Upload
others
View
8
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Diseño experimental para la determinación del mecanismo de acción de los ácidos
húmicos extraídos de carbón colombiano sobre colonias Helicobacter pylori in vitro
para establecer su uso como tratamiento alternativo frente a enfermedades
gastrointestinales asociadas
Lina Valeria Ariza Tapias
Dayanna Katherine Vásquez Escobar
Universidad Distrital Francisco José de Caldas
Facultad de Ciencias y Educación
Proyecto Curricular de Licenciatura en Química
Bogotá
2018
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
2
Diseño experimental para la determinación del mecanismo de acción de los ácidos
húmicos extraídos de carbón colombiano sobre colonias Helicobacter pylori in vitro
para establecer su uso como tratamiento alternativo frente a enfermedades
gastrointestinales asociadas
Lina Valeria Ariza Tapias
Dayanna Katherine Vásquez Escobar
Docente
Jesús Álvaro Jiménez Montoya
Universidad Distrital Francisco José de Caldas
Facultad de Ciencias y Educación
Proyecto Curricular de Licenciatura en Química
Bogotá
2018
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
3
Tabla de contenido
1. Antecedentes .............................................................................................................................. 8
2. Justificación ............................................................................................................................... 12
3. Descripción del problema ......................................................................................................... 14
4. Objetivos ................................................................................................................................... 16
4.1. Objetivo general ................................................................................................................ 16
4.2. Objetivos específicos ......................................................................................................... 16
5. Marco teórico conceptual ......................................................................................................... 17
5.1. Generalidades del carbón ................................................................................................. 17
5.1.1. Historia de la formación del carbón .......................................................................... 17
5.1.2. Clasificación del carbón ............................................................................................. 18
5.2. Sustancias húmicas............................................................................................................ 20
5.2.1. Ácidos húmicos .......................................................................................................... 21
5.3. Helicobacter pylori ............................................................................................................ 27
5.3.1. Características generales y morfología de H. pylori .................................................. 27
5.3.2. Colonización bacteriana y factores de virulencia ...................................................... 28
5.3.3. Métodos de diagnostico ............................................................................................ 31
5.3.4. Tratamientos de erradicación ................................................................................... 34
5.3.5. Resistencia bacteriana ............................................................................................... 36
6. Metodología .............................................................................................................................. 39
6.1. Revisión bibliográfica acerca de los métodos que permiten realizar la determinación del
mecanismo de acción de los ácidos húmicos sobre H. pylori ....................................................... 40
6.1.1. Microscopía de barrido electrónico .......................................................................... 41
6.1.1.2. Microscopio de barrido electrónico ...................................................................... 42
6.1.2. Citometría de flujo .................................................................................................... 44
6.1.2.2. Citómetro de flujo ................................................................................................. 45
6.1.3. Secuenciación de ácidos nucleicos ............................................................................ 49
6.1.4. Análisis proteómico ................................................................................................... 53
6.2. Análisis de los parámetros de estudio con los métodos descritos ................................... 55
6.3. Selección del método para el desarrollo de la propuesta metodológica ......................... 57
7. Desarrollo de la propuesta ........................................................................................................ 59
7.1. Toma y preparación de las muestras de carbón ........................................................... 59
7.2. Análisis próximo ............................................................................................................ 60
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
4
7.3. Análisis último: .............................................................................................................. 62
7.4. Extracción de Ácidos húmicos: ...................................................................................... 63
7.5. Caracterización de los ácidos húmicos .......................................................................... 64
7.6. Tratamiento microbiológico de Helicobacter pylori ...................................................... 64
8. Conclusiones.............................................................................................................................. 78
9. Bibliografía ................................................................................................................................ 79
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
5
Índice de figuras
Figura 1. Etapas de la carbogénesis. (“NEV,” n.d.) .......................................................... 18
Figura 2. Clasificación del carbón por rangos .................................................................. 18
Figura 3. Rutas de formación de las sustancias húmicas. ( Rodríguez Neave, s.f.) ......... 21
Figura 4. Modelo estructural de los ácidos húmicos ((Mirza et al., 2011) ......................... 24
Figura 5. División de sustancias húmicas de acuerdo con su solubilidad (Peña-Méndez,
Havel, & Patočka, 2005). ................................................................................................. 25
Figura 6. Helicobacter pylori. (Valdés, 2016) ................................................................... 27
Figura 7. Acción de la ureasa para la supervivencia de H. pylori ..................................... 30
Figura 8. Factores de virulencia de Helicobacter pylori (“FACTORES DE VIRULENCIA,”
n.d.) ................................................................................................................................. 31
Figura 9. Esquema metodológico general ........................................................................ 40
Figura 10. Estructura interna del microscopio electrónico (Universidad Andrés Bello) ..... 42
Figura 11. Tipos de muestra MEB y método de preparación (De Lozano, V et al., 2014) 43
Figura 12. Esquema general de un citómetro de flujo (Cortés, E., Cervantes, E., Ortiz, A,
2014) ............................................................................................................................... 46
Figura 13. Pirosecuenciación de DNA (n.d. SECUENCIACIÓN DEL ADN). .................... 51
Figura 14. Metodología para la tinción de Gram .............................................................. 70
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
6
Índice de tablas
Tabla 1. Clasificación de los carbones según sus propiedades físicas y químicas ........... 20
Tabla 2. Porcentaje de los elementos presentes en los ácidos húmicos (Gasset, 1968) .. 23
Tabla 3. Longitud de onda de absorción y emisión de algunos fluorocromos utilizados en
la técnica (Shapiro, 2003; McCarthy, 2010). .................................................................... 47
Tabla 4. Parámetros de análisis con los métodos descritos ............................................. 57
Tabla 5. Composición de diferentes medios de cultivo empleados en el aislamiento de
Helicobacter pylori. Adaptado de: Bayona, 2013 .............................................................. 68
Tabla 6. Medios de cultivo útiles para el cultivo de Helicobacter pylori (Majalca-Martínez,
Rivera-Cabrera, Ochoa-Pérez, & Giono-Cerezo, 2001) ................................................... 69
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
7
Índice de diagramas
Diagrama 1. Metodología del muestreo y la preparación de las muestras de carbón ....... 59
Diagrama 2. Metodología para el análisis próximo de las muestras de carbón. ............... 60
Diagrama 3. Metodología para la determinación del porcentaje de humedad .................. 60
Diagrama 4. Metodología para la determinación del porcentaje de cenizas. .................... 61
Diagrama 5. Metodología para la determinación del porcentaje de materia volátil. .......... 61
Diagrama 6. Metodología para la determinación de la densidad. ..................................... 62
Diagrama 7. Metodología para la determinación del poder calorífico. .............................. 62
Diagrama 8. Metodología para análisis último de las muestras de carbón. ...................... 63
Diagrama 9. Metodología para la extracción de los ácidos húmicos. ............................... 63
Diagrama 10. Caracterización experimental de los ácidos húmicos. ................................ 64
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
8
1. Antecedentes
En diferentes estudios se han reportado las propiedades beneficiosas de los ácidos
húmicos en áreas como la agricultura y la medicina. Generalmente a nivel industrial los
ácidos húmicos son empleados en la elaboración de abonos ya que se ha encontrado que
incrementan la capacidad de intercambio iónico y la capacidad de retención de agua
evitando así la pérdida de nutrientes por lixiviación (“Ácidos Húmicos | ACIDOS HUMICOS:
Fertilizantes agrícolas Jisa,” n.d.) , sin embargo, los conocimientos científicos en el área de
la medicina acerca de los mecanismos de acción para el tratamiento de algunas afecciones
son bastante escasos, poniendo en evidencia la necesidad de realizar investigaciones más
amplias y encaminadas a su elucidación, por lo cual en este trabajo se ha planteado el
objetivo de elaborar un diseño experimental para determinar el mecanismo a través del cual
estas sustancias naturales inhiben la bacteria Helicobacter pylori.
A través del tiempo se ha tenido evidencia de cómo diferentes civilizaciones hacían uso de
los humatos para tratar diferentes afecciones de la salud. Desde hace más de 2700 años
A. C. hay evidencia del uso de los ácidos húmicos por parte de los romanos para el
tratamiento de infecciones. Para el año 1.500 el médico chino Li Shi Zan documentó los
usos de los ácidos fúlvicos que junto a los ácidos húmicos hacen parte de la medicina
tradicional china, generando resultados óptimos en tratamientos clínicos, toxicología y
patologías severas.
Por otro lado, hace cerca de 7000 años se conoce un sistema de medicina alternativa hindú
denominada Ayurveda en la cual se prescribe el Shilajit como un elemento
extraordinariamente útil para tratar casi cualquier enfermedad atribuyéndole a su vez
propiedades divinas. Este corresponde a la exudación proveniente de las capas de rocas
en muchas cadenas montañosas del mundo, especialmente en el Himalaya, Tíbet, Norway
y Rusia. Se ha encontrado que el mayor efecto fisiológico del Shilajit se debe a la presencia
de ácidos húmicos y fúlvicos los cuales aparentemente actuaban portando los ingredientes
activos (Suraj P. Agarwal, Rajesh Khanna1 *, R, 2007) Entre los principales usos del Shilajit
está el tratamiento de desórdenes digestivos, distensión abdominal, hemorroides, fístula
rectal y disuria, así como aplicaciones sobre el tracto urinario, vías respiratorias, sistema
nervioso e inmunológico (tratamiento de cáncer) (Suraj P. Agarwal, Rajesh Khanna1 *, R,
2007)
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
9
En el año 1914 el investigador Dr. Hanamel lo utilizó como antiséptico en las heridas de los
soldados de la primera guerra mundial. Algunos microorganismos pueden verse afectados
por la acción de estas sustancias naturales, ya que, por un lado, la catálisis de sus
reacciones metabólicas se alteran y por otro, es posible bloquear directamente un virus y
bacteria, por la interacción de los humatos con los sitios químicamente positivos de los
microorganismos (GmbH, 2015). El Dr. Gramsh (1961) y el Dr. Reichert (1966) los usaron
como tratamiento para la acidez y otros trastornos gastrointestinales, pues en caso de una
acidez excesiva, los ácidos húmicos ayudan a disminuirla, en cambio si hay una
disminución, se logra aumentar la producción de ácido gástrico. El Dr. Zimmerman (1971)
y el Dr. Adamek (1976) los usaban como antitumorales, consiguiendo un decremento
significativo de este tipo de células (Montesinos, 2017).
Los ácidos húmicos, son sustancias orgánicas, presentes en el suelo, la turba y zonas de
alta humedad, como lagos, pantanos y/o riachuelos. Son una mezcla de macromoléculas
complejas que tienen estructuras fenólicas poliméricas con la capacidad de quelar metales.
Se les han atribuido diversas propiedades que le permiten luchar contra pesticidas,
herbicidas, compuestos volátiles, tóxicos y metales en el cuerpo humano (Torres, s.f.). Esto
último se debe a que los ácidos húmicos, a través de su efecto quelante, pueden enlazarse
fácilmente a los iones cargados positivamente, tales como manganeso, hierro, cobre y zinc,
lo que favorece desintoxicación de metales a través de su excreción vía urinaria,
contribuyendo así a una correcta función celular y a la disminución del riesgo de desarrollo
de enfermedades causadas a partir de estos metales (DC, 2015).
Empíricamente, hay evidencia de cómo su consumo puede generar efectos positivos para
la salud, desarrollo y crecimiento de los seres vivos. Los ácidos húmicos manifestaron
capacidad de bloqueo sobre virus tales como simplex herpes, Coxsackie A9, Influenza A,
rinovirus 1B, citomegalovirus, VIH-1, VIH-2, gracias a la interacción de los humatos con los
sitios positivos de la cubierta proteica de un virus, así, el complejo virus-humato no es
absorbido en los tejidos (GmbH, 2015). Por ejemplo, se cree que estas sustancias naturales
ejercen una protección contra el VIH, el virus causante del SIDA. En el año 1995 el Dr.
Shneider hizo uso de los ácidos húmicos como tratamiento en el VIH, al inhibir la infección
VIH 1 en las células MT2, posteriormente en 1995 el Dr. Bernacchi logro la estimulación de
Linfocitos TH1 y 2 para tratar enfermedades infecciosas virales y bacterianas, incluyendo
infección de VIH y cáncer (Montesinos, 2017). Para el año 2002, se publicó un estudio en
& quot, La quimioterapia & quot, donde se indica que las células blancas al ser tratadas con
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
10
oxihumate (una forma de ácido húmico) disminuyó su susceptibilidad a la infección con el
VIH (Sandra, s.f.).
Con base en las diferentes propiedades que se les han atribuido a los ácidos húmicos, en
el mercado existen medicamentos naturales desarrollados a partir de esta sustancia, tales
como el F70, Ácido Fúlvico & Húmico y el HM80, Ácido Fúlvico, Húmico, Minerales y Vit C.
estos productos actúan de la siguiente forma (Montesinos, 2017):
I. Permiten crear un macrófago más fuerte, el cual mantiene encapsulado el virus por
más tiempo hasta que el sistema inmune genere una respuesta adecuada.
II. Ayudan al tracto gastro intestinal, pues facilita la eliminación de bacterias dañinas,
como Helicobacter pylori, y fortalece la presencia de bacterias benéficas, las cuales
liberan nutrientes inmuno defensores.
III. Los Ácidos Húmicos son muy solubles en agua. La interacción de estas dos
sustancias cambia la estructura molecular del agua haciéndola una sustancia activa
más penetrante, facilitando el transporte de vitaminas, minerales, proteínas, etc.
También existe otro medicamento llamado Cytosan, este es un concentrado de humatos de
potasio, enriquecido con silymarin (grupo de alcaloides) y ácido de ámbar. Tiene influencia
positiva sobre el retraso del desarrollo de algunos tumores cancerígenos, previene infartos
de miocardio, embolias cerebrales, coágulos y hematomas. Una de sus funciones más
destacadas es su protección sobre la mucosa intestinal; generan una película protectora,
impidiendo la penetración de sustancias tóxicas y metales pesados hacia el riego
sanguíneo. (ENERGY, 2005)
Tradicionalmente los ácidos húmicos han funcionado como la materia prima para la síntesis
de productos industrializados especializados y servir de sustratos para preparaciones
médicas, pues se han usado durante mucho tiempo como remedio popular en diversas
enfermedades. Por ejemplo, en Babilonia se utilizaron los baños de turba como tratamiento
terapéutico sobre la coagulación de la sangre, la fibrinólisis, la actividad estrogénica, y en
forma de bebida se han utilizado en el tratamiento de enfermedades de tipo gástrico,
intestinal y hepáticas.
Hasta el momento no se han encontrado estudios que especifiquen el mecanismo de acción
a través del cual los ácidos húmicos son capaces de inhibir la bacteria Helicobacter pylori,
tan solo las investigaciones realizadas en la Universidad Distrital Francisco José de Caldas,
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
11
han logrado corroborar la inhibición y delimitar el rango de concentraciones mínimas
inhibitorias de ácidos húmicos que favorecen este proceso.
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
12
2. Justificación
Desde hace casi siete décadas la humanidad ha venido haciendo uso de los antibióticos
para combatir ciertas enfermedades infecciosas. El uso indiscriminado de dichos
compuestos ha generado un grave problema de salud pública mundial a causa del
desarrollo de cepas bacterianas resistentes. La situación tiene tal gravedad que la OMS ha
calificado este suceso como emergencia mundial, por lo cual se ha llamado a sus estados
miembros a tomar medidas para mitigar y estimular la búsqueda y diseño de nuevas
moléculas antimicrobianas así como para realizar tareas de vigilancia, prevención y control
de las infecciones intrahospitalarias y resistencia (Cabrera Cao, Fadragas Fernández, &
Guerrero Guerrero, 2005). Por otro lado es preocupante el elevado costo que significa el
cuidado médico de infecciones causadas por microorganismos resistentes el cual gira
alrededor de 4-7 billones por año en promedio (Asadi A & Razavi S & Talebi M, et al. 2018)
Una de las alternativas para hacer frente este problema consiste en el aprovechamiento de
las propiedades de algunos productos naturales usados en la antigüedad como parte de la
medicina tradicional. Recientemente en la Universidad Distrital Francisco José de Caldas
se han llevado a cabo investigaciones que ponen en evidencia la capacidad que tienen los
ácidos húmicos presentes en el carbón leonardítico colombiano para inhibir el crecimiento
de Helicobacter pylori en cultivos in vitro, así como las concentraciones óptimas para tal
efecto.
Una de las razones más importantes para utilizar los ácidos húmicos en el tratamiento de
diferentes enfermedades, es que este tipo de sustancias no provocan reacciones alérgicas
o inesperadas y además se considera un apirógeno (no produce fiebre). Estudios actuales
realizados por Lab BioChem ponen en evidencia la seguridad total de este sustrato en
niveles de hasta 50 mg/Kg de peso corporal. Hay evidencia de que las sustancias húmicas
tienen propiedades antimicrobianas, pues al parecer estimulan los microbios que son
benéficos y suprimen los que generan daño. Teniendo en cuenta lo anterior y para
avanzar en esta misma línea, se pretende proponer la metodología experimental para
realizar un estudio en la bacteria Helicobacter pylori a nivel transcriptómico, buscando
establecer el cambio en su RNA, al ser inhibidas por la acción de los ácidos húmicos en
ensayos in vitro, contribuyendo a los referentes teóricos que permitan hacer un uso
adecuado de este sustrato natural, como un tratamiento totalmente eficaz contra la
erradicación de esta bacteria, tan ampliamente distribuida en el mundo.
