Bioensaios celulares: Princípios e Aplicações

Letícia Veras Costa LotufoLaboratório de Oncologia Experimental

Departamento de Fisiologia e Farmacologia, UFClvcosta@secrel.com.br

PROGRAMA:• 11/02

– aula 1 - Princípios básicos – Ensaios de citotoxicidade

– aula 2 –Aplicações no estudo de novas drogasanticâncer

• 12/02– aula 3 – Aplicações no estudo de novas drogas

anticâncer– aula 4 - Morte celular: apoptose versus necrose

O ciclo celularSeqüência ordenada de eventos que possibilita a geração de duas células filhas idênticas à célula original

Estímulos:CrescimentoReparoMorte celular

Estágios do ciclo:QuiescênciaIntérfaseMitose

Interfase

• 95% do ciclo celular• Duplicação das

organelas• Duplicação do DNA• Crescimento• Sub-divida em 3 fases:

– G1– S– G2

Fase G1

• Metabolicamenteativas

• Duplicação de organelas, mas nãodo DNA

• Duração variável

• Prepara para fase S

Fase S

• Sinal para duplicaçãocelular

• Duplicação do centrossomo

• Replicação semi-conservativa do DNA-2 cópias idênticas do genoma

Fase G2

• Crescimento contínuo

• Síntese de proteínas(enzimas) paradivisão celular

• A fase da interfasepode ser identificadapelo conteúdo de DNA

Controle do ciclo celular• Controle do ciclo celular:

– Ciclinas– CDKs– Fosforilação/desfosforilação

• Checkpoints

• Proteínas supressoras tumorais

Controle do ciclo celular• Ciclinas• CDKs• Fosforilação/desfosforilação

Progressão G1-S

O ciclo celular• Controle do ciclo celular:

– Ciclinas– CDKs– Fosforilação/desfosforilação

• Checkpoints

• Proteínas supressoras tumorais

Pontos de checagem“Checkpoints”:

Foster A., Radiography, 2007.

Checkpoints:• Ponto de checagem G1

– Ponto de restrição• Ponto de checagem G2

– Localizado na transição G2-M– Síntese de DNA completa e correta para a célula

entrar em mitose• Ponto de checagem da mitose

– Localizado na transição da metáfase para anáfase– Todos os cromossomos devem estar ligados ao fuso

ATIVAÇÃO DE SISTEMAS DE REPARO

ATIVAÇÃO DE VIAS DE INDUÇÃO DE APOPTOSE

Mitose

Aspectos mecânicos da mitose

• Microtúbulos e proteínas associadas

Jordan & Wilson, 2004; Woehlke G and Schliwa M, 2000

Quinesinas

Kummar, 2004 - adaptado

Incapacidade de Reparo do DNA

Célula NormalAgentes que causam lesão no DNA

Lesão no DNA

Mutação em célulassomáticas

Reparo bem sucedido do DNA

oncogenes apoptose supressores tumorais

Expressão de produtos gênicos alterados e perda de produtos gênicos reguladores

Neoplasia maligna

Expansão clonalMutações adicionais (progressões)

Heterogeneidade

Mutações herdadas em:- Genes que afetam o reparo do DNA;- Genes que afetam o crescimento ou apoptose celular

BASE MOLECULAR BASE MOLECULAR DO CÂNCERDO CÂNCER

CÂNCERCÂNCER

É uma doença genética complexa causada por

mutações em genes que controlam o

crescimento celular e/ou apoptose (morte

celular programada).

Mitoses freqüentes

Células anormais e heterogêneas

Neovascularização

Proliferação descontrolada

Síntese anormal de DNA

Síntese de proteínas alteradas

Perda de inibição por contato

Desdiferenciação e perda da

função

Comprometimento do

mecanismo intrínseco de

apoptose

Neovascularização

Poder de invasão e metástase

Núcleo aumentado

CÂNCERCÂNCER

CCéélula normallula normal

TransformaTransformaçção ão malignamaligna

2 c2 céélulaslulas

4 c4 céélulaslulas

8 c8 céélulaslulas

16 c16 céélulaslulas

1 milhão de c1 milhão de céélulaslulas(20 duplica(20 duplicaçções)ões)

1 bilhão de c1 bilhão de céélulaslulas(30 duplica(30 duplicaçções)ões)detectdetectáávelvel

1 trilhão de c1 trilhão de céélulaslulas(40 duplica(40 duplicaçções)ões)

PATOGÊNESEPATOGÊNESETRANSFORMAÇÃO ANGIOGÊNESE

MOTILIDADE E INVASÃO

CAPILARES, VÊNULAS E LINFÁTICOS

ADERÊNCIAEMBOLISMO E CIRCULAÇÃO

EXTRAVASAMENTORESPOSTA AO MICROAMBIENTE

PROLIFERAÇÃO CELULAR TUMORALE ANGIOGÊNESE

METASTASES

METÁSTASESDE METÁSTASES

TRANSPORTE

AGREGAÇÃO MULTICELUAR (LINFÓCITOS E PLAQUETAS)

Moléculas Função no ciclo celular Alterações moleculares no câncer

Ciclina D Promove a entrada na fase G1 Amplificado

Ciclina E Promove a progressão da fase G1 Amplificado

CDK4 Promove a entrada na fase S Amplificado

Rb1 Regulação nos pontos de checagem G1/S Perda ou inativo

p15 e p16 Inibidores da CDK4 e CDK6 Perda

TP53 Regulação nos pontos de checagem G1/S e G2/M Perda ou inativo

Câncer e Ciclo celular

REPLICAÇÃO DO DNA e

PROLIFERAÇÃO CELULAR

PROTO-ONCOGENES GENES SUPRESSORES

Ativados por Mutações

RNA -virus

-dominante-Atividade

Inativados porMutações

DNA-vírus

-recessivo-perda de atividade

GENES-ALVOS NA CARCINOGENICIDADE:

TRATAMENTO DA DOENTRATAMENTO DA DOENÇÇAA

Cirurgia;Cirurgia;

Quimioterapia Quimioterapia consiste em um tratamento a base de fármacos que interferem em diferentes processos tais como: desenvolvimento, crescimento, disseminação e invasão de células cancerígenas (Souza et al., 2007).

