Le basi molecolari delle alterazioni della neurogenesi ...dmmbm.dip.unina.it/wp-content/uploads/sites/17/2018/10/07-Conti.pdf · II CONVEGNO - Sindrome di Down DALLA DIAGNOSI ALLA

Le basi molecolari delle alterazioni della neurogenesi nella sindrome di Down

Anna Conti - DMMBM Napoli

Ci sono alterazioni del trascrittoma

nella sindrome di Down?

Quali sono le conseguenze biologiche e

fenotipiche della disregolazione genica?

Quali geni del cromosoma 21 possono

influenzare la neurogenesi?


II CONVEGNO - Sindrome di Down DALLA DIAGNOSI ALLA TERAPIA - 19-20 Ottobre 2018



Capire i meccanismi molecolari per trovare una terapia


Conti et al, BMC Genomics. 2007

Rapporto DS/N dell’espressionegenica per ciascuncromosoma

La trisomia del cromosoma 21 causa una globale upregolazione di geni

che mappano sul 21



L’upregolazionedi geni sul cromosoma 21 disregola geni su cromosomi diversi


Volcano Plot cuori fetali trisomici vs euploidi: Circa 400 geni che mappano su cromosomi diversi

dal 21 sono disregolati

Volcano Plot neuroni in differenziamento al 65°giorno trisomici vs euploidi: in verde

i geni del cromosoma 21

Ovchinnikovet al, StemCellReports. 2018


La disregolazione coinvolge globalmente due categorie geniche


GENI UPREGOLATI:

EXTRA CELLULAR MATRIX AND CELL ADHESION

GENI DOWNREGOLATI:

MITOCHONDRIAELECTRON TRANSPORT CHAINOXIDATIVE PHOSPHORYLATION

Dalla disregolazione genica al fenotipo clinico


MENTAL RETARDATION HYPOTONIA

TYPE 2 DIABETES AND OBESITY

IMMUNE DISORDERS

HEART DEFECTS

NEURODEGENERATION





Il fenotipo neurale è uno dei principali target della disregolazione genica

• La sindromedi Down comportadisabilitàintellettivanel 100% deicasi

• Le persone con sindrome di Down mostrano un volume ridotto del cervellochecoinvolgeprevalentementeareecorticali, cervelletto, troncocerebrale e ippocampo.

• Questeanomaliesonogiàpresentiallanascita e hannofondamentinellavita prenatale

• Feti con DS e modellimurinidurante la gestazionemostranounariduzione del peso del cervello e del volume dell’ippocampo con un minor numero di cellule anchenelgirodentato e nelcervelletto

• Dalle prime fasidellaneurogenesi le regioniippocampalimostrano un minor numero di neuronied un maggiornumerodiastrociti

• I neuroni DS mostrano una morfologia delle spine dendritiche alterata e unadensitàridottadelle spine e dellesinapsidescrittegiànel 1888


Anomalie del ciclo cellulare alterano il differenziamento neuronale

• La regolazionedellafase G1 del ciclocellularemantieneilrapportofraneuronidifferenziati e cellule neuraliprogenitrici

• In questafasel’attivitàdellecicline D è cruciale per la durataedilcompletamentodellafase G1

• NPC del topoTs65Dn hannoun ciclocellulareallungato e mostranolivellipiùbassi di CyclinaD1

• Un ritardo nella neurogenesi è dovuto anche alla disregolazione di fattori trascrizionaliNFATcespressi in tessuto neocorticale di modelli murini di DS.


L’iperattivazionedi STAT3 induce il differenziamento in astrociti

• L’attività trascrizionale del signaltransducer and activator of transcription 3 STAT3 è regolata dalla fosforilazione in Tyr705 o Ser727

• Entrambe favoriscono l’entrata di STAT3 nel nucleo e quindi la sua attività trascrizionale di geni astrogliogenici

• Nelle cellule trisomiche il pathway JAK-STAT è iperattivo


Il ruolo di SonicHedgehognella neurogenesi

• Shh rilasciato da neuroni o cellule gliali si lega ai recettori Patched(Ptch) sulle spine dendritiche attivando Smoothened (Smo) che induce la trascrizione di geni target

• Viene upregolata la profilina1 ed altre proteine che regolano la crescita assonale, e la plasticità sinaptica