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
13
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
14
3. Descripción del problema
Uno de los principales problemas de salud pública mundial se relaciona con la resistencia
bacteriana a ciertos antibióticos generando consecuencias de mortalidad y morbilidad en la
población. Una de las razones asociadas a este fenómeno es el uso indiscriminado de los
antibióticos en la práctica médica y en la medicina veterinaria, lo cual ha conllevado al
surgimiento y diseminación de mecanismos de resistencia en diversas poblaciones
bacterianas. (García, 2001)
Entre la población mundial, cerca del 50% ha presentado manifestaciones gástricas
asociadas a la presencia de Helicobacter pylori (Hp) y más del 80% pertenece a la población
de países en vía de desarrollo. Dicha bacteria ha sido identificada como el agente causal
de patologías como úlcera péptica y gastritis, lo cual corresponde a un proceso dinámico
que evoluciona hacia la atrofia que afecta al antro, adenocarcinoma y linfoma estomacal,
además ha sido clasificada como carcinógeno tipo I por parte de la Agencia Internacional
de Investigaciones sobre el Cáncer (IARC) y la OMS, (Organización Mundial de la Salud)
con base en evidencias epidemiológicas. (Sánchez, 2006)
El tratamiento de erradicación actual se basa en monoterapias y terapias duales con
antibióticos combinados con un inhibidor de la bomba de protones (IBP), pero además del
elevado costo que esto significa, dicha opción puede resultar inefectiva y contraproducente
debido a que puede generar cepas de bacterias resistentes a dichos antibióticos o
reacciones adversas en los pacientes. Una de las causas de fracaso de los tratamientos
más comunes es la resistencia del microorganismo y por otro lado las características
particulares de la cepa (Alarcón, 1999)
Un estudio realizado por la Universidad del Valle en Colombia, reportó una prevalencia de
más del 69% de infección a causa de Helicobacter pylori en hospitales ubicados en 16
departamentos de Colombia diagnosticadas a partir de muestras de biopsias tomadas de
endoscopias. En nuestro país, el estudio de este microorganismo se inició a finales del año
2010, por lo cual existen pocos informes de laboratorios que especifiquen las condiciones
microbiológicas ideales para su aislamiento y cultivo, haciéndose necesario generar
trabajos que contribuyan al enriquecimiento teórico-práctico referente al trabajo con
Helicobacter pylori. (Bayona, M. A., 2013)
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
15
Recientemente y tras la búsqueda de nuevos enfoques terapéuticos para el tratamiento y
erradicación de Hp, se ha optado por el estudio de los productos naturales, de este modo,
se ha encontrado que los ácidos húmicos, extraídos del carbón de bajo rango colombiano,
han sido empleados históricamente en el control de diversas enfermedades y afecciones,
presentando la capacidad de inhibir la bacteria en mención. Se ha establecido que este
sustrato, recurso invaluable de la medicina tradicional (MT), ejerce una función bactericida
y antibiótica, aunque se desconoce el mecanismo de acción correspondiente, debido en
cierto modo a que según algunas investigaciones realizadas con anterioridad los ácidos
húmicos no presentan una estructura única y por el contrario se caracterizan por la
presencia de grupos funcionales variados asociados a propiedades físicas, químicas y
biológicas que los hacen ser útiles para el hombre, por tal razón se pretende indagar en
este ámbito y establecer la acción de dicha macromolécula a partir de estudios
transcriptómicos para establecer los cambios que se generan en el RNA bacteriano como
resultado de la inhibición del microorganismo, partiendo de los resultados obtenidos con
anterioridad referentes a la concentración mínima inhibitoria producto de las investigaciones
más recientes realizadas en la Universidad Distrital Francisco José de Caldas.
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
16
4. Objetivos
4.1. Objetivo general
Diseñar una metodología experimental para la determinación del mecanismo de acción
inhibitorio de los ácidos húmicos, extraídos del carbón de bajo rango colombiano, frente a
la bacteria Helicobacter pylori mediante ensayos in vitro con el fin de definir su uso como
tratamiento alternativo de las enfermedades gastrointestinales asociadas.
4.2. Objetivos específicos
● Elaborar una revisión bibliográfica acerca de los métodos que permiten realizar la
determinación del mecanismo de acción de los ácidos húmicos sobre H. pylori.
● Analizar las variables de estudio y alcances de cada uno de los métodos descritos
● Seleccionar y adaptar un proceso metodológico como propuesta para la
determinación del mecanismo de acción.
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
17
5. Marco teórico conceptual
5.1. Generalidades del carbón
De acuerdo con Cortés (s.f) el carbón es un sólido oscuro que se forma como resultado de
la acumulación y enterramiento de la materia vegetal, la cual se convierte en carbón al
atravesar por una serie de cambios de temperatura y presión. El carbón también se puede
definir como el combustible fósil más abundante en la Tierra y mantiene un importante papel
en la generación de energía (Smith, Foley, & Lobo, 2004).
La utilización del carbón se remonta a 1000 años AC en China, época en la cual era
empleado para tratar diferentes afecciones y como fuente de energía. Los primeros usos
del carbón fueron de tipo doméstico, donde su extracción sólo se hacía a través de
instrumentos como pica y pala. Actualmente, representa el 25 % de energía que se
consume en todo el mundo. Los mayores depósitos de carbón están en América del Norte,
Rusia, Colombia y China.
El carbón se ha postulado como el sucesor del petróleo, cada vez más costoso y escaso.
La consolidación mundial que ha tenido su uso en diferentes sectores de la industria está
permitiendo tener alternativas a los incrementos abruptos en los precios del petróleo. Por
ejemplo, en el sector eléctrico, carbones como la hulla funcionan como combustible para la
obtención de la energía eléctrica. En el sector siderúrgico, el coque (un carbón con
características especiales que se obtiene por la destilación del carbón) es un combustible
y reductor de hierro para la obtención de acero. En el sector químico, la carboquímica
desarrolla procesos para obtener productos como los alquitranes y el petróleo artificial.
5.1.1. Historia de la formación del carbón
La formación del carbón mineral se remonta a más de 300 millones de años, en el
Paleozoico superior, durante el periodo Carbonífero principalmente. Todo inicia con la
descomposición de la materia orgánica de plantas superiores terrestres, por la acción de
bacterias anaeróbicas. Poco a poco esta materia orgánica se fue haciendo cada vez más
rica en carbono mientras iba perdiendo oxígeno e hidrógeno; así se formaron las turberas.
Todo este proceso de transformación, junto con las altas presiones y temperaturas,
comprimieron los depósitos hasta formar los diferentes tipos de carbón. (TONDA, s.f.) En
la figura 1 se muestran las diferentes etapas en la formación del carbón.
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
18
Figura 1. Etapas de la carbogénesis. (“NEV,” n.d.)
5.1.2. Clasificación del carbón
Con base en su grado de carbonificación se pueden distinguir varios tipos de carbón (Figura
2)
Figura 2. Clasificación del carbón por rangos
5.1.2.1. Turba: se cataloga como carbón joven, pues fue el primero que se
formó, contiene mayor cantidad de impurezas y humedad (hasta
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
19
un 90 % de agua), tiene un menor poder caloríf ico y su contenido
de carbono es de solo un 55%. Es preciso que se someta a un
proceso de secado, para poder ser utilizado como combustible de
baja calidad, sin embargo, en los jardines es muy utilizado por su
capacidad de retener agua (El carbón, 2014).
5.1.2.2. Lignito: se forma por compresión de la turba. Es un carbono de
bajo rango, con aspecto leñoso, terroso o compacto y un color que
varía de pardo a negro brillante (Evangelista, 2007). Tiene un
contenido de azufre de aproximadamente 10%. Se clasifica como
combustible de calidad media, por lo que se destina a la
producción termoeléctrica (Monroy).
5.1.2.3. Hulla: se forma cuando se comprimen las capas de lignito. Es un
carbón bituminoso, lo que implica que es el carbón con poder
caloríf ico más alto, por ende el de mayor importancia económica,
seguido del sub-bituminoso, la antracita y finalmente el lignito
(TONDA, s.f.). Es utilizado en la siderurgia, centrales
termoeléctricas, y en algunos otros sectores industriales. También
se usa para producir carbón de coque usado en los altos hornos.
5.1.2.4. Antracita: es un carbón de alto rango, negro, duro y brillante, es
el último que se formó, es decir, el más antiguo. La presión y el
calor adicionales pueden transformar el carbón en grafito, que es
prácticamente carbono puro. Su combustión al ser tan limpia
permitió que inicialmente se usará con fines domésticos,
actualmente, su mayor aplicación es en las centrales
termoeléctricas.
Teniendo en cuenta lo anterior se evidencia como el origen de los diferentes tipos de carbón
determinan muchas de sus características físicas y químicas. Son varias las clasificaciones
que se pueden realizar, a partir de su grado de carbonificación, por su contenido en materias
volátiles, por la composición elemental de carbono y otros elementos, por su poder
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
20
calorífico, entre otras. La clasificación más usual es la ASTM, que hace uso del contenido
de carbón y materia volátil. Todas estas características se encuentran resumidas en la
tabla 1.
Tipo
Análisis elemental Poder calorífico (Kcal/Kg)
%Volátiles %C %H %O Superior Inferior
Turba 59,3 5,7 35,0 5.700 5.400 67
Lignito 70,0 5,5 24,5 6.750 6.450 54
Hullas
Grasas
Semigrasas
Secas
88,2
92,4
93,5
5,3
4,4
3,8
6,5
3,2
2,7
8.600
8.700
8.650
8.400
8.500
8.450
30
17
9
Antracitas 95,5 2,5 2,0 8.400 8.300 3
Tabla 1. Clasificación de los carbones según sus propiedades físicas y químicas
5.2. Sustancias húmicas
El suelo está formado por diferentes sustancias húmicas: ácidos húmicos, ácidos fúlvicos y
huminas. Son moléculas heterogéneas de elevado peso molecular, donde su estructura y
conformación está fuertemente ligada a la composición del suelo, el pH, las condiciones
ambientales a las que se encuentre sometido y la acción microbiana, por lo cual tanto su
química y efecto fisiológico puede variar (Lodhi, y otros, 2013). Producto de su
transformación bioquímica, presentan diferentes grupos funcionales en su estructura
generados a partir de procesos de descomposición, reacciones de polimerización y
condensación (Martínez, Bravo, & Martín, 2013).
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
21
5.2.1. Ácidos húmicos
Los ácidos húmicos, son moléculas complejas generadas a partir de
la descomposición de la materia orgánica. Es posible localizarlas en
los suelos, turbas, océanos y aguas frescas. Tanto su estructura y
composición está sujeta a las características del suelo, razón por la
cual no es posible encontrar dos moléculas de ácidos húmicos
idénticas (Mosquera, Bravo, & Hansen, 2007).
5.2.1.1. Rutas de formación: Hay varias teorías que explican la formación
de las sustancias húmicas, sin embargo, son difíciles de establecer
teniendo en cuenta la alta velocidad de reacción y la inestabilidad
de los productos intermedios (Gasset, 1968). En la figura 3 se
exponen las cuatro vías principales, por las que se cree se
sintetizan.
Figura 3. Rutas de formación de las sustancias húmicas. ( Rodríguez Neave, s.f.)
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
22
5.2.1.2. Ruta de la lignina: La lignina y otros compuestos fenólicos se
degradan mediante oxidación, perdiendo sus cadenas laterales
con lo que la molécula aumenta su carácter aromático. A medida
que van dándose procesos de oxidación y deshidrogenación de los
productos intermedios, se van generando reacciones de
condensación con amoniaco, aminoácidos y péptidos, que
conducen a la formación de sustancias húmicas. Las reacciones
esenciales comprenden las etapas de descomposición de la
cadena lateral, demetilación, oxidación a quinonas, dimerización y
polimerización, apertura del núcleo, y adición de compuestos
conteniendo nitrógeno. Esta hipótesis impone a la lignina vegetal
como fuente de los grupos que forman las principales unidades
estructurales del ácido húmico (Gasset, 1968). Esta teoría se vio
reforzada por hechos tales como la naturaleza similar de los ácidos
húmicos y la lignina, en cuanto a la resistencia a agentes
microbianos, su solubilidad en medios básicos y su precipitación
en medios ácidos.
5.2.1.2.1. Rutas polifenólicas: se consideran a las quinonas, sintetizadas
por un lado a partir de microorganismos y por el otro a partir de la
lignina, las materias primas a partir de las cuales se sintetizan las
sustancias húmicas. Se inicia con la ruptura de todos los polímeros
de la planta a sus monómeros, derivados del fenilpropano, y como
en la ruta de la lignina sus cadenas son oxidadas y desmetiladas,
obteniéndose quinonas, las cuales reaccionan con compuestos
nitrogenados formando polímeros de aspecto semejante a las
sustancias húmicas (Tortosa, 2008).
5.2.1.3. Composición elemental:
Elementos como el C, H, O, N y S, siempre estarán presentes en los ácidos húmicos,
independientemente de su origen.
Carbono 45 – 65 %
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
23
Oxígeno 30 – 48 %
Nitrógeno 2 - 6 %
Hidrógeno 5 %
Tabla 2. Porcentaje de los elementos presentes en los ácidos húmicos (Gasset, 1968)
5.2.1.4. Naturaleza química:
La naturaleza química y composición de los ácidos húmicos ha sido de gran interés para
muchos científicos, razón por la cual se ha hecho uso de diversas técnicas analíticas
para la elucidación de su estructura. Varios autores como Stevenson (1982), Buffle et
al. (1977), Shulten (2002, 2003), Kujawinski et al. (2002a, 2002b) y Stenson et al. (2002,
2003), han realizado propuestas de las estructuras moleculares que presentan los
ácidos húmicos. De forma general, se les ha reconocido como macromoléculas
aromáticas, con presencia de grupos amino, ácidos, azúcares y compuestos alifáticos.
Sus pesos moleculares están en el rango de 2.0 a 1300 kDa, teóricamente se presume
que cuenta con grupos fenólicos libres y enlazados, grupos metoxi, grupos CH2OH,
nitrógeno, oxígeno y ácidos carboxílicos en los anillos aromáticos. El carbono presente
no hace solamente parte de grupos altamente conjugados, sino que además hace parte
de residuos alifáticos que influyen en la estructura que adquieren los ácidos húmicos
(Mosquera , Bravo, & Hansen, 2007). Según el estudio realizado por (Martínez, Bravo,
& Martin, 2013) en suelos altoandinos colombianos, a través de las técnicas de Pirólisis
- GC/MS y THM, se encontraron 252 compuestos que se lograron clasificar en los
siguientes grupos según la familia a la que pertenecen o su precursor: compuestos
aromáticos y poliaromáticos, ácidos grasos, terpenos, esteroles, hidrocarburos, fenoles,
compuestos derivados de polisacáridos, ligninas, compuestos de nitrógeno,
compuestos de azufre y derivados del ácido fosfórico.
Según Cepeda (1992) los ácidos húmicos son polímeros coloidales, donde sus
monómeros se forman a partir de micro unidades, cada una de las cuales contiene
núcleo, cadena puente y grupo reactivo (grupo carboxílico y alcohol). Los polímeros de
los ácidos húmicos son compuestos aromáticos de tipo fenólico y nitrogenados, tanto
cíclicos como aminoácidos alifáticos. Los compuestos fenólicos son la plantilla de
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
24
carbono de la molécula de ácido húmico, unidas mediante puentes de oxígeno, carbono
o nitrógeno (Estévez Estévez, 2006).
La estructura y composición de los ácidos húmicos puede variar de acuerdo con el
origen geográfico, el clima y las condiciones biológicas, lo cual dificulta la
caracterización precisa de dichas sustancias (“Humic acids: Structural properties and
multiple functionalities for novel technological developments,” 2016).
Aunque no existe una estructura única definida, existen algunos modelos de los mismos
(Figura 2), en los cuales se observan grupos funcionales como los mencionados
anteriormente.
Figura 4. Modelo estructural de los ácidos húmicos ((Mirza et al., 2011)
5.2.1.5. Propiedades de los ácidos húmicos: los ácidos húmicos son sólidos
amorfos de color marrón oscuro, generalmente insolubles en agua y en casi
todos los disolventes no polares, pero muy soluble en soluciones de sales
básicas de metales alcalinos. Los ácidos húmicos provenientes de fuentes
como suelos, turberas, restos vegetales conservan unos principios
estructurales muy semejantes (Estévez Estévez, 2006).
Los ácidos húmicos y fúlvicos, comparten características estructurales, pero
su separación se hace a través de condiciones diferentes. Tanto los ácidos
húmicos como fúlvicos con solubles en álcalis, mientras que las huminas son
insolubles. Su extracción se realiza usualmente con un álcali diluido y su
precipitación se consigue a través de un ácido fuerte (Figura 5), con lo cual
se logra su separación de los ácidos fúlvicos que presentan más grupos
funcionales de naturaleza ácida (Peña-Méndez, Havel, & Patočka, 2005).
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
25
Figura 5. División de sustancias húmicas de acuerdo con su solubilidad (Peña-Méndez, Havel, & Patočka, 2005).
