Можно выделить два типа функциональных доменов,связанных с репликацией ДНК.

Это:РЕПЛИКОНЫ

иВРЕМЕННЫЕ ЗОНЫ РЕПЛИКАЦИИ

Репликоны впервые были обнаружены при изученииреплицирующейся ДНК высших эукариот с использованиемметода “fiber autoradiography”

Существует ряд методических подходов, позволяющих изучать организациюв репликоны протяженных областей генома. Наиболее простой методоснован на анализе полярности синтеза ведущих цепей ДНК

В геноме человека существуют очень длинные (700 kb) и крайнеассиметричные репликоны. Последнее указывает на возможностьгенетической детерминации концов репликонов

В домене - глобиновых генов кур участок начала репликации ДНКрасположен между генами и .

Этот участок начало репликации работает в эритроидных клетках, гдедомен реплицируется в начале S фазы, и в неэритроидных клетках,где домен реплицируется в конце S фазы.

Делеция участка начала репликации приводит к тому, что весь доменреплицируется пассивно с участка начала репликации, находящегося запределами домена. Та же ситуация наблюдается и при «Испанской»делеции, удаляющей 5’-концевую область домена (т.е. использованиеучастка начала репликации контролируется теми же регуляторнымисистемами, которые контролируют транскрипционный статус домена)

5’ HS sites

G A

3’HS1

HOR3’1

HOR5’3

HOR5’2

HOR5’1

7 6 5 4 3 2 1

Embryonic Fetal Adult

LCR

Hispanic deletion~10 kb

ori

Эритроидные и неэритроидныеклеткиХромосомы с “Испанской”делециейХромосомы с делецией ori

Индивидуальные гены реплицируются в разное время по ходу S фазы. Предложенонесколько методических подходов, позволяющих определить предпочтительное время репликации гена (replication timing)

Определение относительнойпредставленности пробы в препаратахреплицирующейся ДНК, изолированныхна различных стадиях S фазы

Подсчет относительного количества клеток(в асинхронной культуре), содержащих двекопии представляющего интерес фрагмента ДНК

Существует определенная корреляция между активностью гена и временемего репликации. Активные и потенциально активные гены как правилореплицируются в первой половине S фазы. Конститутивный гетерохроматинреплицируется в конце S фазы.

Многие тканеспецифичные гены реплицируются в начале S фазы в тех клетках, где эти гены активны, и в конце S фазы в тех клетках, где онине активны.

late

late

early

- globin gene domain

В эктопических позициях LCRдомена - глобиновых геновнаправляет создание таких жеобластей ранней и позднейрепликации

HS4 не важен для установления домена ранней репликации, но важен для установления домена поздней репликации. Делеция HS2 приводит к утрате как ранне-реплицирующегося, так и поздне-реплицирующегося доменов

liver

fibroblasts

RKKGGGGGAW

R = A или GW = A или ТK = G или T

В S. pombe подавляющее большинство ori инициируется в начале S фазы. Существует лишьнесколько поздних ori. Рядом с каждым из нихнаходится несколько блоков AG-богатыхпоследовательностей

В активной и неактивной копиях X хромосомы используются одни и те же участкиНачала репликации, но время репликации по ходу S фазы существенно различается

Figure 1. Experimental strategy for assessing genome wide replication timing using genomic microarrays. (A) Cell cycle profile of cycling human lymphoblastoid cell line after staining with Hoechst 33259. Cells in G1 and S phase of the cell cycle are sorted. (B) The sorted S and G1 phase fractions are checked for purity by re-analysis on the flow sorter and DNA extracted from the fractions. (C) The extracted DNA is differentially labeled with dCTP-Cy3 or dCTP-Cy5 using random primed labeling. (D) The labeled DNA is cohybridized to the array after preannealing with Cot1 DNA to suppress repeats. Early replicating sequences correspond to the spots with an increased S : G1 ratio.

Использование техники гибридизациис олигонуклеотидными чипами позволяетанализировать время репликации протяженных участков ДНК в рамках всего генома, либоиндивидуальных хромосом

Replication timing profiles of two example chromosomes at a 1 Mb resolution. (A) The replication timing of chromosome 6 at a 1 Mb resolution. (B) The replication timing of chromosome 13 at a 1 Mb resolution. The black arrows indicate the gene deserts on chromosome 13.

Одни и те же участки начала репликации как правило используются в клетках, где данный репликон работает в начале S фазы и в клетках,где данный репликон работает в конце S фазы

Время активации участка начала репликации контролируется теми же регуляторными элементами, которые контролируют транскрипционный статус домена

желаю успешной сдачи экзаменов