บทปฏบตการท 7

การตรวจวนจฉยโรคปลาทเกดจากแบคทเรย

โดย

1.นางสาวเจนจรา คาโส รหส 5010101313 สาขา การประมง 4 ป

2.นางสาวนภาพร ศรพอ รหส 5010101336 สาขาการประมง 4 ป

3.นายนฤนาท สำาเภาทอง รหส 5010101337 สาขาการประมง 4 ป

4.นางสาวนตยา เหมลา รหส 5010101340 สาขา การประมง 4 ป

5.นายปฐพงษ เชอมแกว รหส 5010101343 สาขาการประมง 4 ป

กลมเรยนวนองคาร กลมท 1

รายงานนเปนสวนหนงของวชาโรคปลา (ชป 352)

ภาคเรยนท 1 ปการศกษา 2553

มหาวทยาลยแมโจ

บทนำา

แบคทเรยหลายชนดอาศยอยในแหลงนำา ดนกนบอ บนและในตวสตวนำา แตมเพยงบางชนดเทานนทกอใหเกดโรคสตวนำา เพราะฉะนนการแยกเชอจนไดเชอแบคทเรยบรสทธ โดยไมมการปนเป อนเปนสงสำาคญทควรฝกหด เพอใหการวนจฉยโรคเปนไปอยางถกตอง ขอยำาเตอนวา การตรวจวนจฉยโรคจะตองทำาควบคไปกบการสอบถามขอมลเกยวกบการเลยง คณสมบตของนำาในแหลงเลยง อาการของโรค ตรวจอยางปลาทนำามาตรวจสอบแบคทเรยจะตองเปนปลาทปวยและยงมชวตอย

ตรวจเอกสาร

เทคนคทใชในการแยกเชอบรสทธวธ Streak-Plate Technique

การแยกเชอใหบรสทธเปนเทคนคพนฐานทางจลชววทยาทมความสำาคญอยางมาก เนองจากสงแวดลอมตางๆ เชน นำา อากาศ พนหองเรยน หรอแมแตรางกายของคนกมเชอจลนทรยอยหลายชนดทอาจปนเป อนในหลอดเพาะเชอได หลกการของการแยกเชอใหบรสทธบนอาหารเลยงเชอ (culture medium) คอจะตองแยกเชอใหไดโคโลนเดยวๆ (single colony) จำานวนมาก จากนนจงนำาเชอทเปนโคโลนเดยวไปศกษารปรางลกษณะ และคณสมบตตางๆ เพอใหทราบวาเปนเชอชนดใด เทคนคทนยมใชในการแยกเชอบรสทธคอวธ cross streak plate ซงทำาไดโดยใชหวงเขยเชอ (loop) แตะตวอยางหรอสงสงตรวจแลวลากหรอขด (streak)ลงบนจานเพาะเชอทมอาหารแขง (agar plate) อยใหไดแนวระนาบตดตอกน 4-5 เสน หลงจากเสรจในระนาบแรกซงมเชอจลนทรยอยหนาแนนทสด ใหนำาหวงเขยเชอมาเผาไฟใหลวดทปลายรอนแดงเพอฆาเชอทตดใหหมด จากนนจงขดเชอจากสวนของรอยลากในระนาบแรกออกมาเพยงหนงครงแลวลากเปนระนาบทสอง 4-5เสนตดกนโดยรอยขดของ

เชอจะไมทบกบระนาบแรกอก หลงจากนนกทำาเชนเดยวกนกบระนาบทสองจนครบทวทงจานเพาะเชอซงมประมาณสระนาบ (ภาพ ) เมอไดเชอบรสทธแลวจะมการศกษาเชอตอไปในดานตางๆ ซงจะตองมการถายเชอจากอาหารเดมไปยงอาหารใหม หรอมการเพาะเชอลงในอาหารเพอการทดสอบและการวเคราะหตางๆ ดงนนการเรยนรเทคนคทถกตองในการถายเชอจงมความสำาคญเปนอยางยงซงตองอาศยหลกการของ aseptic technique เพอปองกนการปนเป อนของเชอชนดอนซงจะทำาใหผลการทดลองผดพลาดไดอปกรณพนฐานทใชในการถายเชอคอ หวงเขยเชอ เขมเขยเชอ (needle) และตะเกยงอลกอฮอลสำาหรบใชฆาเชอโดยการเผา (incineration) การถายเชอจลนทรยพวกแบคทเรยและยสตจะใชหวงเขยเชอเปนสวนใหญ มบางครงทใชเขมเขยเชอปลายตรง สวนเชอราทเปนเสนสาย (filamentous fungi) มกจะใชเขมเขยปลายงอ

