LIBRO DE ESTRUCTURA DE PROTEÍNAS

Y ENZIMAS

PARA PROFESORES DE ENSEÑAÑZA MEDIA

no cat

1

INDICE Introducción. Objetivos del curso. Conceptos fundamentales.

Pág. 2 - 3

Programa de Clases y Experimentos

4 -5

Apoyo teórico y actividades sesiones 1y 2: estructura de proteínas

7 -17

KIT para la construcción de modelos topológicos de proteínas

18 -24

Apoyo teórico y actividades sesión 3: Efecto del pH sobre la solubilidad de una proteína. Determinación del Punto Isoeléctrico (pI) de la caseína.

o t

25 - 28

Apoyo teórico y actividades sesiones 4 y 5: Introducción

29 - 31

Determinación de la actividad de la enzima β-galactosidasa y efecto del pH y de la temperatura sobre la actividad.

32 - 34

Efecto de la concentración de enzima y de inhibidores sobre la actividad de la β-galactosidasa.

34 -35

2

INTRODUCCION Entre las condiciones fundamentales para la vida hay acuerdo en que una de ellas es llevar a cabo de manera eficiente y selectiva las reacciones químicas necesarias para la mantención de la vida. Para que dichas reacciones químicas, que son en general muy lentas, ocurran en una escala de tiempo compatible con la vida, se requiere de catalizadores que aceleren la velocidad de las reacciones. Los catalizadores biológicos son las enzimas, que, con excepción de un grupo pequeño de RNA catalíticos denominados ribozimas, son proteínas. Las proteínas median prácticamente todos los procesos que tienen lugar en la célula, por lo que presentan una gran diversidad de funciones: las proteínas forman parte de las hormonas, anticuerpos, fibras musculares, plumas, antibióticos, transportadores, enzimas, receptores, entre otras. Son las macromoléculas más abundantes y están presentes en todas las células y en cada parte de ellas. Más aún, son el instrumento molecular a través del cual la información genética es expresada. Las proteínas de todos los organismos, desde los más simples a los más complejos, están construidas en base a los mismos 20 aminoácidos que se unen entre sí a través del enlace peptídico, para dar origen tanto a la estructura lineal (estructura primaria) como tridimensional (estructura terciara). A partir de diferentes secuencias y número de aminoácidos, los diferentes organismos construyen una diversidad de proteínas con diferentes funciones. Conocer la estructura y las propiedades de las proteínas es entonces determinante para entender las numerosas funciones que ellas realizan, incluyendo la catálisis. 1. Objetivos del curso Objetivo general Contribuir al mejoramiento de la enseñanza-aprendizaje de los procesos de catálisis que ocurren en los seres vivos. Por otra parte, dado que los catalizadores biológicos son estructuralmente proteínas, profundizar en el conocimiento de la estructura y propiedades de las proteínas, haciendo énfasis en la relación estructura-función. Ello se logrará mediante la capacitación teórica y práctica de profesores de biología de educación media en cuatro conceptos fundamentales de esta área de la biología mediante el acceso a materiales y equipamiento para que los profesores puedan compartir sus experiencias con sus alumnos usando el enfoque indagatorio. Objetivos específicos

1) Profundizar y asimilar el concepto básico de que los organismos vivos deben llevar a cabo de manera eficiente y selectiva las reacciones químicas necesarias para su vida.

2) Comprender que para que dichas reacciones químicas, que son en general muy lentas, ocurran en una escala de tiempo compatible con la vida, se requiere de catalizadores (enzimas) que aceleren la velocidad de las reacciones.

3) Entender que la estructura y propiedades de las proteínas son determinantes para la función catalítica (enzimática).

4) Conocer la estructura y propiedades de los aminoácidos que forman parte de las

proteínas.

3

5) Conocer la estructura de las proteínas, sus propiedades y algunos métodos de

estudio.

6) Comprender la relación estructura – función en proteínas y la diversidad de las funciones de ellas. 7) Conocer los fundamentos teóricos y las leyes de la espectrofotometría y aplicarlos a la medición de la actividad de una enzima. 8) Comprender las bases del proceso de catálisis y las diversas propiedades de las enzimas. 9) Entregar a los profesores que se capacitan en el curso la posibilidad de transmitir a sus alumnos la comprensión de los conceptos básicos de esta área mediante la experimentación directa que da cuenta de esos conceptos. Los objetivos descritos anteriormente se enmarcan en el contexto de cuatro principios fundamentales para el tema de Estructura de Proteínas y Enzimas: CONCEPTOS FUNDAMENTALES

1. La adquisición de la estructura tridimensional de las proteínas está definida por la secuencia de aminoácidos, codificada en el DNA, las propiedades fisicoquímicas de los aminoácidos y su interacción con el entorno.

2. La función viene determinada por la estructura. La complejidad y

variabilidad estructural y evolutiva de las proteínas permite una gran diversidad de funciones.

3. Las enzimas son catalizadores biológicos que aceleran la velocidad de las

reacciones bioquímicas a temperatura y pH fisiológicos.

4. Las enzimas son específicas y su actividad puede ser regulada a varios niveles.

4

Programa del Curso de Estructura de Proteínas y Enzimas Facultad de Ciencias y Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de Chile y Facultad de de la Pontificia Universidad Católica de Chile 11 al 15 de Enero de 2016 CLASES

Bienvenida Clase 1 11 Enero

Profesor MAURICIO BAÉZ

* Repaso de algunos conceptos fundamentales de la química: tipos de enlaces, interacciones débiles, estructura del agua, pH, pK

Clase 2 11 Enero

Profesor MAURICIO BAÉZ * Estructura de aminoácidos y proteínas. Propiedades físico- químicas. Conceptos fundamentales.

Clase 3 12 de Enero

Profesor RICARDO CABRERA *Proteínas: organización estructural jerárquica clásica. Conceptos de dominio y agregados macromoleculares

Clase 4 12 de Enero

Profesor CHRISTIAN A. M. WILSON * Compactación de la proteína: plegamiento. Desnaturación y renaturación. Concepto de chaperonas. Plegamiento al interior de la célula.

Clase 5 13 de Enero

Profesor NELSON BARRERA * Diversidad estructural. Relación estructura – función. * Sitios y superficies de reconocimiento. Mutaciones en el contexto estructural

Clase 6 13 de Enero

Profesora VICTORIA GUIXÉ * Enzimas como catalizadores biológicos y su participación en vías metabólicas. Catálisis: conceptos de velocidad, energía libre, energía de activación, estado de transición.

* Aspectos termodinámicos y cinéticos. Curva de progreso.

