMPA

Na+

K+

PKA

TyrK

PLC CaMK II

PIP2

PKC

RERE

DAG

IP3

ERK1/2

Noyau


ARNm

VGCC

Ras/Raf-1

CaMK IV

B-Raf

Rap-1

CaMKK

Calcineurine

PP1/2A

P P

CBP

CR

EB

CR

EBPP PP

CBP

CR

EB

CR

EB

Ca2+/CaMCa2+/CaM

Figure 8 : Schéma simplifié des interactions entre les kinases impliquées dans la consolidation cellulaire. Les différentes voies de signalisation (PKA, CaMK, PKC, MAPK) convergent vers la phosphorylation des

facteurs de transcription CREB/ATF, qui promeut la transcription de gènes précoces puis tardifs. Une

néosynthèse protéique s’ensuit, permettant un remodelage physique et qualitatif des synapses au sein du réseau

sous-tendant la trace mnésique. VGCC : canaux calciques voltage dépendants ; R : récepteur métabotropique

(dopaminergique, cholinergique, sérotoninergique ou noradrénergique) lié à un complexe protéique G ; AC :

Adénylate Cyclase ; CaM : Calmoduline ; TyrK : Récepteur Tyrosine Kinase ; RE : Réticulum Endoplasmique.


50

II.F : Mécanismes cellulaires et moléculaires des déficits mnésiques

associés au vieillissement

Les différentes formes de mémoire ne sont pas altérées de façon équivalente par le

vieillissement normal (Hedden et Gabrieli, 2004). La mémoire à long-terme se détériore dans

sa composante déclarative alors que les mémoires procédurale et émotionnelle sont largement

épargnées. La mémoire à court-terme est, quant à elle, essentiellement affectée dans les

aspects organisationnels de la mémoire de travail (Grady et Craik, 2000). Ces déficits

mnésiques spécifiques sont associés à une altération fonctionnelle des régions cérébrales

essentielles aux mémoires déclarative à long terme et de travail (hippocampe et cortex

préfrontal). Les données de neuroimagerie fonctionnelle chez le sujet âgé montrent des

variations d’activité sur un mode bi-directionnel (sur-activation vs hypo-activation) en

fonction de la tâche mnésique considérée, suggérant une réorganisation fonctionnelle en

réponse aux modifications neurobiologiques qui accompagnent le vieillissement (Burke et

Barnes, 2006). Les données de la littérature chez l’animal sont cohérentes avec les

observations précédentes. Au laboratoire, par le développement de tests en labyrinthe radiaire

à 8 bras, R. Jaffard et A. Marighetto ont montré que les composantes mnésiques majeures

touchées lors du vieillissement chez l’Homme sont aussi altérées chez la souris vieillissante.

Ainsi, les souris âgées présentent une altération préférentielle de la mémoire à long terme de

type déclaratif/relationnel associé à un déficit d’activation hippocampique (imagerie de la

protéine Fos) au moment de l’encodage, ainsi qu’une altération de la composante

organisationnelle de la mémoire de travail (Marighetto et al., 1999 ; Mingaud et al., 2008).

Chez l’Homme comme chez le rongeur, l’âge induit des altérations morpho-

fonctionnelles du cerveau (pour revue, Dickstein et al., 2007). Par exemple, chez le rat, le

vieillissement est associé à un déficit de maintien de la PLT dans le CA1 et le gyrus dentelé

(Landfield et al., 1978 ; Barnes et al., 1979 ; Barnes et McNaughton, 1985 ; Geinisman et al.,

1995 ; Lynch, 1998a et b) et à une sensibilité accrue à la DLT ou à la dépotentialisation

synaptique (Norris et al., 1996 ; Foster et Norris, 1997 ; Foster, 1999). Du point de vue

moléculaire, on observe une forte altération de l’homéostasie calcique chez le sujet âgé

(Norris et al., 1996 ; Foster et Norris, 1997). Parmi les sources possibles à l’origine de cette

dérégulation calcique dans l’hippocampe, des études ont montré d’une part, la diminution de

l’expression des gènes liés au stockage interne du Ca2+

et des gènes codant les protéines de

régulation (calcium- et calmodulin-binding-proteins) et d’autre part, l’augmentation de


51

l’activité des canaux calciques voltage-dépendants de type L (L-VGCC) (Campbell et al.,

1996 ; Thibault et Langfield, 1996 ; Disterhoft et al., 1993). Ainsi, le blocage de ces canaux

améliore les performances mnésiques des rats âgés en piscine de Morris (McMonagle-Strucko

et Fanelli, 1993). De plus, dans l’hippocampe âgé, l’augmentation du pool Ca2+

intracellulaire

à partir des canaux L-VGCC s’accompagne d’une augmentation de l’activité des

phosphatases PP1 et calcineurine et par voie de conséquence, d’une diminution de l’état de

phosphorylation de leurs cibles (Norris et al., 1998a ; Foster et al., 2001). La cascade

moléculaire AMPc-PKA-CREB est également altérée avec l’âge (Asanuma et al., 1996). Par

exemple, la diminution de l’expression des adénylates cyclases sensibles au Ca2+

dans le CA1

est directement corrélée aux déficits de performances chez des souris âgées entraînées en

mémoire spatiale en piscine de Morris (Mons et al., 2004). Au contraire, l’augmentation

pharmacologique du niveau d’activité de la PKA améliore les performances mnésiques dans

de nombreuses tâches hippocampo-dépendantes, et notamment spatiales, chez le rat comme

chez la souris (de Toledo-Morrell et al., 1984 ; Hersi et al., 1995 ; Barad et al., 1998 ; Bach et

al., 1999). Cependant, il est intéressant de noter que la même augmentation de l’activité PKA

dans le cortex préfrontal perturbe la mémoire de travail chez des rats et des singes âgés

présentant des déficits préfrontaux (Ramos et al., 2003). Ainsi, dans l’hippocampe où la

concentration calcique intracellulaire régule positivement le signal AMPc par l’activation des

isoformes 1 et 8 de l’adenylate cyclase (AC1 et AC8), une diminution progressive du signal

AMPc avec l’âge induit (1) l’altération des cascades de phosphorylation régulées par la PKA

et (2) la perte du contrôle exercé par la PKA sur l’inhibition de phosphatases Ca2+

-

dépendantes telles que la calcineurine (Blitzer et al., 1995). Parmi les altérations dans la

balance phosphorylation/déphosphorylation régulée par les signaux Ca2+

et AMPc, plusieurs

études montrent un défaut d’activation/phosphorylation du facteur CREB hippocampique

avec l’âge consécutivement à un apprentissage hippocampo-dépendant (Kudo et al., 2005 ;

Monti et al. 2005 ; Countryman et Gold, 2007). Au contraire, l’augmentation des niveaux de

CREB par transfert somatique de gène peut contrer les effets délétères du vieillissement

normal dans des tâches de navigation spatiale ou d’évitement chez le rat (Mouravlev et al.,

2006). Cependant, les connaissances actuelles sur les dysfonctionnements de l’activité CREB

avec l’âge et le lien existant entre une altération de CREB et le déclin des fonctions

mnésiques restent encore limitées. Notamment, lorsque nous avons abordé nos travaux, il

n’existait aucune étude détaillée sur la nature et la cinétique des effets du vieillissement sur

l’activité CREB et les conséquences de l’altération de CREB sur la régulation


52

transcriptionnelle au sein de l’hippocampe. Une partie du travail présenté ici s’est appliquée à

préciser ces deux points et fait l’objet du Chapitre 2.


53

III : Flexibilité, réactualisation et fragilité d’une trace consolidée.

Dans cette dernière partie d’introduction, nous tenterons d’aborder la question de la

stabilité de la trace mnésique consolidée lors de rappels « conflictuels » de l’information, ou

dans le cas du vieillissement normal. La mise en mémoire d’un épisode X associé à un

renforcement R doit permettre à un animal d’adapter son comportement dans une situation Y

équivalente à la situation X, dans le but d’obtenir un renforcement R’ (flexibilité). En fonction

du niveau d’incongruité entre les situations X et Y et entre les renforcements R et R’, la trace

mnésique résultant du deuxième épisode pourra ou non être identique à celle du premier

épisode. Afin de gérer les variations, deux événements sont possibles : soit la trace mnésique

est réactualisée pour chaque incongruité de la nouvelle situation (reconsolidation), soit une

nouvelle trace n’associant plus les stimuli à un renforcement est formée et sa force

déterminera alors sa dominance sur la première (extinction). Après de courtes considérations

concernant le phénomène de reconsolidation, nous nous intéresserons plus précisément à

l’extinction de la trace mnésique.

III.A : Mise en évidence et théorie de la reconsolidation.

En 1968, Misanin et al. rapportent qu’un traitement par chocs électroconvulsifs juste

après la présentation brève d’un stimulus conditionné entraîne une amnésie rétrograde vis-à-

vis de l’association stimulus conditionné/stimulus inconditionnel auquel il appartient alors

que le choc administré seul n’entraîne aucune amnésie (Misanin et al., 1968). Une mémoire

dans un état actif (suite à un rappel) semblait donc plus vulnérable aux effets d’un événement

amnésiant que lorsqu’elle reste inactive (Lewis, 1979). Trente ans plus tard, Przybyslawski et

Sara (Przybyslawski et Sara, 1997) montrèrent l’effet amnésiant du bloquage des R-NMDA

après une séance de rappel dans une tâche spatiale en labyrinthe radiaire, et Nader et al.

(Nader et al., 2000a et b ; Nader, 2003) celui du blocage de la synthèse protéique dans

l’amygdale après réactivation d’une mémoire de peur conditionnée à un son. Ainsi,

l’activation des circuits d’une mémoire déjà bien établie rend la trace qu’ils sous-tendent

labile et celle-ci doit alors subir un « processus moléculaire » permettant sa reconsolidation et

son maintien en mémoire. L’ensemble de ces données illustre tout d’abord le fait que la

mémoire est un processus neurobiologique dynamique : elle subit de perpétuelles

réorganisations en fonction des expériences vécues par l’organisme afin de recombiner et


54

contraster à tout instant les informations d’une situation nouvelle avec celles d’une situation

déjà mémorisée. La réactivation d’une mémoire fragilise sa trace, en quelque sorte en

« découplant les synapses qui la sous-tendent, à tel point qu’elles doivent être reconstruites »

(Rudy et al., 2006). Mais une question essentielle que soulèvent les travaux sur la

reconsolidation est celle du rôle même du rappel de l’information. Selon Nader, de façon

contre-intuitive, il doit être considéré comme susceptible de provoquer une amnésie puisqu’il

rend la trace labile et dépendante de nouvelles modifications moléculaires et synaptiques.

Un problème soulevé par le débat sur la reconsolidation reste de savoir si elle consiste

en une récapitulation exacte des phénomènes de consolidation ou si elle possède ses propres

processus moléculaires. La similarité entre les deux processus a largement été montrée, grâce

à des études pharmacologiques visant tant à inhiber qu’à activer les voies de signalisation

impliquées dans la consolidation après un rappel (pour revues : Horne et al., 1997 ; Rodriguez

et al., 1999 ; Nader et al., 2000b ; Abel et Lattal, 2001 ; Nader, 2003 ; Dudai, 2004 ; Dudai et

Eisenberg, 2004 ; Alberini, 2005). Cependant, plusieurs travaux montrent par exemple que

consolidation et reconsolidation d’un même apprentissage ne recrutent pas les mêmes

structures cérébrales (Hernandez et al., 2002 ; Tronel et Sara, 2002 ; Kelly et al., 2003 ; Bahar

et al., 2004 ; Salinska et al., 2004). Par ailleurs, plusieurs études ont mis en évidence des

dissociations moléculaires entre ces deux processus. Très récemment par exemple, Artinian,

Roullet et al. (2008) ont montré en piscine de Morris que la consolidation de la mémoire

spatiale requiert deux phases de synthèse protéique dans le CA3 (0min et 4h après

acquisition), alors que la reconsolidation ne repose que sur une phase précoce. De plus,

l’injection locale d’oligonucléotides antisens chez le rat a permis de montrer que la

consolidation d’un conditionnement de peur requiert la synthèse de BDNF mais pas de Zif268

dans l’hippocampe, alors que sa reconsolidation nécessite la synthèse de Zif268 mais pas de

BDNF (Lee et al., 2004). De même, le co-facteur de transcription C/EBP est requis dans

l’hippocampe pour la consolidation mais pas la reconsolidation de l’évitement passif, et

inversement dans l’amygdale (Tronel et al., 2005). Enfin, une étude récente chez le mollusque

montre que la réactivation d’une mémoire associative induit un processus de reconsolidation

dépendant de la PKA si le rappel est effectué 6h après acquisition mais pas 24h après (les

deux délais de rappel induisant pourtant une nouvelle synthèse protéique) (Kemenes et al.,

2006).


55

III.B : Formation d’une nouvelle trace inhibitrice au cours de

l’extinction d’un comportement

III.B.1 : Aspects neuropsychologiques de l’extinction

Les mécanismes psychologiques et neurophysiologiques de l’extinction ont été

majoritairement étudiés dans des tâches associatives, et notamment dans le conditionnement

classique de peur. En 1927, les travaux de Pavlov conduisent déjà à la conclusion que la

restitution non renforcée des informations initie un processus d’extinction de la trace

mnésique (Pavlov, 1927), de telle sorte que la présentation ultérieure d’un stimulus

conditionné (SC) perd sa capacité à évoquer une réponse comportementale. Si certains ont

initialement pensé que l’extinction résultait d’un effacement progressif de la trace mnésique

(Estes, 1955), cette hypothèse est aujourd’hui obsolète et on lui préfère la théorie selon

laquelle l’extinction résulte de la formation d’une nouvelle trace mnésique inhibant la trace

initiale. De fait, suite à l’extinction de la peur conditionnée, le comportement de peur associé

au SC peut être spontanément recouvré avec le temps ou rapidement réacquis (Pavlov, 1927 ;

Rescorla et Heth, 1975 ; Bouton et Bolles, 1979 ; pour revues : Rescorla, 2004 ; Bouton et al.,

2006 ; Cammarota et al., 2007).

Cependant, les phénomènes d’extinction ont également été décrits dans d’autres types

de tâches, et notamment des apprentissages de type relationnel/déclaratif. En piscine de

Morris, l’apprentissage de l’emplacement de la plate-forme conduit, lors d’un test de rétention

sans plate-forme, à un comportement de recherche persévérant dans la zone théorique de la

cible. La succession d’essais non renforcés, ou le déplacement de la plate-forme dans un autre

quadrant, induisent la perte progressive de ce comportement caractéristique, témoignant de

l’« extinction de la mémoire de la position de la plate-forme » (Lattal et Abel, 2001 ; Lattal et

al., 2003 ; Morris et al., 2006 ; Varvel et al., 2007 ; Rodriguez-Ortiz et al., 2008). Mais la

question de savoir si les processus psychologiques de l’extinction sont les mêmes pour la

mémoire spatiale et la mémoire d’un conditionnement pavlovien reste ouverte. Par exemple,

bien que Lattal et al. (2003) aient observé un faible recouvrement spontané après extinction

de la préférence de position dans la piscine par déplacement de la plate-forme, une étude plus

récente par l’équipe de Morris n’a pas réussi à mettre en évidence ce phénomène suite à une

extinction classique par retrait de la plate-forme (Morris et al., 2006).


56

III.B.2 : Mécanismes moléculaires et cellulaires de l’extinction

Dans le cas du conditionnement, les données de la littérature semblent confirmer que

l’extinction d’une trace mnésique repose sur la formation et la consolidation d’une nouvelle

trace inhibant la première. Il a ainsi été montré qu’il existe une grande similarité entre les

processus cellulaires et moléculaires impliqués dans la consolidation d’un conditionnement et

dans son extinction. Ainsi, l’extinction nécessite l’activation des R-NMDA (Falls et al., 1992

; Baker et Azorlosa, 1996 ; Tang et al., 1999 ; Lin et al., 2003c) et des voies MAPK/ERK et

PKA (Lin et al., 2003c ; Szapiro et al., 2003 ; Herry et al., 2006 ; Nijholt et al., 2008 ; mais

voir Isiegas et al., 2006), et dépend de la synthèse protéique dans la formation

hippocampique, l’amygdale ou encore le cortex préfrontal (Berman et Dudai, 2001 ; Vianna et

al., 2001 ; Bevilaqua et al., 2006 ; pour revues : Myers et Davis, 2002 ; Cammarota et al.,

2004 ; Izquierdo et al., 2004 ; Cammarota et al., 2005 ; Cammarota et al., 2007). Cependant,

d’un point de vue anatomique, plusieurs travaux impliquent l’activité du cortex préfrontal

médian dans l’extinction d’apprentissages initialement hippocampo-dépendants (Gewirtz et

al., 1997 ; Vouimba et al., 2000 ; Quirk et al., 2006 ; Mueller et al., 2008 ; pour revues,

LeDoux, 2000 ; Quirk et al., 2000) ou amygdalo-dépendants (Herry et Mons, 2004). De plus,

l’extinction de la peur conditionnée semble induire une inversion, ou pour le moins une

modification, de l’équilibre phosphatases/kinases établi lors des phases de consolidation de la

trace mnésique initiale. En particulier, plusieurs études montrent une forte activité des

phosphatases telles que la calcineurine (Lin et al., 2003a et b ; Cannich et al., 2004 ; Havekes

et al., 2008 ; pour revue : Mansuy, 2003 ; mais voir : Baumgartel et al., 2008). Concernant

l’activité transcriptionnelle, si l’extinction nécessite une étape de consolidation d’un nouvel

apprentissage inhibiteur, elle doit aussi être régulée de manière très fine et surtout spécifique.

Par exemple, à l’inverse de la consolidation initiale, l’extinction d’une peur conditionnée

semble induire une diminution de l’activation du facteur CREB préalablement induite lors de

l’acquisition (Lin et al., 2003c).

Dans le cas plus complexe de la mémoire spatiale en piscine de Morris, très peu

d’études concernant les cascades moléculaires impliquées dans l’extinction ont été publiées.

La nécessité d’une synthèse protéique au moment de l’extinction fait d’ailleurs encore

largement débat (Lattal et Abel, 2001 ; Lattal et al., 2004 ; Morris et al., 2006 ; Rossato et al.,

2006 ; Lopez et al., 2008 ; Rodriguez-Ortiz et al., 2008). Les données contradictoires de la

littérature sur ce point s’expliquent par le fait que dans ce type d’apprentissage, il est difficile


57

de différencier les phénomènes d’extinction et de reconsolidation. Ces deux processus, plus

que dans tout autre paradigme, semblent interagir ici de manière très forte, et la balance entre

les deux pourrait alors dépendre de plusieurs facteurs :

(1) du niveau de consolidation de la mémoire initiale (Morris et al., 2006 ; Lopez et

al., 2008 ; Rodriguez-Ortiz et al., 2008)

(2) du protocole d’extinction (Lattal et al., 2003)

(3) du niveau (nombre d’essais) d’extinction (Rossato et al., 2006).

L’ensemble de ces considérations nous a menés à étudier plus précisément les

mécanismes moléculaires associés à l’extinction de la mémoire spatiale dans la piscine de

Morris. Ces travaux font l’objet du chapitre 3.


58

Objectifs généraux des travaux de thèse :

Des travaux récents dans l’équipe et décrits dans l’introduction ont montré que la

cinétique d’activation de la voie MAPK/ERK-CREB peut rendre compte de l’implication

d’une structure cérébrale dans la consolidation d’un conditionnement de peur. Le premier

objectif de ce travail de thèse était de généraliser cette hypothèse à un autre type

d’apprentissage plus complexe de type déclaratif. Nous voulions montrer comment la

cinétique d’activation de la voie transcriptionnelle CREB pourrait refléter un encodage

spécifique de la mémoire spatiale à long terme. Nous avons donc effectué, par

immunohistochimie, une analyse détaillée de la cinétique d’activation/phosphorylation de

CREB dans l’hippocampe (et structures associées) au cours d’une tâche de mémoire spatiale

de référence réalisée en piscine de Morris. Notre objectif était de déterminer si les patrons

d’activation évoluent au cours de la mise en place de la mémoire, sont spécifiques du niveau

de maîtrise de la tâche et peuvent refléter le degré d’implication d’une structure dans la

consolidation de la mémoire. Ce travail est présenté dans le chapitre 1 et fait l’objet de la

Publication 1 :

� Porte Y., Buhot M.C., Mons N. Spatial memory in the Morris water maze and

activation of cyclic AMP response element-binding within the mouse hippocampus.