การแยกเชอดวยวธ cross streak plate

การทำาใหเชอบรสทธดวยเทคนค Streak plate

1. ใชลบเขยเชอ (Loop) เขยเอาเชอออกจากหลอดทมเชอดวยเทคนคปลอดเชอ (Aseptic technique)

2. แลวทำาการ Streak เชอทอยปลาย loop ลงบนจานเพาะเชอทมอาหารเลยงเชอทไดเตรยมไวแลว ดวยความระมดระวง ซงมขนตอนดงน

- เปดฝาจานเพาะเชอใหมชองวางเพยงพอทจะสอด loop เขาไปไดงาย ดงแสดงในภาพ (ก) แลวสอด Loop ทมเชอแบคทเรยอยทำาการ streak ทพนทหมายเลข 1 โดยในระหวางการ streak จะตองไมทำาใหผวของอาหารแตก

- เมอ streak ทบรเวณพนทหมายเลข 1 แลวใหนำา Loop ออกมาฆาเชอโดยการเผาไฟ หลงจากนนทำาให loop เยนลงโดยการแตะทขอบของอาหารเลยงเชอใกลๆ กบบรเวณหมายเลข 1

- หมนจานเพาะเชอใหอยในตำาแหนงทเหมาะสมสำาหรบการ streak บรเวณพนทหมายเลข 2 แลวทำาการ cross streak โดยจดเรมตนจะอยทบรเวณพนทหมายเลข 1 แลวทำาการ Streak ทบรเวณพนทหมายเลข 2 ดงภาพ (ข)

- เมอ streak ทบรเวณพนทหมายเลข 2 แลวใหนำา Loop ออกมาฆาเชอโดยการเผาไฟ หลงจากนนทำาให loop เยนลงโดยการแตะทขอบของอาหารเลยงเชอใกลๆ กบบรเวณหมายเลข 2

- หมนจานเพาะเชอใหอยในตำาแหนงทเหมาะสมสำาหรบการ streak บรเวณพนทหมายเลข 3 แลวทำาการ cross streak โดยจดเรมตนจะอยทบรเวณพนทหมายเลข 2 แลวทำาการ Streak ทบรเวณพนทหมายเลข 3 ดงภาพ (ข) ถาหากจำาเปนสามารถทำาการ streak ทบรเวณพนทหมายเลข 4 ได

- กลบจานเพาะเชอแลวนำาไปบมในตบมเชอควบคมอณหภม 37 องศา

เซลเซยส นาน 24-48 ชวโมงแลวสงเกตการเจรญของเชอ

ขนตอนการทำาเชอบรสทธดวยเทคนค Streak plate

ทมา: Prescott (2002)

ลกษณะโคโลนของแบคทเรยทเจรญบนอาหารแขงและคำา (Key word) ทใชในการอธบายลกษณะ

โคโลน ทมา: Prescott (2002)

ก

ง

ข ค

การทดสอบคณสมบตทางชวเคมของแบคทเรย

1.Catalase test หลกการ

ทดสอบความสามารถในการสราง enzyme catalase ซงแบคทเรยสรางขนมาเพอยอยสลาย H2O2 ซงเปนอนตรายตอเซลล การใชงาน- 3% H2O2 ใชแยก Staphylococcus ซงใหผลการทดสอบ catalase positive ออกจาก Streptococcus ซงใหผลการทดสอบ catalase negative- 30% H2O2 ใชแยก Neisseria gonorrhoeae ซงใหผลการทดสอบ catalase positive ออกจาก Neisseria meningitidis การทดสอบ 1. ใช loop เขยเชอแลวแตะลงบน slide ทสะอาด2. หยด H2O2 ลงบนเชอทอยบน slideการอานผลPositive : มฟองเกดขนทนทNegative : ไมมฟองเกดขน