Según Kononova, los fenoles o quinonas, compuestos con contenido de nitrógeno y los
hidratos de carbono hacen parte de las moléculas de ácidos húmicos. Relaciona la
insolubilidad en álcalis de las huminas con la firmeza con que esta fracción de une a la parte
mineral del suelo y no con una diferencia marcada a nivel estructural con los ácidos
húmicos. También, considera que el ácido fúlvico posee unidades estructurales similares,
pero con menor aromaticidad y mayor presencia de cadenas alifáticas, lo que podría
relacionarse con su solubilidad en medios ácidos.
5.2.1.6. Aplicaciones de los ácidos húmicos: es posible dividirlas en cuatro
categorías: agricultura, industria, medio ambiente y medicina (Peña-Méndez,
Havel, & Patočka, 2005).
5.2.1.6.1. Aplicaciones en agricultura: los ácidos húmicos influyen de forma
significativa en la calidad del suelo, pues mejora tanto las propiedades físicas
como las condiciones de humedad. Actualmente, los materiales húmicos se
incluyen en los abonos, con el propósito de aumentar la fertilidad del suelo,
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
26
el crecimiento de las plantas y la disponibilidad de hierro, pues estos tienen
la capacidad de quelarlo.
5.2.1.6.2. Aplicaciones industriales: los materiales húmicos han sido utilizados en la
preparación del cuero, como agente de curtido de este y como ingrediente
para terminarlo. También tienen aplicaciones para colorear plásticos de
Nylon 6 o PVC, endurecedores de espumas de poliuretano y como
plastificante. Su gran capacidad para retener la transición de metales, les
permite formar complejos metalorgánicos, lo que aumenta la disponibilidad
de estos metales para las plantas.
5.2.1.6.3. Aplicaciones ambientales: tienen la capacidad de formar complejos
hidrosolubles con muchos metales incluyendo radioisótopos, convirtiéndose
en un agente de transporte con capacidad de eliminar metales tóxicos y otros
contaminantes del agua, lodos del suelo y aguas residuales. Por otra parte,
la fermentación de las bacterias puede reducir las sustancias húmicas, la
producción de acetato durante este proceso es energéticamente ventajoso
para las bacterias.
5.2.1.6.4. Aplicaciones biomédicas: se caracterizan por actuar como antivirales y
antiinflamatorios. Su capacidad para formar quelatos permite la eliminación
de metales pesados de organismos vivos. Se ha encontrado que los ácidos
húmicos administrados a ratas profilácticamente disminuyó el daño a nivel
gástrico inducido por etanol. La administración a ratas con úlceras gástricas
y duodenales aceleró significativamente el proceso de curación.
Por otro lado, se ha observado actividad antiviral de las HA contra muchos
virus, como el citomegalovirus (CMV), los virus de la vacuna y el virus de la
inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) y tipo 2 (VIH-2) (“Humic acids:
Structural properties and multiple functionalities for novel technological
developments,” 2016). Se cree que esto se debe a la carga negativa que
asumen dichas moléculas en medios neutros y básicos pudiendo inhibir la
replicación del virus al unirse a los dominios catiónicos del virus, que son
necesarios para la unión del virus a la superficie celular
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
27
5.3. Helicobacter pylori
Helicobacter pylori es responsable de las enfermedades gastrointestinales que se
evidencian en más del 50% de la población a nivel mundial, siendo estas en su mayoría
patologías tales como ulceración duodenal, úlcera péptica, enfermedades cardiovasculares
e incluso cáncer gástrico.
5.3.1. Características generales y morfología de H. pylori
Helicobacter pylori (Hp) es una bacteria Gram negativa de forma espiral o helicoidal que
mide de 0,5 a 3 micras (Figura 6), presenta de dos a seis flagelos unipolares (lofótricos) por
lo cual se le atribuye una gran movilidad (García, 2016). Se caracteriza por colonizar y
sobrevivir a uno de los medios más inhóspitos de nuestro organismo; inicialmente reside en
el antro gástrico pero emigra a otras áreas del estómago y el duodeno. Se encuentra en la
porción profunda del moco entre él y el epitelio (Gonzáles & Quino, 2008), se dice que es
una bacteria microaerofílica debido a que requiere condiciones especiales para su
crecimiento: su atmósfera debe contener 5% de oxígeno, 5% de dióxido de carbono y 85%
de nitrógeno, además su temperatura óptima de crecimiento es de 37°C (Herrera &
Jiménez)
Figura 6. Helicobacter pylori. (Valdés, 2016)
Existen 3 vías principales de transmisión; la transmisión oro-oral está basada en el hallazgo
de la bacteria y su genoma en la saliva; la transmisión oro-gástrica se asocia con el manejo
y desinfección inadecuada de los equipos médicos como gastroscopios; la transmisión feco-
oral corresponde con los datos que representan la prevalencia de infección por Helicobacter
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
28
pylori en países en vía de desarrollo debido a las regulares condiciones de higiene (Rivas-
Traverso & Hernández, 2000)
5.3.2. Colonización bacteriana y factores de virulencia
Una vez Hp llega a la mucosa gástrica, inicia un proceso de colonización en el cual las
proteínas de membrana externa (OMPs) desempeñan funciones de transporte de nutrientes
y transducción de señales procedentes del medio externo, se han identificado más de 21
OMPs en Hp y entre las funciones generales está la adhesión a la célula hospedadora y
estimulación de la producción de citoquinas pro inflamatorias. (Heras, 2017)
En el proceso de colonización y como factores de virulencia y patogenicidad, intervienen
mecanismos y características propias de la bacteria tales como las adhesinas, estructuras
celulares que le impiden a la bacteria ser arrastrada por el peristaltismo o el recambio
epitelial; enzimas como la ureasa que la protege del medio fuertemente ácido; lipasas y
proteasas que propician la desintegración del moco gástrico y disminuyen la capacidad de
las células para secretar mucosa. (Posse, Toledo, & Cabral, 2006)
La adherencia de Hp a la mucosa gástrica es de gran importancia para la colonización
inicial, así como para la persistencia de la bacteria en el estómago humano. La adhesión le
confiere a la bacteria mecanismos de protección frente a la acidez gástrica, dicho
mecanismo se debe a la presencia de las proteínas de membrana externa (PME). Existen
5 familias de PME (Cervantes-García, 2016):
Bab-A (Blood antigen binding adhesion): Esta adhesina interactúa con las células
epiteliales a través de los antígenos de Lewis B fucosilados de los grupos
sanguíneos ABO del ser humano, se han identificado 3 alelos (babA1, babA2, y
babB) de los cuales solo el gen babA2 es funcionalmente activo. Esta proteína está
involucrada en la glicosilación de la mucosa del hospedero que le permite a Hp
adaptarse y persistir.
Hop-: Es la proteína más larga de la familia e incluye la adhesina BabA (HopS),
SabA (HopP), OipA (HopH) y HopQ, esta juega un papel importante en la intensidad
de la respuesta inflamatoria y persistencia.
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
29
HpaA: Esta proteína media la unión a glicoconjugados con ácido siálico presentes
en la superficie de células epiteliales gástricas y de los neutrófilos. Es un antígeno
de membrana que es reconocido por los anticuerpos humanos.
SabA (Sialic acid binding adhesion): Estas proteínas estimulan a los neutrófilos para
inducir la producción de especies reactivas de oxígeno, lo que causa daño oxidativo
en el epitelio gástrico.
OipA: Todas las cepas de Hp contienen el gen oipA que codifica para esta adhesina,
pero solo algunas la expresan, su expresión se asocia al desarrollo de inflamación
gástrica y una mayor producción de IL-8
Uno de los mecanismos de sobrevivencia al medio (pH<4) consiste en la elaboración de
una atmósfera alcalina de la cual se rodea y que sintetiza por acción de la enzima ureasa
a partir de la urea gástrica, liberando así amoníaco que modifica el pH gástrico (figura 7).
La ureasa es acumulada en el espacio periplásmico e hidroliza la urea presente en el
estómago, generando amonio y dióxido de carbono. El amonio eleva el pH hasta 6 o 7 y
ocasiona de manera transitoria aclorhidria, obteniendo así un ambiente óptimo para
sobrevivir mientras se traslada al epitelio gástrico (GARCÍA, 2016). (Gonzáles & Quino,
2008). El hidróxido de amonio generado durante la hidrólisis provoca un daño histológico
asociado en gran medida a esta infección debido al equilibrio del amonio con el agua que
genera el desdoblamiento del moco gástrico haciéndolo más fluido y permitiéndole a la
bacteria desplazarse para llegar a los espacios intercelulares. La gastritis se desarrolla en
el momento en que las células G de la mucosa detectan un pH neutro que promueve
enseguida la liberación de gastrina para estimular la producción de ácido. (Rivas-Traverso
& Hernández, 2000)
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
30
Figura 7. Acción de la ureasa para la supervivencia de H. pylori
De acuerdo con (Herrera & Jiménez), entre los factores de virulencia de la bacteria (Figura
8), en todas las cepas identificadas, se encuentra la citotoxina vacuolizante (VacA) que
propicia la formación de vacuolas intracelulares generando cambios en el metabolismo de
la célula hospedera y la muerte celular. La presencia de vacA puede inducir la expresión
del factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) y provocar el desarrollo de procesos
tumorgénicos. Todas las cepas de Hp tienen el gen vacA que codifica para esta toxina, esta
tiene un peso molecular aproximado de 87 KDa. Induce la vacuolización y múltiples
actividades celulares incluyendo la formación de canales en la membrana, liberación del
citocromo C que induce a la apoptosis y además se une a las células de la membrana
generando inflamación. Su actividad vacuolizante solo se presenta en el 50 a 60% de las
cepas a pesar de que todas contienen dicho gen.
Por otro lado está el lipopolisacárido (LPS) bacteriano el cual posee residuos de
carbohidratos en secuencias similares a las que presentan los antígenos sanguíneos,
pasando desapercibida por el sistema inmune, además el LPS estimula la apoptosis de las
células epiteliales. Su papel fundamental en la patogénesis es evadir la respuesta inmune
durante la colonización del epitelio gástrico, favoreciendo la persistencia bacteriana en el
microambiente (Cervantes-García, 2016).
Otro factor de virulencia es la proteína denominada “Proteína Activadora de Neutrófilo”
(NapA), esta actúa como un agente quelante del hierro y representa un factor quimiotáctico
para neutrófilos y monocitos.
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
31
Sin embargo, el principal factor de virulencia de Helicobacter pylori corresponde a la isla de
patogenicidad cagPAI, este es un segmento de 40 kb con un contenido de G + C de 35%
(Cervantes-García, 2016). Esta isla presenta 27 marcos de lectura abiertos entre los que
se encuentra en gen cagA que codifica para la proteína CagA, esta es una citotoxina que
activa diferentes señales en la célula hospedadora, provocando efectos tales como la
ruptura de uniones intercelulares, estimulación de linfocitos, desregulación del ciclo celular,
apoptosis celular y producción de interleucinas inflamatorias que generan inflamación
crónica, aspecto que se ve estrechamente relacionado con la aparición del cáncer gástrico
(Heras, 2017). Los genes de la isla se expresan y responden a determinadas condiciones
ambientales como el nivel de oxígeno, la fase del crecimiento bacteriano y el pH, entre
otros. Esta isla codifica un sistema de secreción de proteínas tipo IV que inyecta la proteína
CagA y peptidoglicanos en las células epiteliales del hospedero. Las cepas cagPAI se
encuentran con mayor frecuencia en pacientes con úlcera péptica y cáncer gástrico
(Cervantes-García, 2016).
Figura 8. Factores de virulencia de Helicobacter pylori (“FACTORES DE VIRULENCIA,” n.d.)
5.3.3. Métodos de diagnostico
Al hablar de los métodos de diagnóstico de la bacteria, se pueden destacar los métodos
invasivos que implican la realización de una endoscopia y toma de biopsia; entre estos se
encuentran: Prueba rápida de la ureasa, análisis histológico, cultivo y PCR.
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
32
5.3.3.1. Prueba rápida de la ureasa: es una técnica cualitativa que
determina la actividad de la enzima ureasa en una biopsia de
mucosa gástrica, es una prueba universal para detectar la
presencia de dicho microorganismo. Consiste en colocar la biopsia
en medio de urea y un indicador de pH que dejaría en evidencia la
formación de los iones de amonio tras la hidrólisis de la urea, lo
cual elevaría el pH. Cabe destacar la alta especificidad de la
prueba debido a la escasez de bacterias diferentes de H. pylori en
la cavidad gástrica, sin embargo se ve afectada en pacientes que
han recibido tratamiento con antibióticos o con fármacos
inhibidores de la bomba de protones. (Díaz, Domínguez, &
González, 2008)
5.3.3.2. Cultivo: Es posible aislar e identif icar de forma sencilla a H. pylori.
Generalmente se toma una biopsia macerada en un tubo de
16x100mm; se trabaja con un medio de cultivo que contiene agar
sangre sin antimicrobianos y las placas se incuban en
microaerobiosis por 5 días a 35°C. Después de este tiempo, se
obtendrán colonias brillantes y grisáceas de cerca de 1 mm de
diámetro, a los cuales se aplica la tinción de Gram mostrando
bacilos curvos Gram negativos, además este método permite
realizar una tinción a los flagelos. Posterior al cultivo es posible
hacer pruebas de sensibilidad a los agentes antimicrobianos,
estudios de genómica y proteómica dado que permite obtener y
conservar cepas. La sensibilidad de este método de detección
puede variar debido a las condiciones estrictas que requiere la
bacteria (Díaz, Domínguez, & González, 2008) (Rivas-Traverso &
Hernández, 2000).
5.3.3.3. Histología: Esta método incluye técnicas de tinción en cortes
histológicos que permite observar los microorganismos, por lo
general se emplea hematoxilina-eosina y la tinción con azul de
metileno, además permite conocer las lesiones de la mucosa y la
confirmación de la inflamación permite ident if icar zonas de
metaplasia intestinal. La visión al microscopio presenta una
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
33
sensibilidad menor a la del cultivo por lo que no es muy
aconsejable (Peña, 2010).
5.3.3.4. Reacción en cadena de la polimerasa: Esta técnica permite
analizar el DNA bacteriano a partir de biopsias gástricas, se
requieren diferentes cebadores como el urea que codifica para la
subunidad A de la enzima ureasa o el gen glmM que codifica para
la fosfoglucosamina mutasa, este último presenta alta sensibilidad
y especificidad. Este método permite detectar genes asociados a
la patogenicidad como CagA y VacA (Díaz, Domínguez, &
González, 2008).Paralelo es lo anterior, es posible ejecutar
métodos no invasivos como: Prueba del aliento urea C13 – C14;
pruebas serológicas y detección de antígenos en heces fecales.
5.3.3.5. Prueba del aliento urea C13 – C14: Esta técnica cualitativa se
realiza con urea marcada con C13 o C14 que es ingerida en forma
de suspensión, esta se hidroliza, se forma anhídrido carbónico que
es absorbido y exhalado a través del aliento. Dicha concentración
de CO2 se encuentra estrechamente relacionado con la presencia
de H. pylori. La especificidad y sensibilidad de esta prueba es muy
alta pero presenta elevados costos (Díaz, Domínguez, & González,
2008).
5.3.3.6. Serología: Consiste en la detección de anticuerpos séricos de
clase IgG o IgA contra antígenos específicos de la bacteria, sin
embargo, esta técnica presenta el problema de no poder
diferenciar la infección activa de la exposición previa al
microorganismo.
5.3.3.7. Test de sangre completa: Es una técnica poco recomendada que
consiste en un inmunoensayo a partir de una muestra de sangre
para identif icar el anticuerpo IgG frente a H. pylori; así mismo se
puede realizar este ensayo en orina y saliva.
5.3.3.8. Antígeno en heces fecales: Este ensayo cualitativo emplea
anticuerpos policlonales o monoclonales que identif ican al
antígeno en las heces, esto se realiza mediante técnicas
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
34
inmunoenzimáticas. Este método aporta información importante
debido a la fácil obtención y conservación de las muestras y se
realiza para el diagnóstico inicial de la bacteria y para confirmar la
erradicación de la misma después del tratamiento.
5.3.4. Tratamientos de erradicación
La erradicación de H. pylori es la principal indicación para el tratamiento de la úlcera péptica
y se recomienda en los casos con úlcera hemorrágica o perforación. Los tratamientos de
erradicación, además son útiles para aquellos pacientes que presentan linfoma gástrico
MALT, siendo efectivos en las fases iniciales del tumor. (Buitrago, Rodríguez, & Alejandre,
2010). El tratamiento para erradicar esta bacteria implican combinar dos o tres
antimicrobianos y un compuesto anti-ulceroso, que al modificar el pH facilita la acción de
los antibióticos. La duración de la terapia usualmente es de siete a diez días.
5.3.4.1. Compuestos de bismuto: algunos de los más conocidos con
citrato de bismuto coloidal y salicilato de bismuto. Son
citoprotectores, con capacidad de proteger la mucosa del tracto
gastro - intestinal de la acción del entorno ácido, aumentando la
producción de moco y prostaglandinas evitando así la unión de
Helicobacter pylori a la superficie destruyendo la pared bacteriana
a la mucosa gástrica.