Learn. Mem. (2008) 15:885-894.

Les données de la littérature montrent que le vieillissement normal est associé à un déclin

cognitif dans de nombreuses tâches dépendantes de l’hippocampe et que ce déclin est lié à une

altération des mécanismes moléculaires impliquant les voies Ca2+

et AMPc dépendantes

(Foster, 1999). Dans cette série d’expériences, notre objectif était d’identifier les mécanismes

clés du dysfonctionnement de l’activité CREB corrélé aux déficits mnésiques associés à l’âge.

Nous avons testé l’hypothèse selon laquelle une perturbation des patrons temporels

d’activité pCREB peut refléter ou être à l’origine des défauts de consolidation des

mémoires hippocampo-dépendantes observés au cours du vieillissement normal. Nous

avons pour cela mené une étude comportementale en piscine de Morris associée à

l’immunohistochimie détectant pCREB et, en aval, la protéine Fos chez des souris jeunes

adultes et âgées. Ce travail est présenté dans le chapitre 2 et fait l’objet de la Publication 2 :

� Porte Y., Buhot M.C., Mons N. Alteration of CREB phosphorylation and spatial

memory deficits in aged 129T2/Sv mice. Neurobiol Aging. (2008) 29:1533-1546.


59

Enfin, dans la dernière série d’expériences, notre objectif a été d’étudier la stabilité des

patrons d’activation de CREB au cours de l’extinction de la mémoire spatiale en piscine de

Morris. Nous avons utilisé les techniques d’immunohistochimie et de Western-blots

combinées à l’approche comportementale afin de déterminer si l’acquisition/consolidation et

l’extinction de la mémoire spatiale de référence induisent des patrons temporels d’activation

de CREB différents. Nous avons pour cela développé deux protocoles d’extinction, l’un

classique consistant à retirer la plate-forme et l’autre consistant en la présentation d’une

nouvelle plate-forme à chaque session journalière. Ce travail est présenté dans le chapitre 3 et

fait l’objet de la Publication 3 :

� Y. Porte, P. Trifilieff, MC Buhot, N. Mons. Distinct patterns of CREB

phosphorylation after spatial memory and extinction learning in mouse hippocampus.

En préparation.


60

M atériels et M éthodes

61

M atériels et M étM atériels et M étM atériels et M étM atériels et M éthodes hodes hodes hodes


62


63

I : Animaux et procédures comportementales

I.A : Choix des lignées de souris

L’ensemble des expérimentations a été effectué sur des souris provenant de deux

lignées différentes. Les expériences se rapportant aux articles 1 et 3 (Chapitres 1 et 3) ont été

menées chez des individus de la souche consanguine C57BL/6 (centre d’élevage Iffa Credo,

Lyon France). Cette lignée a été choisie pour ses aptitudes largement démontrées en piscine

de Morris (Holmes et al., 2002) qui en font une souche de choix servant de témoin aux

performances standards dans les études de comparaison de lignées génétiquement modifiées

(Schimanski et Nguyen, 2004). Les expériences concernant le deuxième article (Chapitre 2)

ont quant à elles été effectuées chez des souris de la lignée consanguine 129T2/Sv

(Laboratoire de Transgenèse, Université de Bordeaux 2). Cette souche a été préalablement

testée en piscine de Morris (Nguyen et al., 2000 ; Wolff et al., 2002) et des études

préliminaires ont montré que ces souris développent un déficit d’acquisition et de rétention de

la tâche de mémoire spatiale à long terme au cours du vieillissement normal.

I.B : La piscine de Morris : un dispositif comportemental idéal pour

étudier les aptitudes spatiales chez la souris

Afin d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-tendant la mise en

place, la consolidation et l’extinction de la mémoire spatiale, nous avons choisi la piscine de

Morris comme dispositif comportemental (Fig. 9). Cette tâche repose sur la motivation de

l’animal à s’échapper de l’eau en montant aussi vite que possible sur une plate-forme cachée

jouant le rôle de renforcement positif. L’une des principales fonctions attribuées au système

hippcampique est d’encoder et maintenir à disposition les cartes spatiales. Or la résolution

d’une tâche spatiale dans la piscine de Morris requiert de l’animal qu’il établisse une carte

précise de l’environnement dans lequel il évolue afin de pouvoir apprendre et restituer à partir

de n’importe quel point la situation du but non visible en inférant sa position à l’aide d’indices

distaux invariants. A ce titre, la piscine de Morris est aujourd’hui reconnue comme un

excellent test de la mémoire déclarative, dépendante de l’hippocampe (Morris et al., 1982 ;

D'Hooge et De Deyn, 2001). Une lésion de cette structure induit en effet un déficit


64

d’apprentissage chez le rat (Morris et al., 1982 ; Eichenbaum et al., 1990) comme chez la

souris (Logue et al., 1997) et l’on observe un gradient plat d’amnésie rétrograde en piscine de

Morris consécutivement aux lésions hippocampiques (Bolhuis et al., 1994 ; Mumby et al.,

1999 ; Kaut et Bunsey, 2001 ; Clark et al., 2005a et b). Une description précise du dispositif

se trouve dans la partie Material & Methods de chaque article présenté.

Figure 9 : La piscine de Morris : un dispositif idéal pour étudier la mémoire spatiale chez le rongeur. Les souris apprennent à retrouver une

plate-forme immergée dans une piscine

remplie d’eau opacifiée. La tâche

consiste, pour chaque individu, à

s’échapper en retrouvant la plate-forme

le plus vite possible en inférant sa

position à l’aide d’indices visuels

distaux et invariants.

I.C : Procédure générale d’entraînement en piscine de Morris

Préapprentissage. Deux jours avant le début des expériences, tous les animaux sont

classiquement soumis à une séance de préapprentissage leur permettant d’apprendre les

aspects procéduraux de la tâche tels que nager ou grimper sur la plate-forme (Malleret et al.,

1999). Cette séance est décrite dans la section Material & Methods de chaque article.

Procédure générale d’acquisition. Au début de la séance, les animaux sont amenés dans la

pièce de monitoring par groupe de 6. Au cours d’un essai, l’individu est lâché face au rebord

de la piscine à partir d’un point périphérique variable (séquence pseudo-aléatoire) et doit

rejoindre la plate-forme en un temps maximum de 90s. A la fin de chaque essai, les sujets

sont autorisés à rester sur la plate-forme durant 20s pendant lesquelles ils peuvent associer les

indices extérieurs avec la position de la cible. Une présentation de la plate-forme (20s) est

toujours effectuée avant le tout premier essai d’acquisition au premier jour. Si la souris

n’atteint pas le but dans le temps imparti (90s), elle est invitée à suivre le doigt de


65

l’expérimentateur qui lui indique la position de la plate-forme. Pour terminer, la souris est

ramenée dans sa cage située sous une lampe de puissance faible pour éviter toute baisse de

température corporelle et faciliter le séchage du pelage.

I.D : Définition des différents protocoles utilisés

Mémoire de référence. L’apprentissage et la mémorisation à long terme de la position de la

plate-forme dans la piscine de Morris peuvent classiquement s’effectuer de deux manières

différentes : soit les essais sont proposés de façon massée par blocs (8 à 16 essais consécutifs)

temporellement contigus (sur une seule journée) ; soit ils sont effectués par blocs allégés (1 à

6 essais) et distribués sur plusieurs jours. Dans les expériences présentées dans cette thèse, les

animaux apprennent une position constante de la plate-forme (au milieu du quadrant Sud-

Ouest) au cours de 1 à 9 sessions de 2 ou 4 essais consécutifs (1 session par jour, Fig. 10A).

Essais-tests. Tous les groupes de souris ont été soumis à un essai de rappel de 90s, durant

lequel la plate-forme est retirée, en phase finale d’apprentissage. L’absence de plate-forme

permet alors d’évaluer la force du rappel de la position de la plate-forme en analysant le

niveau de persévérance à chercher dans la zone cible exprimé par les animaux.

Extinction simple sans plate-forme. L’absence de récompense au cours des essais-tests

provoque un conflit entre ce qui est « su » et « attendu » et ce que l’animal « vit réellement »,

ce qui induit un processus d’extinction (Pavlov, 1927 ; Rescorla, 2001). Dans le cas de

l’extinction de la mémoire spatiale en piscine de Morris, plusieurs procédures d’extinction

simple ont été proposées, faisant varier le nombre et l’espacement des essais sans plate-forme

(Lattal et Abel, 2001 ; Morris et al., 2006 ; Rossato et al., 2006 ; Lopez et al., 2008). Nous

avons choisi une procédure en 10 essais d’extinction distribués sur 5 jours (1 bloc de 2 essais

consécutifs par jour, Fig. 10B).


66

��

2

RM

�

(groupe Random-PF)

(groupe No-PF)

2

3

��

2

RM

�

(groupe Random-PF)

(groupe No-PF)

2

3

Figure 10 : Description des différents protocoles comportementaux développés afin d’étudier la formation, la consolidation et l’extinction de la mémoire spatiale à long terme dans la piscine de Morris. (A) Protocole d’acquisition de mémoire de Référence. (B) Protocoles d’extinction. Les flèches représentent les

points de lâcher.


67

Extinction Random. Des études ont montré que l’extinction simple peut entrainer chez la

souris un état proche du « désespoir » associé à des symptômes comportementaux de type

dépression tels que l’immobilité (Porsolt et al., 1978 ; Stewart et al., 1996 ; Schulz et al.,

2004 ; Schulz et al., 2007a et b). Une alternative a été proposée, le protocole reversal, dans

laquelle les individus doivent apprendre une nouvelle position de la plate-forme dans le

quadrant opposé à la position initiale (Lattal et al., 2003). Cependant, du point de vue

moléculaire, les événements induits par l’acquisition à long terme d’une nouvelle préférence

de placement, peuvent interférer avec ceux inhérents à l’extinction de la mémoire initiale.

Rossato et al. ont d’ailleurs montré que l’utilisation d’un protocole de type reversal induirait

des processus de reconsolidation plutôt que d’extinction (Rossato et al., 2006). Nous avons

donc choisi de mettre au point un autre protocole, adapté du protocole de delayed-matching-

to-place classiquement utilisé dans le cadre de l’étude de la mémoire de travail (pour revues :

Brandeis et al., 1989 ; D'Hooge et De Deyn, 2001 ; Gerlai, 2001 ; Vorhees et Williams,

2006). Dans cette procédure, appelée Extinction Random (Fig. 10B), les animaux doivent

retrouver la plate-forme, dont la position change tous les jours, au cours de 2 essais

consécutifs quotidiens précédés d’un essai de présentation (20s sur la plate-forme). En

permettant aux souris de retrouver chaque jour la plate-forme refuge, nous nous

affranchissons des problèmes de manque de motivation (désespoir) et observons des

événements moléculaires spécifiques de l’extinction tout en testant la flexibilité cognitive des

souris.

I.E : Paramètres comportementaux

Le traitement informatique des données comportementales permet, durant la phase

d’acquisition, d’obtenir à chaque essai et pour chaque animal, divers paramètres révélant

l’évolution des performances. Le paramètre utilisé en premier lieu est la latence (i.e. temps

mis par l’animal pour arriver à la plate-forme depuis le point de départ, en secondes, s). Ce

paramètre est toujours associé à la vitesse moyenne de nage (cm.s-1

) pour écarter d’éventuels

effets de l’activité locomotrice entre les groupes, notamment lors des études effectuées sur des

souris âgées. La distance totale parcourue du point de départ à la plate-forme (qui permet de

s’affranchir des éventuels effets de la vitesse de nage, cm) ou encore la distance moyenne à la

plate-forme (qui représente un bon indice de la connaissance géométrique de

l’environnement, cm) sont aussi classiquement utilisées. Dans tous les cas, une diminution de


68

ces paramètres au cours de l’apprentissage atteste d’une amélioration des performances des

individus.

Durant les essais tests, la force du rappel de la position de la plate-forme est évaluée

grâce au temps passé et à la distance totale parcourue par les souris dans différentes zones

fictives cibles de la piscine relativement à des zones équivalentes non cibles. On peut ainsi

étudier le pourcentage de temps passé (ou de distance parcourue) dans le quadrant où se

situait la plate-forme lors de l’acquisition (Q cible) par rapport aux trois autres quadrants. Les

mêmes analyses peuvent être effectuées en considérant une zone plus restreinte autour de la

plate-forme (large plate-forme, centrée sur la zone de la plate-forme mais de diamètre deux

fois supérieur) afin d’évaluer la précision des animaux. Dans tous les cas, la persistance des

souris à nager dans les zones cibles plutôt que dans les autres zones illustre un bon rappel de

la position de la plate-forme.

Le détail des analyses statistiques effectuées sur l’ensemble de ces données est décrit

dans la section Material & Methods de chaque article.

II : Immunohistochimie et Western-blotting

II.A : Procédures de marquage immunohistochimique

Fixation des cerveaux. Au délai post-apprentissage requis, les animaux sont profondément

anesthésiés par injection intrapéritonéale d’avertine (10mL/Kg) puis rapidement perfusés au

travers du ventricule cardiaque gauche avec 100mL une solution de paraformaldéhyde (PFA)

4% dans du tampon phosphate (PB) 0,1M à pH=7,4 maintenu froid, afin de fixer les tissus.

Les cerveaux sont alors délicatement prélevés et post-fixés une nuit à 4°C dans du PFA 4%.

Le lendemain, ils sont préparés pour être coupés à l’aide d’un vibratome (Leica) dans du

tampon Tris 0,1M à pH=7,4 (TB) contenant du fluorure de sodium (NaF 0,25mM) agissant

comme inhibiteur de phosphatases. On procède à des coupes sériées de 50µm d’épaisseur (4

lots par cerveau) qui sont conservées à -20°C dans une solution cryoprotectrice contenant

30% de glycérol et 30% d’éthylène glycol dans du PB 0,1M. Chaque puits contient donc des

coupes de l’ensemble du cerveau, les coupes consécutives étant espacées de 200µm.

Marquage immunohistochimique. Toutes les solutions utilisées ici contiennent l’inhibiteur

de phosphatases NaF (0,25mM) et les rinçages sont effectués dans des puits de boîtes de


69

culture à 4°C pendant 15min. Les coupes flottantes sont tout d’abord rincées 4 fois avec du

TB 0,1M puis incubées 30min à 4°C dans une solution de TB contenant 0,5% d’H2O2 afin de

bloquer l’activé péroxydasique endogène des cellules. Les coupes sont alors rincées avec une

solution de TB 0,1M contenant 0,9% de NaCl (TBS) avant d’être saturées et perméabilisées à

l’aide d’une solution de TBS contenant 3% de sérum normal de chèvre, 1% d’albumine

sérique bovine et 0,2% de Triton X-100 (90min à 4°C). On procède alors immédiatement à

l’incubation (48h à 4°C) avec l’anticorps primaire approprié dilué dans le tampon de

saturation : anticorps polyclonaux obtenus chez le lapin, anti-CREB (1:4000, Upstate

Biotechnology, Lake Placid, NY), anti-pCREB (1:2000, Upstate Biotechnology, Lake Placid,

NY), anti-Zif268 (1:5000, Santa Cruz Biotechnology), ou anti-Fos (1:20000, Oncogene

Research Products). Après rinçage abondant des coupes à l’aide de TBS, celles-ci sont mises

en présence de l’IgG de chèvre anti-lapin (1:2000, Jackson Immunoresearch) diluée dans le

tampon de saturation, de nouveau rincées et enfin incubées avec un complexe Avidine Biotine

Péroxydase (Vectastain Elite kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA) à l’abri de la lumière.

La présence des complexes antigène-anticorps est révélée à l’aide de diaminobenzidine

(0,05%) péroxydée en présence d’H2O2 (0,02%). La réaction est stoppée au bout de 10-12min

par 3 rinçages au TB 0,05M et les coupes sont réservées dans du tampon phosphate 0,1M pH

7,4 pour être montées entre lame et lamelle.

Figure 11 : Immuno-histochimie sur coupes flottantes. A gauche sont

schématisées les différentes

étapes du marquage

immunohistochimique et à

droite une microphotographie

illustre un exemple de

marquage anti-pCREB dans

le CA3.

Quantification du marquage. Elle s’effectue en aveugle à l’aide d’un système d’imagerie

semi-automatisé (Biocom Visiolab 2000, V4.50). Pour toutes les structures analysées, une

série de 6-8 comptages par cerveau est effectuée de façon bilatérale sous un grossissement

X10, ce qui permet de produire une moyenne du nombre de noyaux immunopositifs par mm².

Anticorps primaire de lapin

reconnaissant Ser133 phosphorylée

Anticorps secondaire biotinylé anti-lapin

Péroxydase

Avidine

P P

CREB CREB

Coupes

DAB + H2O2 + 2H+ + 2e-

2H2O + DABH2 coloration brune

Exemple de marquage

dans le CA3

Anticorps primaire de lapin

reconnaissant Ser133 phosphorylée

Anticorps secondaire biotinylé anti-lapin

Péroxydase

Avidine

P P

CREB CREB

Coupes

DAB + H2O2 + 2H+ + 2e-

2H2O + DABH2 coloration brune

Exemple de marquage

dans le CA3


70

Des analyses de variance (ANOVA) sont effectuées à l’aide du logiciel Statview avec pour

principaux facteurs de variance les variables Groupe, Délai de Sacrifice et Structure.

Lorsqu’un effet global ou l’interaction entre plusieurs effets apparaissent statistiquement

significatifs (p<0,05), les analyses se poursuivent par des comparaisons de groupes deux à

deux à l’aide des tests post-hocs appropriés.

Choix des structures. Nous nous sommes focalisés sur certaines structures clés impliquées

dans le traitement des informations spatiales et la navigation en piscine de Morris. Notre

intérêt s’est porté sur la région hippocampique (CA1, CA3, gyrus denté), le striatum (dorso-

médian et dorso-latéral), l’amygdale (noyaux latéral et basolatéral) et le cortex préfrontal

(ensemble noyaux prélimbique et infralimbique). En effet, de nombreuses études lésionnelles

et pharmacologiques ont montré que l’hippocampe dorsal est indispensable à l’acquisition des

informations spatiales, notamment en piscine de Morris (Morris et al., 1982 ; Eichenbaum et

al., 1990 ; Bolhuis et al., 1994 ; Logue et al., 1997 ; Mumby et al., 1999 ; Kaut et Bunsey,

2001 ; Bannerman et al., 2004 ; Clark et al., 2005a et b). Cependant, il a été montré que la

lésion du striatum médio-dorsal perturbe aussi l’acquisition de cette tâche (Morris et al., 1982

; Whishaw et al., 1987 ; Devan et al., 1999). D’autre part, des études ont impliqué l’activation

de l’amygdale dans la modulation de l’acquisition et de la restitution des informations

lorsqu’elles sont émotionnellement chargées, notament en piscine de Morris (Packard et

McGaugh, 1992 ; Packard et Teather, 1998 ; Hatfield et McGaugh, 1999). Enfin, des régions

néocorticales comme le cortex préfrontal sont susceptibles d’intervenir dans le stockage à

long terme ou encore dans les processus de planification de l’action (Granon et Poucet, 1995).

II.B : Western-blots

Dans le cadre de l’étude consacrée à l’extinction de la mémoire spatiale, nous avons

procédé à une analyse biochimique par Western-blots afin de compléter et confirmer nos

données immunohistochimiques.