2.Citrate test หลกการ

เพอจะทดสอบความสามารถของเชอในการใช citrate เปนแหลงคารบอนในขบวนการ metabolism ซงจะใหผลผลตทมสภาวะเปนดาง จะเปลยนส indicator เปนสนำาเงน สวนประกอบสำาคญของอาหารเลยงเชอ Simmons citrate medium- Sodium citrate- Bromthymol blue (เปน indicator)

วธเตรยม1. ชงอาหารตามฉลากขางกระปอง นำาไปตมจนละลายเปนเนอเดยวกน

2. บรรจ media ตามขอ 1. ลงในหลอดทมจกเกลยวปดประมาณ 2-3 ml.3.. นำาเขา Autoclave ท 121 ◦ c ความดน 10 ปอนด นาน 15 นาท4.นำามาวาง sant ใหผวหนา media เอยงวธทดสอบ Inoculate เชอโดย Streak เชอบนผว media แลว incubate ท 35-37 c 8-12 ชวโมงการอานผลpositive : มการเจรญของเชอทผว slant media เปลยนจาก สเขยวเปนสนำาเงนnegative : ไมมการเปลยนแปลง media ยงเปนสเขยว

3.TSI ( Triple sugar iron agar )การใชงาน         เปน Biochemical test ตวสำาคญทใชจำาแนก bacteria ในกลม Enterobacteriaceae และ Non fermentative gram negative bacteria โดยอาศยคณสมบต ของการ ferment นำาตาล glucose , lactose , sucrose ของเชอ ทำาใหไดกรดหรออาจใหกาซเปนผลผลตสดทาย และนอกจากนยงเปนการทดสอบความสามารถ ในการผลต H2S อกดวยหลกการ        TSI ประกอบดวยนำาตาล 3 ชนด คอ glucose 0.1 % , lactose 10 % , sucrose 10 % เมอ Inoculate เชอลงไปเชอท slant จะมปรมาณมากกวาบรเวณอน bacteria จะใชนำาตาล glucose หมดเรวกวา ถาเชอไมสามารถใช lactose และ sucose ไดจะหนไปใช protein ทมอยใน media แทน ทำาให slant มภาวะ เปนดาง เปลยน Phenal red เปนสแดง สวน bott นนมแบคทเรยทเจรญอยนอยกวา slant ภายใน 24 ชวโมงจะยงใช glucose ไมหมดจงมความเปนกรดอย

(เปลยนส phenal red เปนสเหลอง) ปฏกรยาจงเปน K/A ( Slant/Bott)- ถาเชอสามารถใชนำาตาลไดตงแต 2 ชนดขนไป จะทำาใหอาหารทงหลอดเปนสเหลอง ปฏกรยาจงเปน A/A - ถาเชอไมสามารถใชนำาตาลทง 3 ชนดไดเลย ปฏกรยาอาจเปน N/N , K/N , A/N ( N คอไมมการเปลยนแปลง )- ถาเชอใชนำาตาลแลวให gas แลว gas จะดนให media ยกตวขน หรอมรอยแยกของ media- ถาเชอสราง H2S จะทำาปฏกรยากบ Ferrous ion ทมอยใน media ได ferous sulfide ทำาใหเกดเปนตะกอนสดำาขนสวนประกอบ ( สำาหรบเตรยมเปนปรมาตรรวม 1000 ml.) - Polypeptone 20 g. - Lactose 10 g. - Sucrose 10 g.- Glucose 1 g.- Sodium Thiosulfate 2 g. - Ferric Ammonium Sulfate 0.2 g.- Sodium Chloride 5.0 g.- Agar 13.0 g. - Phenal Red 0.025 g. ( Final pH ~ 7.3+-0.2)วธเตรยม1. เตรยมสวนประกอบตางๆตามปรมาณทไดระบไวในรายละเอยดสวนประกอบ ถาเตรยมจาก media สำาเรจรปชง media ตามคำาแนะนำาของกระปอง2.ละลายดวย Distilled water นำาไปตมจนละลายเปนเนอเดยวกน 3. ใส media ประมาณ 2-3 ml. ลงในหลอดทมจกเกลยวปด ( ขนาด 13x100 mm.) แตไมควรปดจกเกลยวใหแนนควรใหมอากาศถายเทอยบางเพราะในกรณทเชอ ferment glucose ไดอยางเดยวถามอากาศอยบางจะเกด Alkaline slant ไดดกวา หรออาจใชจกสำาล