5.3.4.2. Inhibidores de la bomba de protones: el omeprazol, lansoprazol,
pantoprazol, esomeprazol y rabeprazol son medicamentos que
funcionan al reducir la cantidad de ácido gástrico producido por
glándulas en el revestimiento del estómago, al inhibir de forma
reversible la enzima H-K ATPasa. (Agudo, 2010)
5.3.4.3. Antimicrobianos utilizados para erradicar H. pylori: Esta
bacteria es sensible a un gran número de antibióticos en
condiciones in vitro pero no todos presentan eficacia in vivo. Los
antimicrobianos que son eficientes desde el punto de vista clínico
para erradicar la infección son los siguientes:
5.3.4.3.1. Amoxicilina: Pertenece al grupo de los betalactámicos, siendo el
único que bajo condiciones in vitro ha demostrado tener eficacia
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
35
en la infección por Helicobacter pylori, al ser el más estable en
condiciones ácidas. En ocasiones se usa en terapias duales o
triples, combinadas con metronidazol, tetraciclina o claritromicina.
De forma general los betalactámicos inhiben la formación de la
pared bacteriana de las microrganismos. (Agudo, 2010)
5.3.4.3.2. Claritromicina: Dentro de los macrólidos es el más utilizado, al
tener una excelente actividad in vitro frente a Helicobacter pylori y
una excelente actividad en medios ácidos. Su mecanismo de
acción se basa en inhibir la síntesis de proteínas de los ribosomas
bacterianos al unirse reversiblemente a la subunidad 50 S del
ribosoma.
5.3.4.3.3. Metronidazol: Los nitroimidazoles son compuestos, que se
activan tras la reducción del grupo nitro unido al anillo imidazólico,
generando compuestos intermediarios y de vida corta. Ingresa a
la célula por difusión pasiva y es químicamente reducido por
proteínas del metabolismo anaerobio característica de algunos
parásitos y de bacterias anaerobias y algunas microaerófilas. La
reducción del metronidazol causa la pérdida de la estructura
helicoidal del DNA, rotura de la cadena e inhibición de la síntesis
de ácidos nucleicos. En Helicobacter pylori, se considera que la
piruvato flavodoxina oxidorreductasa es la proteína capaz de
reducir el metronidazol. (Agudo, 2010)
5.3.4.3.4. Tetraciclina: Ha demostrado buena actividad in vitro. Esta se una
reversiblemente a la subunidad 30 S produciendo una inhibic ión
de la sintesis de proteinas.
5.3.4.3.5. Furazolidona: Hay una reducción del profármaco, con lo que se
forman radicales nitro aniónicos, dañando el DNA. (Agudo, 2010).
En este sentido, la efectividad de un tratamiento aumenta cuanto mayor sean
las tasas de erradicación (superiores al 80%). Las principales opciones de
elección las constituyen las terapias triples las cuales combinan un
antisecretor o inhibidor de la bomba de protones (IBP), generalmente
omeprazol o lanzoprazol con dos antibióticos (claritromicina, amoxicilina o
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
36
metronidazol). La terapia OCA (omeprazol+claritromicina (500
mg)+amoxicilina (1g)) requiere de una duración del tratamiento en pacientes
con úlcera por 7 días, aunque las pautas de 10 días permiten una mayor
efectividad. Otra de las terapias triples recomendadas hacen referencia a la
combinación de 400 mg de ranitidina-citrato de bismuto cada 12 horas junto
con dos antibióticos (amoxicilina y claritromicina); de acuerdo con los datos
reportados, esta última pauta tendría un 85% de eficacia con 0% de
resistencia a claritromicina, 78,5% de eficacia en caso de un 10% de
resistencia y un 65,5% en caso de que la resistencia alcance el 30%
(Buitrago, Rodríguez, & Alejandre, 2010). Paralelo a esto, es posible
encontrar terapias dobles combinando un IBP con un antibiótico (IBP/12h+
amoxicilina 1g/12h) (Puigdengolas, Cuberas, & Mascort, 2011) .
5.3.5. Resistencia bacteriana
La resistencia bacteriana a los antibióticos está íntimamente relacionada con la susceptibilidad
in vitro y se encuentra definida por la concentración mínima inhibitoria (MIC) del crecimiento
del cultivo de un inóculo estándar.
El fenómeno de la resistencia tiene un sustrato genético intrínseco o adquirido que se expresa
fenotípicamente por mecanismos bioquímicos. Es posible encontrar 2 tipos de resistencias
principalmente: natural y adquirida. La resistencia natural se refiere a los mecanismos
genéticos permanentes no influenciados por la dosis de los antibióticos; la resistencia
adquirida se desarrolla como consecuencia de mutaciones en el DNA o por la adquisición de
elementos genéticos móviles donde se transportan los genes de resistencia (plásmidos,
trasposones, integrones).
Las bacterias Gram negativas presentan diversos mecanismos de resistencia ante los
antibióticos, estos pueden ubicarse en las siguientes categorías (Tafur, Torres, & Villegas,
2008):
a. Modificación enzimática del antibiótico: Mecanismo en el cual las bacterias
expresan enzimas capaces de modificar la estructura del antibiótico anulando su
funcionalidad; es el caso de las beta-lactamasas las cuales hidrolizan y modifican el
anillo beta-lactámico mediante reacciones de acetilación, adenilación y fosforilación.
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
37
b. Bombas de salida: Este mecanismo consiste en la expulsión del antibiótico tras su
captación en el espacio periplásmico de las bacterias, evitando así que el antibiótico
llegue al sitio de acción. Estas bombas se encuentran en la membrana externa de
la célula y utilizan la hidrólisis de ATP o un mecanismo de contra-transporte iónico
como sustrato energético. Las bombas de salida pueden ser específicas para un
tipo de fármaco (codificadas en el plásmido) o inespecíficas. Asociadas a las
bombas de salida se encuentran el cierre de porinas, las mutaciones en los sitios de
acción y la presencia de enzimas hidrolíticas.
c. Cambios en la permeabilidad de la membrana externa: Este mecanismo se
refiere a los cambios que generan las bacterias en la bicapa lipídica y modificaciones
en las porinas alterando la permeabilidad dado que estas porinas son canales
proteínicos que regulan la entrada de elementos como las proteínas.
d. Alteraciones del sitio de acción: Consiste en la alteración del sitio de acción donde
se une el antibiótico a la bacteria. Las alteraciones estructurales pueden disminuir
la afinidad de los beta-lactámicos por las proteínas unidoras de penicilinas cuya
función principal consiste en la lisis de la pared celular.
5.3.5.1. Resistencia de Helicobacter pylori a antibióticos
En los estudios in vitro realizados con Hp se evidenció susceptibilidad a una amplia gama
de antibióticos, sin embargo, muchos de ellos pierden su actividad in vivo. Las terapias de
erradicación se basan en el uso de antibióticos combinados con IBP. Los diagnósticos
errados y la administración de dosis elevadas han conllevado al desarrollo de resistencia
frente a los antibióticos más empleados, tales como (Power, Zamora, & Rodríguez, 2008):
a. Resistencia a metronidazol: El metronidazol es un antibiótico bactericida que
pertenece al grupo de los nitroimidazoles. Cuando la molécula de este medicamento
entra a la célula diana, se activa por un proceso de transferencia de electrones
debido a la acción de la enzima NADPH nitrorreductasa que da lugar a
intermediarios imidazoles, responsables de los daños letales a las estructuras
celulares y fragmentación del DNA. En H. pylori se han encontrado mutaciones en
el gen rdxA el cual codifica para una NADPH nitrorreductasa. Dichas mutaciones se
deben a inserciones de pares de bases y a sustituciones originan codones de
parada, dicha mutación impide la activación del metronidazol y por lo tanto
disminuye su acción bactericida.
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
38
b. Resistencia a amoxicilina: La amoxicilina corresponde a una penicilina
semisintética susceptible a la acción de las beta-lactamasas. Su acción está
orientada hacia la inhibición de la biosíntesis y reparación de la pared bacteriana,
esto se debe a la estructura cíclica y anillo beta-lactámico, además de la presencia
y acción de las proteínas de unión a penicilina PBPs (Penicilin Binding Proteins). El
mecanismo de resistencia de H. pylori consiste en mutaciones en la PBP1A,
proteína que presenta mayor afinidad por la amoxicilina lo cual afecta la efectividad
del antibiótico
c. Resistencia a Tetraciclina: La tetraciclina es un antibiótico bacteriostático, cuyo
mecanismo de acción consiste en bloquear la síntesis de proteínas en las bacterias
mediante la unión a la unidad ribosomal 30S impidiendo así la unión del RNA de
transferencia a su sitio de unión. En este sentido, bloquea el proceso de elongación
y se detiene la síntesis de proteínas generando como consecuencia la no
multiplicación bacteriana. El mecanismo de resistencia se presenta debido a la
mutación del gen rrn 16S en las posiciones 926 a 928, en la denominada caja C a
causa de la sustitución de las bases adenina-guanina-adenina por timina-timina-
citosina respectivamente. Esta mutación de permite a la bacteria tolerar
concentraciones de hasta 8 mg/L del antibiótico.
d. Resistencia a claritromicina: La claritromicina es un antibiótico bacteriostático
derivado de la eritromicina; afecta la síntesis de proteínas principalmente debido a
la interferencia que genera en la etapa de elongación como resultado de la unión a
la subunidad ribosomal 23S. La resistencia a claritromicina en H. pylori presenta
como resultado de mutaciones en el gen rrn 23S que codifica para el RNAr 23S.
Como consecuencia de la sustitución de bases en las posiciones 2142 y 2143, se
produce una modificación en la estructura ribosomal afectando la unión al antibiótico
además de generar resistencia a concentraciones de antibiótico entre 1mg/L hasta
64mg/L.
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
39
6. Metodología
Este trabajo de grado se realizó bajo las características de una monografía teórica de
investigación en la cual se abordó, de manera circunscrita, un tema poco explorado,
generando un referente conceptual y procedimental para el desarrollo de una tesis, a partir
de la propuesta planteada a lo largo del documento.
Se realizó una revisión selectiva de la literatura, a partir de diferentes fuentes, tales como
tesis, artículos científicos y libros, mediante una revisión, detección, consulta, extracción,
recopilación e integración de la información teórica referente al tema, con base en una
metodología de la investigación documental, al fundamentarse principalmente en la
información de diferentes documentos y exploratoria, pues el problema de investigación que
se examinó ha sido poco estudiado. Según Hernández, et al, 2014, una investigación de
tipo exploratoria, es el primer paso para desarrollar investigaciones de tipo descriptiva,
correlacional o explicativa.
De acuerdo con los objetivos de la investigación, se hace necesario abordar una
metodología que consta de tres etapas principales, ilustradas en la figura _. En la primera
etapa de revisión bibliográfica se recopila información acerca de diferentes métodos que
podrían contribuir a la interpretación y determinación del mecanismo de acción de los ácidos
húmicos sobre la bacteria Hp. En segundo lugar, la fase de análisis de los parámetros de
estudio constituye una etapa determinante en la posterior selección del método, en esta se
relaciona el fundamento del mismo con algunos factores de virulencia que cobran gran
importancia al tratarse del establecimiento del mecanismo de acción, y por último, la etapa
de selección del método establece la forma más adecuada de lograr el objetivo.
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
40
Figura 9. Esquema metodológico general
6.1. Revisión bibliográfica acerca de los métodos que permiten realizar la
determinación del mecanismo de acción de los ácidos húmicos sobre H.
pylori
La elucidación del mecanismo por el cual los ácidos húmicos inhiben el crecimiento de H.
pylori se puede establecer a través de diferentes métodos, algunos de estos son la
microscopía de barrido electrónico y la citometría de flujo, los cuales permiten observar
cambios en la morfología bacteriana; análisis a nivel transcriptómico y proteómico, a través
de los cuales se evalúan cambios a nivel de expresión génica. El desarrollo de uno o varios
de estos métodos permitirá, en diferente medida, determinar adecuadamente la interacción
entre este patógeno y los ácidos húmicos, pudiendo incluso llegar a establecerse como un
tratamiento alternativo para inhibir el crecimiento de esta bacteria.
A continuación, se expondrán los fundamentos, metodología y alcance de las técnicas
anteriormente nombradas.
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
41
6.1.1. Microscopía de barrido electrónico
6.1.1.1. Generalidades de la técnica
Es una técnica de análisis superficial, que provee información de tipo morfológico,
topográfico y composicional sobre la muestra de estudio. Para ello un fino haz de
electrones, con energías de excitación desde 0.1kV hasta 30kV, incide y se desplaza sobre
la superficie de la muestra, siguiendo una trayectoria de líneas paralelas. Este bombardeo
de electrones provoca la aparición de diferentes señales, que captadas con detectores
adecuados proporcionan, información acerca de la naturaleza de la muestra (Universidad
de los Andes).
La interacción del haz de electrones con la muestra genera diferentes señales que se
relacionan entre sí y con la topografía, el número atómico y el estado químico de la muestra:
Electrones secundarios: Uno de los electrones del haz incidente, pasa cerca
de alguno de los núcleos atómicos de la muestra, transmitiendo energía a
uno o varios electrones internos para saltar fuera de la muestra, los cuales
son de baja energía (< 5 eV) por estar muy cerca de la superficie, haciéndose
sencillo escapar y generar así una información a nivel topográfica de la
muestra.
Electrones retrodispersados: Algunos de los electrones del haz colisiona de
forma frontal con el núcleo de un átomo de la muestra, siendo redireccionado
fuera de la muestra, la intensidad con que lo haga va a depender
directamente del número atómico medio de la muestra de estudio, por lo
tanto, los átomos más grandes, generan mayor cantidad de electrones
retrodispersados, lo que finalmente permitirá elucidar la composición
superficial de la muestra.
Absorción de electrones: La muestra de estudio absorbe electrones de
acuerdo a su espesor y la composición; por lo cual se identifican diferentes
contrastes de la imagen.
Electrones Auger: Al ser expulsado un electrón secundario fuera del átomo,
un electrón ubicado en una capa más externa tiene la posibilidad de llenar
este hueco, resultando así un exceso de energía, la cual es emitida al emitir
un nuevo electrón desde la capa más externa. Esta clase de electrones, dan
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
42
información acerca de la composición de pequeñísimas partes de la
superficie de la muestra.
Rayos X: El exceso de energía puede ser balanceado bien sea por
electrones de Auger o a través de la emisión de rayos X, los cuales son
característicos de cada elemento, lo que también genera información acerca
de la composición de la muestra.
6.1.1.2. Microscopio de barrido electrónico
El microscopio electrónico de barrido (figura 10) está compuesto por: a) Un haz de
electrones, producido por un cañón termoiónico con un filamento de tungsteno o de
hexaboruro de lantano, o un cañón de emisión de campo FEG, los cuales actúan como
emisor; b) Un sistema de lentes electromagnéticas, encargado de focalizar y reducir el
diámetro del haz de electrones producidos por el cañón; c) Un sistema de barrido que hace
recorrer el haz de electrones por la superficie de la muestra; d) Uno o varios sistemas de
detección que captan el resultado de la interacción del haz con la muestra y lo transforman
en una señal eléctrica (Marrero Alberto & Alberto, 2018).
Figura 10. Estructura interna del microscopio electrónico (Universidad Andrés Bello)
6.1.1.3. Protocolo general de aplicación
Para seleccionar el método a usar se deberá tener en cuenta la naturaleza de la muestra, tal como
se muestra en la figura 11.
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
43
Figura 11. Tipos de muestra MEB y método de preparación (De Lozano, V et al., 2014)
Con el fin de analizar el mecanismo de acción de los ácidos húmicos sobre la bacteria, se
propone trabajar sobre un cultivo de H. pylori en condiciones normales de crecimiento y un
cultivo de la misma bacteria tratada con ácidos húmicos en concentraciones específicas.
Los medios sólidos son muy utilizados ya sea agar o metil celulosa, lo importante es que
debe tener una viscosidad de 1500 a 6000 centipoise.
Con base en la información consignada en la figura 11, es posible realizar una preparación
de las muestras biológicas de dos maneras diferentes:
Bajo vacío:
No es necesario procesar la muestra.
Las muestras pueden estar hidratadas, no requieren fijación, ni
recubrimientos conductores.
Controlar los niveles de humedad y vacío.
Las muestras pueden sumergirse en nitrógeno líquido antes de introducirse
en la cámara.
Con la platina de enfriamiento es posible montar las muestras en agua y
congelarlas en la plataforma.
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
44
Alto vacío: Las muestras se secan y estabilizan químicamente teniendo en cuenta:
Cortar agar con colonia.
Colocar en una caja de Petri pequeña.
Fijar: Permite que la estructura morfológica y química del organismo se
mantenga de la misma forma que cuando estaba vivo. Hay fijadores de
carácter físico, tales como el calor, la congelación y la eliminación de agua;
hay fijadores de carácter químico, los cuales implican el uso de una o más
sustancias. Es necesario utilizar soluciones buffer para mantener el pH
dentro de los rangos permitidos a nivel fisiológico.
De Lozano, V et al (2014) proponen realizar una primera fijación en el medio de cultivo,
luego se filtra y se prosigue como si el filtro fuera la muestra. Además, con el fin de no
alterar la morfología de la colonia se realiza la fijación con vapores de OSO4 al 2% por 10
minutos. Un procedimiento específico desarrollado por (Postek, 1980) para la observación
de Bordetella pertussis, consiste en los siguientes pasos:
Seleccionar los especímenes adheridos al agar
Sumergir en FAA (Formol-ácido acético-alcohol) por 24 horas a temperatura
ambiente
Lavar con agua destilada
Deshidratar por 24 horas en 2,2-dimetoxi-propano (DMP) acidificado con 1 gota de
HCl
Transferir la muestra a acetona, dejar 48 horas y secar por punto crítico
La muestra seca se debe recubrir con una capa de metal (oro o platino)
6.1.2. Citometría de flujo
6.1.2.1. Generalidades de la técnica
La citometría es un término que se utiliza para la medición, recuento, comparación y
caracterización de células. La citometría de flujo es una tecnología que permite examinar
diversas propiedades en un gran número de células en poco tiempo. Shapiro, H. (2003)
define la citometría de flujo como una tecnología analítica que permite la medición
simultánea de varias características de muestras biológicas.
