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Mutazioni geniche
MUTAZIONE
Cambiamento ereditario, raro e casuale che provoca
un’alterazione qualitativa e/o quantitativa dell’informazione
genetica, non dovuto a segregazione o ricombinazione
di geni preesistenti
Individuo mutante
Gene normale -> il cambiamento mutazionalepuò essere valutato rispetto ad uno standard che chiamiamo “normale” rappresentato dal genotipo selvatico, che puo’ essere la forma genica piu’ diffusa in natura o presente in uno stock standard di laboratorio
Tipi di mutazioni
• Geniche -puntiformi- delezioni-inserzionisi verificano all’interno di un singolo gene creando varianti alleliche diverse o alleli ipoattivi, inattivi o iperattivi
• Cromosomichesi verificano nell’ambito di segmenti di cromosomi o di cromosomi interi e possono determinare disorganizzazione genica
• GenomicheAnomalie cariotipiche, si verificano quando un organismo presenta dei cromosomi in più o in meno rispetto al normale. Se sono presenti interi corredi cromosomici in più o in meno si parla di euploidia aberrante ; se invece è solo una parte del corredo in eccesso o in difetto l'anomalia è chiamata aneuploidia
La mutazione
1. Crea variabilità sulla quale agisce la selezione naturale nel processo evolutivo, promuovendo le mutazioni favorevoli dalle sfavorevoli o letali
2. Permette l’analisi genetica
3. È alla base del miglioramento genetico di piante ed animali di interesse agronomico
selvatico mutante
mutante selvatico
Reversione
Mutazione in avanti
Retromutazione
Mutazioni puntiformi
- Sostituzioni di basi
- Inserzioni di basi
- Delezioni di basi
Sostituzioni di basi
Sostituzioni di basi
Sostituzioni di basi
Frameshift -> spostamento dello schema di lettura; vengono persi completamente la struttura e la funzione
della proteina normale
Mutazioni nelle sequenze regolative
Il promotore non viene riconosciuto per la trascrizione
La mutazione nei siti accettori e donatori dello splicingcompromette il corretto splicing degli introni
Influenzano la quantita’ di prodotto proteico ma non la struttura della proteina
La mutazione è un cambiamento ereditabile del materiale genetico
SomaticaEreditata solo dai
discendenti di una cellula
Individuo/i mutati
Germinaletrasmessa attraverso
le generazioni
Mutazioni somatiche-Avvengono nelle cellule del tessuto somatico o mitotico o post-mitotico
- Non vengono trasmesse alla progenie
- La cellula in cui avviene la mutazione e’detta capostipite e può dare origine ad un CLONE di cellule mutate o SETTORE
- La mutazione si manifesta se dominante rispetto al WT
Cloni di cellule mutate
Proto-oncogeni e cancro
I proto-oncogeni codificano per una classe di proteine attive in modo selettivo, ovvero solo se opportunamente stimolate e che sono coinvolte nella regolazione della divisione cellulare. Se l’evento mutazionale disaccoppia la proteina dalla sua via
regolativa, la sua attivazione può diventare continua ed incontrollata
Proto-oncogene-> gene coinvolto nella regolazione della divisione cellulare
mutazione
Oncogene
-divisione incontrollata della cellula-diffusione di cellule tumorali
GRasV12 G->T
L’oncoproteina Ras
L’oncoproteinaRas e melanoma
Fenotipi delle mutazioni-Mutazioni morfologichedeterminano nuove caratteristiche fenotipiche visibili
-Mutazioni letalieffetto sulla sopravvivenza
-Mutazioni condizionalicomparsa del fenotipo solo in un ambiente particolare detto restrittivo
-Mutazioni auxotroficheincapacita’ di sintetizzare uno specifico nutriente
-Mutazioni con perdita di funzione (Loss of function)è recessiva se l’allele selvatico e’ sufficiente a sopperire alla mancanza dell’altro allele che è mutato; è dominante se l’alleleselvatico non è sufficiente a sopperire alla mancanza dell’allelemutato
-Mutazioni con acquisto di funzione (Gain of function)la mutazione conferisce acquisto di funzione per cui si comportada dominante
Loss of function
Gain of function
1.232,469,285Sh → sh
2.241,745,280Y → y
2.441,678,736Su → su
11.07647,102Pr → pr
106.028265,391I → i
492.0273554,786R → r
Average number of mutationsper million gametes
Number of mutations
Number of gametes tested
Gene
Frequenza delle mutazioni in alcuni loci del mais
Quanto sono frequenti le mutazioni?
Tasso di mutazione = numero delle mutazioni che si verificano in una certa unità di tempo (generazione di cellule o individui)
Frequenza di mutazione = frequenza con cui una mutazione compare in una popolazione di cellule o individui (la popolazione può essere costituta da gameti o qualsiasi altro tipo cellulare)
Tasso di mutazione = 1/7 divisioni cellulariFrequenza di mutazione= 2/8 cellule
Rilevazione delle mutazioniPoiché la mutazione è un evento “raro”, è necessario
disporre di un sistema di screening opportuno
Sistemi di screening di mutazioniReversione degli auxotrofi- retromutazione nello stesso gene- soppressione in un altro gene
Si fanno crescere i mutanti auxotrofi in terreno permissivo e poi si passano in terreno selettivo, su
cui cresceranno solo i prototrofi
Auxotrofo per l’adenina Su terreno
minimo cresceranno solo i prototrofi per l’adenina
Nella maggior parte delle reversioni si genera una mutazione in un locus genico diverso con funzione
di soppressore dell’auxotrofia
Mutazione soppressoreE’ una seconda mutazione nello stesso locus genico che sopprime l’effetto della prima, almeno in parte
esempio
Delezione della C
Inserzione della A
L’inserzione della A ripristina in parte lo schema di lettura corretto delle parole
Mutazione non senso
Codoni di stop della traduzioneUAG o codone amber, UAA o codone ochre, e UGA o codone opal
Mutazione soppressore intergenico amber
Mutazione nell’anticodone nel t-RNA
Arricchimento per filtrazione (selezione di mutanti auxotrofici)Neurospora, Aspergillus
Crescita di colonie isolate resistenti al fago T1
Cellule di E. Coli resistenti all’infezione da fago T1
La natura della mutazione
Nei cellule di E. Coli resistenti al fago T1 si genera una
mutazione o si determina un adattamento fisiologico alla
presenza del fago?