• Shh induce il fattore neurotrofico BDNF reprimendo il miR-206 di cui BDNF è target

• Shh in vitro regola la proliferazione e la sopravvivenza di precursori neurali NPC

• Shh stimola anche la proliferazione di NPC dell’ippocampo in adulto dove Ptch e Smo sono espressi


L’Shhsignaling è ridotto e l’espressione di Ptch è aumentata nelle cellule neurali di modelli murini di DS

GABA signaling e plasticità sinaptica

• Studi elettrofisiologici hanno mostrato alterazioni della trasmissione sinapticaGABAergica in soggetti con sindrome di Down

• Il neurotrasmettitore GABA (Acido Gamma-Ammino-Butirrico) agisceattraversorecettoriionotropici GABAA e metabotropici GABAB

• I recettori GABAAsonocanaliionicipermeabili al clorocostituiti da subunitàa, b e g. Durante lo sviluppo influenzano il differenziamento e la migrazione neuronale, la crescita assonale e la plasticità sinaptica

• I recettori GABABsono G-protein-coupledreceptors (GPCRs) più spesso extra-sinaptici che regolano l’eccitabilità neuronale accoppiandosi con proteine come inwardly-rectifying potassium channel (GIRK) 2

• Durante la neurogenesi sia GABAA che GABAB controllano la plasticità sinaptica anche se in periodi diversi. Le disfunzioni GABAergiche alterano la plasticità sinaptica, l’apprendimento e la memoria nella DS alterando il bilancio sinaptico eccitatorio/inibitorio


La disfunzione mitocondriale è presente nella sindrome di Down ....

….. e influenza la neurogenesi


Fibroblasti euploidi

Fibroblasti trisomici

Consumo di ossigeno (OCR)

Potenzialedimembrana-TMRM fluorescence

ROS - DCF fluorescence

Fibroblasti euploidi

Fibroblasti Trisomici

Network mitocondrialemtGFP

Trombospondina e PGC-1a nellesinapsi

• Gliastrocitiinfluenzanoilmetabolismoneuronale e le trasmissionisinapticherilasciandomolecoletrofiche come le trombospondine

• In DS, la glicosilazione e la secrezione di TSP-1 sonoinibitecausandounaglobaleriduzione del numero di spine


Torres et al., Free RadBiolMed, 2018

• Neuroni transfettati con Si-PGC-1a mostrano una riduzione della densità di spine dendritiche pari al 75% mentre un aumento del 20% siosserva in neuronicheoveresprimono GFP-PGC-1a

Il differenziamento neuronale di iPSC con trisomia 21 ricapitola il fenotipo clinico

• I precursori neurali derivati da iPSC con trisomia 21 in differenziamento spontaneo danno origine a meno neuroni e più astrociti con uno shift dal fenotipo neuronale ad astroglia ed oligodendroglia

• I neuroni da DS-iPSC hanno neuriti meno lunghi


• Queste differenze sono state confermate nel differenziamento neuronale di iPSC da gemelli monozigoti che differivano unicamente per il numero di cromosomi 21

• L’eliminazione di Stat3 in NeuralStemCells ha dimostrato di promuovere la neurogenesi e inibire l’astrogliogenesi

• Studi su precursori neurali corticali da DS-iPSCs hanno mostrato neuroni GABA più piccoli, upregolazione della subunità a2 downregulazione delle subunità a3 e a5 di GABAA nelle cellule trisomiche

Quali geni del cromosoma 21

possono influenzare la neurogenesi?



Geni del cromosoma 21 in grado di alterare il ciclo cellulare

• Almeno sei geni che mappano sul cromosoma 21 sembrano essere coinvolti nella alterazione delle fasi del ciclo cellulare:

– Dual specificitytyrosine-phosphorylation-regulatedkinase 1A DYRK1A

– Regulatorof calcineurin1 DSCR1/RCAN1

– Amyloid precursor proteinAPP

– Oligodendrocytetranscriptionfactors1 and 2 OLIG1/2

– Potassium Voltage-Gated Channel Subfamily J Member 6 KJN6


DYRK1A

• DYRK1A regolailpotenzialeneurogenicomodulandol’espressione di proteinedel ciclocellularecoinvoltenellatransizionedallafase G1 allafase S.