Clase 7 14 de Enero

Profesora VICTORIA GUIXÉ * Factores que afectan la velocidad de reacciones catalizadas por enzimas: pH, temperatura, concentración de metabolitos y de enzima. Coenzimas. * Proteínas de extremófilos.

Clase 8 14 de Enero

Profesora ANA PRELLER * Localización intracelular de las enzimas. Vías metabólicas y enzimas. * Complejos multienzimáticos. Mecanismos que regulan la cantidad y la actividad de las enzimas.

5

ACTIVIDADES PRÁCTICAS Día 1 1. Construcción de estructuras de aminoácidos y de proteínas usando kits de piezas plásticas. 2. ¿?

Dr. Mauricio Báez y Dr. Ricardo Cabrera. Estudiantes de posgrado

Día 2 1.Visualización de estructuras en el computador. 2. Efecto del pH en la solubilidad de proteínas. Determinación del punto isoeléctrico.

Dr. Mauricio Báez. Dr. Ricardo Cabrera, Dr. Christian A.M. Wilson Estudiantes de posgrado

Día 3 1. Medición de la actividad de una enzima. 2. Efecto de la temperatura, del pH y de la concentración de la enzima sobre la actividad.

Dra. Victoria Guixé y Dra. Ana Preller Estudiantes de posgrado

Día 4 1. Efecto de la concentración de enzima y de inhibidores sobre la actividad.

Dra. Victoria Guixé y Dra. Ana Preller Estudiantes de posgrado

Día 5 *Prueba de evaluación * Taller de evaluación * Discusión de resultados de las actividades Prácticas * Discusión de posibles aplicaciones de los Conceptos del área

J.E. Allende Mauricio Báez Nelson Barrera Ricardo Cabrera Victoria Guixé Ana Preller Christian A. M. Wilson

6

SOPORTES TEÓRICOS Y PROTOCOLOS DE TRABAJOS PRÁCTICOS

7

APOYO TEORICO PARA SESION 1 Introducción a la estructura de proteínas y aminoácidos. Las proteínas son macromoléculas (moléculas muy grandes) formadas por una cadena de moléculas más pequeñas, los aminoácidos. Las proteínas son las principales responsables de realizar las funciones biológicas, y es la estructura o forma de las mismas la que determina su función. Los aminoácidos son moléculas que contienen un grupo carboxilo (-COOH) y un grupo amino (-NH2) libres, más una cadena lateral (R) característica. Para formar las proteínas los aminoácidos se unen entre sí, mediante lo que se denomina el enlace peptídico. Éste se forma entre el grupo amino de un aminoácido y el carboxilo de otro, dando como resultado un enlace covalente CO-NH. Este enlace se conoce como amida. Existen aproximadamente 20 aminoácidos distintos componiendo las proteínas. Éstos se pueden clasificar en función de las características de su cadena lateral R en:

• Hidrofóbicos: Aquellos no afines al agua. • Polares: Aquellos afines al agua capaces de formar puentes de hidrógeno. • Con carga o iónicos: Con carga positiva o negativa a pH fisiológico.

8

La figura superior muestra los 20 aminoácidos que conforman las proteínas clasificados según la polaridad de su cadena lateral. Para familiarizarse con la estructura tridimensional de cada uno de los aminoácidos Ud. puede utilizar un programa de visualización de proteínas. Existen varios programas para visualizar estructuras de proteínas. Entre los más populares se encuentran el "VMD" (visual molecular Dynamics; http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/) y el DeepView-Swiss-PdbViewer http://spdbv.vital-it.ch/). En este taller usaremos el programa VMD. En la carpeta denominada “aminoácidos” hay 20 archivos que corresponden a la estructura de cada uno de ellos. Por ejemplo el archivo “alanine.pdb” contiene la estructura de alanina (ALA o A). Para observar la estructura de alanina abra el programa VMD. “Visual molecular Dynamics” 1. Inicialización del VMD: Ejecute desde el Menú Inicio de Windows el programa VMD. Si todo anduvo bien deberían aparecer 3 ventanas. La ventana VMD Main, es la ventana de control del programa, y funciona como cualquier programa de Windows. La ventana VMD OpenGL Display es donde se representa la proteína y la otra es una consola de texto. Esto es lo que Ud debería observar:

2. Abrir el archivo con la estructura. Para cargar la estructura de un aminoácido en el software VMD, abrimos VMD-MAIN: File-New Molecule- Aparece una nueva ventana que nos permite buscar los archivos. Escoja un aminoácido de la carpeta aminoácidos y lo abrimos con los comandos open y luego load. Si todo anduvo bien aparecerá la proteína representada en la ventana VMD OpenGL Display. En la figura 3A se muestra la estructura de la alanina del archivo “alanine.pdb”.

Figura 3.

A B C

9

3. Manejo de “VMD Display”: La molécula de un aminoácido aparecerá inicialmente representada por “Lineas” (Figura 3A). Cada línea representa una unión covalente entre dos átomos que están en los extremos. Carbono es Cian (o celeste-verdoso), Nitrógeno es Azul, Oxigeno es Rojo, Hidrogeno es blanco. Ud. puede mover la molécula en el espacio para tener una idea de su forma tridimensional. Esto se realiza mediante el mouse (botón derecho mueve respecto al centro, botón izquierdo rota respecto al centro) y las teclas: R= modo rotación, T= modo traslación, C= centrar la rotación/traslación. Pruebe los tres modos de movimiento. 4. Representaciones de moléculas. El programa VMD permite “mostrar” los átomos y las moléculas de diferentes maneras y también colores. Para cambiar la representación del aminoácido vaya al menú principal y selecciones Graphics y luego en el menú desplegable Representations. Esto abrirá un nuevo panel “Graphical Representations” (Figura 4). Figura 4. Panel. “Graphical Representations”

El menú Graphical Representations es muy importante porque permite manejar la representación de la molécula mediante “Drawing method” y su color mediante “Coloring method” (Figura 4). Para representar moléculas pequeñas como aminoácidos se suele utilizar las representaciones denominadas como “lines”, “bonds” o “CPK” “VDW”. Estas representaciones las puede cambiar en el cuadro de “Drawing Method”. Pruebe estas diferentes conformaciones y rote el aminoácido. En la Figura 3A se muestra

Menú desplegable para cambiar de color.

Menú desplegable para cambio de representación.

Menú desplegable para cambiar representación.