Au délai post-apprentissage approprié, les souris sont décapitées et les cerveaux très

rapidement prélévés, déposés dans des tubes eppendorfs stérils et congelés à l’aide d’azote

liquide. Des sections de 300µm sont effectuées à l’aide d’un cryostat et l’hippocampe dorsal

est prélevé à l’aide d’un emporte-pièce. Les tissus sont lysés et homogénéisés dans une

solution d’extraction protéique (10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1% Triton X-100, 30 mM


71

sodium pyrophosphate, 50 mM NaF, 5 µM ZnCl2, 100 µM Na3PO4, 1 mM DTT, 5 nM

okadaic acid, 2.5 µg aprotinin, 2.5 µg pepstatine, 0.5 µg PMSF, 0.5 mM benzamidine, 2.5 µg

leupeptin). Les échantillons sont dénaturés au bain Marie sec (95°C pendant 5min) et la

quantification des protéines totales effectuée par méthode colorimétrique (micro BCA protein

assay kit, Pierce). Les protéines (20µg par puits) sont séparées par électrophorèse sur gel de

polyacrylamide (10% SDS PAGE) puis transférées sur une membrane de polyvinlidene

difluoride (PVDF, 0.45 µm Hybond P, Amersham Biosciences). Les membranes sont saturées

à l’aide d’une solution de BSA 5% (Fraction V; Sigma) dans du TB 0,1M pH 7,5 contenant

0,1M de NaCl (Tyr-TBS) pendant 1h sous agitation à température ambiante, puis incubées

une nuit à 4°C avec l’anticorps polyclonal de lapin anti-pCREB (Upstate Biotechnology, Lake

Placid, NY ) dilué au 1:2000 dans du tampon de saturation contenant 0,1% de Tween 20.

Après rinçage (6X10min) à l’aide de Tyr-TBS-Tween, les membranes sont incubées 2h à

température ambiante avec l’anticorps secondaire de gorille anti-lapin couplé à la péroxydase

de raifort (Horseradish Peroxydase, HRP-conjugated donkey anti-rabbit IgG, Amersham

Biosciences), dilué au 1:5000 dans le tampon de saturation. La présence des protéines est

alors révélée en chambre noire sur film photographique par une réaction photo-luminescente

en présence du substrat ECL (kit Amersham Biosciences). Après révélation, les membranes

subissent un protocole de « décrochage » (ou stripping) des anticorps (2X30min dans du

tampon Glycine 0,1M pH 2,8 au bain-marie à 55°C puis 10min dans du SDS dilué à 2% dans

du TBS 1X) puis sont abondamment rincées. Elles sont alors prêtes pour une nouvelle

saturation et traitées pour la détection de la quantité totale de protéine CREB (anticorps

polyclonal de lapin anti-t-CREB, 1:1000, Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY).

La quantification est directement effectuée par mesure de la densité optique (DO) sur

les films photographiques, à l’aide du logiciel ImageJ. Les données sont présentées, pour

chaque animal, sous forme du rapport DO pCREB / DO t-CREB et analysées par ANOVA

(seuil de significativité p<0,05) à l’aide du logiciel Statview.


72

Chapitre 1 : A ctiv ité cérébrale en m ém oire spatiale de R éférence

73

Chapitre 1Chapitre 1Chapitre 1Chapitre 1 : A ctivité cé: A ctivité cé: A ctivité cé: A ctivité cérébrale rébrale rébrale rébrale consécutive à un apprentissage en consécutive à un apprentissage en consécutive à un apprentissage en consécutive à un apprentissage en m ém oire spatiale de référence en m ém oire spatiale de référence en m ém oire spatiale de référence en m ém oire spatiale de référence en

piscine de M orris.piscine de M orris.piscine de M orris.piscine de M orris.

P ublication 1 : Spatial m em ory in the M orris w ater m aze and activation of cyclic A M P response elem ent-binding w ith in the m ouse h ippocam pus.

P orte Y ., B uhot M .C ., M ons N .E . L earning and M em ory (2008) 15:885-894


74


75

Chapitre 1 : A ctivité cérébrale consécutive à un apprentissage en

m ém oire spatiale de référence dans la piscine de M orris.

I : Introduction

Ces travaux s’inscrivent dans le cadre général des études qui visent à préciser, au plan

anatomo-fonctionnel, l’implication des structures cérébrales (notamment l’hippocampe) et

leurs interactions au cours de la formation d’une mémoire à long terme chez la souris. Dans

ce contexte, les techniques d’imagerie cérébrale chez l’animal utilisent classiquement les

gènes précoces (protéines Fos ou Zif-268) comme marqueurs de l’activité neuronale (Vann et

al., 2000 ; Hall et al., 2001, Touzani et al., 2003 ; Blanchard et al., 2008 ; David et al., 2008).

Cependant, la fenêtre d’induction des gènes précoces étant de durée limitée (entre 1-2h), elle

ne permet pas de rendre compte de l’état d’activation/inactivation des structures cérébrales

dans les phases très précoces et/ou tardives post-acquisition. Pour cette raison, la fenêtre

d’activation/phosphorylation de CREB (entre 0-1h et/ou 3-12h post-apprentissage) offre la

possibilité de mieux caractériser les cinétiques d’activation des structures cérébrales au cours

du processus de consolidation.

Plusieurs travaux fondés sur des apprentissages hippocampo-dépendants suggèrent que

la cinétique d’activation de CREB dépend de la structure cérébrale examinée et du type

d’information mémorisée (Bernabeu et al., 1997a ; Taubenfeld et al., 1999 ; Cammarota et

al., 2000 ; Desmedt et al., 2003). Nos travaux s’appuient sur des données obtenues par J.

Micheau et P. Trifilieff dans un conditionnement de peur, montrant une cinétique

différentielle d’activation de CREB dans le champ hippocampique CA1 selon la nature de

l’association à consolider (Trifilieff et al., 2006). Plus précisément, la consolidation d’un

conditionnement au contexte (hippocampo-dépendant) induit une activation biphasique de

CREB (pics précoce entre 0-60min et tardif après 6h), alors que la consolidation d’un

conditionnement élémentaire à un son (amygdalo-dépendant) est associé à un seul pic précoce

et transitoire (0-15min). Lorsque nous avons débuté cette étude, il existait peu de données

concernant les cinétiques d’activation de CREB au cours d’un apprentissage déclaratif de type

spatial. Seule une étude en labyrinthe radiaire montrait une activation progressive de CREB

dans l’hippocampe parallèlement à l’évolution des performances (Mizuno et al., 2002).


76

Sur la base de ces données, cette étude fondée sur une approche comportementale

associée à l’immunohistochimie (pCREB et Zif268), visait à déterminer lors d’une épreuve

spatiale en piscine de Morris (mémoire de référence) (1) si la cartographie des marquages

pCREB évolue différemment dans les différentes structures cérébrales (hippocampe, striatum,

amygdale, cortex préfrontal) en fonction de la phase d’apprentissage et du délai post-

apprentissage ; (2) si le patron d’activation de CREB dans l’hippocampe en fin

d’apprentissage est spécifique du degré de maîtrise de la tâche.

II : Méthodologie

Des souris jeunes adultes (C57BL/6, 5-6 mois) ont été entraînées dans une tâche de

mémoire de référence en piscine de Morris, durant 9 jours à raison de 4 essais par jour. Un

essai-test de rétention (sans plate-forme) a été effectué immédiatement après le dernier essai

au 9ème

jour afin d’évaluer la force du rappel de la position de la plate-forme. Afin de préciser

la participation différentielle des structures cérébrales (hippocampe, striatum, amygdale,

cortex préfrontal) dans les différentes phases de traitement de l’information (de son

encodage à sa consolidation), les niveaux d’activité pCREB ont été mesurés chez des

animaux sacrifiés 60min après le dernier essai à différents niveaux d’apprentissage (jours 1, 3,

4, 9). Afin de déterminer le degré d’implication des structures cérébrales dans le processus

de consolidation mnésique, nous avons effectué une analyse détaillée des cinétiques

d’activation de CREB à différents délais (de 0min à 48h) après l’essai-test à J9. Enfin, pour

vérifier si le patron d’activation de CREB est spécifique du degré de maîtrise de la tâche,

nous avons comparé les pics précoces d’activation hippocampique de CREB chez deux

groupes d’animaux soumis à un apprentissage ‘complet’ (4 essais/jour) vs ‘partiel’ (2

essais/jour).

III : Principaux résultats et conclusions

(1) L’analyse de la cinétique d’activité pCREB en fonction du niveau d’entraînement met en

évidence un recrutement différentiel de CREB selon les structures cérébrales examinées et

également en fonction de la phase d’apprentissage considérée. L’analyse de pCREB au

délai 60min post-apprentissage montre que l’activation/phosphorylation de CREB dans

l’hippocampe augmente progressivement avec la maîtrise de l’épreuve spatiale, ce qui est en


77

accord avec les observations de Mizuno et al. (2002). Au contraire, l’activité pCREB dans le

striatum est très élevée au 1er

jour d’apprentissage, puis diminue à mesure que les

performances augmentent. Au délai 60min, aucun changement significatif n’est détecté dans

l’amygdale et le cortex préfrontal en fonction du niveau d’entraînement. Si elles ne

démontrent pas directement, nos données indiquent que la mémorisation d’informations

spatiales s’accompagne d’une réorganisation fonctionnelle des circuits mnésiques. Quelques

données de la littérature montrent également qu’avant l’utilisation de la stratégie spatiale, une

stratégie de guidage basée sur une association simple est élaborée (Devan et White, 1999).

Ainsi, l’augmentation progressive de l’activité pCREB hippocampique parallèlement au

niveau d’apprentissage suggère fortement que les éléments du contexte expérimental ne

peuvent être encodés que si l’exposition à l’environnement est suffisante. Cette première

expérience corrobore des données récentes obtenues au laboratoire montrant, lorsque les deux

stratégies spatiale et procédurale sont disponibles, une utilisation préférentielle de la stratégie

procédurale sous-tendue par le striatum au début de l’acquisition, suivie d’un switch vers une

stratégie spatiale sous-tendue par l’hippocampe en fin d’acquisition (Martel et al., 2007).

(2) L’analyse détaillée de la cinétique d’activation de CREB réalisée après l’essai-test

effectué au 9ème

jour d’apprentissage (lorsque les souris ont consolidé la tâche) a permis de

montrer l’établissement de patrons d’activation de CREB différents, dont l’amplitude et la

durée dépendent de la structure cérébrale considérée. La mémorisation de l’information

spatiale s’accompagne d’une activation biphasique de CREB dans le champ CA1 (entre 0-

60min et aux environs de 9h) qui contraste avec une activation monophasique (immédiate et

transitoire) dans le CA3, l’amygdale et le cortex préfrontal, ou non significative dans le

striatum. Ces données concordent avec l’idée générale que la consolidation de tâches

hippocampo-dépendantes nécessite l’activation de nombreux gènes et la synthèse de protéines

selon des vagues temporelles successives (Bernabeu et al., 1997a et b ; Cammarota et al.,

2000 ; Colombo et al., 2003 ; Martel et al., 2007 ; pour revue : Davis et Laroche, 1998). Elles

corroborent l’hypothèse selon laquelle le degré d’implication d’une structure, et donc son

niveau de recrutement au sein d’un réseau en fonction du type d’informations à traiter, est un

élément déterminant dans l’établissement du patron d’activation de CREB. A cet égard, nous

montrons également que la consolidation des informations se manifeste par une activation

durable de pCREB (et également de Zif268) dans le champ CA1 au delà de 24h post-

apprentissage. Une telle observation est cohérente avec l’idée d’un rôle prépondérant du CA1

dans le maintien durable de l’excitabilité neuronale et la persistance de la trace mnésique


78

(Ramirez-Amaya et al., 2005 ; Bekinschtein, et al. 2007 ; Brightwell et al., 2008 ; Miyashita

et al., 2008).

(3) L’analyse du pic précoce d’activité pCREB dans le CA1 d’animaux ayant subi pendant 9

jours soit un apprentissage ‘complet’ (4 essais/jour) soit un apprentissage ‘partiel’ (2

essais/jour) indique que l’activité pCREB évolue différemment dans le temps selon que les

animaux maîtrisent ou non la tâche. Immédiatement après l’apprentissage, l’augmentation

de l’activité pCREB dans le CA1 est maximale dans les deux groupes. En revanche, elle

disparaît dès 15min lorsque l’apprentissage est ‘partiel’ et mal maîtrisé alors qu’elle se

maintient jusqu’à 1h lorsque l’apprentissage est parfaitement maîtrisé. En d’autres termes, la

durée, plutôt que l’amplitude, du pic précoce de pCREB semble être liée au degré de maîtrise

de la tâche. Ce résultat est à rapprocher de celui rapporté par Colombo et al. (2003) montrant

chez le rat, après un apprentissage dans un labyrinthe en croix, que l’activation immédiate de

CREB observée dans l’hippocampe et le striatum est prolongée à 60min uniquement dans

l’hippocampe pour les animaux développant une stratégie spatiale et dans le striatum pour

ceux adoptant une stratégie procédurale.

En conclusion, l’utilisation combinée de l’épreuve de mémoire spatiale de référence et de

l’imagerie pCREB met en lumière l’existence de nombreux facteurs (structure examinée,

phase d’apprentissage, délais post-apprentissages et niveau de maîtrise de la tâche) dont

dépendent l’amplitude, la durée et le sens des variations d’activité pCREB. Nos données

permettent de confirmer l’hypothèse selon laquelle le degré d’implication d’une structure, et

donc son niveau de recrutement au sein d’un réseau en fonction du type d’informations à

traiter, est un élément déterminant dans l’établissement du patron d’activation de CREB.


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Chapitre 2 : P atrons d ’activ ité CR E B et v ieillissem ent norm al

91

Chapitre 2Chapitre 2Chapitre 2Chapitre 2 : D éficits de m ém oire : D éficits de m ém oire : D éficits de m ém oire : D éficits de m ém oire spatiale dus au vieillissem ent spatiale dus au vieillissem ent spatiale dus au vieillissem ent spatiale dus au vieillissem ent

norm al et altération des patrons norm al et altération des patrons norm al et altération des patrons norm al et altération des patrons d’activation de CR E B d’activation de CR E B d’activation de CR E B d’activation de CR E B

P ublication 2 : A lteration of CR E B phosphorylation and spatial m em ory deficits in aged 129T2/Sv m ice. P orte Y ., B uhot M .C ., M ons N .

N eurobiol A ging (2008) 29 :1533-46


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93

Chapitre 2 : D éficits de m ém oire spatiale dus au vieillissem ent norm al

et altération des patrons d’activation de CR E B .

I : Introduction

De nombreux travaux ont montré que le vieillissement normal est associé à des

déficits fonctionnels dans un large spectre de tâches (Foster et Norris, 1997 ; Foster, 1999).

Cette étude est fondée sur des données récentes chez le rat âgé démontrant que des déficits de

mémoire dans une série de tâches hippocampo-dépendantes sont liés à une altération de la

voie transcriptionnelle CREB. Toutefois, les données concernant l’origine des altérations de

l’activité CREB chez le rat âgé donnent des résultats parfois contradictoires. Certaines études

chez des rats âgés présentant des déficits mnésiques indiquent que le vieillissement affecte

spécifiquement l’activité basale de CREB (Brightwell et al., 2004) alors que d’autres études

montrent une altération de CREB sous sa forme phosphorylée active (Kudo et al., 2005 ;

Monti et al. 2005 ; Countryman et Gold, 2007). Ces observations, associées aux résultats

précédents montrant une altération du patron temporel d’activité pCREB hippocampique chez

des souris ne possédant pas une bonne mémoire spatiale, nous ont conduits à étudier le profil

d’activation de CREB au cours du vieillissement normal. Cette étude, fondée sur une

approche comportementale couplée à une approche d’imagerie (détection de CREB, CREB

phosphorylé, gènes précoces), visait (1) à caractériser la nature (amplitude, durée) des

altérations de l’activation de CREB dans l’hippocampe associées au vieillissement ; (2) à

rechercher d’éventuelles relations entre la perturbation du profil d’activation de CREB,

l’altération de la protéine Fos et les déficits mnésiques observés dans une tâche

d’apprentissage spatial chez la souris âgée.

II : Méthodologie

L’étude des effets comportementaux du vieillissement a été effectuée chez des souris

(129T2/Sv) jeunes (5-6 mois) vs âgées (23-24 mois) entraînées dans une tâche de mémoire

spatiale de référence en piscine de Morris durant 3 jours. Les déficits mnésiques chez les

souris âgées ont été évalués 24h après le dernier essai lors d’un test de rétention (sans plate-

forme). Les patrons d’activité CREB, pCREB et Fos ont alors été déterminés par


94

immunohistochimie sur des souris sacrifiées 15min, 60min, 90min et 8h après le dernier essai

du jour 3 d’entraînement ou 15min après l’essai-test différé à 24h.


(1) L’analyse des données comportementales confirme l’existence d’un déficit mnésique chez

les souris âgées par rapport aux jeunes adultes, qui se traduit par une perturbation de

l’acquisition aux 2ème

et 3ème

jours d’apprentissage. Ainsi, bien qu’elles ne montrent pas de

déficit moteur par rapport aux jeunes adultes (pas d’effet de l’âge sur la vitesse de nage au

premier jour), les souris âgées ne montrent aucune diminution de leurs latences à partir du

premier essai du 2ème

jour et jusqu’au dernier essai du dernier jour. De même, les sujets âgés

présentent une plus faible précision que les jeunes dans leur recherche de la plate-forme aux

2ème

et 3ème

jours d’apprentissage. Ce retard d’acquisition est confirmé par un fort déficit de

rétention à long terme lors de l’essai-test différé à 24h.

(2) Le vieillissement induit une altération sélective de pCREB dans l’hippocampe et plus

spécifiquement dans la région CA1. Nos données indiquent que dans l’hippocampe des

souris âgées, l’immunoréactivité pCREB est significativement réduite dans le CA1 et le gyrus

mais pas dans le CA3. De plus, aucune différence d’immunoréactivité pCREB n’est constatée

entre les groupes jeunes et âgés dans le striatum, le cortex préfrontal et l’amygdale (excepté le

noyau latéral à 15min).

(3) Dans la région CA1, l’effet du vieillissement sur l’activation/phosphorylation de CREB

dépend du délai de sacrifice. Les animaux âgés présentent une diminution significative de

pCREB au délai 15min mais pas aux autres délais examinés. La comparaison des

immunoréactivités CREB et pCREB indique que seule la forme phosphorylée/active de

CREB est altérée par l’âge. Par ailleurs, nous montrons également que chez les souris âgées,

la diminution de pCREB dans le CA1 est fortement corrélée aux déficits de performances à

l’essai-test. Au contraire, aucune corrélation entre le niveau d’activité pCREB et les

performances mnésiques n’est observé chez les souris jeunes adultes.


95

(4) Chez les sujets âgés, un déficit d’immunoréactivité Fos est observé aux délais 60-90min

dans la région CA1. En revanche, l’activité Fos n’est pas altérée par l’âge dans les autres

structures.

Dans leur ensemble, nos résultats soulignent l’importance du dysfonctionnement de

CREB hippocampique (spécifiquement du champ CA1) dans les déficits de mémoire spatiale

chez la souris âgée. Nos données montrant que le vieillissement perturbe sélectivement

l’activité pCREB dans l’hippocampe sont globalement cohérentes avec les données de la

littérature. De nombreuses études postulent, en effet, qu’au cours du vieillissement normal, la

mémoire à long-terme se détériore dans sa composante déclarative alors que les formes non

déclaratives de mémoire (notamment la mémoire procédurale reposant sur le striatum et la

mémoire émotionnelle reposant sur l’amygdale) sont largement épargnées (Jaffard et al.,

2000 ; LaBar et al., 2004 ; LaBar et al., 2005 ; Mingaud et al., 2008).