4. นำาเขา Autoclave ท 121 ำ c ความดน 10 ปอนด นาน 15 นาท5.นำามาวาง sant ใหผวหนา media เอยงการทดสอบเขยเชอลงบนผว slant ลกษณะ tail fish แลวแทง loop นนทะลลงไปถงกนหลอด แลว incubate ท 37 ำ C 8-24 ชวโมงการอานผล ( Slant / Butt )K/A = มการ ferment glucose เพยงตวเดยวK/K , K/N , N/N = ไม ferment ทง glucose , lactose และ sucrose A/A = ferment glucose , lactose และ/หรอ sucrose (ferment นำาตาลอยางนอย 2 ตว)A/A G,H2S = ferment glucose , lactose และ/หรอ sucrose ให gas และ H2SA/A G = ferment glucose , lactose และ/หรอ sucrose ให gasTSI สำาหรบ Non ferment bacteria         หลง incubate นาน 20-48 ชวโมงใหผลเปน K/N หรอ N/N ( Non ferment bacteria บาง species อาจเปลยนส slant เปนสเหลองหลง incubate นานกวา 24 ชวโมง เชน Burkholderia pseudomallei , Acinetobacter species บางสายพนธControlCitrobacter freundii = A/A G,H2SPseudomonas aeruginosa = K/KProvidencia rettgeri = K/A

4.Indole test

หลกการ

    เปนการทดสอบความสามารถของแบคทเรยในการผลต Indole จาก tryptophan โดยทอาหารเลยงเชอ Indole broth ประกอบดวย

Tryptophan rich peptone และ NaCl เมอ Tryptophan ใน peptone ถกออกซไดซโดยแบคทเรย ให indole , skatole และ indoleacetic acid (โดยเอนไซม tryptophanase) ซงสามารถตรวจสอบผลทไดจากการตรวจสอบ indole โดยใช alcoholic p-dimethylaminobenzaldehyde โดย indole จะทำาปฎกรยากบ aldehyde ใหผลผลตเปนสแดงในสวนทเปนแอลกอฮอล

     ปจจบนม reagent สองชนดทใชในการตรวจสอบ indole คอ Kovac' reagent และ Ehrlich's reagent แต Ehrlich's reagent มความไวมากกวาและใชในการทดสอบ Indole ทผลตไดจากแบคทเรยกลมแอนแอโรปส และกลมทเปน nonfermentative gram negative bacteria ได

การทดสอบ 1. เพาะเชอทตองการทดสอบลงใน Tryptophan broth บมไวท 37 C 18-24 ชวโมง2. อานผลโดยหยด Kovac' reagent ลงไป 5 หยดเขยาเบาๆ สงเกตสทเกดขน ถาใช Ehrlich's reagent ขนแรกหยดอเทอรลงไป 1 มลลลตรเขยาเบาๆ แลวหยด Ehrlich's reagent ลงไป 5 หยด อานผล

การอานผลPositive : สของ Reagent เปลยนเปนสแดงหรอสชมพ ( เกดเปนวงแหวนสแดงหรอสชมพ)Negative : สของ Reagent ไมเปลยนแปลง