10

como ejemplo la alanina en “lines” (Figura 3A) como “CPK” (Figura 3 B) y VDW (Figura 3C). De las tres representaciones la que mejor representa la “realidad” de la molécula es VDW (Figura 3C). La representación de VMD indica el volumen aproximado que ocupan los electrones en los átomos constituyentes de la molécula. Este volumen no puede ser traspasado por otro átomo y define el acercamiento máximo que pueden tener dos moléculas y por lo tanto el impedimento estérico. Ejercicios. a) Escoja un aminoácido y muéstrelo como CPK e identifique los átomos que lo componen. Si no recuerda el código de colores puede presionar la tecla “cero” y haga click sobre el átomo cuya identidad quiere conocer. La identidad del átomo aparecerá en la consola. b) ¿Qué información extra se obtiene en la representación tridimensional respecto a la representación bidimensional de la figura 1? c) ¿Puede identificar la cadena lateral, el grupo amino y carboxilo del aminoácido escogido ? Tip: ubique el carbono α. d) ¿Cuál es el estado de ionización de los grupos amino y carboxilo? e) ¿Cuál es la geometría del carbono α? f) ¿Cuál es la geometría del carbono del grupo carboxilo? g) ¿Que tipo de aminoácido está observando, D o L?. Para eso puede ayudarse de la regla de CORN. Esta regla dice que si Ud orienta el hidrogeno del carbono α mirando hacia Ud, el grupo carboxilo (CO), la cadena lateral (R) y el grupo amino (N) siguen el camino de la figura formando la palabra CORN (Figura 5).

Figura 5 Visualización del enlace peptídico. Hasta ahora se han observado los aminoácidos por separado. No obstante, cuando las proteínas se sintetizan en el ribosoma se forma un enlace covalente entre los aminoácidos (de tipo L) denominado enlace peptídico. Este enlace se crea entre el extremo carboxilo de un aminoácido y el extremo amino del próximo lo que produce la formación de una molécula de agua (Figura 6). Para observar los aminoácidos formando una cadena polipeptídica abra el archivo “peptido.pdb”. Este archivo muestra un trozo de una proteína de 5 aminoácidos cuya secuencia de aminoácidos es: PHE-MET-LYS-GLU-LYS (Figura 6)

11

Abra la molécula (péptido.pdb) con el programa VMD y visualícela como CPK. ¿Es fácil identificar cada aminoácido o la cadena principal? Para facilitar su observación coloree la estructura como “ResName” en la pestaña “Coloring Method”. Ahora cada aminoácido en la cadena principal se muestra de acuerdo a un color. Identifique las cadenas laterales de cada aminoácido presente en la secuencia. Cuentelas!. Si aún le resulta difícil puede hacer aparecer los aminoácidos uno por uno. El primer aminoácido es PHE (fenilalanina) y es el número 6 en esta secuencia. Para visualizarlo escriba resid 6 en el panel “Selected Atoms”. Ahora para identificar los tipos de átomos presentes en PHE cambie el color por “element” en el cuadro de “Coloring Method”. ¿Puede identificar el carbono α? ¿Qué átomos tiene unidos? (compare la secuencia de la Figura 6 con lo que observa en la estructura). Para observar el segundo aminoácido que es metionina (MET) agregue un 7 en el panel “Selected Atoms”. Esto le dice al programa que muestre los aminoácidos 6 y 7 de la secuencia. Ahora identifique el enlace peptídico entre que une a PHE con MET. Para ayudarse puede usar la secuencia de la figura 6. Agregue más números hasta mostrar todos los aminoácidos de la secuencia (llegue hasta el 10) y trate de identificar el enlace peptídico a medida que van apareciendo los aminoácidos. Note que los átomos que forman el enlace peptídico más el carbono α de cada aminoácido conforman la cadena principal de la proteína. Para ver la cadena principal de la proteína presione el botón “Create Rep” y en el cuadro de “Drawing Method” cambie a la opción a “tube” (Figura 7).

Figura6.Formacióndelenlacepeptídico.Alaizquierdase muestra la reacción de formación de un enlacepeptídico a partir de dos aminoácidos. Nótese que elenlaceseestableceentreunátomodenitrógenoyunátomo de carbono que tiene unido un oxígeno (vercuadrado). La secuencia inferior muestra los enlacespeptídicos de la secuencia que vamos analizar la cualcontiene 5 aminoácidos cuyas cadena laterales semuestran en verde y el enlace peptídico es resaltadoengris.

METPHE LYS GLU LYS

12

Figura 7 Visualización de la estructura de proteínas.

Conocer la estructura de una proteína consiste en determinar la posición espacial (en coordenadas cartesianas x,y,z, por ejemplo) de todos los átomos que la componen. Cuando un grupo de investigación determina la estructura de una proteína, mediante cristalografía de rayos X o NMR, la deposita en una base de datos internacional de libre acceso denominada Protein Data Bank (PDB; http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do). Cada estructura se identifica con un código de cuatro caracteres con una extensión “.pdb”. Descargue de la base datos PDB la estructura con el código 3CQD (Download->PDB File (text)).

13

Si desea observar la información contenida en el archivo pdb utilice un editor de texto como el wordpad.

Figura 1 Los programas de visualización de estructuras interpretan la información contenida en el archivo pdb (figura 1) y la representan visualmente. Por ejemplo, el átomo 908 corresponde al carbono α (CA) de la Lys número 2 de la cadena A y está ubicado en las coordenadas cartesianas x,y,z (19.469, 4.361, 8.492). La información de volumen, formación de los enlaces covalentes y otras propiedades químicas de cada átomo es deducida de su identificación en el archivo (CA; carbono alfa, CB; carbono beta... etc). 1. Estructura de una proteína es coherente con su función. Las proteínas que catalizan reacciones químicas, como las enzimas, deben acomodar al sustrato en algún bolsillo y poseer aminoácidos posicionados específicamente para catalizar la reacción. Además, algunas de estas enzimas poseen sitios regulatorios llamados sitios alostéricos o regulatorios. Muchas proteínas, poseen además moléculas orgánicas unidas como grupos prostéticos (grupo el HEME de la hemoglobina), o iones y cofactores. Por otro lado, hay proteínas que son factores de transcripción y realizan su función mediante la unión a otras macromoléculas como el ADN (Represor ARC; Código PDB 1PAR). Mediante el uso del programa "VMD" se observará la estructura de una enzima (fosfofructoquinasa-2) y la localización de los sitios activos. La enzima le agrega una molécula de fosfato a un azúcar para generar un azúcar con dos fosfatos.