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
45
En contraste con métodos de biología molecular, no se obtiene un resultado promedio de
la muestra de estudio, sino que a través de esta técnica se obtienen resultados
cuantitativos, sobre cada célula estudiada, identificándose aquellas que sean diferentes,
así estén presentes en menor proporción.
La citometría de flujo presenta algunas aplicaciones tales como las que presentan
Hartmann H, Stender H, Schäfer A, Autenrieth IB, and Kempf VA (2005), entre ellas se
encuentran: identificación rápida de microorganismos de interés clínico, estudios de
susceptibilidad o resistencia a medicamentos, análisis y toma de decisiones terapéuticas.
El principio de la citometría de flujo se basa en que las células suspendidas alineadas en
un líquido son pasadas a través de una fuente de luz intensa de una en una y los datos de
la luz reflejada y en la mayoría de los casos de la fluorescencia, relacionada con los
fluorocromos presentes en la célula, son detectados. Las señales luminosas, al ser
detectadas se transforman en impulsos eléctricos, que se amplifican y pasan a ser señales
digitales, las cuales son recogidos y organizados en un archivo de computadora.
En términos generales, es posible reconocer e identificar diferentes moléculas, siempre y
cuando se logre detectar el acoplamiento entre un anticuerpo y un fluorocromo. Es posible
realizar diversas combinaciones de anticuerpos y fluorocromos permitiendo detectar
diferentes antígenos en una misma célula, sin embargo, si la célula no posee el antígeno
correcto, el anticuerpo no podrá unirse, por lo cual la célula no emitirá fluorescencia de ese
color (Barrera y cols., 2004).
Hay moléculas capaces de absorber energía en forma de luz, logrando que uno de sus
electrones alcanzan una órbita mayor de energía y pase de un un estado basal a uno de
excitación. Cuando el electrón excitado regresa a su estado inicial, emite un cuanto de luz
o fotón y desprende energía. Esta transición se llama fluorescencia y los compuestos que
sufren este tipo de fenómeno se conocen como fluorocromos.
6.1.2.2. Citómetro de flujo
Un citómetro de flujo consta de tres sistemas principales, los cuales se ilustran en la figura
12:
a) El sistema de fluidos que transporta las células en suspensión al punto de análisis
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
46
b) El sistema óptico que incluye una o más fuentes de luz dotadas de lentes de enfoque
para iluminar las células, así como un sistema de lentes y filtros ópticos que recogen,
separan y seleccionan la luz de longitudes de onda específicas que emerge de las células
y la dirigen a los fotodetectores. La información lumínica y fluorescente que ofrece la célula
es recogida por los receptores.
El receptor Forward Scatter, recoge la penumbra celular (que es proporcional al tamaño de
la célula), generado al atravesar el láser; el receptor side scatter recoge la cantidad de luz
del láser desviada, proporcional a la complejidad del citoplasma, es decir, a las
desviaciones que producen los orgánulos intracelulares; la fluorescencia emitida por los
fluorocromos es recogida por diferentes receptores, tras ser filtrada por diferentes cristales
dicroicos, los cuales son capaces de reflejar longitudes de onda determinadas, permitiendo
que las demás lo atraviesen sin sufrir modificaciones. Los diferentes receptores transforman
la luz en señales eléctricas, que son enviadas a un registro informático
c) El sistema electrónico que procesa las señales ópticas al transformarlas en pulsos
eléctricos proporcionales a la intensidad de estas.
Figura 12. Esquema general de un citómetro de flujo (Cortés, E., Cervantes, E., Ortiz, A, 2014)
La capacidad de medir simultáneamente múltiples parámetros celulares se debe a la
detección de la desviación de la luz, permitiendo así obtener el tamaño y complejidad, así
como la fluorescencia proveniente de cualquier componente celular o función marcada con
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
47
un colorante fluorescente o fluorocromo sensible a la fuente de luz (Barrera y cols., 2004;
Ortiz y cols., 2006).
Los fluorocromos tienen la característica de presentar en su estructura dobles enlaces
conjugados. Cada fluorocromo absorbe en una longitud de onda específica de luz y emite
en otra longitud también característica tal como se muestra a continuación:
Fluorocromo Absorción (nm) Emisión (nm)
DAPI 345 455
Cascade Blue 395 420
FITC 495 519
PE 480, 565 578
PerCP 490 675
Yoduro de Propidio 493 617
APC 650 660
Tabla 3. Longitud de onda de absorción y emisión de algunos fluorocromos utilizados en la técnica (Shapiro, 2003; McCarthy, 2010).
Los citómetros de flujos están conformados por diversos elementos integrados en el módulo
sensor. El equipo se encuentra asociado a una computadora que tiene diferentes
programas para almacenar la información en forma de archivos, los datos pueden ser
representados gráficamente para su posterior análisis. Para el análisis se puede elegir el
exámen total de los datos (dot plot o diagrama de puntos) o el análisis de solo una parte de
ellos (histograma).
6.1.2.3. Protocolo general de aplicación
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
48
La mayoría de las aplicaciones de la citometría de flujo se basan en la medición de la
fluorescencia. Algunas de las aplicaciones más comunes utilizando fluorocromos son el
análisis de la viabilidad celular y el estado fisiológico.
La determinación de la viabilidad celular consiste en un conteo de las células vivas (sanas)
o muertas en una muestra. Generalmente esta determinación se basa en el análisis de dos
parámetros: actividad metabólica de la célula o integridad de la membrana plasmática.
Una de las formas de evaluar la integridad de la membrana, es el uso de colorantes de
exclusión o colorantes de retención. Los colorantes de exclusión tiñen los ácidos nucleicos
de las células con membranas deterioradas y los de inclusión generalmente utilizan
sustratos fluorescentes que son degradados por las enzimas intracelulares y que generan
productos fluorescentes (Riesberg, 2001).
Las células vivas con membranas intactas se caracterizan por su habilidad para excluir
colorantes que fácilmente penetran la membrana plasmática de células muertas o dañadas.
Al adaptar un procedimiento de Cortés, E., Cervantes, E., Ortiz, A (2014), es posible
establecer el siguiente protocolo para el análisis de la viabilidad de bacterias:
a. Método o desarrollo
● Tomar 60 micro Litros del cultivo de bacterias
● Centrifugar a 500 xg por 5 minutos
● Retirar el sobrenadante
● Resuspender en 1mL de PBS
b. Tinción con yoduro de propidio
● Preparar una cama de hielo
● Colocar en un tubo de poliestireno aproximadamente 106 células lavadas y
suspendidas en 1 ml de PBS
● Agregar 1 μL de IP (concentración final: 2 μg/ml)
● En otro tubo colocar un millón de células en 1 ml de PBS
● Incubar durante 5 minutos en obscuridad en una cama de hielo.
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
49
● En el programa Cell Quest, construya la hoja de adquisición
● Abrir los controladores de los detectores
● Adquirir 20,000 eventos celulares de los tubos sin marca y con IP y analizar
en el citómetro de flujo a 488 nm de excitación
c. Análisis de viabilidad
Mediante el programa de adquisición y análisis CellQuest se obtendrán los histogramas
correspondientes al control positivo y a las células inviables es decir aquellas que
incorporaron IP (Yoduro de Propidio).
6.1.3. Secuenciación de ácidos nucleicos
6.1.3.1. Generalidades de la técnica
Al conjunto de las moléculas funcionales de RNAs (RNA mensajero y RNA no codificante)
producto de la expresión de los genes en una célula se conoce como transcriptoma, su
importancia radica en que representa la cuantificación de material transcrito y su relación
con la expresión de genes (Muñoz & de Biología Celular, 2011). Por un lado, el RNA
mensajero es el producto de la transcripción de genes que finalmente son traducidos en
proteínas y por otro lado, el RNAs no codificante presenta diversas funciones como la
síntesis de ribonucleoproteínas, adaptación de aminoácidos en la traducción y regulación
de la expresión génica.
El análisis del transcriptoma es una herramienta que requiere investigación experimental
(in vitro) y computacional (in silico), por su rigurosidad, es posible obtener importante
información acerca de la activación o desactivación del gen de estudio. Dependiendo de la
técnica utilizada es posible conocer el número de transcritos para determinar la actividad
de los genes, también llamada expresión génica en un tipo específico de células o tejidos
(“Transcriptoma,” n.d.). Recientemente ha surgido una tecnología llamada secuenciación
de nueva generación (NGS) la cual permite inicialmente la secuenciación del DNA y en
segundo lugar, gracias a su versatilidad, la secuenciación masiva de todas las moléculas
de RNA presentes en una muestra y por lo tanto del transcriptoma completo mediante la
técnica RNA-Seq.
El estudio de transcriptomas bacterianos no ha progresado tan rápidamente como el estudio
de transcriptomas eucariotas debido a la naturaleza del RNA bacteriano. El análisis
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
50
exhaustivo de la expresión génica global en bacterias se ha visto obstaculizado debido a la
abundancia de RNA ribosómico (RNAr) y la inestabilidad del RNA (Filiatrault, 2011).
La estrategia básica de secuenciación de ácidos nucleicos consta de 3 etapas
principalmente: a) La degradación específica y el fraccionamiento de los polinucleótidos de
interés a fragmentos suficientemente pequeños para ser secuenciados; b) la secuenciación
de los fragmentos pequeños y d) el ordenamiento de los fragmentos a través de la repetición
de los pasos anteriores.
Entre las nuevas técnicas de secuenciación masiva se encuentra la pirosecuenciación e
illumina (Greif, n.d.).
6.1.3.2. Técnicas
6.1.3.2.1. Pirosecuenciación
Este es un método de secuenciado masivo o “next generation sequencing” (NGS) que se
caracteriza por su alto rendimiento, significativamente mayor a los que implican
electroforesis capilar. Es una técnica enzimática, en la cual se mide la separación de
pirofosfato, tras una reacción de polimerización mediante diferentes reacciones enzimáticas
acopladas que generan una señal de luminosa cada vez que se incorpora un nucleótido
(n.d. SECUENCIACIÓN DEL ADN):
El cebador híbrida con el molde y se incuba en presencia de las cuatro enzimas, los
sustratos APS y luciferina.
A la mezcla anterior, se añade uno de los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato, si
es el complementario a la hebra molde, se integrará a la cadena de DNA creciente
generando una molécula de PPi, sino es el complementario se utilizará otro
desoxirribonucleótido trifosfato.
La ATP sulfurilasa convierte el PPi en ATP, el cual genera la oxidación de la
luciferina (oxiluciferina), catalizada por la enzima luciferasa. Este proceso da como
resultado una cantidad de luz visible, acorde a la cantidad de ATP utilizado. Al ser
captada por un fotodetector, se genera un pico relacionado directamente con el
número de nucleótidos que se han integrado.
Antes de iniciar una nueva reacción, la apirasa degrada todos los
desoxirribonucleótidos trifosfato que no se han integradora la cadena naciente, así
como el exceso de ATP (n.d. SECUENCIACIÓN DEL ADN).
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
51
Todo este proceso permite construir flujogramas, que al ser interpretados por un
computador, da como resultado las secuencias de nucleótidos. También se considera un
método de síntesis, y que la secuencia que se va construyendo depende de la hebra
complementaria. Este aparato permite secuenciar 25 millones de bases, con 99% de
precisión en una corrida de 4 horas.
Figura 13. Pirosecuenciación de DNA (n.d. SECUENCIACIÓN DEL ADN).
6.1.3.2.2. Illumina
En esta tecnología se utilizan nucleótidos terminadores marcados con moléculas
fluorescentes. Además de la paralelización previa, es decir, la capacidad de realizar
millones de secuencias en cada corrida, se diferencia con el método convencional en la
posibilidad de eliminar la fluorescencia una vez obtenida la imagen y desbloquear el
carbono 3’ de manera que pueda aceptar una nueva base para continuar la reacción de
secuenciación.
6.1.3.3. Protocolo general de aplicación
6.1.3.3.1. Pirosecuenciación
En términos generales, la pirosecuenciación se lleva a cabo en cinco pasos esenciales los
cuales se describen a continuación (Pirosecuenciación del ADN, 2016 ):
Inicialmente se debe fragmentar el DNA a secuenciar mediante un proceso conocido
como nebulización el cual es un procedimiento físico en el que el material genético
se rompe en fragmentos de 200 a 800 pares de bases.
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
52
En segundo lugar, mediante una emulsión de aceite se generarán microesferas en
las que se encapsularán los fragmentos únicos de DNA.
En cada microrreactor se encuentran los fragmentos necesarios para llevar a cabo
la reacción de PCR tales como oligonucleótidos, dNTPS, polimerasa y un único
fragmento de DNA molde.
A continuación se realiza la PCR con el fin de generar muchas copias del mismo
fragmento de DNA original.
Finalmente se liberan las esferas de la emulsión y se colocan en placas donde se
secuenciarán. Para tal fin se vierte la emulsión sobre una fase sólida con celdillas
en cada una de las cuales se realizará la pirosecuenciación. La secuenciación
completa se lleva a cabo añadiendo uno de los cuatro nucleótidos y observando qué
celdilla se ilumina.
Después de cada adición de nucleótidos se lava y se añade el siguiente nucleótido
hasta completar la secuencia
6.1.3.3.2. Illumina
Los primeros pasos de esta técnica consisten en fragmentar el DNA y ligar los adaptadores;
posteriormente se debe realizar el paso de amplificación sobre una superficie sólida (“flow
cell”) sobre la cual se dará la reacción de secuenciación.(Greif, n.d.). A continuación se
mencionan los pasos generales para desarrollar esta técnica de secuenciación (Travisany,
2018):
Inicialmente se debe fragmentar el DNA, reparar los extremos y agregar los
adaptadores
A continuación se agrega el DNA a la placa en donde se realizará la hibridación y la
cual presenta el equipo, esto se hibrida aleatoriamente con los adaptadores que
están en la placa
Seguido de esto, se agregan NTPs sin marcar y DNA polimerasa, de esta manera
inicia la amplificación.
Se denatura el DNA y se vuelve a realizar la amplificación puente, en este momento
se habrán generado millones de clústers en la placa, es decir, copias de genes.
Se agregan los dNTPs, cada uno posee un fluoroforo de color particular: G -
Amarillo; C – Azul; A – Rojo; T - Verde.
Esto se excita con láser y se genera una imágen la cual es captada. La imagen
capturada en una posición específica corresponde al primer nucleótido.
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
53
Los ciclos de secuenciación se repiten hasta determinar la secuencia del templado.
Una base a la vez.
Es importante resaltar que por lo general estos procedimientos los realizan las personas
encargadas del manejo del equipo y pueden variar con las características del mismo.
6.1.4. Análisis proteómico
Las técnicas de proteoma son utilizadas en gran escala en la investigación microbiana para
analizar la síntesis global de proteínas como un indicador de la expresión genética de la
bacteria. El término proteoma se refiere al producto de la traducción del RNAm y las
diferentes variantes o modificaciones generadas por la célula después de este proceso. La
combinación del proteoma con genética, biología molecular, bioquímica y biofísica de
proteínas han generado una completa técnica de gran alcance que, en particular para el
desarrollo del presente proyecto permitiría indagar acerca del estado fisiológico de las
células bacterianas en circunstancias particulares.
Entre las aplicaciones de la proteómica está en primer lugar el estudio de la patogenicidad
bacteriana, es decir, el mecanismo mediante el cual los microorganismos interactúan con
el hospedero para generar ciertos procesos clínicos; por otro lado esta técnica permite el
estudio de la expresión de factores de virulencia en microorganismos. La habilidad de los
microorganismos patógenos para causar enfermedades en hospederos susceptibles se
debe a múltiples factores que actúan individualmente o en grupo durante diferentes etapas
de la infección. En el caso de Helicobacter pylori, se presentan entre otros, dos factores de
virulencia: vacA y cagA los cuales ya han sido identificados y se ha encontrado que se
encuentran involucrados en distintos aspectos de la patogénesis de la bacteria; por un lado
el cagA corresponde a un marcador de una isla de patogenicidad que contiene 29 genes
(Cervantes-García 2012). En este sentido, el proteoma podría proporcionar información
acerca de la expresión de dichos genes y constituye una poderosa herramienta para
comparar proteínas sintetizadas por cepas bacterianas virulentas y avirulentas, con
respecto a esto, la electroforesis en geles de doble dimensión puede ser catalogada como
un método para la identificación de factores de virulencia a nivel de síntesis de proteínas
6.1.4.1. Protocolo general de aplicación
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
54
En términos generales, el protocolo a seguir para el estudio con las cepas Helicobacter
pylori, puede constar de las siguientes etapas:
● Cultivo de la bacteria: Es necesario partir de un control positivo el cual será objeto
de comparación con otras cepas bacterianas que crecerán en condiciones distintas
bajo la acción de los ácidos húmicos. Es esencial realizar el cultivo con medios libres
de proteínas, en un estudio realizado por (Bumann et al., 2002) se sugiere que el
medio de cultivo contenga BHI suplementado con ciclodextrina al 1%. Se
recomienda incubar a una temperatura de 37°C en placas de agar sérico con
vancomicina, nistatina y trimetoprim en una atmósfera microaerobia. Se procede a
resuspender las bacterias y a lavarlas con BHI. Las bacterias se recuperan por
centrifugación, se lavan con BHI y se inoculan en un segundo cultivo líquido hasta
alcanzar 20 cultivos de 60 mL cada uno.
