Le chromatogramme

La chromatographieLa chromatographie aspects générauxaspects généraux

Méthode de séparation et de quantification de composés Méthode de séparation et de quantification de composés présents dans une phase homogène liquide ou gazeuse. présents dans une phase homogène liquide ou gazeuse.

Le principe est basé sur les équilibres successifs des Le principe est basé sur les équilibres successifs des composés présents entre 2 phases dont l’une est dite composés présents entre 2 phases dont l’une est dite stationnaire, emprisonnée dans la colonne et l’autre, dite stationnaire, emprisonnée dans la colonne et l’autre, dite mobile qui se déplace en entraînant les substances. mobile qui se déplace en entraînant les substances. L’entraînement différentiel des composés présents dans la L’entraînement différentiel des composés présents dans la colonne conduit à leur séparation.colonne conduit à leur séparation.

Intérêt: couplage avec des détecteurs très sensibles.Intérêt: couplage avec des détecteurs très sensibles.le chromatogramme permet d’obtenir des informations qualitativesle chromatogramme permet d’obtenir des informations qualitatives(temps de rétention d’un composé) et quantitative (surface ou (temps de rétention d’un composé) et quantitative (surface ou hauteur du pic chromatographique).hauteur du pic chromatographique).domaine de mesure: 10domaine de mesure: 10--33 –– 1010--99. Ordre du nanogramme.. Ordre du nanogramme.

Sélectivité?

RésultatsRésultats

ANALYSE

SéparationSéparation DétectionDétectionPréparation d’échantillon

Types de matricesNombre d’échantillons à traiterAppareillage à dispositionType de détection (UV, Fluo, NPD, MS)Possibilité d’automatisation

Types de matricesTypes de matricesNombre d’échantillons à traiterNombre d’échantillons à traiterAppareillage à dispositionAppareillage à dispositionType de détection (UV, Fluo, NPD, MS)Type de détection (UV, Fluo, NPD, MS)Possibilité d’automatisationPossibilité d’automatisation

L’analyse de composés dans des matrices complexes (sang, urine,…L’analyse de composés dans des matrices complexes (sang, urine,…) ) nécessite souvent une optimisation de la séparation nécessite souvent une optimisation de la séparation chromatographiquechromatographique..

Processus analytiqueProcessus analytique

La chromatographie: historiqueLa chromatographie: historique

La chromatographie La chromatographie(du grec chroma: couleur et graphein: écrire) a été inventée par le botaniste Mikhail Tswett au début du XXème siècle.Une colonne de CaCO3 permet de séparer des pigments végétaux (chlorophylles et xanthophylles). Par adjonction de solvant, on obtient des bandes colorées qui se déplacent le long de la colonne à des vitesses propres.Le Prix Nobel de chimie est attribué en 1952 aux biochimistes Martin et Synge pour leur contribution au développement de la chromatographie moderne.

Principe de basePrincipe de base

Le principe qui régit pratiquement toute Le principe qui régit pratiquement toute purification / séparation en chimie, se base sur la purification / séparation en chimie, se base sur la (ré)partition d’une substance A (analyte) entre (ré)partition d’une substance A (analyte) entre deux phasesdeux phases

CristallisationCristallisation: partition phase liquide : partition phase liquide –– phase phase cristallinecristallineDistillationDistillation: partition phase liquide : partition phase liquide –– phase gazeusephase gazeuseSublimationSublimation: partition phase solide : partition phase solide –– phase gazeusephase gazeuseExtractionExtraction: partition entre deux phases liquides non : partition entre deux phases liquides non miscibles (LLE) ou phase liquide miscibles (LLE) ou phase liquide –– phase solide (SPE)phase solide (SPE)ChromatographieChromatographie: partition phase stationnaire : partition phase stationnaire ––phase mobile.phase mobile.

Principe de séparationPrincipe de séparation

Si le composé B a une grande affinité pour la phase Si le composé B a une grande affinité pour la phase stationnaire et le composé A une grande affinité pour la stationnaire et le composé A une grande affinité pour la phase mobile, le composé A aura tendance à êtrephase mobile, le composé A aura tendance à être éluééluéplus rapidement. Son temps de rétention sera plus petit plus rapidement. Son temps de rétention sera plus petit que le temps de rétention de B.que le temps de rétention de B.Cette différence d’affinité pour les deux phases est le Cette différence d’affinité pour les deux phases est le principe même de la chromatographie!principe même de la chromatographie!Il existe diverses méthodes de chromatographie utilisées Il existe diverses méthodes de chromatographie utilisées quotidiennement par les chimistes, biologistes, etc.quotidiennement par les chimistes, biologistes, etc.