Teorie sulla resistenza ai fagi
Cambiamento o adattamento fisiologico costante per tutte le cellule
Evento raro di mutazione casuale variabile nel tempo
Test di fluttuazione
I batteri vengono piastrati su piastre che contengono i fagi T1
Bulk culture
individual culture
Le cellule resistenti, già presenti nella popolazione, vengono selezionate dall’agente ambientale (fago)
Esperimento di Replica-Plating(Lederberg, 1952)
Piastra master con terreno non selettivo
Repliche esatte della piastra master su terreno selettivoLe cellule che crescono su terreno
selettivo avevano la mutazione giàpresente prima della selezione
Se le mutazioni si fossero verificate dopo l’esposizione al fago ogni replica sarebbe stata
diversa quanto a distribuzione delle colonie resistenti
Piastre di selezione
Piastra madre
Ricerca di mutazioni letali associate al cromosoma X di Drosophila: il cromosoma ClB
(Muller)
Regione C invertita soppressore del
crossover
Allele recessivo letale, l
Allele B dominante per l’occhio Bar
Cromosoma bilanciatore: cromosoma marcato con allele dominante (B) e con
inversione (C)
X
ClB
Determinazione di mutazioni letali recessive X-linked
♀ 2 : ♂ 1
Solo ♀
x
x
Mutazione spontanea sull’X che produce un gene letale
La frequenza delle mutazioni spontanee è di circa 1.5 per
1000 cromosomi
Il trattamento con raggi X determina un aumento di oltre 10 volte nella frequenza di mutazioni letaliX-linked
I raggi X sono mutageni in tutti gli organismi
Mutazioni indotte per selezionare varietàvegetali con caratteri desiderati
Mutagenesi di polline o semi
Mutazioni spontanee -> si verificano naturalmente
Mutazioni indotte-> si formano in seguito ad esposizione di un organismo ad agenti mutageni
Mutazioni spontaneeSi verificano per:
- Errori nella replicazione del DNAMalappaiamento di basi a causa dell’oscillazione tautomerica
Fedeltà della replicazione: 1 errore/ ~ 109 nt copiati
Lesioni spontanee
-Depurinazione
-Deaminazione
Transizioni GC->AT
HOT SPOTS non riparti dall’Uracile-DNA glicosilasi
Riparato da parte dell’Uracile-DNA glicosilasi
Danni da ossidazione del DNAda parte di radicali superossidi (O2., da perossido di idrogeno (H2O2) e radicali ossidrili (OH.)
Si appaia erroneamente con A generando trasversione C->A
Mutazioni indotteMutageni-> chimici, radiazioni
-Incorporazione di analoghi delle basi
-5-Bromouracile (5-BU) analogo della timina ma può appaiare con la guanina
-2-Amminopurina (2-AP) analogo dell’adenina (può appaiare con la citosina)
-Agenti alchilanti
EMS (etilmetansulfonato)
NG (nitrosoguanidina)
-Agenti intercalanti
- Proflavina- Arancio di acridina- Bromuro d’etidio
Hanno strutture planari piatte che imitano la coppia di basi, per cui riescono ad inserirsi fra le basi azotate impilate del DNA, causando inserzioni o delezioni di singole coppie di basi
Bromuro d’etidio
Radiazioni UV Generano fotoprodotti
Dimero ciclobutilico di pirimidine
TEST DI AMESTest per valutare il potenziale mutagenico/cancerogeno
di un composto
Stimolazione a produrre enzimi epatici (il fegato di mammiferi può
convertire composti apparentemente non tossici in composti tossici)
La presenza di revertentiindica che il composto chimico èmutageno
Meccanismi di riparazione del DNASistemi enzimatici che riparano i danni subiti dal DNA
Se questi sistemi non funzionano adeguatamente insorgono mutazioni, quindi malattie, quindi cancro
Meccanismo SOSmeccanismo di emergenza attivato per impedire la morte della cellula procariotica in seguito al danno
FotodimeroTC
Le proteine UmuD/C riducono la fedeltà del processo di replicazione del DNA
Riparazione per escissione
Riparazione da DNA glicosilasi
Sito AP (apurinico/apirimidinico)
lasciato dalla glicosilasi
EndonucleasiAP
Riparazione postreplicativa
Il DNA neosintetizzatonon e’ metilato
Riparazione postreplicativa per ricombinazione
Xeroderma Pigmentoso
Difetto nel meccanismo di riparazione per escissione di nucleotidi. Le persone affette sviluppano tumori della pelle con estrema
facilità, indotti da radiazioni UV, in seguito all’esposizione alla luce solare