Radioterapia;Radioterapia;

QTs AntineoplásicosCiclo-específicos e ciclo-inespecíficosFase-específicos:

SM

Antibiotics

Antimetabolites

S(2-6h) G2

(2-32h)

M(0.5-2h)

Alkylating agents

G1

(2-∞h)

G0

Vinca alkaloids

Taxoids

Calabresi e Chabner, 1995 - Adaptado

Hidroxiuréia, PALA(inibe ribonucleosídeo redutase e inibe biosíntese de pirimidina)

Agentes alquilantes(formam derivados com DNA)

Enzimas(inibe síntese protéica)

Alcalóides vegetais e taxóis(inibe polimerização de microtúbulos)

Dactinomicina e derivados(intercalação no DNA e inibição da RNA polimerase)

Antagonistas purínicos(inibem síntese purínica)

Antimetabólitos(inibe síntese de TMP)

SSÍÍTIO DE ATIO DE AÇÇÃO DOS QUIMIOTERÃO DOS QUIMIOTERÁÁPICOSPICOS

Bioensaios

Coleta e identificação de material

Coleta e identificação de material

Citotoxicidade em 4 linhagens

tumorais (MTT)

Citotoxicidade em 4 linhagens

tumorais (MTT)

Estudo do mecanismo de atividade citotóxicaEstudo do mecanismo de atividade citotóxica

Inibição do desenvolvimento de

ovos do ouriço do mar

Inibição do desenvolvimento de

ovos do ouriço do mar

Fracionamentobiomonitorado das amostras (MTT)

Fracionamentobiomonitorado das amostras (MTT)

Toxicidade em Artemia salinaToxicidade em Artemia salina

Identificação dos compostos ativos

Identificação dos compostos ativos

Atividade hemolíticaAtividade hemolítica

Proliferacão celular(MTT)

Proliferacão celular(MTT) Indução de apoptose

(citometria de fluxo)Indução de apoptose(citometria de fluxo)

Análise morfológica (coloração por H/E)

Análise morfológica (coloração por H/E)

Duplicação celular(incorporação de BrdU)

Duplicação celular(incorporação de BrdU)

Inibição de topoisomerase I e II

Inibição de topoisomerase I e II Cinética celular

(curva de crescimento)Cinética celular

(curva de crescimento)

Estudos in vivoSarcoma 180

Estudos in vivoSarcoma 180

Ensaios celulares para o desenvolvimento de novas drogas anticâncer

• Programas de screening

• Etapa inicial – HTS• Ensaios de

citotoxicidade

Exclusão por Azul de TripanConstrução de curvas de crescimento

Azul de Tripan

Inviável

Viável

Tripan ContagemAmostra

INCORPORAÇÃO DE BRDU - SÍNTESE DE DNA -

BrdU

Montar placa

Anticorpos Primário e Secundário

Estreptavidina-Peroxidase

DAB

DNASíntese de DNA Desnaturação

Síntese de DNA-Positivo

Síntese de DNA-Negativo

Análise morfológica – Coloração diferencial por hematoxilina/eosina

Hematoxilina

Montar placa Análise

24h

Incubar com droga

Hematoxilina

Eosina

Eosina

Channels (RED-HLin-Red Fluorescence (RED-HLin))0 40 80 120 160

Num

ber

060

120

180

240

G1

G2DNA Fragmentado

CICLO CELULARCICLO CELULAR

ANANÁÁLISE PELO CONTELISE PELO CONTEÚÚDO DO DNADO DO DNA

CITOMETRIA DE FLUXOCITOMETRIA DE FLUXO

Laser de íon argônio (488 nm)

CCéélulaslulas

Filtros:

FSC

SSC

Detectores:

Vermelho VerdeAmarelo525 nm680 nm 583 nm

100 100 µµmm

Alguns exemplos:

Alguns exemplos:

Cancer Cell 2005, Vol 8: 49-59

Topoisomerases I/II

O Problema Topológico

Mecanismo de ação da DNA topoisomerase I

A topoisomerase I introduz um nick no DNA, permitindo a rotação duma cadeia em torno da outra e aliviando a força de torsão que se acumula à frente do garfo replicativo. O nick é transitório, sendo re-ligado imediatamente após a topoisomerase I ter libertado a outra cadeia.

Mecanismo de ação da DNA topoisomerase I

As topoisomerases também podem levar a cabo a reação inversa, ou seja, introduzir mais voltas na hélice, causando o seu super-enrolamento.

Mecanismo de ação da DNA topoisomerase II

Topo I/II Drug Screening

SC-DNATopoisomerase

Inibidor

Análise

• 30 min a 37ºC;

• Parar a reação com SDS 10%;

• Digestão com PK;

• Extração de impureza com clorofórmio:álcool isoamílico (24:1)

Eletroforese em gel de agarose 1%

Topo I/II Relaxation Assays

Topo I/II Cleavage Analyses

Kinetoplast DNA (kDNA)

Kinetoplast DNA (kDNA)

Alguns exemplos…

ATÉ JÁ…