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Le pouvoir pathogène de la bactérie Bordetella bronchiseptica
Bordetella beta- protéobactérie
bronchiseptica Coccobacille gram négatif, mobile
aérobie
S et N +
tractus respiratoire
présent chez de nombreux mammifères
responsable de bronchopneumonie chez les animaux
zoonose possible
parent de B. pertussis et B. parapertussis
génome séquencé (5.3Mbase)
Bordetella ssp. facteurs de virulence (adhesines et toxine) exprimées sous le contrôle d’un système à 2 composants (BvgAS system)
nécessité d’un TTSS pour induire la cytotoxicité, la colonisation à long terme de la trachée
Le pouvoir pathogène de la bactérie Bordetella bronchiseptica
BvgAS système: BvgS: protéine membranaire histidine kinase
senseur du milieu extracellulaire
activée , phosphoryle BvgA
BvgA: facteur de transcription pour les gènes de virulence
régulation du TTSS
Système de sécrétion de type 3 :
très conservé chez les bactéries Gram-
un des mécanismes très impliqué dans la virulence
translocation des effecteurs du cytosol de la bactérie dans le cytoplasme de la cellule hôte
selon le stade de l’infection, les effecteurs peuvent variés
Représentation d’un TTSS
Protéines sécrétées via le TTSS :
4 protéines identifiées chez Bordetella.
BopB, BopD, BopN et Bsp22
BopB/D complexe de perforation de la membrane plasmique
BopN ATPase permettant la sécrétionObjetif de l’étude:
Identifier de nouveaux effecteurs de Bordetella passant via le TTSS
Recherche de protéines sécrétées via le TTSS
-Comparaison des profils protéiques des surnageants
de culture des souches wt et ΔTTSS en SDS-PAGE
10 bandes différentes entre les 2 pistes dont
BopB, BopN, BopD, Bsp 22
-Extraction du gel des 6 bandes non identifiées
-Trypsination et analyse par spectromètre de masse
pour identification des protéines
MALDI-TOF MS ou ESI-MS/MS
-génération in silico d’une banque de peptides à partir du génome
Recherche de protéines sécrétées via le TTSS
Une seule protéine a été identifié à l’issue du screening.
HP de 69 kDa renommée BopC
-Analyse des séquences peptidiques:
3 bandes sont des produits de dégradation de Bsp22 et BopD
Bande a 1 peptide résidus 33-44 de HP p69
Bande b 5 peptides
Les bandes a (150kD) et b (28kD) correspondent –elles à une seule protéine BopC?
Génération d’un mutant ΔBopC
Clonage puis délétion du gène bopC via le système Gateway™
Introduction dans un plasmide suicide conjugatif (pRK6)
Complémentation du mutant ΔBopC par le plasmide pBopC
Clonage d’une cassette promoteur fha- bopC- terminateur rrnB1
fha hémagglutinine filamenteuse de Bordetella activé par BvgA
Introduction dans un plasmide réplicatif conjugatif (pRK415)
Les bandes a (150kD) et b (28kD) correspondent –elles à une seule protéine BopC?
Comparaison des profils de sécrétion
formation de complexe multimérique
sécrétion dépendante d’un TTSS
BopC a-t-elle un effet cytoyoxique?
Recherche d’un effet cytotoxique de BopC
Infection de cellules L2 de rat pendant 20 min
Coloration avec une solution de Giemsa (différenciation nucléaire et cytoplasmique)
95% des cellules infectées par les témoins +
sont détruites
Pas de cellules dégradées pour les
mutants ΔbopC et ΔTTSS
Recherche d’un effet cytotoxique de BopC
Infection de cellules HeLa
Evaluation de la cytotoxicité par mesure de la LDH
La cytotoxité de B. brochiseptica est associée à bopC.
BopC a-t-elle un effet cytoyoxique?
Recherche d’un effet cytotoxique de BopC
Infection de cellules HeLa pendant 1h
Evaluation de la mortalité par coloration au bleu trypan
57% 48%
BopC a-t-elle un effet cytoyoxique?
Données bibliographiques
B. brochiseptica induit une nécrose des cellules sans activation des caspases
Cependant, observation de certaines cellules infectées TUNEL +
(terminal deoxynucleotidyl transferase- mediated dUTP-biotin nick end-labelling)
Coloration différentielle de la mort cellulaire:
Cellules apoptotiques coloration dense au niveau du noyau
Cellules non apoptotiques: coloration diffuse du noyau
BopC a-t-elle un effet cytoyoxique?
Evaluation de la mort cellulaire
Observation des cellules HeLa infectées à 2h (ou 5h pour la stauroporine)
BopC est requis pour l’induction de la mort cellulaire, mais n’induit pas d’apoptose.
BopC a-t-elle un effet cytoyoxique?
Stsp: staurosporine, inhibiteur des PK
BopC est-elle une protéine formant un pore du TTSS?