Par ailleurs, nos résultats confortent l’hypothèse d’un lien causal entre la réduction de

la forme phosphorylée/active de CREB (et en aval, de la protéine Fos) et la sélectivité des

perturbations mnésiques hippocampiques associées au vieillissement. En accord avec nos

données, des études ont montré que l’interruption de la fonction CREB dans le CA1 par

surexpression d’un dominant négatif KCREB (Pittenger et al., 2002) ou injection

d’oligonucléotides antisens (Guzowski et McGaugh, 1997) perturbe sévèrement la mémoire à

long terme dans une tâche spatiale en piscine de Morris. Parmi les mécanismes qui pourraient

être à l’origine de la perturbation de l’activité pCREB chez les souris âgées, plusieurs études

convergent vers l’hypothèse selon laquelle un dysfonctionnement de la voie cAMP-PKA

entraînant une dérégulation de la machinerie transcriptionnelle (CREB, gènes précoces)

pourrait être impliqué dans la sélectivité des déclins cognitifs liés à l’âge (Asanuma et al.,

1996 ; Barad et al., 1998 ; Bach et al., 1999 ; Mons et al., 2004). Par ailleurs, des variations

des protéines régulées par le signal Ca2+

(Foster et al., 2001) ainsi qu’une suractivation de la

calcineurine (Mansuy, 2003 ; Monti et al., 2005 ; Mansuy et Shenolikar, 2006) ont également

été observées chez le rat âgé. Dans ce contexte une étude récente démontre que

l’augmentation par transgenèse de la CaMK IV, permet de contrer les effets du vieillissement

dans une tâche de conditionnement contextuel en augmentant la phosphorylation de CREB

dans l’hippocampe (Fukushima et al., 2008).

En résumé, cette étude met en lumière l’altération différentielle de pCREB au cours du

vieillissement normal selon les structures examinées. Nos résultats suggèrent fortement


96

qu’une perturbation de la cinétique d’activation de CREB dans CA1 pourrait être un

élément déterminant à l’origine des déficits cognitifs dus à l’âge. Enfin, ce travail a permis

d’apporter des précisions importantes sur la nature du dysfonctionnement de CREB dans

l’hippocampe et ses conséquences sur la transcription des gènes précoces au cours du

vieillissement.


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Chapitre 3 : E xtinction et altérations des patrons de pCR E B

111

Chapitre 3 : E ffetChapitre 3 : E ffetChapitre 3 : E ffetChapitre 3 : E ffetssss de l’extinction de l’extinction de l’extinction de l’extinction de la m ém oire spatiale en piscine de la m ém oire spatiale en piscine de la m ém oire spatiale en piscine de la m ém oire spatiale en piscine

de M orris sur les patrons de M orris sur les patrons de M orris sur les patrons de M orris sur les patrons d’activation de CR E Bd’activation de CR E Bd’activation de CR E Bd’activation de CR E B

Publication 3 : D istinct patterns of CR E B phosphorylation after spatial m em ory and extinction learning in m ouse hippocam pus.

Porte Y ., Trifilieff P ., B uhot M .C ., M ons N .


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113

Chapitre 3 : E ffet de l’extinction de la m ém oire spatiale à long term e en

piscine de M orris sur les patrons d’activation de CR E B

I : Introduction

Les travaux précédents convergent vers l’hypothèse selon laquelle le degré

d’implication d’une structure donnée en fonction du type d’information à consolider est un

élément déterminant dans l’établissement du patron d’activation de CREB. Nous avons

montré dans notre tâche en mémoire de référence spatiale que (1) les patrons spatio-temporels

d’activation de CREB varient en fonction de la structure considérée ; (2) une mauvaise

mémoire de la position de la plate-forme due à un apprentissage ‘partiel’ ou à un déclin

cognitif lors du vieillissement, se traduit par une perturbation du patron précoce d’activation

de CREB dans l’hippocampe. Par analogie, cette étude avait pour but de préciser comment le

patron d’activation de CREB établi après un apprentissage spatial pouvait être modifié par un

changement de tâche induisant l’extinction des informations préalablement acquises.

Les processus d’extinction ont été majoritairement étudiés dans le cadre de la peur

apprise. Selon l’hypothèse de Konorski (1948), l'apprentissage de l'extinction ne s'explique

pas par une disparition de l'association de départ, mais plutôt par l'acquisition d'une nouvelle

association masquant la première sans pour autant la supprimer. Cette hypothèse a été

confirmée par différentes expériences qui mettent en évidence que l'association de départ

(son-choc) demeure intacte même dans le cas d’une extinction complète de la réponse

conditionnée (Bouton et Bolles, 1979 ; Bouton et King, 1983 ; Bouton et al., 1993 ; Bouton et

al., 2006). Sur le plan neuro-anatomique, les processus de consolidation et d’extinction d’une

information donnée reposent sur l’établissement de circuits neuronaux distincts, mais

fonctionnant en interaction (Cammarota et al., 2007). Au plan moléculaire, plusieurs cascades

de signalisation (MAPK/ERK, PKA et PI3 kinases) impliquées dans la consolidation d’un

conditionnement interviennent aussi dans la mise en place de son extinction (Falls et al.,

1992 ; Lin et al., 2003c ; Lu et al., 2001). Toutefois, il a été démontré que l’extinction de la

peur apprise repose spécifiquement sur l’activation de la protéine phosphatase calcineurine

qui, par des mécanismes de déphosphorylation, inhibe les kinases et en aval, perturbe

l’activité CREB et la machinerie transcriptionnelle préalablement sollicitée pour la

consolidation de la 1ère

information (Lin et al., 2003b ; Malleret et al., 2001 ; Mansuy, 2003 ;


114

Havekes et al., 2008). En revanche, l’augmentation de l’activité pCREB dans l’hippocampe

par injection d’un inhibiteur de phosphodiestérase retarde l’acquisition de l’extinction de la

peur apprise à un contexte (Monti et al., 2006).

La présente étude, fondée sur une approche comportementale couplée à une approche

par imagerie (détection de CREB phosphorylé) et biochimique (détermination des niveaux de

CREB phosphorylé et CREB total en Western-blot) visait à déterminer (1) si les effets de

deux procédures d’extinction de la mémoire spatiale en piscine de Morris diffèrent sur les

patrons d’activation de CREB dans l’hippocampe et l’amygdale ; (2) si les altérations de

l’activité pCREB lors de l’extinction sont associées à des modifications de l’expression totale

de CREB ; (3) s’il existe des relations entre les modifications d’activité pCREB dans

l’hippocampe et l’amygdale et le statut cognitif des animaux consécutivement aux deux

procédures d’extinction.

II : Méthodologie

Des souris C57BL/6 (5-6 mois) ont été entraînées à mémoriser la position constante

d’une plate-forme dans une piscine de Morris pendant 4 jours consécutifs (4 essais/jour). Un

essai-test de rétention effectué après le dernier essai d’acquisition au Jour 4 a permis de

vérifier que les sujets avaient acquis une bonne maîtrise de la tâche. Ces animaux ont ensuite

été répartis en trois groupes qui ont été entraînés pendant les 5 jours suivants : (1) soit dans

une épreuve d’extinction impliquant un changement journalier de l’emplacement de la plate-

forme (groupe Random-PF) ; (2) soit dans une épreuve d’extinction classique où la plate-

forme est retirée (groupe No-PF) ; (3) soit dans la même tâche de mémoire de référence

(groupe RM). Immédiatement après le dernier essai de cette seconde période d’apprentissage

(Jour 9), un essai de rétention a permis d’évaluer la force du rappel de la position initiale de la

plate-forme. Les profils d’activation de CREB dans l’hippocampe et l’amygdale ont alors été

évalués par immunohistochimie dans les trois groupes d’animaux sacrifiés à trois délais

(15min, 60min, 8h) après l’essai-test final.

Afin de compléter l’étude immunohistochimique, des souris du groupe Random-PF

ont été sacrifiées à 15min et 60min après l’essai-test final et les hippocampes préparés pour

une analyse par Western-blot en utilisant (1) un anticorps dirigé spécifiquement contre CREB

dans son état phosphorylé/actif (pCREB), puis (2) un anticorps qui reconnaît CREB de


115

manière indépendante de son état de phosphorylation (CREB total). Cette analyse a permis de

vérifier si l’extinction affecte spécifiquement la forme phosphorylée de CREB.


(1) Les protocoles No-PF et Random-PF induisent tous les deux l’extinction de la mémoire

spatiale précédemment acquise. Les données comportementales recueillies lors de l’essai-test

final indiquent que les deux groupes extinction ne présentent plus de préférence pour la

position originale de la plate-forme. Cependant, les deux processus induisent le

développement de stratégies comportementales différentes. Les souris du groupe Random-

PF s’adaptent à la nouvelle tâche (diminution des latences d’arrivée à la plate-forme cible du

jour) et développent une stratégie ‘active’ de recherche distribuée sur l’ensemble des

quadrants de la piscine. A l’inverse, pour le groupe No-PF, on note une forte diminution de la

vitesse de nage entre le 1er

essai à J5 et l’essai-test final à J9, due à une augmentation des

périodes de flottaison au cours de chaque session.

(2) L’examen des patrons d’activation de CREB aux trois délais post-apprentissage à J9

montre que le groupe RM présente un patron d’activation biphasique de CREB dans

l’hippocampe (pics à 15min et 8h) semblable à celui observé dans les premières séries

d’expériences. Ce profil est altéré dans les deux conditions d’extinction et cette altération

dépend du protocole utilisé. En effet, les données immunohistochimiques montrent d’une

part, pour le groupe Random-PF par rapport au groupe RM, une diminution significative de

l’activité pCREB hippocampique aux délais 15min et 8h alors que l’activité pCREB est

préservée à 60min. Dans l’amygdale et les autres structures, aucun changement significatif de

pCREB n’est observé ce qui suggère que la procédure Random-PF affecte spécifiquement

pCREB dans l’hippocampe. Les expériences de Western-blot confirment la forte diminution

de la forme phosphorylée de CREB hippocampique au délai 15min post-apprentissage dans le

groupe Random-PF, et indiquent également que le niveau de CREB total n’est pas modifié

par la procédure d’extinction.

En ce qui concerne le groupe No-PF, l’extinction induit une discrète diminution de pCREB

dans le CA1 au délai précoce de 15min et, au contraire, une augmentation de l’activité

pCREB dans l’amygdale aux 3 délais post-apprentissage.


116

(3) Les analyses corrélatives indiquent, pour les animaux Random-PF sacrifiés au délai 60min

post-apprentissage, qu’il existe une corrélation positive et significative entre l’activité

pCREB dans le CA1 et les performances à l’essai-test attestées par le temps passé dans le

quadrant d’origine (celui de la plate-forme de référence). A l’inverse, on observe une

corrélation négative entre les niveaux de pCREB dans CA1 et le temps passé dans le quadrant

cible du jour. Il est important de noter qu’aucune corrélation entre l’activité pCREB

hippocampique et les performances à l’essai-test n’apparaît à ce délai chez les groupes No-PF

et RM. Dans l’amygdale, une corrélation positive entre l’activté pCREB dans le noyau latéral

et le temps passé dans le quadrant d’origine est observée exclusivement chez les animaux du

groupe No-PF à 60min.

Dans leur ensemble, nos données comportementales confirment que les protocoles

Random-PF et No-PF induisent une extinction complète de la mémoire de la position initiale

de la plate-forme. Cependant, alors que les souris du groupe Random-PF, ayant conservé une

représentation mentale de la plate-forme, développent une nouvelle stratégie active de

recherche, les animaux du groupe No-PF montrent un abandon fréquemment observé dans ce

type de protocole et classiquement interprété comme reflétant un état « de type dépressif »

(Porsolt et al., 1978 ; Stewart et al., 1996 ; Schulz et al., 2004 ; Schulz et al., 2007a et b).

L’analyse immunohistochimique de pCREB révèle une sollicitation différentielle des

régions hippocampiques et amygdaliennes selon la procédure d’extinction. En particulier, la

perturbation de pCREB mesurée dans l’hippocampe est plus importante en situation Random-

PF qu’en situation No-PF. La procédure d’extinction Random-PF affecte spécifiquement

l’activité pCREB aux deux pics d’activation consécutifs à la tâche de mémoire de référence

(15min et 8h). Cependant, l’analyse corrélative révèle qu’il existe un lien entre les variations

de pCREB à 60min et le temps passé dans le quadrant d’origine. Ceci suggère qu’au délai de

60min, un changement bi-directionnel de l’état de phosphorylation de CREB dans le CA1 se

comporte comme un switch moléculaire déterminant l’information qui sera par la suite

consolidée (extinction : déphosphorylation ; reconsolidation de l’information spatiale initiale :

phosphorylation). Ainsi, l’acquisition de la nouvelle tâche Random-PF nécessite une

inactivation totale de la fonction CREB (par déphosphorylation) hippocampique

préalablement activée lors du 1er

apprentissage. L’un des principaux candidats pour une telle

inhibition est la calcineurine. En effet, des études ont montré que la calcineurine, dans le cas

du conditionnement classique, exerce un rétrocontrôle négatif sur les phénomènes de

phosphorylation, renforçant ainsi les traces d’extinction au détriment des traces mnésiques


117

initiales (Lin et al., 2003b et c ; Mansuy, 2003 ; Cannich et al., 2004 ; Havekes et al., 2008).

De manière plus générale, nos résultats concernant le groupe Random-PF illustrent

parfaitement l’idée que le rappel « non congruent » (position différente de la plate-forme) en

piscine de Morris induit une compétition entre deux phénomènes (extinction vs

reconsolidation) sous-tendus par la même région cérébrale (hippocampe) mais caractérisés par

des cascades de signalisation différentes.

Concernant le groupe No-PF, l’extinction par retrait de la plate-forme ne modifie pas

l’activité CREB hippocampique de façon significative alors qu’elle sollicite fortement

l’activité pCREB dans le noyau latéral de l’amygdale. De nombreuses données ont montré

que l’amygdale est impliquée dans la modulation de l’encodage de la mémoire dans des

conditions émotionnellement chargées (Desmedt et al., 1998 ; Quevedo et al., 2003 ; Dolcos

et al., 2004), et notamment en piscine de Morris (Packard et al., 1994). Cette modulation

s’effectue au travers de l’activation de l’axe corticotrope (Bianchin et al., 1999 ; Akirav et

Richter-Levin, 2002 ; Ferry et al., 1999) et induit des phénomènes de plasticité neuronale

dépendants de la fonction CREB (Davies et al., 2004 ; Josselyn et al., 2004 ; Hubbard et al.,

2007 ; Canal et al., 2008). Or, le comportement d’abandon que nous avons observé chez les

souris No-PF laisse supposer que l’absence de plate-forme est vécue de manière intensément

stressante. Dans leur ensemble, ces données suggèrent donc que la mise en jeu de l’amygdale

pourrait témoigner spécifiquement d’une forte interaction entre les processus

d’apprentissage (hippocampe) et les composantes émotionnelles décuplées en l’absence du

renforcement attendu.

En conclusion, cette étude apporte de nouveaux arguments soutenant l’hypothèse que

la cinétique d’activation de CREB dans une structure donnée dépend du type d’informations à

consolider et du degré d’implication de cette structure dans l’acquisition et la consolidation

des informations. L’ensemble de nos travaux montre ici que l’extinction de la mémoire

spatiale induit des modifications du patron d’activation de CREB dans l’hippocampe et

l’amygdale, qui dépendent de l’expérience vécue par les souris. En associant nos données

comportementales, immunohistochimiques et biochimiques, il apparaît alors raisonnable de

supposer que les deux protocoles Random-PF et No-PF conduisent à la formation de traces

mnésiques de natures différentes, mais qui entrent toutes deux en forte compétition avec la

trace mnésique initiale et induisent son extinction.


118


119

DISTINCT PATTERNS OF CREB PHOSPHORYLATION AFTER SPATIAL

MEMORY ACQUISITION AND EXTINCTION LEARNING IN MOUSE

HIPPOCAMPUS

Y. Porte, P. Trifilieff, M.C. Buhot, N. Mons

CNRS UMR 5228, Centre de Neurosciences Intégratives et Cognitives, Avenue des

Facultés, 33405 Talence, France.

Article type: Research Paper

Running title: CREB and extinction of spatial memory

Key words: CREB, spatial learning, extinction, hippocampus, amygdala, water maze.

Text pages: 28

Figures: 6; Table: 0

Abstract: 228 words; Introduction: 733 words; Discussion: 1633 words.

Correspondence to: Dr N. Mons, Centre de Neurosciences Intégratives et Cognitives,

Université de Bordeaux 1, Avenue des Facultés, 33405 Talence, France.

E-mail: [email protected]


120

Abstract:

Whereas the neuronal substrates underlying the acquisition of spatial memory have been

extensively studied, the substrates and mechanisms of spatial extinction remain elusive. Here,

we examined the spatio-temporal patterns of cAMP-Response-Element-Binding (CREB)

activation/phosphorylation following acquisition and extinction of a spatial reference memory

(RM) task in the Morris water maze. As previously reported, 9 days of spatial learning evoked

a biphasic pattern of CREB phosphorylation (15 min and 8 h post-training) in the

hippocampus, relative to naive and swim controls. However, after extinction learning, distinct

regional and temporal changes in pCREB levels occurred as a function of the extinction

procedure used. Indeed, at the end of a Random extinction procedure (in which the platform

was placed in different locations on each of the five days following RM acquisition), pCREB

levels in hippocampal CA1 and CA3 areas were only transiently increased at 60 min after

training. Moreover, correlation analyses indicated that the best Random-performers in the 60

min-Random-PF group had the lowest CA1 pCREB levels. By contrast, at the end of classical

extinction procedure (in which the PF was absent for 5 successive days), hippocampal

pCREB level was only transiently reduced at 15 min post-training whereas amygdalar pCREB

was strongly increased at all time points relative to other trained groups and controls. Taken

together, our results suggest that spatial memory acquisition and extinction in the water maze

may act as two competing processes that involving the same cerebral structures, but

dependent on differential recruitments of CREB transcriptional pathway.


121

1. Introduction.

Learning involves both short- and long-term changes in synaptic plasticity, in which

the synthesis of new proteins appears to be a pivotal requirement for long-term storage of

memories (reviewed by McGaugh 1966; Davis and Squire 1984; Matthies 1989; McGaugh

2000; Guzowski 2002). Among the potential actors of de novo protein synthesis needed for

long-term memory formation is the transcription factor CREB (cAMP Response Element

Binding protein). The function of CREB is regulated largely by the phophorylation of its

Ser133

residue throughout the action of various kinases (for reviews, Lonze and Ginty 2002;

Josselyn and Nguyen 2005). During consolidation of many types of LTM in rodents

phosphorylation/activation of CREB mediates the induction of regulatory immediate-early

genes (IEG) whose products, in turn, contribute to the transcription of late downstream genes,

and activate direct effector proteins, such as structural proteins, signalling enzymes or growth

factors (Lanahan and Worley 1998; Lonze and Ginty 2002). Indeed, various studies reported

that hippocampus dependent learning induces two waves of CREB activation within the

hippocampus: one immediately after training and another 6-9h later (Bernabeu, et al. 1997;

Taubenfeld, et al. 1999; Cammarota, et al. 2000; Stanciu, et al. 2001; Bilang-Bleuel, et al.

2002; Mizuno, et al. 2002; Colombo, et al. 2003; Martel, et al. 2007). Further, we recently

showed that spatial training triggers distinct temporal patterns of pCREB depending on the

region considered, the demand of the task and the degree of learning (Porte, et al. in press).

Confirming that temporal pattern of CREB phosphorylation within a structure relies on the

degree of implication of this structure with respect to the nature of information processing, we

recently reported that fear conditioning evokes distinct patterns of CREB activation in

hippocampal CA1 region according to the degree of association between a discrete auditory

conditioned stimulus (CS) and a foot shock unconditioned stimulus (US) (Trifilieff, et al.

2006). In keeping with these findings, we examined whether the spatio-temporal dynamics of

CREB phosphorylation could represent a crucial determinant to dissociate the molecular

processes underlying spatial memory formation and extinction learning in the water maze.