GCGCHPLCHPLCCCMCCMECECEtcEtc……

DéfinitionsDéfinitions

La La chromatographiechromatographie est une technique dans laquelle les est une technique dans laquelle les constituants d’un mélange se séparent en fonction des vitesses constituants d’un mélange se séparent en fonction des vitesses auxquelles ils sont entraînés à travers une phase stationnaire auxquelles ils sont entraînés à travers une phase stationnaire par une phase mobile.par une phase mobile.

La La phase stationnairephase stationnaire est une phase qui reste en place, soit est une phase qui reste en place, soit dans une colonne, soit sur une surface plane.dans une colonne, soit sur une surface plane.

La La phase mobilephase mobile est une phase qui se déplace sur ou à travers est une phase qui se déplace sur ou à travers la phase stationnaire, entraînant la phase stationnaire, entraînant l’analyte l’analyte avec elle.avec elle.

L’L’élutionélution est un processus au cours duquel lesest un processus au cours duquel les analytesanalytes sont sont entraînés à travers une phase stationnaire par le mouvement entraînés à travers une phase stationnaire par le mouvement d’une phase mobile.d’une phase mobile.

Un Un chromatogrammechromatogramme est le graphique d’une fonction de la est le graphique d’une fonction de la concentration deconcentration de l’analytel’analyte en fonction du temps d’élution (ou en fonction du temps d’élution (ou temps de rétention).temps de rétention).

ChromatographieChromatographie: partition phase stationnaire : partition phase stationnaire –– phase mobilephase mobile

En fonction des propriétés PHYSICOEn fonction des propriétés PHYSICO--CHIMIQUESCHIMIQUESdes molécules et surtout, en GC …des molécules et surtout, en GC …

-- Volatilité / PolaritéVolatilité / Polarité

-- SolubilitéSolubilité

-- HydrophobeHydrophobe / / HydrophileHydrophile

-- AcideAcide / / BaseBase

Propriétés physicoPropriétés physico--chimiqueschimiques

Chromatographie en phase Chromatographie en phase gazeusegazeuse

La La chromatographie en phase gazeuse (GC) est chromatographie en phase gazeuse (GC) est basée sur le partage debasée sur le partage de l’analytel’analyte entre une phase entre une phase gazeuse mobile et une phase liquide immobilisée gazeuse mobile et une phase liquide immobilisée sur la surface d’un support inerte.sur la surface d’un support inerte.La phase (liquide) immobilisée est le plus souvent La phase (liquide) immobilisée est le plus souvent un polymère organique modifié (un polymère organique modifié (siloxanesiloxaneRR33SiO[SiRSiO[SiR22O]O]nnSiRSiR33).).Le gaz porteur est un gaz inerte, typiquement Le gaz porteur est un gaz inerte, typiquement l’hélium (l’hélium (HeHe).).La détection à la sortie de la colonne peut être de La détection à la sortie de la colonne peut être de plusieurs types (FID, NPD, ECD, MSD, plusieurs types (FID, NPD, ECD, MSD, etcetc…).…).

Aspects théoriquesAspects théoriques

Chaque analyte a une affinité plus ou moins prononcée pour la phase mobile et la phase stationnaire (propriétés physico-chimiques).Le coefficient de distribution d’un analyte A est défini comme la constante d’équilibre (KA ou DA) entre la phase mobile et la phase stationnaire (partage du soluté entre les 2 phases).

AMobile AStationnaire KA = CS / CM

Le facteur de sélectivité (α) d’une colonne pour deux espèces A et B est défini comme le rapport des coefficients de distribution KA et KB:

α

= KA / KB (≥

1)

Le facteur de capacité (k’) permet de comparer, pour un soluté donné, différentes colonnes chromatographiques: k’ = mS / mM (m: masse du soluté dans chaque phase).De faibles valeurs de k’ indiquent que le composé est peu retenu. Habituellement, on travaille avec des k’ compris entre 1 et 10.