fructose-6-P fructose-1,6-bisPMgATP+ MgADP+

Para observar la estructura Ud debe obtener el archivo 3CQD.pdb desde la base de datos http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do. El archivo 3CQD.pdb contiene las coordenadas cartesianas de la fosfofructoquinasa-2 obtenida en presencia de uno de su sustratos, ATP. Para cargar el archivo, abrimos VMD-MAIN: File-New Molecule-

Numero de cada átomo (INDEX number)

Tipo de átomo

Aminoácido (name)

Cadena (chain)

Coordenadas atómicas X Y Z

Numero del aminoacido en la secuencia (resid)

14

Aparece una nueva ventana que nos permite buscar los archivos, seleccionamos el archivo 3CQD.pdb y lo abrimos con los comandos open y luego load. Si todo anduvo bien aparecerá la proteína representada en la ventana VMD OpenGL Display. Ud puede rotar la estructura de la proteína como en el caso de los aminoácidos. 2. Selecciones y Representaciones. Menu: “Graphical Representations”. Tal como vimos en el caso de los aminoácidos Ud puede representar la estructura de diferentes maneras. Inicialmente hay una sola representación “all” representada en “Lines” y coloreada por “name”. Pruebe modificando la representación de la estructura como CPK, VWD y lines en el menú de “Graphical Representations”. Note lo asombroso de la estructura y como cada átomo se localiza en un lugar específico del espacio. También note el gran tamaño respecto al péptido analizado anteriormente. Esta enzima es un homodímero constituido por 2 cadenas polipeptídicas idénticas denominadas como A y B. Cada cadena está compuesta por 309 aminoácidos lo que hace un total de 4602 átomos organizados en el espacio!

Ud puede seleccionar los átomos de la proteína que quiere observar. Se pueden

elegir aminoácidos por su nombre (ej: resname TYR, mostrara todas las tirosinas), o por su posición en la secuencia (Ej. resid 1, mostrara el primer aminoácido). Este comando acepta rangos (ej Resid 2 to 4, mostrara los aminoácidos 2 a 4). En el manual del programa puede encontrar muchas más opciones de selección de átomos. Por ejemplo, para visualizar la cadena principal represente la proteína como “tube” en el cuadro “Drawing Method”. Si desea ver dónde comienza la cadena agregue una representación mediante el botón “Create Rep” y seleccione “resid 1”. Ud debería ver la estructura como se muestra a la izquierda de la Figura 2.

Figura 2.

Molecula: 3cqd

Representaciones gráficas

Selección de átomos: Protein

15

Visualización de la estructura cuaternaria de la proteína. Esta proteína contiene dos subunidades con idéntica secuencia e idéntica estructura (es un homodímero). Para distinguir ambas subunidades seleccione “Chain” en el cuadro “Coloring Method”. Esto debiera mostrar la estructura como se observa a la derecha en la figura 8. Pregunta: ¿dónde cree que se ubican los sitios activos de la enzima? Visualización de sitios activos y estructura secundaria. Para ver los sitios activos de la enzima vamos a mostrar su estructura secundaria. El programa puede representar la estructura secundaria de la enzima automáticamente debido al reconocimiento de patrones repetitivos de puentes de hidrogeno y el cálculo de las rotaciones de algunos enlaces. Esto lo verán en el segundo día de laboratorio. Por ahora simplemente vamos a representar la estructura secundaria como se muestra en la figura 3. En “Coloring Method” cambie la opción a “Secondary Structure” y en “Drawing Method” cambie la selección por “New Cartoon”. La pregunta de los sitios activos la podemos responder haciendo aparecer uno de los sustratos. Para eso cree una representación nueva y escriba “Resid 313 310” en el cuadro “Selected ATOM”. Pruebe cambiando en “Drawing Method” diferentes representaciones para la molécula de ATP.

Figura 3.

16

Trayectorias moleculares (Demostrativo) El programa VMD también puede ser utilizado para visualizar y analizar trayectorias producidas mediante programas de dinámica molecular. Al igual que una película, una trayectoria está constituida por múltiples cuadros o "frames" que representan la ubicación de los átomos calculada entre intervalos finitos de tiempo. La trayectoria que observarán representa la simulación del plegamiento de una proteína denominada como VirC2 desde su estado desplegado hasta el estado final nativo y está compuesta por 4001 cuadros (Fig 1). El objetivo es observar los cambios conformacionales y cómo cambia el "RMSD" en función del tiempo.

Normalmente las simulaciones requieren al menos dos archivos: un archivo que contiene las coordenadas y la identidad de los átomos de la estructura de la proteína y otro archivo, generalmente de gran tamaño, que contiene las posiciones atómicas en función del tiempo de simulación. Elimine las estructuras anteriores (simplemente puede abrir y cerrar el programa) y abra el archivo VirC_03.gro que contiene las coordenadas de la estructura de VirC2. Represente la estructura como "New Cartoon" y coloree como "Radial". Observe como la hélice del carboxilo terminar de la proteína pasa por debajo de un "loop" o lazo. Para cargar la información de la dinámica, simplemente abra el archivo VirC_03_fold.xtc. Este archivo contiene las posiciones atómicas en función del tiempo. En el panel principal observe como aumenta el número de cuadros a medida que el programa lee la trayectoria (Fig 1, círculo rojo). De la misma manera que un reproductor de video, Ud puede elegir la posición de la película manipulando los botones de la barra de desplazamiento (Fig 1, cuadrado azul). Observe la película completa manipulando estos botones. Para promediar las fluctuaciones rápidas y observar mejor los cambios conformacionales aumente el valor de "trajectory smoothing window size" a 3 (Fig 2). Debido a que es difícil determinar los eventos importantes en una trayectoria mediante una inspección visual, determine la variación del RMSD de la proteína a lo largo del tiempo. Abra la aplicación "RMSD trajectory tools" (VMD main-> extension-> analysis-> RMSD trajectory tools). En la ventana de la aplicación, marque las opciones como se muestra en la figura 3 y presione el botón Align y luego el botón RMSD. Esto debiera generar un gráfico como el que se muestra en la figura 5.

17

Utilice la información del gráfico para determinar cambios conformacionales importantes en la proteína. ¿Que se puede deducir del gráfico? ¿Cuál es el estado desplegado? ¿Hay algún intermediario? ¿cómo es su estructura? ¿Que eventos lo definen?

