Limonene

Il limonene è un metabolita secondario, presente in natura in numerose specie vegetali, in particolare nella buccia di limoni e agrumi. La molecola appartiene alla categoria dei composti terpenici, sintetizzati nelle piante in vie metaboliche complesse a partire dall’unità a cinque atomi di carbonio dell’isoprene.

L’importanza che assume questa molecola è dovuta alla sua correlazione con la prevenzione nell’insorgenza di alcuni tumori , nonché possedendo spiccate proprietà antiossidanti, risulta importante nel proteggere le cellule dallo stress ossidativo e dalle disfunzioni mitocondriali.In particolare il limonene si è dimostrato efficace nella prevenzione e cura di tumori alla mammella, cancro alla prostata, tumori del fegato e dello stomaco.

Come si evince dalla figura gli effetti chemopreventivi di composti naturali, di cui il limonene ne è un buon rappresentante, sono molteplici e diversificati ma tutti tesi a limitare la proliferazione cellulare o indurre apoptosi delle cellule cancerose.

Sono stati proposti diversi meccanismi d’azione per il limonene tuttavia essi sono stati sperimentati solo in vitro, e in vivo solo su modelli murini.

Un primo esperimento (1), teso a dimostrare come il limonene intervenga sulla crescita e sulla metastatizzazione del tumore allo stomaco, inducendo l’apoptosi delle stesse cellule tumorali.

Cellule tumorali BGC-823 sono state inoculate per via sottocutanea in topi nudi al fine di creare la massa tumorale.D-limonene, puro al 97%, è stato somministrato a diverse concentrazioni a quattro gruppi randomizzati di topi: un gruppo di controllo, un gruppo trattato con un chemioterapico (5-FU), un terzo gruppo tratta con il limonene e il quarto gruppo assumeva una combinazione dei due,per sette settimane.

All’ottava settimana, quando i topi sono stati uccisi, la neoplasia è stata prelevata e pesata, nonché valutata l’eventuale comparsa di metastasi a distanza.

La tabella successiva mostra i risultati ottenuti

Dai risultati in tabella possiamo subito notare come la massa tumorale, espressa in grammi, si sia notevolmente ridotta nel gruppo che assunto limonene in forma assoluta o combinato al chemioterapico, così come è aumentato di almeno sei volte l’indice apoptotico (AI) rispetto al gruppo di controllo. Ultima considerazione importante va fatta sulla riduzione del numero di microvasi, segno di ridotta angiogenesi e di ridotta metastatizzazione, nonché nella ridotta produzione del fattore di crescita dell’endotelio vasale (VEGF), il quale sostiene il processo di neoangiogenesi della massa tumorale in crescita.

Un secondo esperimento (2) prende in considerazione l’azione svolta dal metabolita principale del limonene, l’alcool perillico(POH) e di un suo analogo la perilaldeide (PALD). In questo studio sono state prese cellule di adenocarcinoma polmonare umano A549 e una linea cellulare del carcinoma a cellula squamose della lingua , BroTo.

Dall’analisi dei dati si ottengono i seguenti grafici:

Dal grafico possiamo notare come la vitalità delle cellule , di entrambe le linee cellulari, sia notevolmente ridotta in seguito a trattamento con POH e PALD indicando l’elevato grado di citotossicità sulle cellule tumorali di entrambi i metaboliti.

In questi altri grafici, invece il grado di inibizione della proliferazione cellulare è rappresentato dalla capacità di generare colonie da parte delle linee tumorali, all’aumentare della concentrazione di POH e PALD.

Questa tabella ci mostra invece, tenendo in considerazione il potere pro-apoptotico dei metaboliti, la proporzione di cellule in diverse fasi del ciclo cellulare esposte ai monoterpeni. Ad esempio nella linea cellulare A549 ad una concentrazione di POH di 1mM abbiamo l’arresto del 76.7% delle cellule in fase G0/G1 del ciclo cellulare.POH e PALD quindi, a seconda delle diverse concentrazioni, determinano l’arresto delle colonie cellulari trasformate in fasi differenti del ciclo cellulare.