5. Voges-Proskauer test (VP)

หลกการเปนการทดสอบควาสามารถของเชอ ในการให acetyl-methylcarbinol ( acetoin ) เปน end product จากการ ferment นำาตาล glucoseสงทตองใช1. MR-VP medium ( buffered peptone broth ทม glucose )2. 5 % alpha-naphthol solution3. 40 % sodium hydroxide solution หรอ potassium hydroxideวธทดสอบ1. Inoculate เชอทตองการทดสอบลงใน MR-VP medium2. Incubate ท 37 องศาเซลเซยส นานประมาณ 18-24 ชวโมง3. แบง broth ท incubate แลวลงใน tube ขนาดเลก4. หยด 5 % alpha-naphthol solution ( 0.6 ml. ตอ broth culture 2.5 ml. ) และ 40 % sodium hydroxide solution ( 0.2 ml. ตอ broth culture 2.5 ml. ) ลงไป5. เขยาเบาๆ ใหเขากนและเพอใหออกซเจนเขารวมในปฏกรยา ตงทงไว 10 – 15 นาท กอนอานผล6. หากพบวาไดผลลบให incubate broth ทยงไมไดหยด VP-reagents ตอไปอก 24-48 ชวโมง แลวทดสอบซำาจากขอ 3 – 5

การอานผลผลบวก broth เปลยนเปนสชมพแดงภายใน 10 – 15 นาทหลงจากเตม

VP-reagents สวนมากจะเกดสชมพแดงภายใน 3-5 นาทผลลบ ไมมสชมพหรอสแดงเกดขน

6. Methyl Red Test

หลกการ เปนการทดสอบความสามารถของเชอทจะผลตและรกษาความเปนกรดของอาหารเลยงเชอจากการใช glucose ไวใหม pH ตำากวา 4.4สงทตองใช1. MR-VP medium ( ซงเตรยมจาก buffered peptone broth ทม glucose 0.5 % )2. Methyl Red solution

วธทดสอบ1. Inoculate เชอทตองการทดสอบลงใน MR-VP medium 2. Incubate ท 37 องศาเซลเซยส นานประมาณ 18-24 ชวโมง3. แบง broth ท Incubate แลวลงใ tube ขนาดเลก4. เตม Methyl Red reagent ลงใน broth ใน tube เลกทแบงมา5. หากพบวาไดผลลบให incubate broth ทยงไมไดเตม methyl red reagent ตอไปอก 24-48 ชวโมง แลวทดสอบในขอ 3 และ 4 ใหม

7.Cytochrome Oxidase testหลกการ         Aerobic bacteria มกระบวนการ oxidative phosphorylation สำาหรบขบวนการหายใจและสรางพลงงานระหวางการเกดขบวนการน จะมการถายเทอเลกตรอนใหกบออกซเจนโดยผาน cycle ของการขนสงอเลคตรอน ซงจะอาศยการทำางานของ Cytochrome ตางๆ Oxidase test นเปน การทดสอบหา C

oxidase ของเชอแบคทเรย ซงจะไป oxidize สารเคมทำาใหเกดสารประกอบสมวง

นำายา 1. Kovac' s oxidase reagent ( 1% tetramethyl- p-phenylenediamine dihydrochloride) 2. กระดาษกรองวธทดสอบ1. เตรยมสารละลาย 1% tetramethyl- p-phenylenediamine dihydrochloride ในนำาเกลอท sterile แลวหยดลงบนกระดาษกรอง2. platinum loop หรอแทงแกวเขยเชอมาขดลงบนกระดาษกรองทเตรยมไว ( ไมควรใช loop ททำาจากเหลกและนโครมเพราะจะทำาใหเกดผลบวกปลอมได

การอานผลPositive : กระดาษกรองบรเวณทขดเชอลงไปเปลยนเปนสนำาเงนภายใน 10 วนาทNegative: ไมเกดการเปลยนแปลงControlPositive : Pseudomonas aeruginosaNegative : E. coli

8.API 20 E

เปนชดวนจฉยแบคทเรยสำาเรจรปเชงพาณชยทนำาเขาจากตางประเทศ ใชแยกชนดแบคทเรยกลม Enterobacteriaceae และแกรมลบอนๆ แบคทเรยจะตองไมเจรญชาหรอตองการอาหารชนดพเศษ (fastidious) ประกอบดวยสารตงตนหรออาหารแหง (dehydrated substrate) จำานวน 20 กระเปาะเลกๆ สำาหรบตรวจสอบปฏกรยาของ