Fig 1

Fig 2

Fig 3

Fig 4

18

KIT PARA LA CONSTRUCCION DE MODELOS TOPOLOGICOS DE PROTEINAS

El objetivo básico del kit, creado por el Dr. Richard Garratt del Laboratorio de Biología Estructural de la Universidad de São Paulo, es permitir el ensamblaje de modelos físicos simplificados de proteínas (sin preocuparse de detalles atómicos), semejantes a las representaciones de los Programas de Visualización de proteínas. Más específicamente, los modelos construidos con los componentes del kit, enfatizan la topología del plegamiento de la macromolécula en base a la disposición espacial de las estructuras secundarias. Los componentes, montados en una determinada secuencia, simbolizan elementos de la estructura secundaria (alfa-hélices y hebras-beta), así como sus conexiones, para la construcción de modelos representativos del plegamiento tridimensional de cualquier estructura proteica. COMPONENTES Familiarícese con los componentes del kit (figura 1). Las piezas cilíndricas (a, b, c) o extendidas (d, e), se pueden concatenar entre sí para producir alfa hélices y hebras beta de diferentes tamaños, respectivamente. Dado que las hebras beta individuales deben interactuar con otras hebras, la pieza (f) viene a representar esquemáticamente los puentes de hidrógeno que se establecen entre estas hebras y se encajan en los orificios laterales de las piezas (d, e). Los segmentos de la cadena polipeptídica que conectan elementos de estructura secundaria, pueden ser representados por las piezas (g). Las piezas transparentes (h) e (i) sirven para aumentar la estabilidad mecánica de la estructura construida y pueden ser usadas de la forma más conveniente, sin representar ningún aspecto de la estructura proteica. Por su parte, la pieza (j) puede ser usada opcionalmente para rematar el extremo N-terminal de alguna alfa hélice.

Figura 1. Los componentes del Kit. Las piezas no obedecen a una escala específica. Sólo como sugerencia, cada pieza cilíndrica puede ser tratada como una vuelta de alfa-hélice, (3,5 residuos) y cada pieza extendida puede corresponder a 2 residuos.

19

ELEMENTOS DE ESTRUCTURA SECUNDARIA La figura 2 muestra ejemplos de elementos de estructura secundaria. Entre las miles estructuras de proteínas resueltas, se han observado "distorsiones" en los elementos de estructura secundaria. En la construcción del modelo será importante introducir estas variaciones morfológicas. Por ejemplo, la alfa hélice canónica mostrada en 2a puede modificarse hacia la forma 2e, mediante la introducción de un pedazo pequeño del componente (g). Comparar, en el caso de 2b y 2c, la diferencia entre una hebra beta sin torsión y con torsión, respectivamente. En el último caso, las piezas deben ser ligeramente giradas dextrógiramente. Además, el mismo eje longitudinal de la hebra puede presentar una curvatura (2d) Figura 2: Elementos de estructura secundaria y sus distorsiones habituales.

La figura 3 muestra una sábana beta compuesta de 5 hebras paralelas, unidas por la inserción de las piezas 1f. En este ejemplo, las hebras beta (con eje longitudinal dextrógiro como en 2c) llevan a la formación de una sábana beta no planar, es decir cóncava hacia uno de sus lados. Por otra parte, en el caso de una estructura típica de barril, dado que las hebras presentan una inclinación respecto del eje longitudinal del barril, las regiones que se enlazan mediante puentes de hidrógeno terminan correspondiendo solo a los segmentos verdes. En la figura 3b se muestran distintos tipos de sábanas (también llamadas hojas) beta. Por ejemplo, (c) y (d) son formados por el tipo de hebra beta mostrado en 2d; sin embargo, en el caso de (d) el número de segmentos en la hebra es mayor, en la región de torsión del eje longitudinal. Finalmente, en algunas representaciones en los libros básicos de Bioquímica se suele mencionar la configuración zig-zagueante de la cadena principal en el caso de las hebras que forman la sábana. Este rasgo es presentado en el esquema 3e.

20

Figura 3: Diferentes tipos de sábana beta.

CONSTRUCCION DE LA ESTRUCTURA TERCIARIA: Ejercicio 1. Los barriles-beta forman parte del número limitado de super-plegamientos (super-folds) conocidos, ya que es muy frecuentemente observado en estructuras de proteínas. Esta morfología fue inicialmente identificada para la enzima TIM (triosa-fosfato isomerasa) Objetivos. 1. Construir un barril beta/alpha8 a partir de una limitada cantidad de información topológica. 2. Percibir que la tendencia de la sábana beta a "cerrarse" como un barril, es una consecuencia mecánica natural de las propiedades de la hoja.

21

Figura 4. Información topológica para la construcción del barril alpha/beta8.

Es aconsejable proceder en etapas para la construcción de una estructura tridimensional de proteínas con el kit. Por ejemplo, la figura 5 muestra diferentes etapas en el montaje del barril beta/alpha8. El ejemplo mostrado no representa la estructura de ninguna proteína específica, pero sirve para destacar la topología de este plegamiento. Inicialmente, montar ocho hebras beta y torcer el eje longitudinal pieza a pieza (figura 5a-c). Luego, unirlas mediante puentes de hidrógeno (5d). Figura 5. Diferentes etapas para el montaje de un barril beta/alpha8.

Es necesario notar que las sábanas cerradas con la forma del barril, poseen una inclinación respecto del eje longitudinal del barril (algunos autores han denominado este efecto cizallamiento, traducido del inglés shear). Por lo tanto, en el montaje, el último residuo de la primera hebra tiene que ser unido con el penúltimo de la segunda, el penúltimo de la primera, con el antepenúltimo de la segunda, y así sucesivamente. Realizando esto hebra a hebra, la torsión longitudinal introducida en el eje de cada hebra individual, producirá de manera natural la curvatura que permitirá eventualmente el cierre del barril (5e). Finalmente, el barril puede ser cerrado mediante puentes de hidrógeno

22

entre la última hebra y la primera (5f) y las alfa hélices pueden adicionarse del lado externo del barril mediante el uso de conectores 1(g) y alfa hélices 2(a) para completar una cadena polipeptídica única y continua. Figura 6. Resultado esperado ejercicio 1.

*Ejercicio alternativo: intente la construcción de un barril beta/alpha8, usando la torsión levógira en cada hebra.

23

Ejercicio 2 El dominio de unión a NAD (nicotinamida adenina dinucleótido) fue inicialmente observado en deshidrogenasas como la alcohol deshidrogenasa de hígado, la malato deshidrogenasa y la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa. Variaciones morfológicas han sido subsecuentemente encontradas en otras faimlias de enzimas pero están usualmnete asociadas a la función de unión de mononucleótidos o dinucleótidos, Por definición, cada mitad es conocida como Rossmann Fold, en honor al apellido de su descubridor. Objetivos: 1. Construir el clásico dominio de unión a NAD, destacando mediante colores, la semejanza de las mitades que lo componen. 2. Observar la localización del segmento de unión a fosfato entre la primera hebra y la primera hélice para enfatizar su rol funcional. 3. Cuidar la correcta definición de quiralidad en la estructura protéica.

