Université Saad Dahleb, Blida

Faculté des Sciences Agro-Vétérinaires

Département de Biologie

Compte rendu du TP Nº 03 de microbiologie

Qu’est qu’un milieu de culture ? Les différents types de milieux de culture. Examen macroscopique. Les techniques d’isolement.

Année scolaire : 2008 /2009

* Pour un diagnostic bactérien, on prélève du patient un prélèvement a fin de trouver l’agent causal de la maladie, puis on fait un isolement des bactéries (sépare les bactéries du reste de l’échantillon) qu’on souhaite traiter cet isolement exige l’utilisation des milieux de culture.

Qu’est qu’un milieu de culture   ?

C’est un support pour les bactéries, qui contient des éléments nutritifs indispensables à la croissance et la survie des bactéries. Les éléments nutritifs abandons dans les milieux sont :

Des ions métalliques : phosphore, azote, soufre et des ions en traces : magnésium, cuivre…etc.

Source d’énergie :le glucose comme source de carbone. L’eau. Tampon pH(règle le pH adéquat pour le développement de la bactérie,généralement

l’optimum de croissance des bactéries est de 7 ). Parfois on trouve des facteurs de croissance tel que des vitamines , chocolat ,œuf .

Les ingrédients apportés au milieu de culture dépendent des exigences et besoins nutritifs de chaque espèce bactrienne ce qui explique les différents types de milieux de cultures.

Les différents types de milieu de culture selon leur composition   :

1. Milieu synthétique   : Préparés exclusivement avec des produits chimiques purs. Le milieu synthétique de composition bien définie, constitue le milieu de culture idéal. Ce type de milieu permet d'obtenir des résultats comparables et de déceler avec précision les modifications qu'il subit au cours du développement microbien. Il n'en est généralement pas de même avec les milieux non synthétiques qui sont constitués par des éléments complexes de composition variable. Les milieux synthétiques conviennent surtout aux moisissures (champignons microscopiques) mais fort peu aux bactéries.

2. Milieu complexe   : Milieu dont on ne connaît que partiellement la composition. Ces milieux de culture peuvent contenir des extraits de levure (cellule de levure déshydratée et lysées) qui fournissent une source d'acide aminé de vitamine et d'azote, des extraits de malt apportant une source de carbone, des peptones (protéine animale, de poisson, de caséine de lait) source d'azote organique qui intéresse les individus hétérotrophes. (Ex. bouillon nutritif, bouillon au soja.).

Et on a plusieurs types : Milieu simple ou général   :

Les composants chimiques +gélose (sucre ajouté a un solidifient). Le milieu simple, c’est un milieu minimal +gélose.

Milieu enrichi   : C’est un milieu simple +des facteurs de croissance (œuf, vitamines, chocolat, extrait de viande…etc.).Ce milieu sert au développement de certaines bactéries auxotrophes qui nécessitent des facteurs de croissance.

Milieu sélectif   : Favorise le développement d’une espèce bactérienne -permet de sélectionner un type bactérien parmi plusieurs- et inhibe les autres bactéries, ce milieu contient des facteurs

inhibiteurs comme l’antibiotique, poison ou des colorants comme la fuchsine. La gélose macConky est utilisée pour détecter E.coli et d’autres bactéries apparentées. Les sels biliaires ou les colorants comme le Crystal violet et le rouge neutre favorise la croissance des bactéries gram-négatifs et inhibe celle des bactéries gram-positifs.La gélose Chapman est un milieu sélectif a gram positif.

Milieu spécifique   : C’est un milieu d’identification de la bactérie, ce milieu donne l’exactitude de la bactérie déjà isolée.Différentiation des colonies bactériennes (examen macroscopique) :Sur ces milieux de culture une cellule bactrienne nous donne des millions de descendants s’accumulent sous une masse appelée «colonie », on a deux types de colonies : une colonie pur qui contient la même espèce,et une colonie mixe ou poly microbienne qui contient deux ou plusieurs types de bactéries. Après isolement et incubation on effectue un examen macroscopique qui constitue a différentier les bactéries selon la taille, la couleur, la forme : lisse, irrégulière ou bien bombés ou plate.

EXAMEN MACROSCOPIQUE DES CULTURES L'examen macroscopique des cultures est le premier examen effectué à partir de l'isolement après incubation. L'aspect des colonies dépend du milieu utilisé de la durée et de la température de l'incubation. Il ne pourra être décrit convenablement qu'à partir de colonies bien isolées : les colonies sont d'autant plus petites qu'elles sont rapprochées. La colonie peut apparaître à la surface du milieu de culture pour les germes aérobies, ou être en profondeur pour les germes anaérobies

1. Aspect de colonies en surface sur milieu solide 1.1. La taille Elle peut être mesurée à l'aide d'une règle graduée pour les grandes colonies. Il est possible aussi d'utiliser le microscope au grossissement le plus faible pour mesurer la taille des petites colonies en utilisant de micromètres oculaires.. 1.2. La forme

Allure de contours : lisse, dentelés, déchiquetés, irréguliers Relief : surface bombée, demi-bombée, plate. Centre : parfois surélève, parfois ombiliquée (en creux)

1.3. L'aspect de la surfaceLa surface d’une colonie bactérienne peut être lisse, rugueux, renvoyer la lumière de façon à leur donner un reflet métallique ou un aspect irisé.

1.4. La consistanceAu moment du prélèvement il est possible d'apprécier si les colonies sont grasses, crémeuses (on obtient facilement des suspensions homogènes), sèches ou encore muqueuses (on obtient difficilement des suspensions homogènes). 1.5. La couleur et/ou pigmentPlusieurs colonies n’ont pas une couleur bien définie (blanc, gris). Par contre, certaines bactéries produisent un pigment insoluble qui donnent un aspect bien caractéristique à la

colonie (rose, jaune, rouge …), tendis que d’autres produisent un pigment soluble qui diffuse et colore le milieu

2. Aspect de la pousse en milieu liquideLes bouillons nutritifs sont aussi utilisés pour cultiver les bactéries. Dans un bouillon la croissance microbienne se traduit par l’apparition d’un trouble ou opalescence mais l’aspect varie selon les espèces.

3. Mode opératoire : a. Milieu solide:

Repiquer différentes aspects et formes de colonies sur des tubes de gélose linéaire Incuber à 37°C pendant 24 h Observer) les différents aspects

1b. Milieu liquide : Repiquer à l’aide d’une anse de platine des colonies différentes dans des tubes de

bouillon nutritifs Flamber l’anse après chaque repiquage Incuber à 37 °C pendant 24 à 48h Observer les différents aspects de pousse en milieu liquide

Techniques d’isolement   :

Isoler la bactérie c’est la séparer du reste du prélèvement, puis on purifie (une série des ensemencement pour avoir une colonie pur )les bactéries au fur et à mesure des ensemencements, c’est le point de départ d’une étude aboutissant à l’identification.On peut isoler les bactéries par la méthode des quadras (épuisement du milieu) ou par épuisement simple.