• L’overespressionetransgenica di DYRK1A in vitro allunga le fasiG1 e S e quindirallenta la produzione di progenitorineurali. Ciò coincide con la riduzionedeilivellinucleari di Ciclina D1 mediata da DYRK1A.

• Topitransgenici per DYRK1A mostrano deficit di memoriaedalterazionidellatrasmissionesinaptica


Arbones et al, PharmacolTher, 2018

RCAN1, DYRK1A e il pathway dellacalcineurina

• L’entrata del Calcionellacellulaattiva la calcineurinachepromuovel’entratadegliNFATcnelnucleo

• La localizzazione e attività di NFATc sono regolati dalla sua fosforilazione

• RCAN1 inibiscel’azionedellacalcineurina e DYRK1A inibisceiltrasferimento di NFATcnelnucleo

• Il topo NFATc- mostra tratti fenotipici simili alla DS


RCAN1 ----NFATc4 ----


Genichepossonoinfluenzareilrapportoneuroni/astrociti

• APP– L’overespressione di APP e deisuoiprodotti di clivaggio: APP

solubile e AICD stimolano la cascata JAK-STAT e quindil’astrogliogenesi e inibiscono la neurogenesi.

– Il silenziamento di APP ristabilisceilcorrettodifferenziamentoneltopo Ts65Dn.

• DYRK1A– Il pathway di signaling di STAT vieneinfluenzato da DYRK1A

mediante la fosforilazione di STAT3 pertantol’overespressionedel gene potenziail signaling aumentandol’astrogliogenesi.


Genicandidati per la disfunzionemitocondriale

• NRIP1/RIP140– Diminuiscel’efficienzadeimitocondrie ne altera la morfologia

• DYRK1A e DSCR1/RCAN1– Controllano PGC-1a attraversoil pathway calcineurina/NFAT

• SUMO3– Aumental’attivitàrepressivadi NRIP1 ediminuiscel’attivitàtrascrizionaledi PGC-1a

• PREP1– Reprime PGC-1a eigenidifusione OPA1 e MFN2

• ETS2– Attival’apoptosimitocondrialemediatada p53 e la caspasi-3 inducendo la

mortecellulare• APP e SOD1

– Inducono stress ossidativo• CBS

– Influenzal’attivitàmitocondrialeregolandonegativamenteiprocessi di metilazione• ITSN1

– Regolail pathway apoptoticomitocondriale


NRIP/RIP140 è un repressorediPGC-1a edeisuoi target


Scarpulla, BBA, 2011

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

Fol

dch

ange

CTR siRNA5nM siRNA 20nM

RIP140 PGC1alpha

Il silencing di RIP140 in fibroblasti DS produce upregolazione di PGC-1a e dei suoi target e migliora la funzionalità mitocondriale Izzo et al, HumMolGenet, 2014

I miRNA del cromosoma 21

• La overespressione di hsa-let-7c induce alterazionidellamorfologianeuronale e dellasinaptogenesi

• La regolazione del citoscheletro di actina è essenziale per l’arborizzazionedendritica

• I miRNA let-7 hanno come target validatimembri del pathway del citoscheletro di actinacome PAK1, DIAPH2, RDX and ITGB8, oltre a LIN-41, un fattorechepromuove la rigenerazioneassonica

• let-7c ha come target diretto MECP2 3’ UTR e ne regolailivelliproteiciin cellule neuronaliumane. I modellianimali e neuronali con deficit di Mecp2 mostranoalterazionidellacrescitadendritica e dellaconnettivitàsinaptica

• Il MiR-155 reprimeilfattore di trascrizione TFAM cheregola la biogenesimitocondriale


Let-7c influenza l’attivitàmitocondrialereprimendol’espressio

nedi ANT1

• L’overespressione con un mimicodi let-7c downregola ANT1 ediltarget validato DICER

• L’eperimentoreciprocodisilenziamentoupregolaidue geni


BBA, 2008

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

ANT1

DICER

CTR miR let-7c 25nM

Fol

dch

ange

Genicheinibisconoirecettori GABA


• Lo studio dellosviluppoembrionaledell’ippocampo ha mostratounaalterazionedeiprofili di espressionedellesubunitàdeirecettori GABAAspecialmentedelle a3 cheeranodownregolate in tutte le regionidell’ippocampodurantetutte le epoche di sviluppo