Mesure de l’activité hémolytique (30min de contact)
Contrairement à BopB/D, BopC n’appartient pas
au complexe de perforation de la membrane plasmique
BopC a-t-elle un effet cytoyoxique?
BopC et phosphorilation
Données bibliographiques
B. brochiseptica induit des déphosphorylations dans des cellules L2 infectées.
Ce phénomène est TTSS dépendant.
Recherche d’un effet de BopC sur les protéines tyrosine phosphorylées (PY).
Observation par immunofluorescence de différents facteurs:
adhérence bactérienne ( actine et bactérie)
Etat de phosphorylation des PY
BopC et phosphorilation
Observation des cellules HeLA
après 0, 20 min ou 1h d’infection
BopC et phosphorilation
Au cours du développement de l’infection:
•l’adhésion et la colonisation des cellules ne sont pas modifiées
chez les mutants ΔbopC et ΔTTSS.
•l’état de phosphorylation des PY est modifié par la souche wt
mais ni par le mutant ΔbopC, ni par le mutant ΔTTSS
BopC induit une déphosphorylation des PY dans les cellules infectées.
BopC et phosphorilation
Au cours du développement de l’infection B. brochiseptica BopC :
•requis pour l’induction de la mort cellulaire
•modifie l’état de phosphorylation des PY
Sur quel aspect BopC agit principalement?
Infection de cellules HeLa en présence d’inhibiteur de la déphosphorylation,
le sodium orthovanadate
Observation en microscopie à fluorescence
Mesure de la cytotoxicité (LDH et TUNEL)
BopC et phosphorilation
Infection de cellules HeLa par B. brochiseptica wt en présence ou non de vanadate
+
-
L’état de déphosphorylation des PY dans les cellules en présence de vanadate est relativement atténué.
BopC et phosphorilation
Infection de cellules HeLa par B. brochiseptica en présence ou non de vanadate
Observation sur 200cellules au hasard
La présence de vanadate atténue la déphosphorylation des PY induite par BopC.
BopC et phosphorilation
Infection de cellules HeLa par B. brochiseptica en présence ou non de vanadate
BopC et phosphorilation
Infection de cellules HeLa par B. brochiseptica en présence ou non de vanadate
Le vanadate et donc l’état de déphosphorylation des PY n’ont pas d’effet sur la cytotoxité cellulaire.
↓[PY] dans les cellules infectées par B. brochiseptica
a lieu après la mort cellulaire dépendante de BopC.
BopC et sécrétion via le TTSS
Données bibliographiques
Les effecteurs TTSS dépendants sont introduits directement dans la cellule hôte depuis
le cytoplasme bactérien via le TTSS.
BopC est-elle un effecteur de type III?
Utilisation d’un système rapporteur TEM-1 β-lactamase ( Charpentier et Oswald, 2004)
Fluorescence
Resonance
Energy
Transfert
BopC et sécrétion via le TTSS
Génération des fusions TEM1
Amplification PCR des gènes bopC, bcrH2 (protéine cytoplasmique induit par BvgA)
et map (effecteur de EPEC)
Clonage dans le pCX340 (fusion traductionnelle avec TEM1)
puis PCR pour introduction dans un plasmide réplicatif conjugatif (pRK415)
via le système Gateway™,
BopC et sécrétion via le TTSS
Analyse des transformants ΔbopC et ΔbopB et ΔTTSS avec les plasmides TEM1
Protéines totales Protéines sécrétées
5%
20%
Les produits de fusion BopC-TEM1 sont correctement synthétisés et sécrétés exceptés dans la souche ΔTTSS.
BopC et sécrétion via le TTSS
BopC est transloquée via le TTSS dans la cellule hôte.
Le signal d’adressage se situe dans les 48 premiers acides aminés N-ter.
Cellules HeLa infectées+ CCF2-AM
70% FRET+
BopC et cytotoxicité dans la cellule hôte
BopC a un effet cytotoxique mais est-il direct ou résulte –t- il d’une cascade de régulation?
Clonage de BopC dans un plasmide d’expression eucaryote
Transfection des cellules COS-7, HeLa, 293T
Mesure de la cytotoxicité à 18h
L’expression de BopC directement dans la cellule permet
d’induire la mort cellulaire sans intervention d’autres
facteurs de virulence.
Discussion
BopC (Bordetella outer protein involved in cytotoxicity)
protéine de 69kDa
impliquée dans la mort cellulaire
protéines sécrétées via le TTSS : pore forming proteins (translocators) (1)
ou effecteurs (translocated protéins) (2)
effecteur de cytotoxicité qui provoque la nécrose des cellules infectées.