Ample evidence indicates that extinction learning in the water maze is an active ‘inhibitory’

learning process resulting in the formation of new memory traces that no longer associate the

distal cues with the initial refuge platform (PF) (Lattal, et al. 2003; Prados, et al. 2003), and

not simply a passive process of erasure or ‘unlearning’ (Bouton and Bolles 1979; Bouton

1993; Rescorla 2001). Many recent studies have investigated the molecular basis of

acquisition and extinction of hippocampal-dependent learning. Accumulating evidence

indicate that both processes are controlled by the tightly regulated balance between the


122

cAMP-protein kinase (PKA) signaling cascade and protein phosphatase calcineurin, in which

the one counteracts actions of the other (Malleret, et al. 2001; Mansuy 2003; Havekes, et al.

2008). However, major differences between the two processes have been underlined. Indeed,

inhibition of hippocampal PKA activity impaired long-term memory for contextual fear

conditioning and water maze training (Abel, et al. 1997; Wallenstein, et al. 2002; Ahi, et al.

2004) while transgenic inhibition of neuronal PKA activity facilitated extinction of contextual

fear memories without interfering with storage of the original fear memory (Isiegas, et al.

2006). Other studies also reported that enhanced cAMP dependent signalling activity by

administration of cAMP analog 8-Br-cAMP in the midbrain periaqueductal gray (Mc Nally et

al., 2005) or by overexpression of type-1 adenylyl cyclise in the hippocampus (Wang, et al.

2004) impairs extinction of contextual fear memories. Extending these findings, Monti et al.

(2006) (Monti, et al. 2006) found that increased CREB expression and phosphorylation in the

hippocampus enhances retention and slows down extinction of contextual fear memory. These

data strongly suggest that the cAMP-PKA signalling pathway, although required for

hippocampal-dependent memory acquisition, may act as an inhibitory constraint in the

formation of memory extinction.

In the present study, we used two distinct extinction procedures to determine in more detail

how extinction affects the original spatial learning-induced increase in CREB

phosphorylation. After training in a spatial reference memory task in the Morris water maze,

mice were subjected to either a Random-PF procedure in which the original PF was moved to

a random location at each daily session, or a No-PF procedure in which they swam in the

absence of PF. We then examined the temporal patterns of CREB immunoreactivity in the

hippocampus and the lateral nucleus of the amygdala (LA) following spatial acquisition and

extinction training.

2- Material and methods.

2.1-Animals

Experiments were conducted on a total of 90 C57Bl/6 male mice (Iffa Credo; Lyon). At their

arrival, animals were 8 weeks old and weighed approximately 25 g. They were maintained in

collective cages of 20 subjects, on a 12 h light-dark artificial cycle (lights on at 7:00), in a

temperature controlled colony room (22 +/- 1 °C) where they had full access to food and

water. One week before behavioural training, animals (20 weeks old, 30 g) were individually

housed and handled each day during 5 min. They were then tested during the light phase


123

between 7:30 and 18:30. All experimental procedures were conducted in accordance with the

European Communities Council Directive of 24 November 1986 (86/609/EEC).

2.2- Apparatus

The water maze consisted of a swimming pool based on that described by Morris (1984) and

adapted for mice. A white circular tank (140 cm diameter, 40 cm high) was filled to a depth of

30 cm with opaque (non toxic paint, Pebeo, Gemenos, France) water maintained at 20 °C +/-

1 °C. Located inside the pool was a removable, circular (13 cm diameter) platform (PF) made

of transparent Plexiglas, positioned such that its top surface was 0.5 cm below the water. The

apparatus was located in a room uniformly illuminated by a halogen lamp and equipped with

various distal cues on the walls. A video camera fixed to the ceiling of the room and

connected to a video recorder and to a video-tracking system (videotrack, Viewpoint, Lyon,

France) detailed in Malleret, et al. (1999), allowed the recollection of data. The experimenter

followed the course of each trial thanks to a video monitor located in an adjacent room, which

housed the home cages of the mice undergoing testing.

2.3- Behavioral procedures

2.3.1- Pretraining. Two days prior to the acquisition phase, mice performed a familiarisation

session in order to acquire the procedural aspects of the task. They were placed on the PF

occupying a central (non spatial) position for 20 s, and then, were released from 2 peripheral

opposite points. They were allowed to swim during 30 s and the experimenter could verify its

motor capacities for swimming and climbing on the PF. Mice that did not find the PF were

gently invited to follow the finger of the experimenter indicating the way to reach the refuge.

After each pre-training trial, mice were allowed to stay 20 s on the PF.

2.3.2- General training procedure. Each trial consisted in releasing the mouse into the water

facing the outer edge of the pool in one of the virtual quadrant (except the quadrant where the

PF was located) and allowing it to escape to the submerged PF in a maximum of 90 s. After

each trial, animal was allowed to remain for 20 s during which associations between

environmental cues and the PF location could be formed. After completion of each trial, mice

were placed back to their home-cages in an adjacent room, beneath heat lamps in order to

reduce the loss of core temperature.


124

2.3.3- Experimental design.

Acquisition of the reference memory task: Each mouse was given four daily training trials

for 4 consecutive days (days 1-4) with an inter-trial interval (ITI) of 8-10 min. They were

trained to locate the PF situated in the centre of the south-west quadrant, from three peripheral

releasing points according to a counterbalanced sequence of four successive trials. This

rendered inappropriate the use of egocentric or path integration strategies, and mice could find

the PF only by inferring its location from a global representation of the environment (i.e.

allocentric spatial strategy). After completion of the last trial on day 4, all trained mice

received a probe-test, during which they had to swim in the absence of the PF for 90 s. At the

end of this probe trial, subjects were removed from the pool at the exact position where the

target PF was supposed to be, in order to minimize any initiation of extinction process.

Trained mice were then allocated to one of the three groups described below on the basis of

their performance on the probe trial: all mice that failed to show a preference for the original

target quadrant (< 27 %) were dropped from the experiments.

Reference group (RM; n = 27): Mice assigned to the RM group received two consecutive

daily trials (2 min ITI) during which the hidden platform remained in the original location

from days 5 to 9. The first daily trial was always preceded by an exposure trial (20 s on the

PF). On day 9, all mice were given a probe trial (PF removed, 90 s) which occurred

immediately after trial 2.

Random extinction group (Random-PF; n = 20): During each day of Random extinction

procedure (days 5 to 9), the PF location was moved to a new location and mice learnt to reach

the new PF position on two successive trials (2 min ITI) from two peripheral and PF-

equidistant releasing points. The first daily trial was always preceded by an exposure trial (20

s on the PF). Immediately after trial 2 on day 9, mice from the Random-PF group were given

a probe trial (PF removed, 90 s).

Simple Extinction group (No-PF; n = 19): The procedure was identical to Random extinction

procedure in every respect except that each session consisted of two 90 s trials in the absence

of the escape PF. Immediately after trial 2 on day 9, mice were given a probe trial (PF

removed, 90 s).

Trained mice from the three experimental groups (RM, Random-PF and No-PF) were

sacrificed for immunohistochemistry at 15 min (RM: n = 10; Random-PF: n = 7; No-PF: n =

8), 60 min (RM: n = 7; Random-PF: n = 7; No-PF: n = 6) or 8 h (RM: n = 10; Random-PF: n

= 6; No-PF: n = 5) after final probe trial on day 9.


125

2.3.4- Control groups.

Home caged animals: Mice (n = 8) were handled similarly to other subjects prior to the

acquisition phase and taken out of their home-cages to be sacrificed altogether with

experimental animals at the end of day 9.

Swim control animals: Mice (n = 4) received 2 trials / day during which they had to swim in

the pool during 45 s (i.e. mean latency averaged on the 9 days for all experimental groups) in

the absence of PF. They were sacrificed 15 min after last trial on day 9.

2.3.5- Quantification and analysis of behavioural data.

The movements of the subjects were recorded using the VIDEOTRACK system as previously

described (detailed in Malleret et al., 1999). The data were processed using Excel (Microsoft)

in order to calculate the escape latency, i.e. the time required to reach the platform from the

releasing point (in seconds, s); the mean path length run from the releasing point to the PF (in

centimetres, cm); the mean percent of time spent in the RM group target quadrant (QRef) [100

x (time in the target quadrant / total time in the pool)]; and the mean swim speed (path length

/ latency, in cm / s). Analyses of variance (ANOVAs) with Group (RM, Random-PF and No-

PF) as between-subject factor, and Day and Trial as the main within-subject factors were

performed using StatView 5.01 (SAS Institute Inc.) on data from reference memory

acquisition and extinction. Further analyses of individual group comparisons (Bonferroni-

Dunn post-hoc test and Student t-test), were used when the effect of the main factors or their

interaction was significant (P < 0.05). Analyses were also conducted for the probe trials in

terms of the mean swim speed in the whole pool and percents of time spent or path length run

in quadrants. ANOVAs were then performed with Group and Quadrant as the main factors.

To further evaluate spatial selectivity of the mice, when a main effect or an interaction

appeared significant, data of each quadrant were compared to chance level for swimming in

one quadrant zone [i.e. 25 % = 100 x (area of one quadrant / whole pool area (π x 702))] and

to data from other quadrants (Student’s t-test).

2.4- Western blotting

Blots were performed as described previously (Trifilieff et al., 2006). Briefly, mice from the

Random-PF group were decapitated, together with naïve controls (n = 6), at either 15 (n = 3)

or 60 min (n = 3) time points after probe test on day 9. Brains were rapidly removed,

hippocampi were dissected and tissue lysed in a solubilization buffer (10 mM Tris-HCl, 50


126

mM NaCl, 1% Triton X-100, 30 mM sodium pyrophosphate, 50 mM NaF, 5 µM ZnCl2, 100

µM Na3VO4, 1 mM DTT, 5 nM okadaic acid, 2.5 µg aprotinin, 2.5 µg pepstatine, 0.5 µg

PMSF, 0.5 mM benzamidine, 2.5 µg leupeptin). Cell lysates (20 µg per lane) were separated

by 10 % SDS-PAGE before electrophoretic transfer onto polyvinlidene difluoride membrane

(0.45 µm Hybond P, Amersham Biosciences). Membranes were saturated (2 h, room

temperature) with 5 % BSA (Fraction V; Sigma) and incubated overnight at 4 °C with the

anti-active CREB antibody (polyclonal anti-pCREB, 1:2000; Upstate Biotechnology, Lake

Placid, NY). On the second day, blots were incubated (2 h, room temperature) with donkey

anti-rabbit-horseradish peroxidase-conjugated antibodies (1:5000; Amersham Biosciences)

before exposure to the ECL substrate (Amersham Biosciences) and photographic revelation.

Then blots were stripped (glycine-HCl, pH 2.8, two times for 30 min at 55 °C, 10 min in 2 %

SDS), saturated in 5 % non-fat dry milk, and incubated overnight with the total CREB

antibody (polyclonal anti-CREB, 1:1000; Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY).

Quantification was achieved by measuring optical density (OD) directly on photographic

films (ImageJ). Data were presented as the ratio (pCREB-OD / tCREB-OD) and were

analyzed by ANOVA (StatView 5.01; SAS Institute Inc.) with the Group (naïve, 15 min-

Random-PF and 60 min-Random-PF) as the main factor.

2.5- Immunohistochemical procedures

All mice under deep Avertin (10 ml / Kg, i.p.) anaesthesia, were perfused transcardially with

ice-cold 4 % paraformaldehyde in 0.1 M phosphate buffer (PB). The brains were removed

and stored overnight in fixative solution, sectioned (50 µm) on a vibratome (Leica) and then

kept at -20 °C in a solution containing 30 % ethylene glycol, 30 % glycerol, 0.1 M PB until

processed for immunohistochemistry. All solutions contained the phosphatase inhibitor

sodium fluoride (NaF; 0.25 mM). Free-floating sections were rinsed in 0.1 M Tris buffer

saline (TBS, pH: 7.4), incubated with 0.5 % H202 in TBS to inhibit endogenous peroxidase.

After blocking in TBS containing 3 % bovine serum albumin (BSA), 2 % normal goat serum

and 0.2 % Triton X-100, tissue sections were incubated at 4 °C for 48 h with rabbit primary

polyclonal antibody that recognizes the active/phosphorylated form of CREB (anti-pCREB,

1:2000, Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY). After extensive washes in TBS, sections

were incubated in biotinylated goat anti-rabbit IgG (1:2000; Jackson Immunoresearch) for 2

h at room temperature. Sections were again rinsed in TBS before incubation in avidin-

biotinylated horseradish peroxidase complex (Vectastain Elite kit, Vector Laboratories,

Burlingame, CA) for 2 h at room temperature. Sections were rinsed in TBS and then in TB


127

and the revelation accomplished with diaminobenzidine (0.025 % in TB) in the presence of

0.03 % H2O2 for 10-12 min. The sections were washed in TB, mounted on gelatin-coated

slides, dehydrated and coverslipped with Eukitt.

Data quantification and analysis. Quantitative analysis was performed using an imaging

analysis system (Biocom Visiolab 2000, V4.50). The experimenter was blind to the

experimental groups of mice examined. Each region was counted bilaterally with a 10X

objective in at least three consecutive sections per animal (the rostro-caudal distance between

consecutive sections was 0.2 mm). The number of positive nuclei was averaged to produce a

mean. The different brain regions were delimited according to the Franklin and Paxinos

stereotaxic atlas (1997). Data were expressed as the mean (+/- S.E.M.) number of immuno-

positive nuclei per mm2. Statistical analyses of immunohistochemical data were performed

using ANOVAs (StatView statistical software) followed by appropriate post-hoc tests to

determine the source of significance. Differences between groups were considered statistically

significant when probability levels were < 0.05.


128

3.1- Behavioural results

3.1.1- Water maze acquisition.

From days 1 to 4, spatial learning performance was assessed using the standard reference

memory version of the Morris water maze task requiring mice to learn a constant spatial PF

location (Figure 2). Trained mice significantly reduced their escape latencies across training

days (fig. 2A left). Analysis of variance confirmed significant Day (F(3,207) = 38.521; P <

0.0001) and Trial effects (F(3,207) = 7.491; P < 0.0001) but no Day * Trial interaction

(F(9,621) = 1.028; P > 0.4). During the probe test realised immediately after last trial on day

4, all mice exhibited a strong preference for the target quadrant compared to other three ones

(data not shown). ANOVA conducted on the mean percentage of time spent in the four

quadrants confirmed a significant Quadrant effect (F(3,198) = 37.636; P < 0.0001), due to a

bias toward the QRef that was highly statistically different from chance level (Student t-test: P

< 0.0001). Importantly, a posteriori analyses indicated that the RM, Random-PF and No-PF

groups did not differ during acquisition (Group and Day * Group interaction: Fs = 0.388 and

1.042; Ps > 0.3) and retention (Group and Group * Zone interaction: Fs < 1.1; Ps > 0.3).

3.1.2- Reference memory group.

As shown in figure 2A right, the RM group reached asymptotic level of performance on day

7, as revealed by the absence of significant Day effect for the mean escape latencies from

days 7 to 9 (F = 1.08; P > 0.3 , ns). During probe test on day 9, RM mice displayed high

preference for the QRef (F(3,78) = 47.079; P < 0.0001; Fig. 2C). This bias was highly

statistically different from chance level (t(26) = 11.778; P < 0.0001) and time spent in other

three quadrants (all Ps < 0.0001).

3.1.3- Water maze extinction.

Random extinction group. Figure 2B depicted the results of the Random-PF extinction

training in which the PF was placed to a new location at each daily session. The Random-PF

animals spent less time in the QRef over days 5 to 9 suggesting that mice extinguished their

preference for the former target quadrant. ANOVA conducted on the percent of time spent in

the QRef on the first extinction trial for each session revealed significant effects of Group

(F(1,51) = 40.686; P < 0.0001) and a significant Day * Group interaction (F(4,204) = 14.817;

P < 0.0001). As shown in Fig. 2A right (grey circles), the mean escape latencies to locate the

target PF increased on day 5 for the Random-PF group, resulting in a significant effect Group


129

(F(1,52) = 117.369; P < 0.0001). Post-hoc comparisons confirmed that extinction training

significantly increased escape latencies on the first and second sessions (days 5-6 vs day 4: P

< 0.0001) but then the Random-PF group showed a decrease in latencies over sessions

(F(4,100) = 3.575; P = 0.0091; Day 5 or 6 vs Day 9: Ps < 0.01). Direct comparisons between

the Random-PF and RM groups indicated that there was a significant reduction of the time

spent in QRef after each extinction session (from days 6 to 9 all Ps < 0.001) suggesting that

the Random-PF mice adapted their research behaviour to the new situation. Analysis of the

mean percent of time spent in the different quadrants during final probe trial on day 9 (Fig.

2C) revealed significant effects of the Quadrant (F(3,153) = 35.458; P < 0.0001) and Group *

Quadrant interaction (F(3,153) = 22.870; P < 0.0001). Unlike the RM animals, the Random-

PF mice had no preference for the former QRef (vs chance level: t(25) = 0.354; P > 0.7, ns)

confirming that the original learning was well extinguished. Importantly, no significant

difference was found between RM and Random-PF animals when measuring the mean swim

speed neither during extinction period nor during final probe trial (Ps > 0.2, ns).

No-PF extinction group. Figure 2A right depicted the results of the No-PF extinction training

in which the PF was removed from Days 5 to 9. Planned comparisons between the RM and

No-PF groups at each daily session revealed that escape latencies were significantly increased

in the No-PF mice during extinction training (Group effect: F(1,44) = 68.130; P < 0.0001 and

Day * Group interaction: F(4,176) = 8.448; P<0.0001). Post-hoc analyses confirmed

significant differences between day 5 vs days 7-9 (all Ps < 0.01), indicating that the No-PF

mice progressively developed a lack of interest for the original PF location. Moreover,

analyses of variance conducted on data from the mean swim speed during the extinction

period indicated that, compared to RM subjects, mice from the No-PF group swam slower and

slower across days, especially on the second trial of each session (Day * Group interaction for

trial 2: F(4,176) = 3.492; P = 0.009; Group * Trial interaction: F(1,44) = 36.935; P < 0.0001;

see Fig. 2D and E). This resulted in slower swim speed in the No-PF group during trial 2 on

days 8 (P = 0.0187) and 9 (P = 0.0011). When considering the percent of time spent in the

target QRef, there was also a significant Day effect (F(4,72) = 7.228; P < 0.0001; Fig. 2B) due

to significant differences between day 5 and days 7-9 (Ps < 0.001). During final probe trial on

day 9, No-PF animals displayed no preference for the original target QRef (Fig. 2C). Overall,

mice seemed to avoid this quadrant and spend more time in the three other ones. A significant

effect of the Quadrant was found (F(3,54) = 18.501; P < 0.0001), especially due to longer

time spent in the releasing quadrant than in others (all Ps < 0.01). As analyses conducted on


130

the mean swim speed during probe trial revealed significant effect of Group (F(1,44) =

95.174; P < 0.0001) due to slower swim speed for the No-PF animals relative to the RM

group (Fig. 2F), we analysed the percent of path length, a parameter that does not depend on

the mean swim speed and immobility. Results were found similar to percent of time (F(3,54)

> 23; P < 0.0001 and releasing Q vs other Qs: all Ps < 0.01; not shown).

3.2- Immunohistochemical results

3.2.1. Differences in pCREB levels within the hippocampus and the amygdala following

spatial acquisition and extinction.