Figura 7. Información topológica para la construcción del dominio de unión a NAD.

24

Se sugiere construir primero la sábana beta de 6 hebras y luego adicionar las 5 hélices, garantizando que éstas estén posicionadas del lado correcto de la sábana, de acuerdo con las reglas de quiralidad. Prestar atención al hecho de que en las hojas beta abiertas, como las que se trabajan en este ejercicio, el sitio mismo de unión se ubica en la "hendidura" que resulta entre dos conectores que se curvan hacia lados opuestos de la hoja, entre las dos mitades del dominio. Figura 8. Resultado esperado ejercicio 2.

25

APOYO TEORICO PARA SESION 3

Efecto del pH sobre la solubilidad de una proteína. Determinación del Punto Isoeléctrico (pI) de la caseína. a) Introducción Las proteínas presentan propiedades ácido-base que están determinadas por el número y tipo de sus radicales ionizables, junto con los grupos amino y carboxi terminal. Las proteínas que han sido modificadas post-traduccionalmente, ya sea mediante glicosilación, fosforilación, sulfonación, acetilación, etc., poseen cargas adicionales. Existe un pH en que las proteínas tienen una carga neta cero, el cual se conoce como punto isoeléctrico. A un pH diferente al de su punto isoeléctrico, las proteínas presentan carga, lo cual permite que éstas migren al ser sometidas a un campo eléctrico. La insolubilidad de la caseína (una fosfoproteína) en su punto isoeléctrico puede ser utilizada como un método conveniente para determinar este punto. Si a una serie de tubos que contienen iguales volúmenes de una solución de caseína disuelta en una solución de acetato de sodio, se les agrega cantidades variables de ácido acético, se obtienen tubos con diferentes pHs. Si se conoce el pK del ácido acético, el pH resultante en cada tubo puede ser calculado por medio de la ecuación de Henderson-Hasselbach:

pH = pK + log ][][

ácidosal

pK ácido acético = 4,7

Considerando que el tubo N° 1 contiene 1 ml de acetato de sodio 0,1M y se le agrega 1,6 ml de ácido acético 1M, antes de emplear la fórmula será necesario convertir el ácido a igual molaridad que la sal, con lo que resulta:

pH = 4,7 + log ( )

)67,266(67,16

pH = 4,7 + log 16,67 - log 266,67 pH = 4,7 + 1,22 – 2,42 pH = 3,5

26

Los pHs obtenidos en cada uno de los tubos, siguiendo el ejemplo dado para el tubo N° 1, están calculados y dados en el esquema de trabajo. Después del experimento, el pH del tubo que contenga un máximo de precipitación es tomado como punto isoeléctrico. Parte Experimental. Reactivos. 1. Caseína al 0,5% en acetato de sodio 0,1 M 2. Ácido acético 1 M 3. NaOH 10 M Procedimiento. Rotule una serie de tubos de ensayo del 1 al 9. En el tubo N° 1, agregue 320 µL de ácido acético 1 M y 680 µL de agua destilada. Mezcle bien. Añada 500 µL de agua destilada en cada uno de los 8 tubos restantes. Saque 500 µL de la solución del tubo N° 1 y agréguelos al tubo N° 2, mezcle bien.

A continuación, saque 500 µL del tubo N° 2 y transfiéralos al tubo N° 3, mezcle bien, etc. Continúe del mismo modo hasta completar la serie de tubos. En el tubo N° 9 una vez efectuada la mezcla, saque 500 µL de solución, y descártelos. Posteriormente agregue a cada tubo 100 µL de la solución de caseína en acetato de sodio 0,1 M. Mezcle al instante. Anote en una tabla el efecto inmediato que se produce en los diferentes tubos y el que se observa después de 15 minutos.

ESQUEMA DE TRABAJO

Tubos N°

1 2 3 4 5 6 7 8 9 Agua destilada [µL] 680 500 500 500 500 500 500 500 500 Ácido acético 1 M [µL] 320 - - - - - - - - Volumen de solución que se adiciona al tubo siguiente [µL]

500

500

500

500

500

500

500

500

500*

Caseína en acetato 0,1 M [µL] 100 100 100 100 100 100 100 100 100 pH en cada tubo 3,5 3,8 4,1 4,4 4,7 5,0 5,3 5,6 5,9 Resultados inmediatos Resultados a los 15 [min]

27

* = Descartar Emplear en la tabla los siguientes símbolos: 0 = no cambia, + = opalescencia, y x = precipitado Con papel pH puede chequear el pH de los tubos Al tubo con el mayor precipitado agregue 100 µL de NaOH y observe qué ocurre. Comente los resultados obtenidos Busque información sobre la técnica de isoelectroenfoque.

28

APOYO TEORICO PARA SESIONES 4 Y 5 Enzimas y catálisis a) Introducción. Las enzimas son proteínas que se encuentran en la célula mezcladas entre sí y con muchas otras especies moleculares. Sin embargo, es posible detectarlas y determinarlas con exactitud por las reacciones que catalizan. Para esto es necesario conocer el o los sustratos y el o los productos de las reacciones y disponer de los métodos analíticos para medirlos. Al mismo tiempo es imprescindible realizar todos los controles que permitan descartar posibles artefactos que puedan simular una actividad enzimática, al hacer aparecer el producto o desaparecer el sustrato de la reacción. Los controles más importantes en enzimología son: Blanco de sustrato: Mezcla de reacción semejante a la mezcla donde se detecta la actividad enzimática, en la cual la solución de sustrato se reemplaza por un volumen equivalente de su solvente, el que habitualmente es agua o un amortiguador. Este control es útil cuando se sospecha que los componentes del sistema, con excepción del sustrato, interfieren con el método para medir el sustrato o los productos. Blanco de enzima: En este control la solución enzimática se reemplaza por un volumen equivalente de su solvente, el que generalmente es un amortiguador. Este control es importante cuando el sustrato es inestable y puede dar producto en ausencia de la enzima. Tiempo cero: Este control contiene todos los componentes necesarios para la detección de la actividad enzimática y consiste en que la reacción se detiene en el momento mismo de completar el sistema. Esto puede realizarse agregando un agente inactivante antes o inmediatamente después de completar la mezcla de reacción. Este control detecta interferencias debidas a cualquiera de los componentes y debe ser tomado en cuenta para los efectos de la cuantificación de la actividad enzimática. Es importante recordar que el estudio in vitro de una enzima implica que ésta debe ser aislada y purificada, aunque sea parcialmente, para después analizar individualmente las variables que influyen sobre su actividad. Para este proceso es indispensable fijar inicialmente en forma tentativa las condiciones experimentales en que se realizará el ensayo enzimático, tomando en consideración todos los conocimientos generales que se tienen sobre la naturaleza de las enzimas y aquellos hechos particulares que nos permiten suponer algunas cualidades o requerimientos especiales de la enzima en estudio. De este modo se debe elegir un pH, una temperatura y un tiempo de incubación compatibles con la naturaleza proteica de la enzima y que permitan analizar de manera apropiada los distintos factores que influyen sobre la actividad enzimática. En este trabajo práctico usaremos la β-galactosidasa, una enzima que hidroliza los β-galactósidos tales como lactosa u otros rompiendo el enlace o -glucosídico. La actividad de esta enzima es relativamente fácil de detectar pues actúa también sobre sustratos sintéticos cromogénicos que al ser hidrolizados originan productos coloreados. El o-nitrofenil- β -galactósido es un sustrato sintético de la β-galactosidasa por el cual la enzima presenta una alta afinidad, y que al ser hidrolizado libera ortonitrofenol.