Analyse in silico du gène bopC
BopC a une fonction protein-tyrosine phosphatase (PTPase) comme YopH
mais rBopC activité PTPase –
membre de la famille PTPase activité catalytique sur la cystéine 403 dans YopH
BopC n’a pas de cystéine
L’effet PTPase ne serait pas lié à BopC
Discussion
Analyse in silico du gène bopC
•Recherche de protéines homologues et ou de motifs conservés
Présent uniquement chez les souches de Bordetella (identité >95%)
•Localisation à l’extérieur du locus TTSS
idem pour d’autres effecteurs de TTSS (SopE, SigD, orf3,Nle5)
•Recherche d’îlots de pathogénie dans une région de 20kb flanquant bopC
transposase 5kb en amont de bopC B.parapertussis
transposase 2kb en amont et intégrase 1.6kb en aval de bopC B. pertussis
Rien chez B. bronchiseptica
•Régulation + de bopC par le système BvgAS
Discussion
La protéine BopC
•BopC est sécrétée sous forme de multimère ou compléxée (150-200kDa >69kDa)
observation en SDS-PAGE de tels phénomènes
pour des protéines ayant de nombreux segments TM
mais BopC possède un seul TM prédit (619-643aa)
la multimérisation de BopC serait porté par la partie Cter (449-658 aa) de BopC
BopC et TTSS
•Les TTSS peuvent sécréter des effecteurs hétérologues:
Xanthomonas TTSS reconnaît YopE;
Yersinia TTSS reconnaît Pseudomonas AvrB et AvrPto;
Bordetella TTSS reconnaît EPEC Map bien que moins stable ( absence de la chaperone CesT)
•BopC aurait un effet régulateur sur l’expression des autres protéines du TTSS
La spectrophotométrie de masse
MALDI-TOF Matrix –assisted laser desorption/ionization Time of Fly
ESI Electrospray Ionization
Phage lambda recombination in E. coli
The Gateway® System
relies on five sets of
specific and non cross-
reacting att sequences
The specificity is given
by the 7 nucleotides of
the core region
PhageattP
cos
232 bp
attBE. coli
x
21 bp
attLLysogen
attR
96 bp 157 bp
Integration(Int, IHF)
Excision(Int, IHF, Xis)
Glossary of terms used in Gateway® cloning
att site – A defined length of DNA that constitutes a recombination site. There are 4 classes of att sites called attB, attP, attL, and attR.
ccdB gene – A counterselectable gene that allows for negative selection of unwanted by-product plasmids after recombination.
Donor (pDONR) Vector – A vector with attP sites flanking a counterselectable gene that recombines with a gene of interest flanked by attB sites.
BP reaction – A recombination event between attB and attP sites catalyzed by BP Clonase™ II
Entry (pENTR) clone – A vector that contains your gene of interest flanked by attL or attR sites.
LR reaction – A recombination event between attL and attR sites catalyzed by LR Clonase™ II
Destination (DEST) Vector – An application-geared vector with attR sites flanking a counterselectable gene that will recombine with one or more entry clones.
MultiSite Gateway® Technology – A system that allows simultaneous assembly of multiple DNA fragments into a single destination vector
90-99% correct cloneson Kan plates
Building a Gateway® Entry Clone
geneattB1 attB2
+attP1 attP2
ccdB
D o norVector
K anR
+
gene
attL1 attL2
EntryC lone
K anRccdBattR1 attR2
BP Clonase™ II
Obtaining a Gateway® Expression Clone
Express ionC lone
gene
attB1 attB2
A m pR
attP1 attP2
ccdB
D o norVector
K anR
attR1 attR2
ccdB
D estinationVector
A m pR
gene
attL1 attL2
EntryC lone
K anR
90-99% correct cloneson Amp plates
+ +
LR Clonase™ II
CTGCTTTTTTGTACAAACTTG attB1 CAGCTTTCTTGTACAAAGTTG attB2 CAACTTTATTATACAAAGTTG attB3 CAACTTTTCTATACAAAGTTG attB4 CAACTTTTGTATACAAAGTTG attB5
StandardGateway®
MultiSiteGateway®
Invitrogen Proprietary & Confidential
X XX X
X
X
attB2attB5
attP2attP5
attR2attR1
attB5rattB1
attP5rattP1
attL5
attL1
attB2attB5attB1
attL2
attR5
PCR Fragments
pDONRs
Entry Clones
Destination Vectors
Expression clones
2-fragment MultiSite Gateway® Pro
BP reactions
LR reaction
Invitrogen Proprietary & Confidential
MultiSite Gateway® Three-Fragment Vector Construction Kit
CmR
X XEntry clones
Destination vector
attB3attB4 attB2attB1Expression clone
attR1attL4 attL3attR2
attR3attR4
attL2attL1
ccdB
X X X XattB1rattB4
attP1rattP4
attB2attB1
attP2attP1
attB3attB2r
attP3attP2rX X
PCR Fragments
pDONRs
BP reactions
LR reaction
Système TEM