Claudia Alpini, Laboratorio Analisi Chimico Cliniche,

Fondazione I.R.C.C.S. Policlinico “San Matteo”

Pavia

L’evoluzione tecnologica dell’immunofluorescenza:

verso la completa automazione degli ANA – IFI

CENNI STORICI

1948

1957

1950

Anti-nuclear antibodies: Contemporary techniques and clinical application to

connective tissue diseases

G. A. McCarty, D. W. Valencia and M. J. Fritzler

Oxford University Press, Oxford, 1984

1980

La storia della diagnostica autoimmune

inizia negli anni ‘40 e ‘50

Antigen

Renato Tozzoli LigandAssay 15 (4) 2010

Metodi di dosaggio degli autoanticorpi

Tra i metodi “convenzionali di prima generazione” l’IFI rappresenta la

prima tecnica per la rivelazione degli autoanticorpi e nella sua

applicazione principale (ANA-IFI) rappresenta anche il primo esempio

di test “Multiplex” nella storia.

Figure 1

The evolution of technologies for autoantibody detection: the role of automation (see text for legends).

Tozzoli et al.: Current state of diagnostic technologies in the autoimmunology laboratory

Nell’ultimo ventennio, la ricerca ha prodotto una vera rivoluzione nell’ambito delle

tecnologie diagnostiche dirette alla rivelazione/quantificazione degli autoanticorpi,

che si è tradotta

• in un aumento esponenziale della capacità analitica

• in un rapido incremento numerico delle richieste

L’evoluzione delle tecnologie : la determinazione degli ANA

• un aumento esponenziale della capacità analitica

L’evoluzione delle tecnologie : la determinazione degli ANA

Journal of Immunology Research

• un rapido incremento numerico delle richieste

ANA anno 2013

Statistica richieste ANA

A

S

L

B

E

L

G

C

C

H

I

R

Incremento ANA negli anni

A

S

L

E

M

A

T

INF

A

M

B

A

P

E

D REU

Laboratorio Analisi Chimico Cliniche,

Fondazione I.R.C.C.S. Policlinico “San Matteo” Pavia

M

E

D

.

I

N

T

Anticorpi anti-antigeni nucleo-citoplasmatici : ANA

Definizione

■ sono autoanticorpi appartenenti a tutte le classi di immunoglobuline,

più spesso IgG, diretti verso i normali costituenti e compartimenti cellulari, comuni

a tutti i tipi di cellule,rappresentati da acidi nucleici, macromolecole, proteine associate

acidi nucleici, enzimi e loro cofattori;

■ sono presenti in modo stabile nel nucleo e nelle principali strutture cellulari

(membrana, nucleoplasma e cromatina, nucleolo);

■ migranti dal nucleo al citoplasma, durante le fasi del ciclo cellulare;

■ sono presenti in modo stabile nel citoplasma;

■ sono la conseguenza della perdita, da parte dell’organismo, della tolleranza

verso antigeni “self ”.

Ann Rheum Dis July 2014 Vol 73 No 7

“ANA”

- Sono un test di screening utilizzato per la diagnosi di quasi tutte la malattie

reumatiche autoimmuni, e in alcuni casi , ne rappresentano un parametro

diagnostico/classificativo .

- Utili da un punto di vista clinico/diagnostico in altre patologie autoimmuni e non.

Journal of Immunology Research

Volume 2014, Article ID 315179, 18 pages

ANA new technologies

ANA-IFI

……rapido incremento numerico delle richieste

……disponibilità di tecnologie ad elevato throughput

ANA test ??

“vecchio”

ANA-IFI “nuovo”

ANA test Screening

► Consolidamenti in atto: necessità di

assorbire aumentati carichi di lavoro

► Esigenza di integrazione ed accentramento

su stazioni analitiche multiparametriche

► Aumento richieste esami

Ma..il problema:

► del controllo della qualità

( riproducibilità, sensibilità, specificità);

► dell’interpretazione clinica dei risultati ;

► dell’accuratezza dei metodi

Ha evidenziato crescenti preoccupazioni circa l’adozione

unilaterale di questi nuovi metodi .

Alla domanda : “ Quale metodo utilizzare?”