Nombre de plateaux théoriquesNombre de plateaux théoriques ((NN))Ce paramètre permet de définir Ce paramètre permet de définir l’l’efficacitéefficacité d’une colonne. Plus ce d’une colonne. Plus ce nombre est grand (valeurs de l’ordre nombre est grand (valeurs de l’ordre de 100’000), plus la colonne est de 100’000), plus la colonne est efficace.efficace.

Afin de pouvoir comparer les Afin de pouvoir comparer les colonnes entre elles, on définit la colonnes entre elles, on définit la hauteur équivalente de plateaux hauteur équivalente de plateaux théoriquesthéoriques ((HH ou ou HEPTHEPT))

HEPT = H = L / NHEPT = H = L / NL L = longueur de la colonne= longueur de la colonne


•• LaLa résolutionrésolution ((RsRs))Ce paramètre représente la séparation entre 2 pics. Elle dépend Ce paramètre représente la séparation entre 2 pics. Elle dépend de 3 de 3 facteurs:facteurs:-- sélectivité sélectivité αα-- facteur de capacité k’ (doit être facteur de capacité k’ (doit être compris entre 1 et 10)compris entre 1 et 10)-- efficacité de la colonne Nefficacité de la colonne N

RRss = 2 [(t= 2 [(tr2r2 –– ttr1r1 ) / (w) / (w11 + w+ w22 )])]ttrr : le temps de rétention du composé: le temps de rétention du composéw: largeur du pic à miw: largeur du pic à mi--hauteurhauteur

Plus Plus RRss est grand, meilleure est la séparation.est grand, meilleure est la séparation.A partir de A partir de RRs s = 1.5 la séparation entre 2 composés est complète.= 1.5 la séparation entre 2 composés est complète.


RésolutionRésolution

Helium

GC: AppareillageGC: Appareillage

GC: l’injecteurGC: l’injecteur

L'L'injecteurinjecteur est logé dans un bloc est logé dans un bloc métallique dont la température est métallique dont la température est régulée afin d'assurer une bonne régulée afin d'assurer une bonne homogénéité thermique du homogénéité thermique du système. L'échantillon va être système. L'échantillon va être introduit, à travers une pastille autointroduit, à travers une pastille auto-- obturante appelée obturante appelée septumseptum, par , par l'intermédiaire d'unel'intermédiaire d'une microseringuemicroseringue. . L'échantillon sera vaporisé et les L'échantillon sera vaporisé et les solutés traverseront l'injecteur à solutés traverseront l'injecteur à travers un tube en verre (parfois travers un tube en verre (parfois métallique) appelé métallique) appelé linerliner (ou (ou insertinsert), ), grâce au gaz porteur, jusqu'à la tête grâce au gaz porteur, jusqu'à la tête de la colonne. de la colonne.

liner

SplitSplit: injection d’une partie de l’échantillon : injection d’une partie de l’échantillon dans la colonne (1:10, par exemple).dans la colonne (1:10, par exemple).

SplitlessSplitless: injection de la totalité de : injection de la totalité de l’échantillon dans la colonne (1 à 10 l’échantillon dans la colonne (1 à 10 μμl).l).

L’injecteurL’injecteur

SplitSplit

SplitlessSplitless

ColonneColonne

InjecteurInjecteur

DétecteurDétecteur

Four GCFour GCSilice greffée Silice greffée

recouverte d’une recouverte d’une couche de polyimidecouche de polyimide

Support pour la Support pour la colonne capillairecolonne capillaire

Colonne capillaireColonne capillaire

… etc

Nombreuses colonnes capillaires Nombreuses colonnes capillaires commercialisés:commercialisés:

-- nature de la phase greffée (polarité)nature de la phase greffée (polarité)

-- longueur de la colonne (10m à 60m)longueur de la colonne (10m à 60m)

-- diamètre de la colonne capillaire diamètre de la colonne capillaire (0.18mm à 0.53 mm)(0.18mm à 0.53 mm)

-- diamètre de la couche greffée diamètre de la couche greffée (0.10(0.10μμm à 1.50 m à 1.50 μμm)m)

Choix de la colonne (greffage) en Choix de la colonne (greffage) en fonction des substances que l’on veut fonction des substances que l’on veut analyser.analyser.

AttentionAttention !!