Levels of pCREB immunoreactivity (pCREB-ir) were measured 15 min following

probe trial on day 9 in the three trained (RM; random-PF; No-PF) groups and compared to

those of controls (naive; swim). In the hippocampus, ANOVA for repeated measures revealed

a significant Group effect (F(4,32) = 16.116; P < 0.0001) and a significant interaction effect

between ‘Groups’ and ‘Hippocampal subregion’ (F(4,32) = 4.414; P < 0.0059). Further

analysis revealed a significant Group effect in the dorsal CA1 (F(4,32) = 14.364; P < 0.0001)

with post-hoc analysis revealing a higher level of pCREB in the RM group than in the

Random-PF (P < 0.0001), No-PF (P = 0.0006) and controls (naive and swim : P < 0.0001 and

P = 0.0018 respectively) groups. In contrast, levels of pCREB did not differ in the No-PF and

Random-PF groups relative to naive and swim controls (all Ps > 0.05; except for naive vs No-

PF: P = 0.005). In the dorsal CA3, a significant Group effect was also observed (F(4,32) =

13.469; P < 0.0001) with levels of pCREB significantly greater in the RM and No-PF groups

than in controls (naive and swim : all Ps < 0.01; except No-PF vs swim: P > 0.7, ns) and

higher pCREB level in the RM group relative to the Random-PF group (P < 0.0001) and No-

PF group (P = 0.0006). In the amygdala, there was also a significant Group effect (F(4,32) >

3.6; P = 0.01) which was mainly due to significant increased pCREB level in the No-PF

group relative to naive and swim controls (Ps < 0.05) and other trained groups (RM: P < 0.01;

Random-PF: P < 0.05).

3.2.2- The Random-PF and No-PF extinction procedures induced distinct patterns of

pCREB.

We examined whether the different training conditions would result in different

patterns of pCREB in the dorsal hippocampus and the amygdala. To that end, patterns of

CREB phosphorylation were compared in animals sacrificed at 15 min, 60 min or 8 h after

probe trial on day 9. We first compared Random-PF and RM groups. In the CA1 region, two-


131

way ANOVA revealed a significant effect for Group (F(1,41) = 25.208; P < 0.0001) and a

significant interaction effect between ‘Group’ and ‘Time of sacrifice’ (F(2,41) = 5.307; P =

0.0089). The Group condition by Time of sacrifice interaction was attributable to greater

pCREB level among the RM group relative to the Random-PF group at 15 min and 8 h after

training, but not at 60 min after training (Fig. 4A). Indeed, in the RM group, the greatest CA1

CREB activation was detected at the 15 min time point (vs 60 min: P = 0.03 ; vs 8 h: ns)

whereas CA1 pCREB level in the Random-PF group was significantly higher at 60 min after

training relative to other time-points (vs 15 min: P = 0.0485 ; vs 8 h: P = 0.008). In the CA3

region, two-way ANOVA also indicated a significant Group effect and a significant Group *

Time of sacrifice interaction (Fs > 4; Ps< 0.05). Significantly greater pCREB levels were

found after RM training relative to naive controls (all Ps <0.01), whatever the time of

sacrifice. Oppositely, in Random-PF mice, significant pCREB increase was found only in the

group sacrificed 60 min after training (P < 0.0001).

Representative immunoblots using antibodies that specifically detect either Ser133

-

pCREB or total CREB in hippocampal homogenates from naive controls, 15 min-Random-PF

and 60 min-Random-PF animals are shown in Fig. 5. ANOVA conducted on the ratio

(pCREB / CREB) revealed a significant effect of the Group (F(2,9) = 4.801; P = 0.0381; Fig.

5A). Confirming our immunohistochemical data, there was a significant difference in pCREB

level between naive controls and the 60 min-Random-PF animals (+ 108 %; P < 0.05). Given

that hippocampal CREB levels in the two Random-PF groups were similar to naive controls

(P > 0.5; Fig. 5B), we can conclude that Random-PF extinction training specifically affects

the phosphorylation status of CREB rather than the protein level.

In contrast to the Random-PF group, there was no effect of Time of sacrifice in the

No-PF group for none of the structures analyzed (all Fs < 1.2; all Ps > 0.3). Indeed,

significant increases of pCREB levels were found at each delay compared to naive controls

(CA1: Fs > 5; Ps < 0.05; CA3: Fs > 11; Ps < 0.01; LA: Fs > 22; Ps < 0.001, except at 8h P =

0.0555). However, the three No-PF groups did not differ significantly to the swim controls

whatever the structure examined (all Ps > 0.05) except for the 15 min and 60 min time points

in the LA (both Ps < 0.05). When comparing No-PF and RM groups, ANOVA revealed a

significant main effect of the Group in CA1 (F(1,40) = 5.168; P = 0.0285, Fig 4A) due to

higher levels of pCREB in 15 min-RM group than in the three No-PF groups (all Ps < 0.05).

By contrast, a strong significant effect of the Group was seen in the LA (F(1,39) = 8.543; P =

0.0057, Fig. 4C) due to higher levels of pCREB in 15 min- and 60 min-No-PF groups than in

corresponding RM groups (all Ps < 0.05).


132

Finally, direct comparisons between Random-PF and No-PF groups revealed

significant effects Group * Delay of sacrifice interaction in the CA3 (F(2,33) = 4.813; P =

0.01). ANOVA also revealed a strong significant effect of Group in the LA (F(1,31) > 16; P =

0.0003). These effects were mainly attributable to significantly lower activation of CREB in

Random group at 8 h post-training time point in CA3 (P < 0.01) and at 15 min and 60 min in

the LA (Ps = 0.0096 and 0.0152 respectively).

3.2.3- Relationships between spatial learning performance and levels of hippocampal

pCREB-ir for the Random-PF and No-PF groups.

To better understand the relationships between hippocampal CREB activation and

spatial reference learning and extinction, we next investigated whether the number of pCREB

immunoreactive nuclei was related to learning performance during probe trial on day 9. In the

RM procedure, no statistically reliable correlation existed between behavioural performance

and pCREB levels whatever the time interval or region considered. In the Random-PF

procedure, a significant and positive correlation was found between CA1 pCREB at 60 min

post-training and the percent of swim time spent in the target QRef (R=0.805; p=0.028).

Conversely, a negative, although not statistically significant, correlation occurred between

CA1 or CA3 pCREB and percent of time spent in the QRandom (CA1: R=-0.681; P=0.09; R=

-0.730; P=0.06). Thus, as seen in Fig. 6, the Random-PF animals showing a slower memory

extinction rate tended to display higher pCREB levels in the hippocampus. In the No-PF

procedure, no correlation existed between behavioural performance and hippocampal pCREB

levels whereas in the LA, a positive correlation between pCREB at 60 min and percent of

time spent in the target QRef just failed to reach significance (LA: R= 0.799; R=0.056).


133

4- Discussion

In the current study, we examined the differential patterns of CREB phosphorylation

within the hippocampus and the amygdala following spatial memory and extinction learning.

Mice trained in the RM task displayed a highly significant increase in hippocampal pCREB-ir

levels at early (15-60 min) and late (8 h) post-training time points, when compared to naive

and swim controls. The present results indicate that the extinction learning-related changes in

CREB phosphorylation differ greatly according to the extinction procedure and structure

considered. The complete extinction of previously acquired RM task following the Random-

PF training resulted in (1) a strong reduction of hippocampal CREB phosphorylation at both

15 min and 8 h, but not at 60 min and (2) no changes in pCREB-ir levels in the amygdala. In

addition, correlational analyses revealed that CA1 pCREB levels in the 60 min-Random-PF

animals were related to behavioral performance in the Qref during probe trial. In contrast, the

No-PF extinction learning weakly reduced the hippocampal pCREB-ir levels at 15 min only

but significantly increased CREB phosphorylation at 15-60 min after training in the

amygdala. The present work suggests that the two extinction learning procedures are

mediated by distinct and specific changes in CREB phosphorylation in the hippocampus and

the amygdala.

4.1- Behaviour

As expected, initial training in the standard RM task (days 1-4) resulted in a good

acquisition of the memory for the PF location in all experimental groups (decreasing latencies

and bias toward the target QRef during probe trial). To examine the role of pCREB in

extinction of spatial memory, mice were exposed from days 5-9 to either a Random-PF

procedure (with the position of the PF being changed every session) or a No-PF procedure

(without PF). During probe trial that followed the 5th

session of extinction, the Random-PF

and No-PF groups showed a complete extinction of the original PF location (as indicated by a

decrease in searching consistency toward the former Qref) confirming that there are several

ways to extinguish an established preference in the water maze (Lattal and Abel, 2000; Lattal,

et al. 2003). Although the two extinction groups showed no preference for the original PF

location, the mechanisms underlying the extinction might differ for mice in these groups. We

show that, over the course of extinction sessions, the Random-PF group displayed a constant

swim speed whereas in the No-PF group, swimming in the absence of PF led to an increase in

the amount of time a mouse spent floating. During probe trial, the No-PF animals persisted in


134

the releasing quadrant and adopted the strategy of floating. As suggested by previous studies,

immobility in the No-PF group, which learned that searching is futile, may be indicative of a

despair or depressive behavior (Porsolt, et al. 1978; Stewart, et al. 1996; Lattal, et al. 2003;

Lattal, et al. 2004; Schulz, et al. 2004; Schulz, et al. 2007a; Schulz, et al. 2007b). The

Random-PF procedure, in contrast, eliminated the original preference and mice continued to

maintain an active PF-directed search strategy. Indeed, the present results show that, during

probe trial, the Random-PF mice readily abandoned the area that previously contained the PF

and then engaged in an apparent random search (similar percent of time spent in the four

quadrants). Thus, in agreement with Susuki et al. (2004), the present results show that the two

extinction conditions triggered the formation of a new memory trace “PF no longer there” that

competes with the original memory “PF should be there”.

4.2- The Random-PF extinction-related CREB phosphorylation is structure, time and

state specific.

We and others have demonstrated that consolidation of hippocampus-dependent

learning tasks leads to at least two waves of neuronal plastic changes (Bernabeu, et al. 1997;

Taubenfeld, et al. 1999; Cammarota, et al. 2000; Stanciu, et al. 2001; Bilang-Bleuel, et al.

2002; Mizuno, et al. 2002; Colombo, et al. 2003; Martel, et al. 2007; Porte et al., 2008).

Consistent with these findings, training in the RM task was associated with a highly

significant increase in hippocampal pCREB-ir at 15-60 min and 8 h post-training time

intervals relative to naive and swim controls. Importantly, when compared to the RM groups,

there was a strong decrease in CREB phosphorylation in the hippocampal CA1 and CA3 of

the Random-PF animals. The reduced CREB phosphorylation occurred early after extinction

training (i.e. 15 min time-point) and within a relative short period (< 60 min), and was

followed by a second decrease of pCREB-ir at around 8 h after training. Our data also show

that (1) the Random-PF extinction learning affects specifically the phosphorylation state of

CREB whereas inactive CREB protein remained unchanged and (2) CA1 pCREB levels in the

60 min-Random-PF animals were closely related to individual performance on the probe trial

(i.e. the higher CA1 pCREB levels were observed in mice that had the stronger memory for

the original Qref at the final retention test). Furthermore, when compared to the RM and

control groups, the Random-PF mice did not show any significant changes in CREB

phosphorylation in the amygdala. Consistent with our data indicating that the extinction of the

spatial RM response in the Random-PF mice relies on a rapid and transient CREB

dephosphorylation specifically in the hippocampus, previous studies demonstrated that


135

extinction of conditioned fear produced a rapid increase in phosphatase activity likely via

upregulation of Ca2+

-dependent phosphatase calcineurin (Lin et al., 2003a,c). Activation of

neuronal calcineurin during memory extinction has been proposed to create negative-feedback

loop that suppresses PKA activity (and downstream proteins such as CREB) and weakens the

original memory both in the hippocampus and the amygdala (Lin, et al. 2003a; Lin, et al.

2003b; Mansuy 2003; Cannich, et al. 2004; Havekes, et al. 2008). Furthermore, it has been

reported that transgenic inhibition of PKA activity (Isiegas, et al. 2006) or inhibition of PKA

anchoring to A-kinase facilitate fear extinction (Nijholt, et al. 2008) whereas the increase in

PKA-CREB pathway slows down memory extinction (Monti et al., 2006). However, when

mice were sacrificed at 60 min after extinction training, we found that (1) the levels of

hippocampal CREB phosphorylation were similar in the Random-PF and RM groups and (2)

CA1 pCREB levels in the Random-PF mice were significantly and positively correlated with

the time spent in the QRef during probe trial. Together, these findings indicate that extinction

of previously formed spatial memory requires CREB dephosphorylation in the hippocampus

and suggest that at the 60 min time point, bi-directional changes of the phosphorylation state

of CREB in the hippocampus behaves as a molecular switch for extinction (decrease) or

reconsolidation (increase) of the original spatial memory. Thus, our results support the

proposed idea that non congruent retrieval in the Morris water maze may trigger two

competing processes (i.e. reconsolidation and extinction) characterized by different molecular

requirements (Suzuki et al., 2004; Rossato et al., 2006). Alternatively, while a transient

decrease in calcineurin activity leading to increased phosphorylation of CREB may be

necessary for Random-PF memory, further inhibition of calcineurin may be detrimental as

suggested by the fact that hippocampal CREB activation observed at 60 min was not followed

by a second activation at 8 h post-training time.

4.3- Extinction induced changes in pCREB levels depend on the protocol.

The present results further show that the extinction-induced changes in CREB

phosphorylation greatly depend on the extinction protocol used and the brain structures

examined. Indeed, the No-PF animals showed only a modest decrease of pCREB level in the

hippocampus at 15 min post-training, whereas a highly significant increase in CREB

phosphorylation was observed in the amygdala relative to the RM and Random-PF groups. In

a recent study, Kogan and Richter-Levin (2008) explored the regional patterns of CREB

phosphorylation 20 min after swimming without PF under high or low stress conditions. They

described a great increase in pCREB within the basolateral nucleus of the amygdala and CA1


136

subfield of the hippocampus under higher stress conditions. On the contrary, lower stress

condition resulted in reduced CREB activation in the CA1 compared to animals trained in a

spatial reference memory task. Thus, our data in the LA, taken together with behavioural

depressive-like symptoms, seem to be congruent with a high stress level episode. In contrast,

pCREB level in the hippocampus of No-PF group much better recalled a low-stress activation

pattern. However, this is not so surprising, as in our experiments, animals had previously

learned to associate the PF location with cues of the environment, so that the absence of PF

can really be thought as a new spatial learning. Our data showed increased CREB activation

in the amygdala under No-PF conditions, but only when previous learning was being

extinguished (No-PF group), and not in total absence of learning (swim controls). This further

supports the idea that CREB activation in the amygdala mainly reflects the interaction

between learning and stress. Indeed, evidence in both humans and rodents suggest that the

amygdala may act by modulating the memory encoding under emotionally charged conditions

(Desmedt, et al. 1998; Bianchin, et al. 1999; Ferry, et al. 1999; Frey, et al. 2001; Akirav and

Richter-Levin 2002; Quevedo, et al. 2003; Dolcos, et al. 2004) and pharmacological

experiments further showed enhanced performance in the spatial version of the task by post-

training intra-amygdala infusions of D-amphetamine (Packard, et al. 1994).

In conclusion, our findings clearly indicate close relationships between extinction of spatial

learning and alteration of CREB mediated transcription. We further demonstrate a high

degree of interaction between learning and emotional components, and show that extinction

of a spatial memory trace tightly depends on the way memory is being extinguished. Another

question frequently discussed in the literature, and still without consensual answer, is the

dependence of spatial memory extinction in the water maze to protein synthesis. Taking our

results into account, it should be interesting to assess whether Random-PF or No-PF

extinction procedures differentially induce de novo protein synthesis. Further experiments are

being achieved to address this issue.

Acknowledgements: This work has been supported by the Centre National de la Recherche

Scientifique and Université de Bordeaux. We thank L. Decorte and A. Faugère for technical

assistance and D. Panzeri, N. Argenta and J. Huard for animals care and breeding.


137

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144

Figure legends

Figure 1: Experimental design. Behavioural training procedures are depicted. Acquisition of

the reference memory (RM) task in the water maze was achieved across four daily training

sessions of four 90 s trials with a constant PF location. At the end of the acquisition period,

mice were subjected to a probe test (90 s without PF) in order to assess preference for the

target quadrant and assign subjects to one of the following groups. Two extinction protocols

were developed and applied from days 5 to 9. A first group of animals was subjected to two

daily trials with a pseudo-random PF location preceded by a 20 s presentation of the PF of the

day (Random-PF group). A second group of mice was subjected to exactly the same

procedure except that the PF was removed from the pool (No-PF group). Finally, a last group

(not represented) followed a RM training (PF at the same location as during acquisition) of

two daily trials preceded by a PF presentation (RM group). Whatever the case, all mice were

subjected to a final probe trial on day 9 just following the last training trial. Thin black arrows

represent releasing points.

Figure 2: Behavioural results. (A) All subjects acquired the reference memory task as

assessed by decreasing latencies from day 1 to day 4 (left panel). Extinction of the initial RM

target quadrant preference (right panel) was first assessed by measuring either latencies to

reach the PF (RM and Random groups) or the time spent before first crossing of the initial PF

annulus (No-PF group). (B) Extinction was confirmed by decreasing percent of time spent in

the initial target quadrant in Random and No-PF groups across days, as opposed to increasing

to an asymptotic level for RM mice. (C) Percent of time spent in the four fictive quadrants

(RM target quadrant, Random-PF target quadrant, Adjacent 1 and 2) during final probe trial

on day 9 confirmed extinction in both Random and no-PF groups, unlike RM group, which

continued displaying high preference for the original target quadrant. (D) Mean swim speed

(cm.s-1

) on trials 1 and 2 for RM and No-PF groups averaged on days 5 to 9 revealed a strong

effect of the trial in No-PF mice only, which displayed slower swimming on the second trial.

(E) Mean swim speed (cm.s-1

) of mice from RM and No-PF groups during the second trial of

each extinction session (days 5-9) revealed increase in time spent floating by No-PF mice

from day to day. (F) Mean swim speed (cm.s-1

) during probe trial on day 9 for RM and No-PF

groups. vs chance level: *** P < 0.0001; vs other quadrants: °°° P < 0.0001; RM group vs No-

PF group: ### P < 0.0001. Dotted lines represent chance level. ♣ Random-PF target quadrant

corresponds to releasing quadrant of the No-PF group.


145

Figure 3: Early levels of CREB phosphorylation after day 9. Mice from RM, Random-PF

and No-PF groups were sacrificed 15 min after probe trial on day 9 together with controls

(naive and swim). pCREB immunoreactivity was then analysed in hippocampal CA1 (A) and

CA3 (B) subfields, and the lateral nucleus of the amygdala (C). Data are expressed as the

mean (+/- S.E.M.) number of pCREB immunopositive nuclei per mm². vs naive controls: ** P

< 0.001 and *** P < 0.0001; vs RM group: °° P < 0.001 and °°° P < 0.0001; vs No-PF group:

# P < 0.05.

Figure 4: Distinct patterns of pCREB following RM task and spatial extinction. Mice

from RM, Random-PF and No-PF groups were sacrificed at three post-training delays (15

min, 60 min and 8 h). CREB phosphorylation patterns were analysed by

immunohistochemistry in the hippocampal CA1 (A) and CA3 (B) subfields, and the lateral

nucleus of the amygdala (C). Data are expressed as the mean (+/- S.E.M.) number of pCREB

immunoreactive nuclei per mm². vs respective 60 min * P < 0.05 and ** P < 0.001; vs

respective Random-PF group: ° P < 0.05, °° P < 0.01 and °°° P < 0.0001; vs respective RM

group # P < 0.001. Dotted lines represent naive controls’ level.

Figure 5: Western blots confirmed the early lack of activation of CREB in the

hippocampus of Random-PF group. Mice from the Random-PF group were sacrificed 15

min and 60 min after probe trial on day 9 and hippocampi prepared for western blot analysis.

(A) Total amount in CREB protein within the hippocampus of 15 min- and 60 min-Random-

PF, and naive mice expressed as the mean (+/- S.E.M) optical density (OD). No differences

were found for hippocampal CREB total amount between the two experimental groups and

controls. (B) CREB hippocampal phosphorylation was assessed by determining for each

subject the ratio (pCREB-OD / tCREB-OD). No CREB activation was seen 15 min after

probe trial on day 9. Representative pCREB and CREB immunoblots from Random-PF mice

sacrificed 15 min or 60 min after final probe trial and naive controls are shown above the

respective bars. vs 15 min-Random-PF group: * P < 0.05.