เอนไซมทแบคทเรยผลตและความสามารถในการใชนำาตาลชนดตางๆ ชดทดสอบนไมไดใชสำาหรบการตรวจสอบโดยตรงจากสตวทปวยเชอแบคทเรยตองมการแยกเชอบรสทธกอน

วธการทดสอบ

1. เตมนำากลนลงในกลองพลาสตกอบเชอ (incubation box)2. เขยเชอแบคทเรยทแยกบรสทธแลวลงในหลอดทดลองทมนำาเกลอ

0.85% ทฆาเชอแลวจำานวน 5 ml ใหไดความขนทพอเหมาะ3. ใช ปเปต เลกดดสารละลายแบคทเรย ลงในกระเปาะ

เตมทกหลอดเฉพาะในสวนหลอดกระเปาะปด (tube) กอนหลอดทขดเสนใตใหเตม mineral oil ปดทบในสวน cupuleหลอดทตวอกษรอยในกลองใหเตมแบคทเรยทงในสวนทเปนหลอดปดและสวน cupule

4. บม (incubate) ท 30 ◦c นาน 18-24 ชวโมง5. ตรวจผลของ API 20 E

บทปฏบตการท 7การตรวจวนจฉยโรคปลาทเกดจากแบคทเรย

จดประสงคของการศกษานเพอใหนกศกษาสามารถแยกเชอแบคทเรยจากปลาทเปนโรค สงเกตลกษณะของโคโลนของเชอททำาใหเกดโรคสตวนำาและลกษณะรปราง รวมทงการใชเทคนคทางชวเคมพนฐานทเกยวของกบการแยกเชอ (Identification) เชอโรคทกอใหเกดโรคปลาวธการ

1. ทำาความสะอาดพนทททำางานดวยแอลกอฮอล 70 %2. ทำาใหปลาสลบโดยใชเขมเขยเจาะบรเวณสมองหรอใชมดตดเสน

ประสาทไขสนหลง หรอใชยาสลบเกนขนาด3. สงเกตลกษณะผดปกตภายนอกของปลาทเปนโรค เชน แผล ฝ การ

อกเสบ ลกษณะการตกเลอด การบวมนำา การหกกรอนของครบ ลกษณะสของลำาตว

4. ใชเอธานอล 70% เชดบรเวณทองดานททำาการผาตด เพอไมใหมการปนเป อนกบแบคทเรยทอยบรเวณภายนอกหรอในแหลงนำา จากนนใชปากคบและกรรไกรผาตดจมแอลกอฮอลแลวลนไฟเพอฆาเชอ

ทำาการผาทองปลาอยางระมดระวง อยาใหโดนอวยวะภายในฉกขาด เพอหลกเลยงการปนเป อนของเชอแบคทเรยจากแหลงอน

5. สงเกตลกษณะของตบ ไต มาม ลำาไส แลวใชหลปเขยเชอเผาไฟจนรอนแดงเพอฆาเชอ ทงใหเยนจงทำาการแยกเชอจากปลาโดยใชหลปจมไปบรเวณไตสวนหลง เนองจากไต ทำาหนาทกรองของเสยจากสวนตางๆ ของรางกายออกจากเลอด จงเปนอวยวะทเหมาะสมสำาหรบการแยกเชอแบคทเรย นำาไปเขยเชอบนอาหารวนสำาหรบเลยงเชอแบคทเรย N/A (nutrient agar),BHI(Brain Heart Infusion) หรอ TSA โดยอาหารทใชตองไมมนำาอยบนผวอาหาร อาจแยกเชอจากมามดวย

6. บนทกราบละเอยดเกยวกบชนดของปลา แหลงทมา อวยวะทแยกเชอ วนทแยกเชอและเชอผเพาะเชอ พรอมขอมลอนๆ ในสมดบนทก