● Precipitación de proteínas extracelulares: Los cultivos con crecimiento exponencial
se centrifugan durante 15 minutos a 4°C y se filtra el sobrenadante para eliminar las
bacterias residuales. Las proteínas extracelulares se precipitan mediante la adición
de TCA (ácido tricloroacético), se centrifuga por 10 minutos y se resuspende el
sedimento en 10mL de acetona, se disuelve usando un baño de agua ultrasónico.
Se repite este paso dos veces y el sedimento final se seca al aire (Bumann et al.,
2002).
● Electroforesis en gel bidimensional: Se solubilizan las proteínas por 30 minutos a
temperatura ambiente en urea 9 M-1% 3 - [(3-colamidopropil) -dimetilamonio] -1-
propanosulfonato (CHAPS) -ditiotreitol 70 mM (DTT) Servalyto al -2%. El el trabajo
realizado por Brumann (2002) se utilizó un sistema de electroforesis en gel
bidimensional (23 por 30 cm). Para la identificación de proteínas se aplicaron 50 a
70 µg de proteínas extracelulares en el lado anódico del gel de enfoque isoeléctrico.
Los puntos se identificaron y cuantificaron mediante el programa de análisis de gel
TOPSPOT (Bumann et al., 2002)
● Toma de huellas dactilares de péptidos: La mezcla de péptidos se mezcló con una
solución saturada de ácido α-ciano-4-hidroxicinámico en 50% de acetonitrilo-0,3%
de ácido trifluoroacético (TFA), y se aplicaron 2 µl a la plantilla de muestra de un
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
55
láser asistido por matriz Espectrómetro de masas de ionización por desorción. Las
huellas dactilares de masa de péptidos se buscaron con el programa MS-FIT.
6.2. Análisis de los parámetros de estudio con los métodos descritos
De acuerdo con los factores de virulencia asociados a Helicobacter pylori, es posible
relacionarlos con los métodos anteriormente descritos (tabla 4), con el fin de seleccionar
posteriormente el más adecuado para la determinación del mecanismo de acción de los
ácidos húmicos sobre dicha bacteria.
Método Alcance del método Laboratorios para el
desarrollo del
análisis
Microscopía de
barrido
electrónico
Este método permite hacer un análisis de la
bacteria a nivel morfológico, siendo posible
examinar algunos factores asociados a la
colonización y virulencia. En primer lugar es
posible detectar cambios en la membrana
celular asociados a alteraciones en el LPS
bacteriano el cual posee residuos de
carbohidratos que pasan desapercibidos en
el proceso de reconocimiento por los
anticuerpos. La membrana celular es un
factor de supervivencia de la bacteria
importante a estudiar ya que corresponde al
límite entre el espacio intracelular y el espacio
extracelular y que presenta condiciones
extremas de pH. Las adhesinas son otras
estructuras celulares que pueden ser
estudiadas con este método, estas le impiden
a la bacteria ser arrastrada por el
peristaltismo o el recambio epitelial, así
Universidad
de los Andes
Universidad
Nacional
Universidad
ECCI.
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
56
mismo pueden ser objeto de estudio otras
estructuras externas como los flagelos o la
pilis bacteriana.
Citometría de
flujo
Este método hace posible medir múltiples
parámetros que permitirían el posterior
análisis con el mecanismo de acción de los
ácidos húmicos sobre Hp. La viabilidad
celular que se relaciona con la integridad de
membrana es uno de los parámetros de
interés pues los compuestos en mención
(AH) pueden incidir directamente sobre la
misma afectando el potencial de membrana.
Dichos aspectos se pueden estudiar
mediante el uso de fluorocromos y la
interpretación de los histogramas que se
obtengan de los ensayos realizados.
Pontificia
Universidad
Javeriana.
Universidad
Nacional.
Secuenciación
de ácidos
nucleicos
Entre los genes asociados a Hp como
factores de virulencia está el gen cagA el cual
codifica la proteína CagA, este gen
desencadena efectos tales como la ruptura
de uniones intercelulares, estimulación de
linfocitos, desregulación del ciclo celular,
apoptosis celular y producción de
interleucinas inflamatorias que generan
inflamación crónica. Así mismo el gen vacA
induce la expresión del factor de crecimiento
vascular endotelial (VEGF) y puede llegar a
provocar el desarrollo de procesos
tumorgénicos. Dichos genes pueden ser
secuenciados y comparados con bacterias
que han sido expuestas al tratamiento con
ácidos húmicos.
Alianza
Unandes-
Corpogen.
ISLA S.A.S.
Servicios
Médicos
Yunis Turbay
y Cía.
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
57
Análisis
proteómico
Entre los factores de virulencia que se
podrían estudiar con este método se
encuentran por un lado las proteínas de
membrana OMPs las cuales desempeñan
funciones de transporte de nutrientes y
transducción de señales, en HP se han
identificado más de 21 OMPs y entre las
principales funciones está la adhesión a la
célula hospedera y estimulación de
citoquinas pro inflamatorias.
Por otro lado para efectos comparativos entre
células desarrolladas normalmente y bajo la
acción de los ácidos húmicos, sería posible
comparar la manifestación de la proteína
NapA (Proteína Activadora de Neutrófilo) y la
cual actúa como un agente quelante del
hierro. La proteína cagA es otro de los objetos
de estudio mediante esta técnica, es una
citotoxina que activa diferentes señales en la
célula hospedadora provocando diferentes
efectos asociados a la inflamación, aspecto
relacionado con la aparición de cáncer
gástrico.
Alianza
Unandes-
Corpogen.
ISLA S.A.S.
Servicios
Médicos
Yunis Turbay
y Cía.
Tabla 4. Parámetros de análisis con los métodos descritos
6.3. Selección del método para el desarrollo de la propuesta metodológica
La secuenciación del transcriptoma bacteriano de Helicobacter pylori, mediante las técnicas
de nueva generación (NGS, Next-generation sequencing), permitirá secuenciar todos los
transcritos de RNA expresados por estas células, después de que sean sometidas a la
acción inhibitoria de los ácidos húmicos. A través de esto se puede obtener mayor
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
58
información de los genes que están activados y de los genes que están reprimidos,
independientemente de que estos estuvieran o no anteriormente identificados.
La calidad y confiabilidad de estos resultados dependen del correcto desarrollo
metodológico y experimental, a partir del cual se obtienen las muestras que serán
secuenciadas, cualquier error en este punto, implica empezar de nuevo, lo que conlleva
una mayor inversión en tiempo y recursos. Por otro lado, la rigurosidad de trabajo se hace
necesaria, para poder evitar la generación de variaciones técnicas, que conlleven a
conclusiones erradas, para lo cual se trabajará con un mínimo de tres muestras de
Helicobacter pylori cada una expuesta al tratamiento inhibitorio que ejercen los ácidos
húmicos, esto facilita evaluar la variabilidad biológica en cada tratamiento y compararlo con
el otro, para finalmente generalizar los resultados a la población bacteriana. (RODRÍGUEZ
CUBILLOS et al, 2014)
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
59
7. Desarrollo de la propuesta
El desarrollo de esta propuesta tiene tres vertientes, la primera se relaciona con la
caracterización de las muestras de carbón y una posterior extracción de los ácidos húmicos,
que serán sometidos a diversas pruebas para caracterizarlos física y químicamente; la
segunda, está enmarcada al tratamiento microbiológico que se le hará a las diferentes
cepas de Helicobacter pylori. Finalmente, una tercera fase implica unificar los anteriores
desarrollos experimentales, para evaluar la eficiencia inhibitoria de los ácidos húmicos en
las diferentes muestras bacterianas, a partir de las cuales se obtendrán muestras de sus
transcritos de RNA, que permitan conocer la información de los genes que están siendo
activados y reprimidos, cuando la célula se somete a una condición específica.
7.1. Toma y preparación de las muestras de carbón
Se plantea la recolección de seis muestras de carbón, siguiendo lo estipulado en la norma
ASTM D 2234-98. Posteriormente, se debe realizar una disminución de tamaño a través de
un proceso de molienda y tamizado, hasta que cada muestra alcance un tamaño de
partícula cercana a los 0,25 mm, separada mediante un tamiz Malla No. 60. El
procedimiento se ilustra en el diagrama 1.
Diagrama 1. Metodología del muestreo y la preparación de las muestras de carbón
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
60
7.2. Análisis próximo
En el diagrama 2, se ilustra la metodología usada para caracterizar las diferentes muestras
de carbón y establecer así la más óptima para la posterior extracción de los ácidos húmicos
que se emplearán posteriormente en la inhibición de la bacteria Hp.
Diagrama 2. Metodología para el análisis próximo de las muestras de carbón.
7.2.1. La metodología para la determinación del porcentaje de humedad de
cada una de las muestras de carbón se muestra en el diagrama 3.
Diagrama 3. Metodología para la determinación del porcentaje de humedad
7.2.2. Determinación del porcentaje de cenizas: La metodología para la
determinación del porcentaje de ceniza para cada una de las muestras
de carbón se muestra en el diagrama 4.
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
61
Diagrama 4. Metodología para la determinación del porcentaje de cenizas.
7.2.3. Determinación de materia volátil: La metodología para la
determinación del porcentaje de materia volátil para cada una de las
muestras de carbón se muestra en el diagrama 5.
Diagrama 5. Metodología para la determinación del porcentaje de materia volátil.
7.2.4. Determinación de densidad: La metodología para la determinación
de la densidad para cada una de las muestras de carbón se muestra
en el diagrama 6.
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
62
Diagrama 6. Metodología para la determinación de la densidad.
7.2.5. Determinación de poder calorífico: La metodología para la
determinación del poder caloríf ico para cada una de las muestras de
carbón se muestra en el diagrama 7.
Diagrama 7. Metodología para la determinación del poder calorífico.
7.3. Análisis último:
En el diagrama 8, se ilustra la metodología usada para realizar el análisis último de las
diferentes muestras de carbón, a través del cual se determina la composición porcentual de
nitrógeno, carbono, hidrógeno y azufre, por medio del equipo THERMO FLASH 2000
CHNS-O ubicado en las instalaciones de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas.
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
63
Diagrama 8. Metodología para análisis último de las muestras de carbón.
7.4. Extracción de Ácidos húmicos:
La extracción de los A.H. se hace a partir de carbón de bajo rango, determinado por el
análisis próximo y último de las diferentes muestras de carbón, pues se considera como
una de las principales fuentes de estos ácidos. Con base en los trabajos en la Universidad
Distrital Francisco José de Caldas se ha logrado optimizar los procesos de extracción de
los A. H., por lo cual se continúa con la misma metodología de extracción el cual se describe
en el diagrama 9.
Diagrama 9. Metodología para la extracción de los ácidos húmicos.
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
64
7.5. Caracterización de los ácidos húmicos
Teniendo presente la naturaleza particular de los ácidos húmicos de acuerdo con su fuente
de extracción, se hace necesario realizar un estudio del sustrato, con el propósito de
conocer las características físicas y químicas que presente y contrastarlas con las fuentes
teóricas, para poder asegurar de que el sustrato extraído realmente son ácidos húmicos y
así poder determinar la inhibición de estos sobre la bacteria H. P. Esta metodología se
ilustra en el diagrama 10.
Diagrama 10. Caracterización experimental de los ácidos húmicos.
7.6. Tratamiento microbiológico de Helicobacter pylori
Con el propósito de poder realizar un análisis transcriptómico sobre las bacterias, como
terapia alternativa de inhibición, se hace necesario establecer los criterios para obtener,
sembrar y cultivar este microorganismo, así como el procedimiento para determinar y
comparar los halos de inhibición al ser tratados con ácidos húmicos y el antibiótico
seleccionado.
7.6.1. Toma de biopsias: La biopsia a partir de mucosa gástrica es una de las
opciones más habituales para el aislamiento y cultivo de Helicobacter pylori,
pues este tipo de microorganismo se establece principalmente en la zona antral
del estómago, excepto en individuos tratados con IBP (Inhibidores de la Bomba
de Protones) y antihistamínicos, en los que se encuentran densidades más
grandes en el cuerpo. (Alarcón, T., Baquero, M., Domingo, et al. 2004). El
protocolo recomendado para la toma de biopsias en pacientes con gastritis
crónica es el propuesto por el sistema Sydney, este establece que se deben
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
65
tomar dos muestras antrales a partir de las curvaturas mayor y menor con 2 a 3
cm proximales al píloro, dos muestras del cuerpo estomacal a partir de las
curvaturas mayor y menor 8 centímetros distales del cardias y una muestra a
partir de la cisura angularis. No se recomienda realizar la biopsia en pacientes
con úlcera sangrante ya que puede ocasionar una hemorragia (Bayona Rojas,
2013)
7.6.2. Transporte y conservación de las biopsias: Este tipo de procedimiento está
sujeto al tiempo que tome iniciar el cultivo de la bacteria. En el caso de que el
trabajo se vaya a iniciar inmediatamente después de la toma de la muestra, se
recomienda introducir el microorganismo sobre la pared del tubo o en un tubo
estéril con 0,5 mL de suero salino, teniendo en cuenta que la muestra
permanecerá viable hasta un máximo de 6 horas. Cuando la siembra se va a
realizar en un tiempo mayor, la biopsia debe introducirse en un medio de
transporte semisólido a 4ºC, extendiendo la viabilidad hasta un periodo de 48 h.
Sin embargo, la mejor opción es procesar la biopsia en las cuatro horas
siguientes, una vez tomada la muestra. (Alarcón, T., Baquero, M., Domingo, et
al. 2004).En la bibliografía hay pocos reportes sobre el adecuado transporte y
condiciones de aislamiento de Helicobacter pylori de biopsias gástricas,
especialmente si estas deben transportarse por un largo periodo de tiempo. De
ahí la importancia de trabajar adecuadamente en este aspecto, pues la
estabilidad de la muestra bacteriana durante su transporte puede llegar a limitar
la recuperación de esta.
7.6.3. Cultivo y aislamiento de Helicobacter pylori: Tanto el cultivo como
el aislamiento de Helicobacter pylori dependen del adecuado control
de diferentes variables que incluyen la recogida, el transporte, el
almacenamiento, los medios de cultivo y las condiciones de
incubación. Es necesario ser muy riguroso en este tipo de
procedimientos, especialmente si la muestra se obtiene a partir de
una biopsia gástrica, ya que esta aporta diversas ventajas en el
estudio histológico de la bacteria, tales como la sensibilidad y/o la
resistencia a los diferentes antibióticos. Tanto la recuperación de la
bacteria, como las características de crecimiento deben hacerse de
forma correcta, ya que de estas dependen estudios de epidemiología ,
diversidad genética y susceptibilidad a antibióticos o antimicrobianos.
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
66
(Alarcón, T., Baquero, M., Domingo, et al. 2004). Las muestras de
biopsia deben triturarse o pulverizarse con una pequeña cantidad de
solución salina antes de aplicarse sobre el medio, una vez
homogeneizado, debe colocarse de inmediato sobre el medio, para
esto se toma el asa y se extiende sobre la superficie del medio de
cultivo elegido.
7.6.3.1. Medios de cultivo:
Un adecuado cultivo de Helicobacter pylori, permitirá conocer sus características de
crecimiento, su diversidad genética, su epidemiología y la posibilidad de determinar la
resistencia a los antibióticos usados en el tratamiento. El primer paso es realizar una adecuada
homogeneización de la biopsia en un volumen pequeño de suero fisiológico, buscando facilitar
la liberación de las bacterias.
Una de las principales características de Helicobacter pylori es su facilidad de crecer en
diferentes medios de cultivo, sin embargo, en cada uno de estos existen factores de
crecimiento que se deben tener en cuenta (tabla 4). Lograr medios de cultivo líquidos es difícil,
sin embargo, algunos de los más prácticos incluyen el caldo de Brucella, cerebro-corazón,
Mueller-Hinton y tripticasa soja, suplementados con nutrientes, siendo el más común el suero
bovino fetal. En el caso de los medios de cultivo sólidos los más frecuentes son el Mueller-
Hinton y el agar Columbia, suplementados con suero de caballo, lisado de eritrocitos y hemina,
extracto de levadura, peptona, isovitalex, sin embargo, los mejores resultados se obtienen con
suero bovino fetal o sangre.
Autores Medio basal Requerimiento
de Sangre
Suplementos Antibióticos
Tersterman
y cols (2001)
Agar sangre B- ciclodextrina,
colesterol y
suero fetal
bovino
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
67
Joo y cols
(2010).
Caldo Brucella Suero equino,
extracto de
levadura y
dimetil-beta-
ciclodextrina.
Stevenson y
cols (2000)
Agar
Columbia
Sangre de
caballo
Extracto de
carne y almidón
de maíz.
Vancomicina,
anfotericina
B,
trimetoprima y
cefsulodina
Bilbao y cols
(2007)
Agar
Columbia
7% de sangre
desfibrinada de
cordero.
DENT
(vancomicina,
trimetoprim,
anfotericina B
y cefsulodi).