Figure 6: pCREB hippocampal levels of Random-PF mice were related to individual

performance. Correlation analysis realised on data from mice sacrificed 60 min after day 9

revealed that Random-PF pCREB levels in the CA1 were closely related to the percent of

time spent in the RM (C) and Random-PF (D) target quadrants. Mice performing best the

Random-PF task showed the lowest levels of pCREB activity and mice that best recalled the


146

original PF location tended to display the higher pCREB levels. By contrast, no correlation

was seen between 60 min-RM group pCREB immunoreactivity and the same behavioural

parameters (A and B).


147

Figure 1

Day 1 Day 4 Probe trial

RM

acquisition

Day 5 Day 6 Day 7 Day 8 Day 9 Probe trial

Random-PF

No-PF

Figure 1


RM

acquisition


Random-PF

No-PF


RM

acquisition


Random-PF

No-PF


Random-PF

No-PF


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1 2 3 4 5 6 7 8 9

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149

Figure 3

Naive Swim No-PFRM Random-PF

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Figure 3


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300

400

500

600


150

Figure 4

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°


151

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Figure 5

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Random-60min

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Random-15min

Random-60min

Figure 5

pCREB

CREB


152

Figure 6

0

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100

150

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Figure 6

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D

D iscussion générale

153

D iscussion généraleD iscussion généraleD iscussion généraleD iscussion générale


154


155

L’organisation systémique de la mémoire chez l’Homme et l’animal permet de

distinguer entre autre la mémoire à court terme (de quelques secondes à quelques heures) de

la mémoire à long terme (de quelques heures à toute une vie). Ces deux systèmes sont liés par

une étape de « consolidation », qui permet le renforcement d’une trace initialement fragile en

une trace plus robuste. Des travaux antérieurs effectués en conditionnement classique au sein

de l’équipe, avaient permis de montrer comment l’établissement d’une cinétique différentielle

d’activation de la cascade MAPK/ERK-CREB peut participer à l’élaboration de

représentations mnésiques spécifiques en fonction de la tâche (Trifilieff et al., 2006). Ainsi, la

consolidation d’une association entre le contexte de conditionnement et un choc électrique

(hippocampo-dépendante) se traduit par une activation biphasique des MAPK/ERK et CREB

dans le CA1 (pics précoce 0-60min et tardif 6-9h), alors que la consolidation d’une

association élémentaire entre un son et le choc (amygdalo-dépendante) n’induit qu’un pic

précoce et transitoire (0-15min). Dans ce cadre, nos travaux ont porté sur l'étude des

cinétiques de la voie transcriptionnelle CREB-gènes précoces lors de la consolidation ou de la

perturbation (vieillissement, extinction) d'une mémoire spatiale acquise en piscine de Morris.

Notre démarche, fondée sur l’association de l’approche comportementale et des techniques

d’immunohistochimie et de Western-blot, visait à : (1) étudier la cinétique d’activation de

CREB dans le cerveau afin de cartographier les structures cérébrales impliquées dans

l’apprentissage spatial ; (2) définir les patrons temporels d'activation de la voie

transcriptionnelle CREB en fin d’apprentissage spatial (mémoire consolidée) afin de

déterminer s’ils varient en fonction de la structure étudiée et du degré de maîtrise de la tâche ;

(3) mieux définir les bases moléculaires du déclin cognitif observé dans les tâches

hippocampo-dépendantes lors du vieillissement normal ; (4) mettre en évidence des relations

entre des modifications d’activité pCREB et les statuts cognitifs différentiels d’animaux

soumis à deux procédures d’extinction de la mémoire spatiale.

1- Patron biphasique d’activité transcriptionnelle CREB dépendante,

signalisation moléculaire et consolidation mnésique.

Dans le premier article, nous mettons en évidence la mise en place d’une activation

biphasique de CREB dans le CA1, chez des animaux entraînés pendant 9 jours et qui

maîtrisent parfaitement la tâche spatiale en mémoire de référence en piscine de Morris. Le

patron biphasique que nous observons spécifiquement dans le CA1 est en accord avec l’idée


156

générale que la consolidation mnésique repose sur deux phases (précoce et tardive)

d’activation de la transcription (Igaz et al., 2002) et de la traduction géniques (Quevedo et al.,

1999). Précisément, nous montrons que l’acquisition d’une tâche de mémoire de référence

spatiale en piscine de Morris induit, au 9ème

jour d’entraînement, un pic précoce d’activation

de CREB dans le CA1 immédiatement après le dernier essai et qui se maintient pendant

60min. Ce premier pic est suivi d’une seconde activation tardive aux environs de 9h qui

diminue progressivement mais reste, après 24h, significativement supérieure au niveau de

base de souris témoins restées en cage.

i) Phase précoce de consolidation cellulaire

De nombreuses études pharmacologiques, biochimiques et génétiques ont montré

l’implication de différentes kinases (CaMK, PKC, MAPK/ERK, PKA) dans l’acquisition et la

consolidation de tâches dépendantes de l’intégrité de l’hippocampe. Cependant très peu

d’études se sont intéressées à leur cinétique temporelle d’activité lors d’un apprentissage

spatial. Bien que toutes ces kinases semblent intervenir durant la première heure suivant un

apprentissage simple tel que le conditionnement classique ou l’évitement conditionné,

l’examen des données de la littérature permet de dégager une cinétique temporelle plus ou

moins précise de leur action durant la phase précoce de consolidation cellulaire. D’une

manière générale, les protéines régulées par le Ca2+

semblent impliquées plus précocement.

Ainsi, une étude pharmacologique a montré in vitro que l’application d’un stimulus

dépolarisant sur des neurones hippocampiques induit une phosphorylation très rapide (<2min)

et soutenue (>60min) de CREB, sous-tendue par la convergence d’un signal rapide CaMK-

dépendant et d’un signal lent MAPK-dépendant. Plus précisément, dans un premier temps (10

premières minutes suivant la stimulation), l’activation de CREB dépend presque uniquement

de l’activité des CaMK Kinases et de la CaMK IV. Dans un second temps (≈30min), une

coopération (cross-talk) entre les voies CaMK et MAPK se met en place, jusqu’à ce que

l’activation de CREB ne dépende plus que de l’activité prolongée des MAPK (>60min) (Wu

et al., 2001). Concordant avec ces données, il a été montré que la CaMK II agit dans une

fenêtre temporelle restreinte de 0 à 30min (pic modeste) après entraînement dans une tâche

d’évitement (pour revue, voir Shobe, 2002) alors qu’il existe une fenêtre temporelle de 60-

90min durant laquelle l’activation de la MAPK et de la PKA est effective dans la

consolidation de la mémoire de peur conditionnée à un contexte (Wallenstein et al., 2002 ;

Trifilieff et al., 2007). Par ailleurs, bien que l’activité de la PKC (Ca2+

et DAG dépendante)

soit soutenue dans l’hippocampe pendant au moins 90min après un conditionnement à un


157

contexte (Wallenstein et al., 2002), elle ne semble effective pour la consolidation de la

mémoire spatiale en piscine de Morris que dans une fenêtre très réduite immédiatement après

l’apprentissage (Bonini et al., 2007). Partant de ces données, nous proposons qu’une

coopération temporelle fine entre les protéines kinases dépendantes des signaux calciques

(CaMK, PKC), puis non dépendantes du Ca2+

(PKA, MAPK voire CaMK II dont

l’autophosphorylation prolonge l’activité de manière indépendante du Ca2+

) permettrait

l’induction et le maintien de l’activité pCREB durant au moins 60min après l’entraînement.

De manière intéressante, nous montrons chez des souris ne maîtrisant pas la tâche (groupe

Ref-2T, chapitre 1) que l’activation précoce de CREB dans le CA1 au 9ème

jour est très

transitoire et revient en moins de 15min au niveau de base observé chez des souris sacrifiées

avant l’entraînement. Dans ce cas, un déséquilibre de la balance kinases/phosphatases,

notamment dû à un défaut d’activité des kinases les plus soutenues telles que les PKA et

MAPK, associé à une augmentation de l’activité déphosphorylante (calcineurine), pourrait

être à l’origine de la chute rapide des niveaux de pCREB. Cependant, nous observons chez les

souris du groupe ne maîtrisant pas la tâche, que l’activation immédiate de CREB dans le CA1

est d’une amplitude comparable à celle observée chez les souris la maîtrisant parfaitement

(groupe Ref-4T). Récemment, Colombo et al. (2003) ont montré chez le rat, après un

apprentissage dans un labyrinthe en croix, une activation immédiate de CREB dans

l’hippocampe et le striatum qui ne se prolonge à 60min dans l’hippocampe que chez les rats

développant une stratégie spatiale et dans le striatum chez ceux adoptant une stratégie

procédurale. En accord avec ces données, nos travaux suggèrent que la durée, plutôt que

l’amplitude, de l’activation précoce de CREB dans le CA1 reflète spécifiquement la

consolidation, et permet l’induction des phénomènes de plasticité (transcription des gènes

précoces, synthèse protéique) nécessaires au maintien durable de l’excitabilité neuronale.

ii) Phase tardive de consolidation cellulaire

Concernant le second pic d’activation de CREB aux environs de 9h, Trifilieff et al.

(2006) ont montré qu’il dépendait, dans le cas d’un conditionnement contextuel, de

l’activation des MAPK/ERK. Concordant avec cette idée, une activation prolongée des ERK

dans le cortex piriforme est nécessaire au maintien des modifications de plasticité neuronale

induites plusieurs jours après une tâche de discrimination olfactive (Cohen-Matsliah et al.,

2007). Toutefois, d’autres enzymes ont été impliquées dans cette réactivation tardive. Par

exemple, il a été montré que l’apprentissage d’un conditionnement à long terme induit une


158

activation très prolongée des PKA et PKC chez l’abeille (Grunbaum et Muller, 1998 ; Muller,

2000).

Afin de préciser ce qu’implique, d’un point de vue fonctionnel, la réactivation tardive

de CREB dans le CA1, nous avons étudié le patron d’activité de l’une de ses cibles, le gène

précoce zif268. Nous avons ainsi montré, en fin d’acquisition, que l’activation prolongée de

CREB dans le CA1 s’accompagne de la production de la protéine Zif268 au délai tardif de

24h. Corroborant nos résultats, une augmentation tardive de l’activité des facteurs de

transcription immédiats et inductibles c-Fos (12h) et Zif-268 (24h) a récemment été observée

suite à la mémorisation à long terme d’une tâche d’évitement (Bekinschtein et al., 2007).

Concernant Zif268, il a été montré chez des souris mutantes que ce facteur de transcription est

nécessaire au maintien de la PLT et à la consolidation mnésique (Jones et al., 2001). De plus,

la comparaison des profils comportementaux de souris sauvages, hétérozygotes et double

mutantes, a permis à Bozon et al. (2002) de montrer que Zif268 est particulièrement requis

dans les tâches ayant trait à une information spatiale. De manière intéressante, lorsque les

fonctions CREB et MAPK/ERK sont génétiquement bloquées de façon conditionnelle ou

pharmacologiquement interrompues chez des souris, celles-ci présentent exactement le même

profil comportemental que les mutantes zif268. Ceci suggère un lien direct entre l’activation

de CREB via les MAPK/ERK et l’induction de Zif268 (Bozon et al., 2003a et b). Nos

données soutiennent alors fortement l’hypothèse selon laquelle l’activation hippocampique

du facteur CREB permet, via l’induction du gène précoce Zif268, l’expression d’une

plasticité synaptique à long terme impliquée dans le maintien de la trace mnésique.

2- Origines possibles du patron biphasique

A ce stade, il est légitime de s’interroger sur les liens spécifiques unissant chacune des

deux phases d’activation du facteur CREB. Des études précédentes ont suggéré, dans le cas de

l’évitement conditionné ou d’un apprentissage gustatif, que la deuxième phase de

phosphorylation/transcription génique pourrait être une conséquence moléculaire directe de

l’apparition de la première (Bernabeu et al., 1997a ; Swank et Sweatt, 2001). Selon cette

hypothèse, la première phase d’activation de CREB pourrait induire l’activation ou la

synthèse de protéines capables de « relancer » ou maintenir l’activité phosphorylante des

neurones de façon tardive, permettant l’induction d’une seconde phase de transcription. Par

exemple, la capacité d’autophosphorylation de la CaMK II, qui augmente l’amplitude et la


159

durée de son activité en la rendant indépendante du complexe Ca2+

/calmoduline, suggère un

rôle de cette kinase dans la régulation de la transcription lors des phases tardives de

consolidation, notamment après un seul essai d’entraînement (Cammarota et al., 2002 ; Irvine

et al., 2006). Par ailleurs, l’apprentissage d’une tâche d’évitement passif induit une production

soutenue de BDNF durant au moins 6h (Ma et al., 1998) qui, en se fixant sur ses récepteurs,

peut activer les MAPK/ERK (Tyler et al., 2002). Pourtant, dans le cadre d’un

conditionnement contextuel, l’inhibition de la première phase de phosphorylation n’empêche

pas l’apparition de la seconde (Trifilieff et al., 2006). Or une étude récente a montré que les

neurones exprimant la seconde phase de transcription suite à une tâche d’exploration spatiale

sont une sous-population des neurones initialement activés lors de l’encodage (Ramirez-

Amaya et al., 2005). L’apparition de la seconde phase serait ainsi une propriété non plus

purement cellulaire, mais reflétant la mise en place d’une activité coordonnée au sein d’un

réseau de neurones, voire de structures cérébrales.

Une question intéressante reste alors de savoir quel type d’activité cérébrale peut

mener au déclenchement d’une réactivation différée (9h plus tard) de neurones ayant servi à

l’encodage initial des informations. De nombreuses études ont mis en évidence des

phénomènes de replay off-line d’activités neuronales (par exemple, des séquences d’activation

de cellules de lieu) pendant le sommeil suivant une séance comportementale (Louie et

Wilson, 2001 ; Kali et Dayan, 2004 ; Ribeiro et al., 2004 ; Ribeiro et Nicolelis, 2004 ; Euston

et al., 2007 ; Ji et Wilson, 2007) ou immédiatement après l’entraînement durant la phase

d’éveil (Foster et Wilson, 2006). Ces phénomènes ont été observés tant dans des aires

néocorticales (cortex préfrontal) que dans des structures limbiques (hippocampe, amygdale).

Dans une étude très récente, Datta et Auerbach (2008) montrent que l’apprentissage d’une

tâche d’évitement actif chez le rat induit une augmentation de l’activité des cellules

génératrices d’ondes P pontiques durant le sommeil paradoxal subséquent. Cette activité est

alors susceptible de provoquer une libération de glutamate dans l’hippocampe induisant

l’augmentation du niveau de phosphorylation de CREB et la transcription des gènes précoces

arc et zif268 dans les cellules pyramidales (Datta et al., 1998 ; Ulloor et Datta, 2005). Bien

que nos données immunohistochimiques s’appliquent à une plus large échelle temporelle, il

est séduisant de penser qu’une telle activité de réseau coordonnée puisse régir les phases

répétitives d’activité transcriptionnelle et traductionnelle nécessaires à la consolidation de

l’information spatiale dans notre tâche. Une étude tout d’abord purement descriptive (cages

d’activité) puis plus qualitative (électrophysiologie) des cycles veille-sommeil de souris


160

entraînées dans notre protocole de mémoire de référence permettrait alors de développer cette

hypothèse.

3- Altérations de la cinétique d’activation de la transcription et stabilité de la

trace mnésique.

Les études sur le vieillissement montrent le rôle crucial des protéines régulées par la

voie Ca2+

dans les dysfonctionnements cognitifs liés à l’âge (pour revue, Foster, 1999 ;

Gerendasy, 1999). Parmi les altérations cérébrales qui pourraient être à l’origine des déficits

mnésiques observés chez l’animal âgé, des changements neurobiologiques associés à la voie

Ca2+

(diminution de la complexité dendritique et des épines de certaines populations

neuronales, déafferentiation progressive, pertes synaptiques, …) ont été observés. Dans ce

contexte, les mécanismes de phosphorylation-déphosphorylation qui modulent l’activité

CREB étant contrôlés par les voies de signalisation dépendante du Ca2+

et de l’AMPc, nous

postulions qu’un dysfonctionnement dans l’activation de CREB entraînant une

dérégulation de la machinerie transcriptionnelle pouvait être impliqué dans la sélectivité

des déclins cognitifs liés à l’âge. Nos données d’imagerie (chapitre 2) montrent que les souris

âgées ayant des déficits mnésiques présentent une forte perturbation de l’activité CREB sous

sa forme activée/phosphorylée au délai précoce de 15min (mais pas aux délais plus tardifs)

dans le champ CA1, perturbation qui coïncide avec une diminution de l’expression de la

protéine Fos. Parmi les facteurs pouvant être à l’origine de l’altération de l’étape de

phosphorylation précoce de CREB dans le CA1, des études ont montré que l’âge

s’accompagne d’une diminution de la densité des R-NMDA (Magnusson, 2000 ; Scheuer et

al., 1995), du Ca2+

et des protéines de régulation de la voie Ca2+

(calmodulin-binding-

proteins). Parallèlement, une surexpression des canaux calciques type L-VGCC et une

augmentation de l’activité calcineurine ont été observées (Foster et al., 2001). Par ailleurs,

plusieurs observations laissent supposer que l’altération de la voie AMPc/PKA peut

également jouer un rôle majeur dans l’étape de déphosphorylation de CREB. Par exemple, il a

été montré que les adenylate cyclases régulées par le Ca2+

sont fortement altérées par l’âge

(Mons et al., 2003). De plus, la diminution de l’activité PKA induit une augmentation de celle

de la calcineurine et par conséquent, favorise la déphosphorylation de CREB. Enfin, il existe

un contrôle négatif du niveau d’AMPc par les voies Ca2+

, qui peut être exercé par la


161

calcineurine à travers l’inhibition de l’activité de l’adenylate cyclase de type 9 (Paterson et

al., 2000).

Concernant l’extinction (chapitre 3), nous montrons chez le groupe Random-PF ayant

subi une extinction par déplacements successifs de la plate-forme que le niveau d’activation

de CREB hippocampique est très diminué aux délais correspondant aux deux pics observés en

mémoire de référence (15min et 8h). Un changement de procédure induisant l’extinction du

comportement dirigé de recherche de la plate-forme semble donc se traduire par -reposer sur-

la perturbation du profil temporel d’activité transcriptionnelle hippocampique initial. Ainsi,

le profil biphasique d’activation de CREB devient monophasique avec un pic retardé de

pCREB à 60min dans le CA1. De plus, nous montrons à travers une étude corrélative, que les

individus présentant les meilleures performances dans la tâche Random-PF (dont la mémoire

de référence est la mieux “éteinte”) sont aussi ceux qui présentent les plus faibles niveaux de

pCREB dans l’hippocampe (spécifiquement dans le CA1). Concordant avec ces résultats, une

étude très récente chez le rat montre, dans le cadre de l’extinction d’un conditionnement

classique, une diminution de l’activation de CREB dans le noyau basolatéral de l’amygdale

parallèlement à la diminution de la réponse de peur au contexte (Izumi et al., 2008). De ces

données se dégage l’hypothèse selon laquelle l’extinction de la mémoire spatiale nécessite

l’activation de voies moléculaires s’opposant à l’activation initiale de CREB. Parmi les

acteurs potentiels de cette déphosphorylation se trouve de nouveau la calcineurine qui, dans le

cas du conditionnement classique, semble permettre un renforcement des traces d’extinction

en créant une boucle de rétrocontrôle négatif qui inhibe les phénomènes de phosphorylation

sous-tendant la trace mnésique initiale (Lin et al., 2003b et c ; Mansuy, 2003 ; Cannich et al.,

2004 ; Havekes et al., 2008).