29

-orto-nitrofenil- β – galactósido ortonitrofenol

El o-nitrofenol en medio alcalino toma un color amarillo. La absorción de este compuesto a 420 nm es directamente proporcional a su concentración por lo menos hasta 0,30 µmoles/ml. b) Medición de la actividad enzimática mediante el uso de técnicas de fotometría. Cuando la luz atraviesa un medio transparente parte de ella puede ser absorbida, de modo que la intensidad de la luz transmitida (It) es siempre menor que la intensidad de la luz incidente (Io). La intensidad de la luz transmitida es función de la intensidad de la luz incidente multiplicada por una potencia de 10 con exponente negativo cuyo valor depende de una constante (ε, coeficiente de extinción) que es característica para cada medio transparente, y del espesor del medio. Lo anterior queda expresado en la siguiente relación: It = Io x 10-ε

l Estas mismas relaciones son aplicables al estudio de la absorción de la luz por soluciones coloreadas de diferentes concentraciones: a medida que la concentración de la solución (c) aumenta en progresión aritmética, la intensidad de la luz transmitida disminuye en progresión geométrica:

It = Io x 10-

εc

De aquí surgió la Ley de Lambert-Beer que relaciona la disminución de la intensidad de la luz transmitida con la concentración y el camino recorrido por la luz al atravesar la solución, lo que se expresa matemáticamente como:

log IIo

t=εlc

La razón It / Io se llama transmisión o transparencia. Cuando la luz transmitida es igual a la luz incidente el valor de la razón es 1 y la solución es totalmente transparente. Si se descarta, por medio de un control apropiado (blanco), la luz absorbida por las paredes del continente de la solución y por el solvente y se considera sólo la transparencia de la sustancia disuelta (soluto) cuya concentración se desea medir, se habla de transmitancia. Lo contrario a la transmisión se denomina opacidad y corresponde al valor recíproco de ésta, es decir Io/It. Al aplicar logaritmos se obtiene que:

OCH2OH

OH

OH

OH

O

O2N

β-Galactosidasa+ H2O

OCH2OH

OH OH

OH

OH

O2N

HO+

30

El logaritmo de la opacidad se denomina absorción o extinción. Cuando los términos Io e It se emplean en el sentido que se les dio al definir la transmitancia este cuociente se denomina absorbancia (A), de modo que: A = εlc La ecuación muestra que la absorbancia es directamente proporcional al camino recorrido por la luz (l = constante) y a la concentración de la solución, y que además depende de una constante (ε) que es característica para cada sustancia a una longitud de onda determinada. De esto se deduce que la absorbancia de la solución dependerá sólo de su concentración. Este principio permite determinar la concentración de una sustancia en solución por medio de la fotometría. Todo método espectrofotométrico se basa en la comparación de la absorción de luz por una solución de un compuesto de concentración desconocida, con la de una solución de la misma sustancia cuya concentración se conoce; a esta última se le denomina solución estándar o patrón. Si el compuesto cuya concentración se desea medir absorbe la luz visible, las soluciones serán coloreadas y el método se denominará colorimétrico. Los compuestos que no absorben en el espectro visible pueden hacerse reaccionar para generar un compuesto coloreado. La absorbancia de una solución es la resultante del la luz absorbida por el soluto más la absorbida por el solvente. Para poder medir sólo la absorbancia del compuesto cuya concentración se desea conocer, es necesario descartar la absorbancia de las otras sustancias presentes en la solución (solvente, reactivos, etc.); por lo tanto, en todo método espectrofotométrico es imprescindible hacer una mezcla que contenga todos los componentes de la solución excepto aquel cuya concentración se desea medir; ésta se denomina blanco de la reacción, y su absorbancia debe restarse a las muestras problema y a los patrones. Como se indicó antes, la relación entre la absorbancia de una solución y la concentración del soluto que absorbe queda descrita por la Ley de Lambert-Beer, que establece una proporcionalidad directa entre ambas variables. Si esta proporcionalidad no se cumple, éste método de medición no puede emplearse. Por tanto, es indispensable conocer la sensibilidad del método al trabajar con cualquier procedimiento espectrofotométrico, determinando el intervalo de concentraciones en el cual se cumple la Ley de Lambert-Beer. Cuando se determina la concentración de un compuesto en solución mediante espectrofotometría es indispensable mantener constante el paso de luz para lo cual se usan tubos especiales (cubetas) exactamente calibrados. Generalmente, se usan cubetas de 1cm de paso de luz de modo que en estas condiciones la absorbancia queda determinada por ε y la concentración del compuesto (c). Lo anterior significa que para calcular la concentración debemos conocer el valor de A y de ε. La forma más exacta para determinar la concentración de una solución problema es medir su absorbancia e interpolar la concentración correspondiente en la curva de calibración.

31

Experimento 1: Determinar la actividad de la enzima β-galactosidasa Materiales

Amortiguador fosfato de sodio pH 7,2 0,1 M o-nitrofenil-β-galactósido (ONFG) 0,01 M Carbonato de sodio 1,0 M β-galactosidasa

Procedimiento Experimental 1. Coloque en un tubo de ensayo 0.5 ml de la solución amortiguadora, 0,2 ml de la

enzima y 0,6 ml de agua. Mezcle, equilibre los tubos a la temperatura ambiente e inicie la reacción agregando 0,2 ml de sustrato. Anote el tiempo. Incube simultáneamente un blanco de sustrato (todos los componentes menos el sustrato) y un blanco de enzima (todos los componentes menos la enzima). Incube los tubos durante el tiempo que le permita obtener una coloración amarilla visible en el tubo con el sistema completo (5 – 10 minutos). Todos los tubos deben tener el mismo tiempo de incubación.