Yepes y cols
(2008)
Agar Brucella Sangre de
cordero al 5%
Vega y cols
(2012)
Caldo Mueller
Hinton
Extracto de
cianobacterias
(MH-CE)
Vega y cols
(2012)
Caldo Mueller
Hinton
Suero fetal de
ternera (MH-
FCS)
Trespalacios
y cols (2010)
Wilkins-
Chalgren
Isovitalex No se
especifican.
Quiroga y BD Suero de caballo Isovitalex al
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
68
cols (2005) Helicobacter
Agar
al 8% y
suplemento
selectivo para
Campylobacter
(Merck)
1%.
Tabla 5. Composición de diferentes medios de cultivo empleados en el aislamiento de Helicobacter pylori. Adaptado de: Bayona, 2013
Se debe tener presente la cantidad de sangre que se utilice, pues se ha comprobado que una
relación de 7-10 % favorece en mayor medida el desarrollo de la bacteria; y por otro lado el
tipo de sangre, ya que hay un mayor crecimiento con sangre de caballo al 10% y lisada al 7%.
Lo más importante es que la sangre que se utilice este fresca, pues aunque los medios de
cultivo preparados puedan llegar a funcionar es difícil tener certeza de la frescura de sus
componentes.
Debido a que en la toma de la biopsia es posible encontrar contaminantes junto a Helicobacter
pylori, se hace necesario utilizar inhibidores que no afecten su viabilidad, tales como
vancomicina, sulfametoxazol, trimetropin, cefsulodina y polimixina B, los cuales hacen parte
de la preparación de los medios selectivos. (Alarcón, T., Baquero, M., Domingo, et al. 2004).
Es importante tener en cuenta que hay varios medios de cultivos reportados (Tabla 5), donde
su elección está sujeta a la accesibilidad comercial sobre cada uno de los ingredientes. Sin
embargo, de forma general es posible reconocer los elementos básicos que se requieren para
la preparación de estos medios tales como el empleo de un caldo o agar base nutritivo
enriquecido con sangre fresca de cordero o de equino, isovitalex al 2%, suero de equino al
10% y antibióticos. (Bayona, M. A., 2013).
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
69
Medios sólidos con sangre
de caballo
Medios sólidos con suero de
caballo
Medios sólidos sin sangre
de caballo
Caldo BHI con 10% agar
Agar Brucella
Agar Muller Hinton
Agar Skirrow
Agar Columbia
Agar Campylobacter
modificado
Agar Chocolate
Agar GC (Gonococos)
Caldo BHI
Caldo Muller Hinton
Caldo Brucella
Caldo soya tripticasa
Agar Columbia
Hemina
Rojo fenol
Isovitalex
Urea
Tabla 6. Medios de cultivo útiles para el cultivo de Helicobacter pylori (Majalca-Martínez, Rivera-Cabrera, Ochoa-Pérez, & Giono-Cerezo, 2001)
7.6.3.2. Incubación: La atmósfera en la cual se desarrolla Helicobacter
pylori, no solo se caracteriza por ser microaerofílica sino que
además debe cumplir con los siguiente requerimientos: 5 -10% de
O2, 5-10% de CO2 y 80-90% de N2 a 35-37 ºC, un porcentaje de
humedad del 95% y una incubación de diez días, antes de
considerar negativo el cultivo. Por lo anterior, se hace necesario
utilizar cabinas de microaerofilia o sobre comerciales que generan
las condiciones anteriormente descritas. (Alarcón, T., Baquero, M.,
Domingo, et al. 2004).
7.6.3.3. Identificación del microorganismo: Teniendo en cuenta que la
cepa nativa se debe tomar de varias biopsias diferentes, tras la
incubación se observarán microorganismos de diferentes tipos,
razón por la cual se deben realizar técnicas de contraste, pruebas
microbiológicas y bioquímicas que permitan identif icar plenamente
las cepas correspondientes a Helicobacter pylori.
7.6.3.3.1. Tinción de Gram: Tendiendo en cuenta la clasificación de
Helicobacter pylori, como una bacteria Gram negativa, esta tinción
dará como resultado una coloración rosada, sin embargo, si dentro
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
70
del protocolo de esta tinción se cambia la safranina por fucsina la
coloración que se observa será de color rojo. El procedimiento
para el desarrollo de esta tinción se presenta a continuación:
Figura 14. Metodología para la tinción de Gram
7.6.3.3.2. Prueba de Ureasa: A través de esta prueba será posible distinguir la
bacteria en cuestión de las Campylobacter, por su capacidad de hidrolizar la
urea en anhídrido carbónico y amonìaco, generando un cambio de color de
la enzima ureasa, debido al marcado incremento de pH que causa el
amoniaco, sin embargo, se debe considerar que la bacteria “in vitro” se
comporta diferente a su estado “in vivo”, pues habrá una marcada menor
cantidad de ureasa dentro de la bacteria, lo que generará muchos resultados
negativos o débilmente positivos.
7.6.3.3.2.1. Procedimiento: Inocular varias colonias del microorganismo en 0,25 ml
de caldo de urea e incubar a 370C. A los pocos minutos se podrá
observar un color rojo.
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
71
7.6.3.3.3. Prueba de catalasa: Esta enzima está asociada a la superficie de
Helicobacter pylori y la protege de la acción fagocitica de algunos
mediadores químicos de la inflamación, como los neutrófilos y los
metabolitos reactivos de oxígeno, para garantizar su supervivencia en el
tejido inflamado. Debido a su actividad peroxidasa, al poner en contacto
alguna colonia de estas con peroxido de hidrogeno, se formarán burbujas,
pues la Helicobacter pylori hace uso de la enzima catalasa para eliminarlo,
generando agua y oxígeno, de ahí el burbujero observado. (Alarcón, T.,
Baquero, M., Domingo, et al. 2004)
7.6.3.3.3.1. Procedimiento: Inocular un asa con colonias en una gota de H2O2 al
3% depositada en un portaobjetos. La formación de burbujas indica una
prueba de catalasa positiva.
7.6.3.3.4. Prueba de oxidasa: La reacción de esta enzima se debe a que Helicobacter
pylori, presenta un sistema citocromooxidasa que activa la oxidación del
citocromo, reducido por el oxígeno molecular, dando lugar a peróxido de
hidrógeno, de ahí que su acción vaya ligada a la de la enzima catalasa, que
degrada este compuesto como se explicó anteriormente.
7.6.3.3.4.1. Procedimiento: Transferir varias colonias a una tira de oxidasa o a un
papel de filtro impregnado en dihidro-cloruro de N,N,N´,N´ tetrametil-p-
fenilendiamina al 1%. Una reacción azul oscura indica la presencia de la
enzima oxidasa. (Alarcón, T., Baquero, M., Domingo, et al. 2004)
7.6.3.4. Sub cultivo del microorganismo: Los resultados de las anteriores pruebas,
permiten identificar la presencia de Helicobacter pylori, y por ende aislarla
de otros microorganismos también presentes en las biopsias. A partir de
esta, será posible realizar una resiembra que servirá como cepa de
referencia nativa y control positivo en los posteriores tratamientos y pruebas
a realizar. Es posible realizarla de dos formas diferentes:
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
72
7.6.3.4.1. Directamente con el asa, se recoge la biomasa de un aislamiento de
Helicobacter pylori (previamente identificado con las pruebas mencionadas)
y se inocula en un medio no selectivo (tabla 10) y un ambiente
microaerofílico.
7.6.3.4.2. Se prepara una suspensión densa del microorganismo, en caldo BHI o
solución salina y se inoculan en placas con medios no selectivos (tabla 10)
y un ambiente microaerofílico. Es necesario esperar un rango de 48 - 72
horas de incubación para hacer uso de los mismos en las pruebas
siguientes.
7.6.3.5. Conservación de las muestras: Teniendo claro que su realizarán varios
estudios, tanto las biopsias obtenidas, como las cepas de Helicobacter pylori,
deben almacenarse de forma correcta.
7.6.3.5.1. Conservación de las biopsias: Cada biopsia será introducida en un criotubo
con 0,5 mL de BHI. 20 % de glicerol y una incubación con una temperatura
de -80 ºC o 196º C (si se usa nitrógeno líquido).
7.6.3.5.2. Conservación de los aislamientos de Helicobacter pylori: Se deben seguir
los siguientes pasos: primero, resembrar las cepas en dos placas de agar no
selectivo; segundo, esperar 48 horas para recoger e inocular en 2-3 mL de
BHI con 20 % de glicerol; tercer, almacenar en criotubos con una
temperatura de -80 ºC o 196º C (si se usa nitrógeno líquido). (Alarcón, T.,
Baquero, M., Domingo, et al. 2004)
7.6.4. Tratamiento de la bacteria Helicobacter pylori con los ácidos
húmicos y antibióticos comúnmente utilizados en los
tratamientos: Están reportados algunos valores de Concentración
Mínima Inhibitoria (CMI), para la cepa de referencia H. pylori ATCC
43504 en diferentes antibióticos, tales como: amoxicilina (0,016-0,12
mg/L), claritromicina (0,016-0,12 mg/L), metronidazol (64-256 mg/L),
telitromicina (0,06-0,5 mg/L) y tetraciclina (0,12-1,0 mg/L). Con base
en esto, será posible trabajar con algunos de estos antibióticos y los
ácidos húmicos, para el tratamiento de la cepa de referencia nativa,
previamente establecida.
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
73
7.6.4.1. Cepa de referencia nativa + antibiótico seleccionado: Teniendo
en cuenta los valores establecidos de CMI, a la bacteria en estado
natural, se le tratara con el antibiótico seleccionado, el cual servirá
como un control negativo, que permitirá contrastar con la acción
inhibitoria de los ácidos húmicos.
7.6.4.2. Cepa de referencia nativa + ácidos húmicos: Se emplearán los
ácidos húmicos en diferentes concentraciones 0.5%, 0.625% y
0.75%, que en investigaciones anteriores mostraron ser las que
generaron los halos de inhibición más altos.
7.6.5. Determinación de sensibilidad frente a agentes antimicrobianos: Con el
propósito de normalizar cada uno de los procedimientos que existen frente a la
determinación de la susceptibilidad in vitro, existen normas según la zona
geográfica, por ejemplo, en América se rige la norma del Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI) a través de su Subcommittee of Antimicrobial
Susceptibility Testing. (Balouiri et al, 2016) Una vez que se han aislado colonias
de Helicobacter pylori, la cual ya se ha identificado como patógeno potencial, es
necesario proceder de la siguiente manera para realizar la prueba de
sensibilidad:
● A partir de la cepa nativa de Helicobacter pylori, previamente caracterizada, con la
ayuda de un asa se toman de 3-5 colonias, para facilitar la detección de la
resistencia y se suspenden en 5mL de suero fisiológico, caldo de Mueller – Hinton
o agua destilada (Cavalieri et al, 2005).
● Se debe ajustar la turbidez a un 0,5 de la escala de McFarland (lo que corresponde
a aproximadamente 1,5 X 10 8 CFU/ml). Se puede ajustar visualmente, utilizando
una tarjeta blanca, a la cual se le hacen varias líneas blancas de diferente grosor,
para contrastar el patrón de turbidez y el inóculo.
● La preparación del patrón de turbidez incluye la preparación de sulfato de bario, a
partir de la reacción entre 99.5 mL de ácido sulfúrico y 0,5 mL de cloruro de bario.
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
74
La lectura de absorbancia de este patrón debe estar entre 0.08 – 0.10 con filtro de
625 nm.
● Con ayuda de un hisopo o un asa estéril, se humedece con el inóculo y se siembra
sobre la superficie del medio de cultivo barriendo tres veces y dejando reposar entre
cinco y quince minutos. Los medios de cultivo más utilizados para Helicobacter pylori
son Mueller-Hinton o Columbia suplementado con 5 a 10% de sangre (de caballo o
carnero).
● Se colocan los discos de papel filtro impregnados con el antimicrobiano
seleccionado, incluyendo los ácidos húmicos, con una pinza anatómica,
correctamente esterilizada. Para Helicobacter pylori, se sugiere un disco de
metronidazol de 5 μg, donde las medidas del halo son, <16 mm para resistencia,
16-21 mm para intermedio y >21 para sensible. En claritromicina se puede preparar
un disco de 2 μg, siendo resistente cuando hay ausencia de halo de inhibición, o un
disco de 15 μg y se considera resistente si el halo es de <18 mm. Los discos se
conservan a 4ºC y se extraen cuatro horas antes de su uso, para que lleguen a la
temperatura ambiente.
● El tamaño de la caja de petri determinará la cantidad de los discos a utilizar. Para
un diámetro de 100mm, debe haber un máximo de 5 discos, y para un diámetro de
150 mm, máximo pueden haber 12 discos. Cabe aclarar que entre cada disco debe
existir una distancia de 2.5 cm. Se deben incubar invertidas a 35ºC, luego de que
hayan transcurrido 15 minutos de la colocación de los discos. La interpretación se
realiza a partir de las tablas provistas por el CLSI. (Trigoso. C.)
7.6.5.1. Interpretación de resultados: Tras una incubación por un tiempo de 18
horas y a una temperatura de 35 ºC, se miden los halos de inhibición con
ayuda de una regla. Con base en las tablas provistas por el CLSI, se podrán
establecer los puntos de corte, lectura de halos, relación con los valores de
CIM y la susceptibilidad, resistencia o punto intermedio para cada grupo
bacteriano (Trigoso. C.). De igual forma, se comparan estos resultados con
los de los ácidos húmicos, para establecer los halos de inhibición que estos
generen, en las diferentes concentraciones trabajadas.
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
75
7.6.6. Extracción de RNA total: El RNA que se extraiga a partir de las colonias
bacterianas de Helicobacter pylori, puede ser copiado a moléculas de DNA
bicatenaria y a su vez estas pueden dar origen a cDNA. Por lo tanto la calidad
en los procesos de extracción del RNA, es el paso fundamental para iniciar el
estudio de secuenciación. Este ácido nucleico es el más abundante en la célula,
sin embargo, su obtención se dificulta debido a diversas impurezas, tales como
RNAasas, proteínas y polisacárido. De forma general los procesos de extracción
incluyen de una lisis celular, separación, purificación, precipitación, lavado y
disolución. (Sandoval-Pineda et al, 2017)
7.6.6.1. Lisis celular: Las células bacterianas se homogenizan en una solución de
isotiocianato de guanidina y fenol (pH 5 a 6), logrando su lisis e inactivación
de las ribonucleasas endógenas. El isotiocianato de guanidina en muy buen
desnaturalizante de proteínas, por lo cual podrá inhibir las RNAsas, mientras
que la solución ácida de fenol facilita la formación de fases orgánicas (donde
queda retenido el DNA) y acuosas (donde queda suspendido el RNA) y
también facilita la desnaturalización de proteínas e inactivación de
nucleasas.
7.6.6.2. Separación: Con una solución de etanol, se diluye el lisado y se introduce
en una columna de resinas de intercambio aniónico. Esta resina está hecha
de sílice con grupos cargados positivamente de dietil-amino-etil (DEAE), los
cuales interaccionan con los grupos fosfatos del RNA. Los contaminantes
se retiran mediante lavados.
7.6.6.3. Precipitación: El RNA que está en la columna se eluye con soluciones
iónicas acuosas y se purifica a partir de esta fse a través de precipitación y
centrifugación con isopropanol a bajas temperaturas haciendo que el RNA
sea óptimo para técnicas de secuenciación. (Salazar Montes et al, 2013)
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
76
7.6.5.2. Análisis transcriptómico
La transcriptómica corresponde al estudio del conjunto de los RNAs presentes en un
organismo o célula. Este se caracteriza por ser dinámico y responder a las condiciones
ambientales. En este conjunto de transcritos no solo se incluye el RNAm que refleja los genes
que están siendo expresados de forma activa sino también otros tipos de RNA con actividad
estructural, catalítica y reguladora (Valledor, n.d.).
El estómago humano es un entorno dinámico y hostil en que H. pylori se encuentra con una
variedad de factores ambientales estresantes tales como las fluctuaciones del pH, las
limitaciones de nutrientes, las cambiantes disponibilidades de los iones metálicos, el estrés
oxidativo generado por el sistema inmunitario del huésped, entre otros. A pesar de estar muy
bien adaptado al nicho gástrico humano, este patógeno requiere sistemas reguladores para
cambiar rápidamente su expresión génica y así adaptar las condiciones de colonización
(Backert & Yamaoka, 2016). Dichos cambios en la expresión génica serán inducidos in vitro
en la bacteria siendo los ácidos húmicos extraídos del carbón leonardítico colombiano el factor
estresante y de los cuales se sabe que generan una reacción inhibitoria sobre el patógeno,
tras esta interacción patógeno-inhibidor, es posible realizar un análisis transcriptómico con
fines comparativos entre cultivos desarrollados bajo estrés e inhibición y cultivos desarrollados
en condiciones normales.
El análisis transcriptómico permite realizar una caracterización funcional de los sRNAs que
junto con la identificación de las proteínas de unión al RNA asociadas, ayuda a comprender
los roles potenciales en la virulencia de Helicobacter y la respuesta al estrés.