En résumé, nos résultats convergent vers l’idée que toute perturbation de la

consolidation mnésique dans la tâche de mémoire spatiale de référence en piscine de Morris

s’accompagne d’une dérégulation du patron spatio-temporel d’activité transcriptionnelle

CREB dépendante. L’ensemble de nos données soutient donc l’hypothèse plus générale selon

laquelle le patron d’activation de CREB dans une structure centrale pour un apprentissage

pourrait refléter l’état cognitif d’un individu. Dans ce cas, sur le plan moléculaire, une

ultime question s’impose : dans quel sens le lien de causalité « dérèglement moléculaire-

perturbation cognitive » doit-il être exprimé ?


162

4- Le patron d’activation de CREB varie en fonction de la structure étudiée :

un pas vers l’étude systémique ?

Au cours du chapitre 1, nous avons montré la mise en place d’une activation

biphasique de CREB (phase précoce 0-1h et tardive 9h-24h) dans le CA1 hippocampique

après 9 jours d’acquisition en mémoire de référence spatiale. Au contraire, les données

immunohistochimiques n’ont révélé qu’un seul pic (précoce et transitoire) dans le CA3,

l’amygdale et le cortex préfrontal, et aucune activité pCREB dans le striatum dorsal. Ces

données soulignent en premier lieu que l’activation du facteur CREB (qui n’est pas

généralisée) témoigne, quel que soit le profil temporel de cette activité, de l’implication

d’une région cérébrale donnée dans la résolution d’une tâche donnée. Cependant, les

différentes cinétiques observées semblent refléter différents niveaux d’implication des

structures cérébrales examinées. Ainsi, la dissociation mise en évidence entre les deux

champs hippocampiques s’accorde avec des rôles fonctionnels distincts dans la mémoire

spatiale. En effet, des études chez le primate non humain et chez le rat indiquent que des

lésions sélectives des différentes sous-régions hippocampiques peuvent affecter différentes

fonctions mnésiques (Gilbert et al., 2001 ; Kesner et al., 2004 ; Lee et al., 2005 ; Rogers et

Kesner, 2007). Chez la souris, bien qu’il soit largement démontré que les lésions complètes de

l’hippocampe induisent des déficits d’apprentissage notamment en mémoire spatiale, peu de

données ont analysé le rôle différentiel des champs hippocampiques. Une récente étude

montre toutefois qu’une lésion sélective du CA1 induit une perturbation de l’apprentissage en

mémoire de référence en labyrinthe radiaire (Dillon et al., 2008). De même, l’absence de la

sous-unité NR1 du récepteur NMDA sélectivement dans les cellules pyramidales du CA1

perturbe l’acquisition d’une tâche spatiale en mémoire de référence en piscine de Morris

lorsque les sessions sont distribuées sur plusieurs jours (Tsien et al., 1996). Concernant la

région CA3, des souris KO-NR1-CA3 sont déficitaires dans la réalisation d’un test

d’appariement différé (Delayed Matching to Place) en piscine de Morris (Nakazawa et al.,

2003), alors qu’elles présentent des performances comparables aux souris contrôles si elles

sont entraînées dans la version standard (sessions distribuées sur plusieurs jours) (Nakazawa

et al., 2002). Partant de ces observations, il a été proposé que les R-NMDA dans le CA3 sont

essentiels pour l’acquisition rapide (après un essai) de la mémoire spatiale dans un nouvel

environnement (Nakazawa et al., 2003). Cependant, il a été montré que l’inactivation

temporaire (Florian et al., 2004) ou l’injection d’oligonucléotides anti-sens CREB dans le


163

CA3 (Florian et al., 2006), perturbent l’acquisition et la consolidation d’une tâche de mémoire

spatiale de référence dans une procédure par essais massés en piscine de Morris. L’ensemble

de ces résultats, en complément des données chez le rat, suggère un rôle préférentiel du CA3

dans la détection, l’acquisition rapide et la consolidation de nouvelles informations spatiales.

Le CA1 jouerait un rôle plus spécifique dans l’acquisition, le maintien et la restitution

d’informations spatiales plus familières. En accord avec ces données, nos résultats d’imagerie,

obtenus en fin d’apprentissage spatial selon une procédure par sessions distribuées,

soutiennent l’idée que le degré d’implication d’une structure cérébrale (CA1 vs CA3) en

fonction du type d’informations à traiter (familiarité vs nouveauté spatiale), se manifeste au

niveau cellulaire par des activations différenciées de CREB (biphasique vs monophasique).

De façon plus générale, nous confirmons et développons l’hypothèse que la visualisation d’un

patron d’activité biphasique puisse témoigner du rôle central joué par une région cérébrale

donnée pour résoudre une tâche donnée. Par opposition, le patron monophasique, précoce

et transitoire d’activation de CREB, dénoterait une implication plus « secondaire » d’une

structure au sein du réseau global sous-tendant une trace mnésique. Ceci nous mène alors

naturellement à élargir notre réflexion à un niveau analytique supérieur, et à nous interroger

sur la place que tiennent finalement les travaux que nous avons présentés ici dans les débats

plus généraux concernant les systèmes de mémoire et leurs interactions.

5- Etude des régions cérébrales impliquées dans la navigation spatiale en

piscine de Morris et leurs interactions à travers l’activité du facteur CREB.

Il est depuis des décennies admis que l’hippocampe dorsal est fortement impliqué dans

le traitement des informations spatiales et notamment en piscine de Morris (Morris et al.,

1982 ; Eichenbaum et al., 1990 ; Bolhuis et al., 1994 ; Logue et al., 1997 ; Mumby et al.,

1999 ; Kaut et Bunsey, 2001 ; Bannerman et al., 2004 ; Clark et al., 2005a et b). Cependant,

la complexité de cette épreuve spatiale en fait par essence une tâche susceptible d’impliquer

un grand nombre de structures cérébrales dans le but de gérer le plus finement possible les

données sensori-motrices et émotionnelles. De nombreuses données montrent ainsi

l’implication du système striatal dans l’acquisition des informations de type procédural

(Morris et al., 1982 ; Whishaw et al., 1987 ; Devan et al., 1999), de l’amygdale dans la

modulation émotionnelle de l’acquisition et de la restitution des informations à travers un


164

dialogue direct avec l’hippocampe (Packard et Teather, 1998) ou encore du cortex préfrontal

dans les processus de planification de l’action (Granon et Poucet, 1995).

Les études lésionnelles chez l’animal ont largement montré qu’il existe différents

systèmes de mémoire sous-tendus par différents réseaux de structures cérébrales et

caractérisés par les opérations cognitives spécifiques qu’ils effectuent (Schacter et Tulving,

1994). La théorie des systèmes de mémoire multiples et parallèles avancée par White et

McDonald (2002), décrit l’existence de trois systèmes principaux caractérisés par le type

d’associations qu’ils sous-tendent : le système hippocampique (associations complexes de

multiples stimuli avec une réponse comportementale), le système striatal (association simple

stimulus-réponse) et le système amygdalien (associations stimulus-renforcement ou stimulus-

affect). Lors de l’acquisition d’une information, ces trois systèmes principaux sont

susceptibles de l’encoder et de la stocker sur des modes différents. Ils entrent alors dans un

jeu d’interactions par coopération ou compétition (Kim et Baxter, 2001) qui conduisent à

l’élaboration d’une stratégie comportementale adaptée. Ainsi, lors d’un apprentissage spatial

en piscine de Morris, un encodage simultané de différentes informations sensorielles et

motrices s’effectue dans différents référentiels (spatial/relationnel, procédural, émotionnel), et

à partir de ces informations, l’animal peut mettre en place différentes stratégies de navigation

en fonction des conditions expérimentales.

Dans ce cadre, nos résultats supportent l’hypothèse de l’existence de fortes

interactions entre l’hippocampe et le striatum au cours de l’acquisition et de la

consolidation, ou entre l’hippocampe et l’amygdale lors de l’extinction, de la mémoire

spatiale. Dans notre première série d’expériences, l’analyse des niveaux d’activité pCREB

dans différentes structures cérébrales au cours de l’apprentissage a mis en évidence une

activation précoce et décrémentielle du striatum dorsal (début de l’acquisition, jours 1-4)

suivie d’une activation croissante de l’hippocampe parallèlement à l’amélioration des

performances spatiales (jours 4-9). Ces résultats soutiennent l’hypothèse que la mise en jeu

précoce du système striatal est un pré-requis essentiel pour le traitement de données

procédurales générales de la tâche, facilitant le traitement hippocampique (spatial) plus

tardif. Nos résultats corroborent une étude récente effectuée au laboratoire chez la souris par

Martel et al. (2007). Cette étude montre que lorsque les stratégies spatiale et indicée sont

toutes deux disponibles lors de l’acquisition (présence d’indices distaux et d’un indice sur la

plate-forme), les animaux utilisent d’abord une stratégie indicée (sous-tendue par le striatum),

puis, quand l’exposition à l’environnement est suffisante, un shift s’opère vers une stratégie

spatiale allocentrée (sous-tendue par l’hippocampe).


165

Dans la dernière étude enfin, l’analyse des niveaux de pCREB dans différentes

structures après 5 jours d’extinction sans plate-forme a mis en évidence une forte activation

de CREB dans le noyau latéral de l’amygdale quel que soit le délai précoce ou tardif examiné,

accompagnée d’une activation significative de CREB dans l’hippocampe par rapport aux

témoins naïfs. Ces observations corroborent plusieurs études montrant que la modulation

émotionnelle de l’encodage mnésique par l’amygdale nécessite l’induction de phénomènes de

plasticité neuronale dépendants de la fonction CREB dans cette structure (Davies et al., 2005 ;

Josselyn et al., 2004 ; Hubbard et al., 2007 ; Canal et al., 2008). Le comportement

caractéristique d’abandon que nous avons observé chez les souris soumises à ce protocole,

laisse penser que l’absence de plate-forme est vécue de manière stressante. Nos travaux

suggèrent ainsi, pour la première fois grâce à la technique d’immunohistochimie, que la mise

en jeu de l’amygdale au cours de l’extinction sans plate-forme pourrait témoigner d’une forte

interaction entre les processus d’apprentissage spatial (système hippocampique) et les

composantes émotionnelles (système amygdalien) spécifiques de cette tâche.

Ainsi, nos travaux associant des études comportementales à l’analyse

immunohistochimique et biochimique, bien que très descriptifs, nous auront permis d’illustrer

à plusieurs reprises les théories d’interaction des systèmes de mémoire. En effet, nous

montrons clairement l’implication différentielle de plusieurs structures cérébrales en fonction

du type d’information à traiter. De plus, en accord avec la théorie des systèmes de mémoire

multiples et parallèles (White et McDonald, 2002), nous montrons une mise en jeu

concomitante des trois régions principales (hippocampe, striatum, amygdale) dans des réseaux

différents, caractérisés par des poids/influences structuraux spécifiques de la tâche apprise et

définis par une cinétique transcriptionnelle variable. En ce sens, nos travaux s’incluent

aisément dans une nouvelle tendance qui vise à redéfinir la notion de systèmes de mémoire en

fonction des dynamiques d’interaction de ces systèmes. Dans l’équipe, des données obtenues

par Aurélie Boucard (2008) suggèrent par exemple, dans deux tâches (spatiale vs indicée)

effectuées dans un labyrinthe en croix aquatique, que la fonctionnalité même des réseaux de

structures en tant que systèmes de mémoire sous-tendant l’un ou l’autre des apprentissages,

naîtrait directement des interactions mises en jeu entre les différentes structures. Ainsi, la

convergence des connexions fonctionnelles cérébrales (déterminées par imagerie Zif268) sur

l’hippocampe reflèterait la mise en place d’une stratégie spatiale, alors que la convergence

vers l’amygdale témoignerait de l’élaboration d’une stratégie indicée. En accord avec le

concept de « contexte neural » proposé par McIntosh (2000), ces données supposent donc que

chaque structure cérébrale appartenant à un réseau est le support d’une fonction de base dont


166

le mode d’association (« poids connectionnel ») aux fonctions supportées par les autres

structures régit l’utilisation cohérente d’une fonction cognitive globale. En d’autres termes, en

accord avec nos données montrant l’implication des mêmes structures cérébrales dans des

situations distinctes mais selon un patron moléculaire variable, il serait possible de redéfinir la

notion de système de mémoire en proposant qu’un seul réseau complexe (le cerveau) soit

capable d’adopter diverses configurations pour élaborer la sortie comportementale la plus

adaptée.

6- Conclusion et perspectives.

Dans leur ensemble, les expériences menées au cours de ce travail de thèse ont permis

d’appréhender les mécanismes transcriptionnels sous-tendant la plasticité neuronale, et plus

généralement la consolidation, sous un angle nouveau. A travers l’étude détaillée du décours

temporel d’activation de la voie transcriptionnelle CREB dépendante, nous montrons que ce

facteur représente un switch fonctionnellement décisif dans la formation de la mémoire

spatiale à long terme et la stabilisation des performances. La comparaison des patrons

d’activité dans plusieurs situations comportementales nécessitant différents types de

traitement de l’information spatiale a permis de montrer à la fois l’extrême sensibilité et la

spécificité des résultats obtenus.

Afin de poursuivre ces travaux, plusieurs projets sont proposés. Dans un premier

temps, nous pensons étayer nos hypothèses concernant la régulation de la cinétique spatio-

temporelle d’activation de CREB à travers une étude combinant immunohistochimie,

western-blots et pharmacologie. En effet, s’il est trivial que l’équilibre entre les activités

kinases et phosphatases est au cœur des mécanismes de plasticité synaptique sous-tendant la

trace mnésique, peu de travaux ont été consacrés à l’étude des interactions entre ces voies.

Nous proposons alors d’étudier les cinétiques d’activation des phosphatases PP1 et

calcineurine et leur influence sur l’activation de CREB pour en déduire leurs rôles

fonctionnels respectifs lors de la consolidation. Parallèlement à ces expériences, l’étude des

voies moléculaires en amont du facteur de transcription CREB (AMPc-PKA-MAPK/ERK et

phosphatases), pourrait être effectuée dans le cadre du vieillissement.

Concernant l’extinction de la mémoire spatiale, une étude par imagerie

(immunohistochimie) et biochimie (western-blots), devrait permettre de préciser si les

modifications d’activité pCREB s’accompagnent d’altérations de l’expression des gènes


167

précoces. De plus, une étude pharmacologique (injection intracérébrale d’antisens ou

d’inhibiteurs de synthèse protéique) devrait permettre de préciser le rôle fonctionnel du

facteur CREB notamment en indiquant si les perturbations de cinétique pCREB observées au

cours de cette thèse sont une cause ou une conséquence du changement de stratégie

comportementale.

Enfin, en plus de dépendre de l’action trans-régulatrice de diverses protéines, la

transcritption génique est aussi régulée par l’accès même de ces complexes à l’ADN. Le

remodelage de la chromatine par phosphorylation de l’histone H3 sur les résidus Ser10

et Ser28

(Davie et al., 1999), ou via l’activation d’histones acétyltransférases (Ait-Si-Ali et al., 1999)

permet la décondensation du nucléosome et facilite ainsi la transcription. Dans une étude

récente, Levenson et al. (2004) ont montré que le niveau d’acétylation des histones H3 et H4

dans les neurones hippocampiques dépend étroitement du degré de recrutement de

l’hippocampe dans la résolution de deux tâches (conditionnement au contexte vs inhibition

latente). Dans ce cadre, un projet consistera en une étude alliant les approches

comportementale (piscine de Morris), pharmacologique (micro-injections intra-

hippocampique) et immunohistochimique, dans le but de mettre en lumière le rôle fonctionnel

des modifications subies par les histones dans divers types de tâches.


168

R éférences B ibliographiques

169

R éférences R éférences R éférences R éférences B ibliographiquesB ibliographiquesB ibliographiquesB ibliographiques


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RESUME : De nombreuses données suggèrent que l'activation/phosphorylation du facteur de

transcription CREB (cAMP Responsive Element Binding protein, pCREB) est nécessaire à la

consolidation mnésique, notamment dans les tâches dépendantes de l’hippocampe (HPC). Au

laboratoire, il a été récemment montré, dans deux paradigmes de conditionnement classique, que la

consolidation des associations contexte-choc (HPC-dépendante) vs son-choc (amygdale-dépendante), est

associée à l'établissement de cinétiques pCREB différentielles dans l’HPC (respectivement biphasique

vs monophasique). Partant de ces données, nos travaux ont porté sur l'étude des cinétiques de la voie

transcriptionnelle CREB-gènes précoces lors de la consolidation ou de la perturbation (vieillissement,

extinction) d'une mémoire spatiale acquise en piscine de Morris. L’analyse des niveaux de pCREB au

cours de l’entraînement met en évidence un recrutement différentiel des structures examinées selon la

phase d’apprentissage, et nous a ainsi permis d’illustrer la théorie d’interaction des systèmes de

mémoire. L’étude détaillée de la cinétique d’activation de CREB en fin d’apprentissage (lorsque la

mémoire est bien consolidée) met en évidence des patrons d’activité pCREB qui varient selon la

structure considérée (biphasique dans le CA1 vs monophasique ou inexistant dans les autres structures).

La durée et l’amplitude de l’activation de CREB reflètent (1) le niveau d’implication de la structure

cérébrale considérée dans le traitement des informations spatiales et (2) le degré de maîtrise de la tâche.

L’analyse des patrons d’activation de CREB chez des souris âgées révèle que les déficits de mémoire

spatiale dus au vieillissement sont associés à une altération sélective de la cinétique pCREB et à une

diminution de la production de protéine Fos dans le CA1. Enfin, nous montrons que l’extinction de la

mémoire spatiale induit des altérations spécifiques du patron d’activation de CREB dans le l’HPC

(CA1) et l’amygdale selon que l’extinction est effectuée par retrait ou changements successifs de la

position de la plate-forme. Dans leur ensemble, nos données mettent en lumière le rôle crucial de

l’activation de la voie transcriptionnelle CREB dépendante dans l’aire CA1, dans une fenêtre temporelle

extrêmement fine, pour le traitement des informations spatiales.

Mots-clés : mémoire spatiale, piscine de Morris, souris, CREB, gènes précoces et immédiats,

consolidation, vieillissement, extinction, hippocampe, immunohistochimie, western-blots.

ABSTRACT: Accumulating evidence suggest that the activation/phosphorylation of CREB

transcription factor (cAMP Responsive Element Binding protein, pCREB) is necessary for memory

consolidation in hippocampus (HPC)-dependant tasks. Recently, it has been shown that the

consolidation of memory traces for contextual- (HPC-dependant) vs elemental- (amygdala-dependent)

conditioning resulted in different pCREB patterns in the HPC (respectively biphasic vs monophasic).

Based on these data, we studied, by immunohistochemistry and western-blots, the activation patterns of

the CREB-early genes transcriptional route during consolidation and disturbance (aging, extinction) of a

spatial memory acquired in the Morris water maze. Analysis of pCREB levels across training revealed

differential recruitment of the structures considered as a function of the learning phase, and illustrated

memory systems interaction. A detailed analysis of the kinetics of CREB activation at the end of

training (when the memory is well consolidated) showed variable activation patterns within the different

structures examined (biphasic in the CA1 vs monophasic or absent in other structures). The amplitude

and duration of CREB phosphorylation reflected (1) the role of the structure examined in spatial

information processing and (2) the degree of mastering of the task. The detailed analysis of CREB

phosphorylation in aged mice revealed that aging-induced spatial memory deficits are associated to a

selective alteration of pCREB pattern and Fos production in the CA1. Finally, we showed that

extinction of spatial memory differentially affected the CREB phosphorylation pattern in the HPC

(CA1) and the amygdala when extinction occurred either by moving or by retiring the platform.

Together, our findings highlight the crucial role of the activation of the CREB dependant transcriptional

route within a narrow window in the CA1 subfield for efficient spatial information processing.

Key words: spatial memory, Morris water maze, mice, CREB, immediate early genes, consolidation,

aging, extinction, hippocampus, immunohistochemistry, western-blots.

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L’UNIVERSITE DE BORDEAUXori-oai.u-bordeaux1.fr/pdf/2008/PORTE_YVES_2008.pdf · Ce travail de recherche a été effectué au sein du Centre de Neurosciences Intégratives et Cognitives