Comitati internazionali ad hoc, come:

- IUIS/WHO/AF/CDC Comitato per la standardizzazione di autoanticorpi correlati a malattie autoimmuni

- Task Force della American College of Rheumatology (ACR)

Meroni et al. BMC Medicine2014, 12:38

Journal of Immunology Research

Volume 2014, Article ID 315179, 18 pages

ANA-IFI deve la sua riaffermata superiorità ad una elevata sensibilità.

Sensibilità non riscontrabile nei metodi alternativi e caratteristica fondamentale

ed obbligatoria in un saggio destinato ad essere utilizzato come “screening”.

●

●

●

●

Nella pratica clinica, una corretta interpretazione del test ANA deve essere

d’aiuto a stabilire…

“Qual è la probabilità di un paziente di avere la malattia quando il test di

laboratorio è positivo o non avere la malattia quando il test di laboratorio è

negativo” …. difficile in termini di specificità e sensibilità

PVN di SPA è inferiore al PVN di IFI

In virtù della riaffermata superiorità…..

“rivoluzione e modernizzazione” del test ANA-IFI

Negli ultimi anni si sono intensificati gli sforzi per

migliorarne in modo significativo i principali svantaggi

4

5

3

2

1 2

3

4 5

Piattaforme tecnologiche

avanzate per l’automazione

di ANA-IFI

Piattaforme tecnologiche

avanzate per la lettura e

l’interpretazione di ANA-IFI

1

4

Agmon-Levin N, et al. Ann Rheum Dis 2013;0:1–7. doi:10.1136/annrheumdis-2013-203863

Agmon-Levin N, et al. Ann Rheum Dis 2013;0:1–7. doi:10.1136/annrheumdis-2013-203863

Piattaforme tecnologiche avanzate

per l’automazione di ANA-IFI

LIS

LIS

Oggi: stato dell’arte

Piattaforme tecnologiche

avanzate per la lettura e

l’interpretazione di ANA-IFI

Questi “Sistemi Intelligenti” utilizzano:

microscopi automatizzati con sorgente luminosa a LED;

vassoi porta vetrini robotizzati;

video camere ad alta sensibilità;

hardware e software diversi dedicati all’acquisizione,

alla analisi e alla valutazione dell’immagine ANA-IFI.

Metodo robusto nello screening

dei campioni positivi/negativi;

Criticità sono state rilevate:

■ interpretazione di alcuni quadri fluoroscopici;

■ pattern con reattività multiple.

Tale interpretazione errata può avere

implicazioni in ambito clinico,

sottolineando

la necessità e l’ importanza dell’interpretazione

dell’ esperto.

Autoimmunity Reviews 13 (2014) 292–298

18 falsi negativi*

22 falsi positivi●

* 2 sieri “critici” anche per operatori esperti;

16 sieri 50% pattern citoplasmatici (1 Jo1non riconosciuto da 4/6)

50% pattern inusuali

errore 3,3% con sens.media 96,7%

● % errori calcolata sul totale delle osservazioni pari al 10,8%

65% con titolo ≤1:160 (1/3 pattern citoplasmatico e 2/3 pattern inusuale)

35% con titolo ≥1:320 ( 60% pattern citoplasmatico e 40% pattern inusuale)

Complessivamente l’efficacia analitica dei sistemi

è notevole:

40/756 errori pari al 5,3%

Sensibilità 96,7%

Specificità 89,2%

Imprecisione analitica buona < 1,99% x< 25,26%

(manuale 39,12%)

Buona correlazione tra valore analitico del segnale e titolo manuale (titoli bassi e morfologia complessa penalizzano corretta classificazione)

…Interpretazione ANA-IFI

Corretta identificazione dei quadri morfologici “classici”

Difficoltà nell’interpretazione di quadri fluoroscopici “inusuali” e citoplasmatici

•Difficoltà nella corretta interpretazione di quadri fluoroscopici “misti”

L’interpretazione dei quadri fluoroscopici dipende :

■ limitazioni dichiarate dai produttori;

■ qualità del substrato;

■ preparazione vetrini .

*

*

*

• non sono stati valutati sieri con pattern“misti”

*

Time

Th

rou

gh

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t AN

A-IF

I

...verso la completa automazione degli ANA-IFI

….siamo vicini alla meta!

Standardizzazione e completa automazione

procedura di esecuzione

Armonizzazione dei risultati in IFI:

-riduzione soggettività;

-riduzione variabilità intra-inter laboratorio;

-throughput più elevato flusso di lavoro