Milenkovicet al, Brain StructFunct, 2018

• L’ipotesi è cheAPP, in particolareilframmentotossico b-amyloid (1–42), inibisca la subunità a3 facilitandoildifferenziamentoneuronaleprematuro

• Altro link fra trisomia 21 e GABA signaling viene dal gene KCNJ6 che codifica la G-proteincoupled GIRK2. Una extra copia di KCNJ6 nel topo Ts65Dn mice causa overespressione sia del gene che della proteina GIRK2 nell’ippocampo e nella corteccia

Matriceextracellulare e neurogenesi

• Le molecole di adesione cellulare influenzano molti aspetti dello sviluppo neurale inclusi la migrazione cellulare, e il pattern dendritico

• L’overespressione di DSCAM nei neuroni ippocampali inibisce l’arborizzazione dendritica in maniera compatibile con il fenotipo dendritico in DS.

• L’espressione di DSCAM è modulata durante lo sviluppo ed è localizzata nelle membrane sinaptiche durante il periodo di maggiore arborizzazione dendritica corticale e la formazione delle spine dendritiche


Il runt-related transcription factor RUNX1

• Neimammiferi RUNX1 gioca un ruolocrucialenellaregolazionedellosviluppo del sistemanervoso (Wang and Stifani 2017)

• Runx1 regolaanche la crescitaassonale

• La disregolazione di Runx1 ha mostrato di causareapoptosineuronalemassiva

• Runx1 è espresso neiprecursorineuralideirecettoriolfattori dove regolailciclocellulareattraversol’inibitoredellakinasiciclinadipendente p21






Quali geni del cromosoma 21 possono

influenzare la neurogenesi?



Strategieterapeutiche:Contrastare SHH


Chen et al. Int J Mol Sci. 2018

SAG

DYRK1A è un master regulator del fenotipo neurale

Non stupisce quindi che sia stato in questi anni il principale target terapeutico


Arbones et al, PharmacolTher, 2018

Strategieterapeutiche:Ancoracontro DYRK1A

• ALGERNON (ALteredGEnerationofNeurons) è un inibitorediDYRK1A piùspecifico di EGCG usato in epocaprenatale per prevenire deficit cognitivinel topo Ts1Cje.

• In progenitorineurali da DS-iPSripristinaivalori di Cyclin D1 econtrasta i difettiproliferativi

• Il trattamentoprenatale non è ancorarealistico ma ALGERNON stimolaanche la neurogenesinell’adultodimostrando un potenzialeterapeuticonellaneurodegenerazione

“FlowersforAlgernon” è un racconto

di fantascienza del 1959 di Daniel Keyes

trasformato in romanzo nel 1966


ConclusioniterapeuticheStimolare PGC-1A


CHROMOSOME 21 TRISOMY

Ca2+

PPARg

Ca2+

MOBILIZATION

IP3R

Ca2+IP3R

NRIP1PGC-1a

MITOCHONDRIAL BIOGENESIS

NRF1/2, ERRa

DYRK1A

DSCR1

CnA/NFATc HEART

DEVELOPMENTCnA/MEF2

OPA1

MITOCHONDRIAL CRISTAE MORPHOLOGY

PPARγ agonists

PGC-1α activators

SUMO3


GRAZIE ADMMBMLucio NitschAntonella IzzoSimona PaladinoNunzia MolloMaria NittiFerdinando BonfiglioRita GenesioRita CicatielloRosanna MancoFlorianaFabbriniPaola D’AgostinoRosa Negri

IEOS-CNRGaetano CalìFlaviana GentileGiuseppe MatareseClaudio ProcacciniDeriggioFaicchia

UNIVERSITY OF FOGGIANazzareno CapitanioClaudia PiccoliRosella Scrima

DBSMarina Prisco

UNIVERSITY OF FERRARAPaolo PintonSimone Patergnani

TIGEMElena PolishchukRoman Polishchuk

DSBAMaria D'ArmientoCarlo Olla

II CONVEGNO Sindrome di DownDALLA DIAGNOSI ALLA TERAPIA

19-20 Ottobre 2018


Anna Conti - DMMBM Napoli

Documents

Le basi molecolari delle alterazioni della neurogenesi ...dmmbm.dip.unina.it/wp-content/uploads/sites/17/2018/10/07-Conti.pdf · II CONVEGNO - Sindrome di Down DALLA DIAGNOSI ALLA