-- stabilité du greffage (durée de vie stabilité du greffage (durée de vie des colonnes, peut dépendre du des colonnes, peut dépendre du fabricant)fabricant)

La silice grefféeLa silice greffée (phase stationnaire)(phase stationnaire)

INJECTEUR

DETECTEUR

T1

T2

T3

AU

GM

ENTA

TIO

N D

E LA

TEM

PER

ATU

RE

300

°C50

°C

XXOSSSOOXO

OXSSXSOOSOXXXOX

O XX SOOO X SSOOO XX SSSOO XXXX S

O XX SOOO X SSOOO XX SSS

OO XXXX S

Abondance

Temps (min)

La séparation des moléculesLa séparation des molécules

Temps de rétention (min)Temps de rétention (min)

AbondanceAbondance

Temps que met la substance depuis Temps que met la substance depuis son introduction dans la colonne son introduction dans la colonne

(injection) jusqu’au moment où elle (injection) jusqu’au moment où elle arrive au détecteurarrive au détecteur

Caractéristique de la quantité de Caractéristique de la quantité de substance initiallement présente dans substance initiallement présente dans

le volume qui a été injectéle volume qui a été injecté

Le chromatogrammeLe chromatogramme

Pics chromatographiquesPics chromatographiques

Pics chromatographiquesPics chromatographiques

DETECTEURDETECTEUR

O XX SOOO X SSOOO XX SSS

OO XXXX S

La vitesse de migration des substances dans la colonne La vitesse de migration des substances dans la colonne capillaire dépend de leur capillaire dépend de leur volatilitévolatilité et leur et leur polarité polarité

(interaction avec la phase stationnaire).(interaction avec la phase stationnaire).

de là, dépend l’ordre d’arrivée au détecteur!de là, dépend l’ordre d’arrivée au détecteur!

La migration dans la colonneLa migration dans la colonne

NCH3 C

OOCH3

O CO

CocaineCocaineCC 1717 HH 2121 NONO 44MW = 303MW = 303

B.p. = 98 °CB.p. = 98 °C

Molécule polaireMolécule polaire

NH2

CH2 CHCH3

AmphétamineAmphétamineCC 99 HH 1313 NNMW = 135MW = 135

B.p. = 203 °CB.p. = 203 °C

Molécule peu polaireMolécule peu polaire

Il est nécessaire de dériver la molécule Il est nécessaire de dériver la molécule pour l’analyse par GCpour l’analyse par GC--MS !MS !

Analyse directe par GCAnalyse directe par GC--MS !MS !

Volatilité et polaritéVolatilité et polarité

Détecteur les plus couramment utilisés:Détecteur les plus couramment utilisés:-- FID: FID: Flame Ionization DetectorFlame Ionization Detector-- TCD: Thermal TCD: Thermal Conductivity DetectorConductivity Detector-- ECD: ECD: Electron Electron Capture Capture DetectorDetector-- NPD: NPD: Nitrogen Phosphorous Detector Nitrogen Phosphorous Detector (détecteur spécifique)(détecteur spécifique)-- MSD: Mass MSD: Mass Spectrometer Detector Spectrometer Detector (détecteur universel)(détecteur universel)

NPDNPD ECDECD FIDFID FPDFPD PIDPID TCDTCD MSDMSD

STABILITE du détecteur:STABILITE du détecteur:

Reproductibilité des Reproductibilité des injections!injections!

La détectionLa détection

LINEARITE du détecteur:LINEARITE du détecteur:

Zone de concentration dans laquelle le signal de détection est dZone de concentration dans laquelle le signal de détection est directement irectement proportionnel à la concentration en analyte (quantité injectée).proportionnel à la concentration en analyte (quantité injectée).