2. Al finalizar el tiempo de incubación detenga la reacción agregando 0,3 ml de solución de carbonato de sodio y agitando inmediatamente los tubos.

3. Complete con agua (1,2 ml) hasta un volumen de 3 ml y mida la absorbancia en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 380 nm.

Expresión de resultados Distribuya en una tabla los tubos usados, los componentes de cada uno y sus respectivos valores de absorbancia. Experimento 2: Efecto del pH sobre la actividad de la enzima β-galactosidasa Materiales

Amortiguador fosfato de sodio pH6,5 0,2 M Amortiguador fosfato de sodio pH 7,5 0,2 M Amortiguador acetato de sodio pH 4,8 0,2 M Amortiguador Tris pH pH 9,0 0,2 M o-nitrofenil-β-galactósido (ONFG) 0,01 M Carbonato de sodio 1,0 M β-galactosidasa

32

Procedimiento Experimental 1. Disponga una serie de 4 tubos de ensayo con los componentes que indica la tabla. Tubo Amortiguador

(ml) pH H2O

(ml) Sustrato 10 mM (ml)

Enzima (ml)

A 380 nm

1 Acetato 0,5 4,8 0,6 0,2 0,2 ml 2 Fosfato 0,5 6,5 0,6 0,2 0,2 ml 3 Fosfato 0,5 7,5 0,6 0,2 0,2 ml 4 Tris 0,5 9,0 0,6 0,2 0,2 ml 2. Agregue todos los componentes del sistema menos la enzima. Agite. Inicie la reacción agregando la enzima a intervalos de tiempo de 1 min. Incube todos los tubos durante 10 minutos (todos los tubos deben tener el mismo tiempo de incubación) y detenga la reacción agregando 0,3 ml de la solución de carbonato de sodio, agitando inmediatamente los tubos. 3. Complete con agua (1,2 ml) hasta un volumen de 3 ml y mida la absorbancia en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 380 nm. Expresión de resultados Distribuya en una tabla los tubos usados, los componentes de cada uno y sus respectivos valores de absorbancia. Haga un gráfico de barras que muestre la actividad de la enzima (A 380 nm) en función del pH del medio. Experimento 3: Efecto de la temperatura sobre la actividad de la β –galactosidasa. Materiales

Amortiguador fosfato de sodio pH 7,5 0,1 M o-nitrofenil-β-galactósido (ONFG) 0,01 M Carbonato de sodio 1,0 M β-galactosidasa

Procedimiento Experimental 1. Disponga una serie de 4 tubos de ensayo con los componentes que indica la tabla a excepción del sustrato, y en las condiciones de temperatura que se obtengan.

Tubo Fosfato pH7,5 (ml)

Temperatura obtenida (º C)

H2O (ml)

Sustrato 10 mM (ml)

Enzima (ml)

A 380 nm

1 0,5 Agua con hielo 0 -7 º 0,6 0,2 0,2 ml 2 0,5 Ambiente 25- 28º 0,6 0,2 0,2 ml 3 0,5 Baño 40 º 0,6 0,2 0,2 ml 4 0,5 Termo 70 - 80 º 0,6 0,2 0,2 ml

33

2. Preincube cada tubo durante 2 - 3 minutos, con todos los componentes menos el sustrato, a cada una de las temperaturas indicadas. Inicie la reacción agregando el sustrato e incube durante 10 minutos (todos los tubos deben tener el mismo tiempo de incubación) 3. Detenga la reacción agregando 0,3 ml de la solución de carbonato de sodio, agitando inmediatamente los tubos. 4. Complete con agua (1,2 ml) hasta un volumen de 3 ml y mida la absorbancia de todos los tubos en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 380 nm, y a las demás longitudes de onda que tiene el espectrofotómetro. Expresión de resultados Grafique todos sus resultados (una curva para cada longitud de onda) en un gráfico de actividad enzimática (absorbancia) versus temperatura. Experimento 4: Efecto de la concentración de la enzima sobre la actividad de la β –galactosidasa. Procedimiento Experimental 1. Disponga una serie de 4 tubos de ensayo. Coloque todos los componentes del sistema enzimático, como se indica en la tabla, excepto la enzima. Mezcle, equilibre a la temperatura de incubación e inicie la reacción agregando los ml de enzima que corresponde a cada tubo. Mezcle inmediatamente e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente. Tubo Fosfato

pH 7,5 (ml) H2O (ml)

Sustrato10 mM (ml)

Enzima (µL)

A 380 nm

1 0,5 0,75 0,2 50 2 0,5 0,7 0,2 100 3 0,5 0,6 0,2 200 4 0,5 0,4 0,2 400 2. Detenga la reacción agregando 0,3 ml de la solución de carbonato de sodio, agitando inmediatamente los tubos. 3. Complete con agua (1,2 ml) hasta un volumen de 3 ml y mida la absorbancia en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 380 nm. Expresión de resultados Grafique la actividad de la enzima (absorbancia) en función de la cantidad (uL) de enzima.

34

Experimento 5: Efecto de de un inhibidor (lactosa) sobre la actividad de la β –galactosidasa. Procedimiento Experimental

1. Disponga una serie de 6 tubos de ensayo con los componentes que indica la tabla. Coloque todos los componentes del sistema enzimático, excepto la enzima.

2. Mezcle, equilibre a la temperatura de incubación e inicie la reacción agregando los ml de enzima que corresponde a cada tubo. Mezcle inmediatamente e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Tubo Fosfato

pH 7,5 (ml)

H2O (ml)

Sustrato 2 mM (ml)

Lactosa 50 mM (µL)

Enzima (ml)

A 380 nm

1 0,5 0,6 0,2 0 0,2 2 0,5 0,5 0,2 100 0,2 3 0,5 0,4 0,2 200 0,2 4 0,5 0,3 0,2 300 0,2 5 0,5 0,2 0,2 400 0,2 6 0,5 0,1 0,2 500 0,2 3. Detenga la reacción agregando 0,3 ml de la solución de carbonato de sodio, agitando inmediatamente los tubos. 4. Complete con agua (1,2 ml) hasta un volumen de 3 ml y mida la absorbancia en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 380 nm. Expresión de resultados Grafique la actividad de la enzima (absorbancia) en función de la cantidad (uL) de inhibidor.

35