7. อบอาหารเลยงเชอท 26-30 ◦c นาน 16-24 ชวโมง ลกษณะของโคโลนของเชอตางๆ บนอาหารวน บนทกขนาด ความนนของโคโลน ลกษณะขอบ ส หากมเชอแบคทเรยมากกวาหนงชนดใหแยกเชอจนกวาไดเชอแบคทเรยบรสทธบนอาหารวนแขง

8. เมอไดเชอบรสทธจงยอมสผนงเซลลแบคทเรย (gram stain) และสงเกตรปราง

9. ตรวจ catalase test , cytochrome oxidase แลวนำาแบคทเรยไปทดสอบคณสมบตทางชวเคมตอไป

การแยกเชอแบคทเรยบรสทธ

1. นำาเชอแบคทเรยทไดมาทำาการแยกเชอใหบรสทธ 2. นำาเชอแบคทเรยทได มาทำาการเกลยในอาหารวน โดยใชเขมจมทเชอ

แลวนำาไปเกลยบนอาหารวน ซงตองเกลยใหทวอาหารวน

3. ใชเขมลนไฟ ทงใหเยนแลวไปจมทเชอแบคทเรย นำาไปเกลยบนอาหารวน จากนนนำาเขมไปลนไฟอก ทงใหเยน แลวใชเขมเกลยเชอตอจากเชอครงแรก นำาเขมไปลนไฟอก ทงใหเยน นำาเขมไปเกลยเชอตออก เพอทำาการเจอจางเชอ ไมใหเชอมมากเกนไป

4. จากนนนำาเชอทได ไปยอมแกรมตอไป

วธการยอมแกรม

1. ทำาความสะอาดแผนสไลดและเชดใหแหง2. หยดนำากลนหยดเลกๆ ลงบนแผนสไลดทสะอาด3. ลนไฟเขมเขยเชอรปวงกลมหรอหลปใหรอนแดง ทงใหเยน แลวเขย

เชอแบคทเรยบรสทธปรมาณเลกนอย นำาไปเกลยบนหยดนำาบนสไลด ละเลงใหเปนแผนบางๆ ลนลวดเขยเชอจนรอนแดงอกครงเพอทำาลายเชอแบคทเรยทเหลอบนปลายหลป

4. หลงจากสไลดแหงสนทแลว นำาสไลดผานเหนอเปลวไฟ 2-3 ครง การผานเปลวไฟเปนการดงนำาอออกจากเซลลแบคทเรย เพอใหเซลลแบคทเรยตดแนนกบสไลด ทดสอบดวาอนโดยแตะบนหลงมอ

5. ทงใหเยน จากนนจงยอมสโดยการหยด crystal violet ลงบนเชอแบคทเรยทเกลยไวแลวใหทวมทงไวประมาณ 20 วนาท จงลางออกโดยการใหนำาประปาไหลผานเบาๆ

6. หยด iodine ลงบนสไลด ทงไว 60 วนาท จงลางออกดวย decolorizer ( acetone/alcohol) เปนเวลา 10-15 วนาท ลางออกดวยนำาสะอาดทนท

7. ยอมทบ (counter stain) โดยการหยด safranin ทงไว 20 วนาท

8. ลางออกดวยนำา วางเอยงไวใหแหง9. นำาไปสองดภายใตกลองจลทรรศน (x100) บนทกการตดส รปราง

และขนาดของแบคทเรย

ตรวจ catalase test , cytochrome oxidase แลวนำาแบคทเรยไปทดสอบคณสมบตทางชวเคม เชน Citrate test , TSI (Triple Sugar Iron Agar Slant), Indon test, MR (Methyl Red Test) , VP (Voges – Proskauer Test) และ API 20 E

ผลการทดลอง

จากการทดลองพบวาปลานลทนำามาทดลองตรวจวนจฉยโรคปลาซงเอาเชอแบคทเรยไดจาก ตบ ไต มาม และสมองปลานล โดยเราไดนำาเอาแบคทเรยทไดจากสมองปลานลมาแยกเชอแบคทเรยใหไดเชอบรสทธแลวนำาเชอทไดไปทดสอบคณสมบตทางเคมดงน