Quantité injectée (Quantité injectée (μμl)l)Concentration (Concentration (μμg/ml, ng/ml)g/ml, ng/ml)LOD: limite de détectionLOD: limite de détection

LOQ: limite de quantificationLOQ: limite de quantification

Signal / Abondance / Aire du picSignal / Abondance / Aire du pic

Domaine de linéaritéDomaine de linéarité

LOQLOQLODLOD

SaturationSaturation

La linéaritéLa linéarité

NPDNPDNorcocaïneNorcocaïne

TropacocaïneTropacocaïne

CuscohygrineCuscohygrine

FIDFID

SensibilitéSensibilité

NPDNPD

MSMS

Sélectivité / SpécificitéSélectivité / Spécificité

DETECTEURDETECTEUR

OOO X OOOOOOO XX OOOOOO XXX

OOOO X

L’aire sous le pic L’aire sous le pic chromatographique est chromatographique est

caractéristique de la concentration caractéristique de la concentration de la substance dans l’échantillon de la substance dans l’échantillon

analyséanalysé

La surface ou la hauteur du pic La surface ou la hauteur du pic chromatographiquechromatographique est proportionnelle à la masse ou est proportionnelle à la masse ou à la concentration injectée. Il est ainsi possible, au moyen d’uà la concentration injectée. Il est ainsi possible, au moyen d’une courbe d’étalonnage, ne courbe d’étalonnage, de déterminer avec précision la quantité de déterminer avec précision la quantité chromatographiéechromatographiée. En GC, l’injection n’étant . En GC, l’injection n’étant pas très reproductible, il est nécessaire d’utiliser un standardpas très reproductible, il est nécessaire d’utiliser un standard interne (SI). Le choix du interne (SI). Le choix du SI est très important car il doit se comporter comme le ou les pSI est très important car il doit se comporter comme le ou les produits à analyser et ne roduits à analyser et ne doit pas interférer sur le chromatogramme. doit pas interférer sur le chromatogramme.

AbondanceAbondance

Temps rétentionTemps rétention

22 11

1 2

Quantité de substance détectéeQuantité de substance détectée

LinerLiner

L'intérêt du L'intérêt du linerliner est de retenir les constituants non volatils de l'échantillon, est de retenir les constituants non volatils de l'échantillon, impropres par nature à la impropres par nature à la chromatographiechromatographie..

LinerLiner

Standard interneStandard interne

-- Composé organique ajouté à un mélange inconnu, à une concentratiComposé organique ajouté à un mélange inconnu, à une concentration on connue.connue.

-- Utiliser pour déterminer la concentration d’un ou de plusieurs cUtiliser pour déterminer la concentration d’un ou de plusieurs composés omposés dans un mélange inconnu.dans un mélange inconnu.

-- Le volume d’échantillon injecté n’a pas d’importance, contrairemLe volume d’échantillon injecté n’a pas d’importance, contrairement à la ent à la méthode de la courbe d’étalonnage.méthode de la courbe d’étalonnage.

-- Trois Trois conditions conditions doivent être respectées pour pouvoir l’utiliser :doivent être respectées pour pouvoir l’utiliser :

11) Le composé choisi doit être idéalement de structure chimique ) Le composé choisi doit être idéalement de structure chimique similaire aux composés étudiés.similaire aux composés étudiés.22) Le composé choisi comme standard interne doit être absent du ) Le composé choisi comme standard interne doit être absent du mélange inconnu, car s’il y est, sa concentration deviendra mélange inconnu, car s’il y est, sa concentration deviendra inconnue.inconnue.33) Le pic du standard interne doit être bien séparé des autres pi) Le pic du standard interne doit être bien séparé des autres pics cs du mélange inconnu, sinon le calcul de sa surface sera inexact.du mélange inconnu, sinon le calcul de sa surface sera inexact.

La plupart des schémas et figures contenues dans cette présentatLa plupart des schémas et figures contenues dans cette présentationionsont tirées des ouvrages suivants:sont tirées des ouvrages suivants:

-- F. Rouessac et A. Rouessac: F. Rouessac et A. Rouessac: Analyse Chimique, MéthodesAnalyse Chimique, Méthodeset Techniques Instrumentales Moderneset Techniques Instrumentales Modernes, Masson, 2ème édition, 303 p., 1994., Masson, 2ème édition, 303 p., 1994.

-- G. Schwedt: G. Schwedt: Atlas de Poche des Méthodes d’AnalyseAtlas de Poche des Méthodes d’Analyse, Flammarion, édition, Flammarion, éditionfrançaise, 234 p., 1993.française, 234 p., 1993.

-- M.S. Klee: M.S. Klee: GC Inlets GC Inlets –– An IntroductionAn Introduction, Hewlett, Hewlett--Packard, 132 p., 1990.Packard, 132 p., 1990.

RéférencesRéférences

Documents

Le chromatogramme