Anche da questa serie di grafici possiamo notare come all’aumentare della dose dei monoterpeni somministrati ad altre cellule tumorali, in questo caso (3) si trattava di 116 linee cellulari di carcinoma del colon umano, sia per alcool perillico che per l’acido perlillico(AP), si ha l’accumulo di cellule 116 HCT nella fase G1 del ciclo cellulare. Questo incremento è accompagnato a una marcata diminuzione della percentuale di cellule in fase S.

Molti studi hanno dimostrato la correlazione tra ciclo cellulare e l’insorgenza del cancro. Il passaggio attraverso le diverse fasi del ciclo cellulare è governato da un complesso di proteine chinasi. Ogni complesso è costituito da una subunità catalitica, cdk, e una proteina associata, ciclina. La progressione del ciclo nella fase G1 è mediata dall’attività combinata di ciclina D1/Cdk4,6 e del complesso ciclina E/Cdk2.

In questo immunoblot possiamo invece osservare l’espressione delle diverse proteine che regolano il ciclo cellulare operanti sul passaggio dalla fase G1 alla fase S.Possiamo notare, con l’utilizzo di entrambi i monoterpeni , dell’incremento dose-dipendente dell’espressione della proteina p21, proteina che gioca un ruolo importante nella transizione G1/S, e alla conseguente diminuzione della ciclina D1 come già precedentemente riscontrato.Anche l’espressione di cdk4 e cdk2 subisce una diminuzione dipendente dalla dose di terpene somministrata.In particolare a concentrazioni di POH di 1 mM i livelli della ciclina D1 sono ridotti dell89%.

In questo studio invece( 4) , utilizzando cellule del cancro alla prostata umano DU-145, si è voluta indagare l’attività antiproliferativa e proapoptotica dell’impiego terapeutico del limonene associato ad un comune chemioterapico, il docetaxel.

Come si può vedere dai grafici (A, B), la percentuale di cellule sopravvissute è notevolmente ridotta sia nel trattamento solo con docetaxel che nel trattamento solo con limonene. Altresì si può notare come,nel grafico C,l’aumento progressivo della concentrazione di limonene sia associata alla progressiva riduzione della vitalità cellulare.

Questo studio ha posto l’accento anche sull’effetto pro-apoptotico del limonene sulle cellule cancerose. Per analizzare l’attività apoptotica, l’espressione di specifiche caspasi è stata messa in evidenza mediante l’utilizzo di anticorpi monoclonali di topo marcati con fluorofori.

a) Cellule di controllo

b-e) Cellule trattate con docetaxel + d-limonene per 6-12-24-48 ore rispettivamente

f) Cellule trattate con docetaxel

p21 – p53 – BAD – citocromo C

Bcl-xl – PARP

Bad e Bcl-xl appartengono entrambe alla famiglia di proteina Bcl-2, di cui la prima è una proteina pro-apoptotica, tanto che i suoi livelli aumentano, mentre la seconda è una proteina anti-apoptotica e di fatto i suoi livelli risultano ridotti.

La proteina PARP è invece un enzima che partecipa ai meccanismi di mantenimento dell’integrità della cromatina e della riparazione del DNA.

L’ultimo studio (5) che si vuole qui considerare è effettuato su due linee cellulari di cancro alla mammella umano : KPL-1 e MCF-7. Anche in questo caso il trattamento è avvenuto con alcool perillico.

PCNA (sliding clamp) funziona come cofattore della DNA-polimerasi sia nella fase S che nella sintesi del DNA stesso, è associata alla riparazione del DNA. Livelli molto bassi di PCNA si possono osservare in cellule non replicanti.

Come abbiamo potuto notare, numerose sono le evidenze a sostegno dell’efficacia del limonene nei confronti della proliferazione cellulare e dell’induzione apoptotica nelle cellule cancerose.Tuttavia si rendono necessari ulteriori studi e sforzi affinché tale molecola possa in futuro, entrare a far parte delle strategie anticancro, con numerosi benefici sulla salute umana, data la sua tossicità pressochè nulla.