El estudio de RNAs pequeños bacterianos (50 a 400 nt de largo) actúan como reguladores
postranscripcionales en diversas condiciones de estrés y crecimiento o durante la virulencia,
estos son una clase emergente de reguladores de la expresión de genes postranscripcionales
que actúan durante la respuesta al estrés bacteriano o el control de la virulencia en patógenos
(Papenfort y Vogel 2010; Storz et al. 2011)
El análisis del transcriptoma de Helicobacter pylori presenta una gran importancia en el
desarrollo de esta propuesta ya que proporcionará información acerca de las condiciones en
que se requiere la expresión de ciertos genes y sus funciones fisiológicas orientando la
elucidación del mecanismo de acción del factor externo y objeto de estudio (ácidos húmicos).
En este sentido, los métodos de secuenciación de la próxima generación han resultado ser
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
77
una herramienta eficaz para descubrir la estructura del transcriptoma e identificar
transcripciones novedosas en procariotas. Los perfiles de expresión basados en RNA-seq de
bacterias cultivadas en diferentes condiciones o en comparación con cepas mutantes
ayudarán a identificar sRNAs, que se inducen en ciertas condiciones de estrés o virulencia.
Así mismo, la comprensión completa de los procesos de infección requiere la investigación
paralela de la expresión de genes tanto en el patógeno como en el huésped, aspecto que
podría considerarse en futuros trabajos relacionados (Sharma & Pernitzsch, 2012).
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
78
8. Conclusiones
El desarrollo de esta propuesta implica el trabajo multidisciplinar de distintos grupos
de investigación centrados en áreas como la química, la microbiología y las ciencias
de la salud, buscando establecer desde diferentes enfoques el tratamiento
alternativo frente a H. pylori que se puede realizar a partir del uso de sustratos de
tipo natural, como lo son los ácidos húmicos.
Para la puesta en marcha tanto de esta propuesta como de otras similares, se le
sugiere a la Universidad Distrital Francisco José de Caldas, mejorar la
infraestructura a nivel de equipos y laboratorios, así como implementar materias
como microbiología, que permitan tener unas bases teóricas y experimentales más
claras, facilitando el planteamiento y la interpretación de resultados del proyecto
investigativo.
La secuenciación del RNA de H, pylori inhibida con los ácidos húmicos, permitirá
comparar y reconocer los cambios a nivel del transcriptoma generados en el
microorganismo bajo una condición específica, sentando las bases teóricas y
experimentales para nuevas rutas terapéuticas.
El análisis global del transcriptoma de H. pylori, implica el desarrollo de varias fases
experimentales donde cada uno influirá en gran medida en la validez de los
resultados obtenido, para la identificación plenas de los genes diferencialmente
expresados.
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
79
9. Bibliografía
Ácidos Húmicos | ACIDOS HUMICOS :: Fertilizantes agrícolas Jisa. (n.d.). Retrieved October
3, 2018, from https://www.acidoshumicos.com/acidos-humicos/
Agudo, S. (2010). ESTUDIO MOLECULAR DE LOS FACTORES DE VIRULENCIA Y DE LA
RESISTENCIA A CLARITROMICINA EN LA INFECCIÓN POR Helicobacter pylori. Tesis
doctoral. Universidad Complutense de Madrid, Madrid.
Asadi A & Razavi S & Talebi M, et al. (2018). A review on anti-adhesion therapies of bacterial
diseases. Infection, doi:10.1007/s15010-018-1222-5
Alarcón, T. (1999). Antibiotics resistance problems with Helicobacter Pylori.
Alarcón, T., Baquero, M., Domingo, D., López-Brea, M., Royo G. (2004). Recomendaciones de
la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. Diagnóstico
microbiológico de la infección por Helicobacter pylori.
Backert, S., & Yamaoka, Y. (2016). Helicobacter pylori Research: From Bench to Bedside.
Springer.
Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. (2016). Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity:
A review. Journal of Pharmaceutical Analysis, 6 (2016) 71–79.
Barrera Ramírez L.M., Drago Serrano M.E., Pérez Ramos J., Zamora A.C., Gómez Arroyo F.,
Sainz Espuñes T.R y Mendoza Pérez F. 2004. Citometría de flujo: vínculo entre la
investigación básica y la aplicación clínica. Rev Inst Nal Enf Resp Mex, 17: 42-55.
Bayona Rojas, M. A. (2013). Microbiological conditions for culturing Helicobacter Pylori. Revista
Colombiana de Gastroenterologia, 28(2), 94–99.
Bayona, M. A. (2013). Condiciones microbiológicas para el cultivo de Helicobacter pylori.
Asociaciones Colombianas de Gastroenterología, Endoscopia digestiva, Coloproctología y
Hepatología, 94-99.
Buitrago, F., Rodríguez, E., & Alejandre, J. (2010). Criterios actuales para la erradicación de
Helicobacter pylori. Badajoz, España: FMC.
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
80
Bumann, D., Aksu, S., Wendland, M., Janek, K., Zimny-Arndt, U., Sabarth, N., … Jungblut, P.
R. (2002). Proteome Analysis of Secreted Proteins of the Gastric Pathogen Helicobacter
pylori. Infection and Immunity, 70(7), 3396–3403.
Cabrera Cao, Y., Fadragas Fernández, A., & Guerrero Guerrero, L. G. (2005). Antibióticos
naturales: Mito o realidad. Revista Cubana de Medicina General Integral, 21(3-4), 0–0.
Cavalieri, S., Harbeck, R., McCarter Y., Ortez, J., Rankin, I., Sautter, R., et al. (2005). Manual
de Pruebas de Susceptibilidad Antimicrobiana: Washington: Departments of Laboratory
Medicine and Microbiology University of Washington.
Cervantes-García, E. (2016). Helicobacter pylori: mecanismos de patogenicidad. Revista
Latinoamericana de Patología Clínica Y Medicina de Laboratorio, 1, 100–109.
Cortés, E., Cervantes, E., Ortiz, A (2014). Manuel de Prácticas de Laboratorio, Citometría de
flujo. Universidad Autónoma Metropolitana. Unidad Itzapalapa. Obtenido de:
http://publicacionescbs.izt.uam.mx/DOCS/MCF.pdf
Cortes , V. J. (s.f.). Carbon.
DC, D. E. (16 de julio de 2015). GLOBAL HEALING CENTER. Obtenido de Los beneficos del
ácido húmico: https://www.globalhealingcenter.net/salud-natural/beneficios-del-acido-
humico.html
De Lozano, V., Yáñez, M., Morales, A. (2014). Principios y práctica de la Microscopía
Electrónica. Bahia Blanca. Obtenido de: https://www.bahiablanca-
conicet.gob.ar/biblioteca/principios-practica-microscopia-electronica.pdf
Díaz, L. B., Domínguez, L. E., & González, B. L. (17 de Noviembre de 2008). Métodos para la
detección de la infección por Helicobacter pylori. La Habana, Cuba: Centro Nacional de
Investigaciones Científicas.
El carbón. (2014). Obtenido de Todo sobre el carbon: http://carbon-
unilibre.webnode.com.co/clasificacion/tipos-de-carbon/
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
81
ENERGY. (2005). Complementary Natural Health Products and Altenative Medicine.
Recuperado el 21 de septiembre de 2017, de http://www.energy.sk/es/menu_x3001x.asp
Evangelista, C. M. (2007). El carbón. El recorrido de los minerales. Madrid: Dirección general
de minas, industria y energía.
FACTORES DE VIRULENCIA. (n.d.). Retrieved July 17, 2018, from
http://ricardoarenas.weebly.com/factores-de-virulencia.html
Filiatrault, M. J. (2011). Progress in prokaryotic transcriptomics. Current Opinion in Microbiology,
14(5), 579–586.
GARCÍA, E. C. (2016). Helicobacter pylori: macanismos de patogenicidad. Revista
Latinoamericana de Patología Clínica y Medicina de Laboratorio, 100-109.
García, F. (28 de Septiembre de 2001). Resistencia bacteriana a antibióticos. Obtenido de
SciELO: http://www.scielo.sa.cr/scielo.pHp?script=sci_arttext&pid=S0001-
60022001000300001
GmbH, H. (2015). HUMINTECH. Obtenido de Qué son ácidos húmicos?:
http://www.humintech.com/es/ganaderia/informacion/que-son-acidos-humicos.html
Gonzáles, E., & Quino, A. (Noviembre de 2008). Helicobacter pylori.
Greif, G. (n.d.). Métodos de secuenciación de ácidos nucleicos. Retrieved Octubre 17 del 2018,
from
http://www.chlaep.org.uy/descargas/curso_tb_mico_bacterias/metodos_de_secuenciacion
_de_acidos_nucleicos.pdf
Heras, J. M. (Junio de 2017). Factores de virulencia de Helicobacter pylori involucrados en su
persistencia, colonización y patogenicidad. Universidad Complutencia.
Hernández Sampieri, R., Fernández Collado, C., Baptista Lucio, M. (2014). Metodología de la
investigación. México D.F.: McGRAW-HIL.
Herrera, M. O., & Jiménez, V. R. (s.f.). GASTRITIS Helicobacter pylori. Laboratorio de
Bacteriología Experimental, Instituto Nacional de Pediatría.
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
82
Humic acids: Structural properties and multiple functionalities for novel technological
developments. (2016). Materials Science and Engineering: C, 62, 967–974.
Lodhi, A., Tahir, S., Iqbal, Z., Mahmood, A., Akhtar, M., Qureshi, T. M., . . . Naeem, A. (2013).
Characterization of commercial humic acid samples and their impact on growth of fungi and
plants. Soil Science Society of Pakistan, 32(1), 63-70. Obtenido de (http://www.sss-
pakistan.org
Majalca-Martínez, C., Rivera-Cabrera, J., Ochoa-Pérez, S. A., & Giono-Cerezo, S. (2001).
Transporte, aislamiento, identificación y conservación de cepas de Helicobacter pylori.
Bioquimia, 26(4). Retrieved from http://www.redalyc.org/resumen.oa?id=57611574003
Marrero Alberto, A., & Alberto, A. M. (2018). Microscopio electrónico de barrido y
elucubraciones históricas. El artesonado mudéjar del santuario de Tacoronte (Tenerife).
Tsafiqui, (10). https://doi.org/10.29019/tsafiqui.v0i10.400
Martínez, C. X., Bravo, I., & Martin, F. J. (2013). Composición molecular de ácidos húmicos
evaluada mediante pirólisis – cromatografía de gases – espectrometría de masas e
hidrólisis térmica asistida y metilación en suelos altoandinos de Colombia. Revista
colombiana de química, 42(1).
Mirza, M. A., Agarwal, S. P., Rahman, M. A., Rauf, A., Ahmad, N., Alam, A., & Iqbal, Z. (2011).
Role of humic acid on oral drug delivery of an antiepileptic drug. Drug Development and
Industrial Pharmacy, 37(3), 310–319.
McCarthy D.A. 2010. Fluorochromes and Fluorescence. En: Flow cytometry: principles and
applications. 3a ed., 2a reimpresión. Macey M.G. (editora). New Jersey, EUA, editorial
Human Press. 59-112 pp.
McGRAW-HILL INTERAMERICANA EDITORES, S.A. Hernández Sampieri, R., Fernández
Collado, C., Baptista Lucio, M. (2014). Metodología de la investigación. México D.F.:
McGRAW-HILL
Muñoz, V. M. V., & de Biología Celular, U. de C. (chile) F. de C. B. D. (2011). Análisis de
transcriptoma en tejido reproductivo mediante secuenciación masiva: abalón rojo (Haliotis
rufescens) como modelo de estudio.
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
83
Monroy, “. d. (s.f.). El carbon. I.E.S departamento de tecnología.
Montesinos, R. (Julio de 2017). Remediosnaturales.es. Obtenido de El esalobon perdido entre
la nutrición y el ser humano: http://www.remediosnaturales.es/wp-
content/uploads/2014/07/acidos-humicos-fulvicos.pdf
Mosquera , C. S., Bravo, I., & Hansen, W. E. (2007). COMPORTAMIENTO ESTRUCTURAL
DE LOS ÁCIDOS HÚMICOS OBTENIDOS DE UN SUELO ANDISOL DEL
DEPARTAMENTO DEL CAUCA. REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA, 36(1), 31 - 41.
NEV. (n.d.). Retrieved July 17, 2018, from
https://dominicana.nuevaescuelavirtual.com/contenido_el2/L_18090_ei/?p=10
Peña, S. A. (2010). ESTUDIO MOLECULAR DE LOS FACTORES DE VIRULENCIA Y DE LA
RESISTENCIA A CLARITROMICINA EN LA INFECCIÓN POR Helicobacter pylory. Madrid,
España: Tesis Doctoral.
Peña-Méndez, E. M., Havel, J., & Patočka, J. (2005). Humic substances ñ compounds of still
unknown structure: applications in agriculture, industry, environment, and biomedicine.
Applied biomedicine, 3, 13-24.
Posse, R. A., Toledo, R., & Cabral, M. L. (2006). HELICOBACTER PYLORI: Clínica,
Diagnóstico y Tratamiento. Revista de Posgrado de la VIa Cátedra de Medicina, 9-12.
Postek, M. T. (1980). SCANNING ELECTRON MICROSCOPY A STUDENTS HANDBOOK.
Power, M. H., Zamora, O. R., & Rodríguez, B. L. (17 de Noviembre de 2008). The resistance to
antibiotics in Helicobacter pylori. Ciudad de La Habana, Cuba: Centro Nacional de
Investigaciones Científicas.
Puigdengolas, X., Cuberas, A., & Mascort, J. (2011). Helicobacter pylori: detección, tratamiento
y valoración de la erradicación. Barcelona, España: FMC.
Regino, W. O., Trespalacios, A. A., & Otero, E. (2009). Helicobacter pylori: Current treatment
An important challenge for gastroenterology. Revista Colombiana de Gastroenterologia,
279-292.
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
84
Rivas-Traverso, F., & Hernández, F. (2000). Helicobacter pylori: Factores de virulencia,
patología y diagnóstico. Rev Biomed, 187-205.
RODRÍGUEZ CUBILLOS AE, PERLAZA JIMÉNEZ L, BERNAL GIRALDO AJ. (2014)
Analizando datos de RNA-Seq en procariotas: una revisión para no expertos. Acta biol.
Colomb.;19(2):131-142.
Rodríguez Neave, F. (s.f.). Intagri. Obtenido de Sustancias Húmicas: Origen, Caracterización
Y Uso En La Agricultura: https://www.intagri.com/articulos/nutricion-vegetal/acidos-
humicos-fulvicos-nutricion-vegetal
Salazar Montes, A., Sandoval Rodriguez, A., Armendáriz Borunda, J. (2013). Biología
molecular, Fundamentos y aplicaciones en las ciencias de la salud. México, D. F: McGRAW-
HILL INTERAMERICANA EDITORES, S.A.
Sandoval-Pineda, J., Ochoa-Corona, F., Torres-Rojas, E. (2017). Evaluación de diferentes
métodos de extracción de ARN a partir del hongo nativo Xylaria sp. Rev. Colomb. Biotecnol,
19(1), 42-54.
Sánchez, J. S. (Junio de 2006). Resistencia a antibióticos. Revista Latinoamericana de
microbiología, 105-112.
Sandra. (s.f.). Sandrasnew. Obtenido de http://www.sandranews.com/beneficios-de-acidos-
humicos/
Shapiro HM. Practical Flow Cytometry. New York. John Wiley & Sons Inc. 2003. 4th Edition.
Sharma, C. M., & Pernitzsch, S. R. (2012). Transcriptome Complexity and Riboregulation in the
Human Pathogen Helicobacter pylori. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 2.
https://doi.org/10.3389/fcimb.2012.00014
Smith, M. A., Foley, H. C., & Lobo, R. F. (2004). A simple model describes the PDF of a non-
graphitizing carbon. Carbon, 42(10), 2041–2048.
Suraj P. Agarwal, Rajesh Khanna1 *, Ritesh Karmarkar, Md. Khalid Anwer and Roop K. Khar.
(13 de febrero del 2007). Shilajit: A Review. Wiley InterScience, 401–405.
Línea de Investigación en Carbones Universidad Distrital Francisco José de Caldas
85
Sussmann, O., Mattos, L., & Restrepo, A. (s.f.). Resistencia bacteriana. Obtenido de
http://blocs.xtec.cat/ferrerfrancesch/files/2009/06/002620resistencia.pdf
Tafur, J. D., Torres, J. A., & Villegas, M. V. (2008). Mechanisms of antibiotic resistance in Gram
negative bacteria. ASOCIACIÓN COLOMBIANA DE INFECTOLOGÍA, 223-233.
TONDA, J. (s.f.). EL ORO SOLAR Y OTRAS FUENTES DE ENERGÍA. Recuperado el 14 de
10 de 2017, de LA ENERGÍA DEL CARBÓN: 300 MILLONES DE AÑOS:
http://bibliotecadigital.ilce.edu.mx/sites/ciencia/volumen3/ciencia3/119/htm/sec_11.htm
Transcriptoma. (n.d.). Retrieved June 18, 2018, from
https://www.genome.gov/27562853/transcriptoma/
Torres, C. (s.f.). Beneficios del ácido húmico. Recuperado el 21 de 09 de 2017, de
https://www.vix.com/es/imj/salud/5649/beneficios-del-acido-humico
Trigoso. C. PRUEBAS DE SENSIBILIDAD Y RESISTENCIA ANTIMICROBIANA.
Valledor, L. (n.d.). Transcriptómica y Proteómica. Retrieved Octubre 27 del 2018, from
http://www.valledor.info/wp-content/uploads/2013/12/Transcriptomica2013.pdf