ลกษณะโคโลน

- ลกษณะโคโลนมสขาวขน form จะเปนแบบ Punctiform ความนนจะมลกษณะทโคงนนขมมาเลกนอย และขอบของโคโลนมลกษณะกลมไมครคระ

ลกษณะรปรางของแบคทเรยหลงจากการยอมสแบบแกรม

- โครงสรางทางเคมของเซลลแบคทเรย ยอมตดสมวง/นำาเงน ของ Crystal violet ซงเปนแบคทเรยแกรม บวก

- ลกษณะของเซลลแบคทเรยมลกษณะรปรางกลมเปนค หรอตอกนเปนสายโซทมความยาวตางๆ กน

การทดสอบการสรางเอนไซมแคตตาเลส ( catalase test )

มฟองเกดขนทนท มการสรางฟอง O2 แสดงวา แบคทเรยสรางเอนไซมแคตาแลส ผลเปนลบ ( Positive)

การทดลอง ไซโตโครมออกซเดส ( Cytochrome Oxidase Test )

กระดาษกรองบรเวณทขดเชอลงไปไมเปลยนแปลง ไมมส ผลของการทดลองไซโตโครมออกซเดส ( Cytochrome Oxidase Test ) จงเปน ลบ

      

การทดลองการใชซเตรท ( Citrate test)

แบคทเรยไมเจรญในอาหารเลยงเชอ และอาหารเลยงเชอไมมการเปลยนส ผลเปนลบ ( negative ) : ไมมการเปลยนแปลง media ยงเปนสเขยวอย

TSI (Triple Sugar Iron Agar Slant)

อาหารในหลอดเมอใสเชอลงไป เปนเวลา 24 ชวโมง อาหารไมมการเปลยนแปลง แสดงวา แบคทเรยไมใชนำาตาลตวใดเลย ( K/K) และไมมฟองอากาศตดอยในอาหาร

Indon testเมอหยด Kovac' reagent ลงไป 5 หยดเขยาเบาๆ ใน

Tryptophan broth ทบมไวท 37 C 18-24 ชวโมงผลทอานได เปน ลบ ( Negative ) : สของ Reagent ไมเปลยนแปลง

MR (Methyl Red Test)

เมอหยด Methyl red ลงไป 1 หยด ใน เชอแบคทเรยในอาหารเหลว MR-VP 0.5 มล . บมท 37 ◦C นาน 24 ชวโมง ผลทอาน ลบ จะไดสารละลายสเหลองหรอสสม

VP (Voges – Proskauer Test)

เมอเตม 0.6 มล. ของ 5% - narphthol solution แลวเตม 0.2 มล. ของ 40% KOH ในอาหารเหลว MR-VP 0.6 มล . บมท 35 ◦C นาน 24 ชวโมง เขยาใหเขากน ผลทอานได คอ ไมมการเปลยนแปลงสารละลาย แสดงวา ผลเปน ลบ

API 20 E

หมายเหต ไมสามารถตรจสอบหาขอมลเชอได

วจารณผลการทดลอง

- จากผลการทดลองพบวาในสมองปลานลเชอทพบเปนเชอแกรมบวก มรปรางของเชอ ลกษณะของเซลลแบคทเรยมลกษณะรปรางกลมเปนค หรอตอกนเปนสายโซทมความยาวตางๆ กน การคดเลอกเชอทใหผลลบตอการทดสอบ catalase, oxidase ซงสนนฐานวาเปนเชอ Streptococcus ซงสอดคลองกบการทดลองของ Petcharat Sakdinun ทมขอมลวา เชอ Streptococcus เชอแกรมบวก catalase, oxidase เปนผล ลบ

เอกสารอางอง

เทคนคการแพทย . Catalase test . เขาถงไดท : http://www.medtechzone.comTechno In Home. เขาถงไดท : http://www.technoinhome.comชนกนต จตมนส. โรคปลานล.คณะเทคโนโลยการประมงและทรพยากรทาง

นำา มหาวทยาลยแมโจ.

อภญญา จนทรวฒนะ. เทคนคพนฐานทางจลชววทยา (521302 Agro-Industry Microbiology Laboratory)