Location: Morel Lab

Background TW is a diatom with a hard outer shell consisting of glass‐like siliconDi    i l d i   h  fi i   f   l   i   Diatoms are involved in the fixation of a large portion of the world’s CO2

Evidence has suggested that TW specifically use both the C3 and C4 pathway for carbon fixationI   h  C   h   h   ld    b   In the C3 pathway, they would concentrate carbon dioxide in the chloroplasts using carbonic anhydrases

In the C4 pathway  they would create the intermediate  In the C4 pathway, they would create the intermediate product malate

http://arjournals.annualreviews.org/doi/full/10.1146/annurev.arplant.50.1.539

Why are we interested in theWhy are we interested in the chloroplasts? Past research has established that TW uses the enzyme TWCA, and more recently, CDCA  as carbon concentrating mechanismsconcentrating mechanisms

However, we are not sure about the localization, amount and type of carbonic anhydrase enzymes that amount and type of carbonic anhydrase enzymes that might be in the chloroplasts

The evidence of CA in the chloroplast would point more towards a carbon concentrating mechanism using CA rather than the C4 pathwayusing CA rather than the C4 pathway

However, if there is a lack of substantial CA in the chloroplasts  then this would point more towards the chloroplasts, then this would point more towards the C4 pathway

(Roberts et al., C3 and C4 Pathways of Photosynthetic Carbon Assimilation in Marine Diatoms, 2007)

Environmental Implications This gives us important clues on how some of the most important organisms in the ocean are involved in the fixation of CO2fixation of CO2 Understanding this process will help us better find solutions to the increasing atmospheric CO2 g pconcentration due to global warming

In the month of July, atmospheric CO2 concentrations   t  8    ( 6 8 i     % i )   ith were at 387 ppm (276.8 in 1744‐ a 40% increase), with 

models showing concentrations in the 450 ppm range in 2050

Approach To isolate the chloroplasts‐

1) Break open shells with just enough force so that it d   t d t  th   lldoes not destroy the organelles

2) Isolate chloroplasts on a gradient 

Experiments We first tried the method by Mason et al.,  in the case of Chlamydomonas reinhardtii We modified the protocol to instead use 30 seconds of sonication

We observed the 20/45/65 Percoll gradient  and collected the  We observed the 20/45/65 Percoll gradient, and collected the layer at the 20/45 interface Very few broken cells, and those that were broken were torn 

tapart

More Experiments Syringe and needle method‐

Both 26 and 27 gauge needles usedl h d b k ll Conclusion‐ not enough pressure created to break open cells

And Mored o e

Glass beads Both 0.1 mm and 0.5 mm glass beads used in an attempt t  t     llto tear open cells Too much debris and beads may either be too rough or too gentle on the cell

Polytron HomogenizerA  l     i   f h i i   i h    At least 3 minutes of homogenization with no significant cell breakage

Sonication Attempted sonication at different lengths

General Conclusion‐S i i  d      i   hl l Sonication does not preserve intact chloroplasts

More Experiments‐ A whole assortment of various techniques that I attempted

Conclusions Problems‐

We do not know exactly what the chloroplasts look like, so even if we do isolate them, we may not know what we are looking at

We must try more methods of breaking open the cells  We must try more methods of breaking open the cells while preserving chloroplasts

Once we observe a large amount of cell breakage with intact chloroplasts, we must work on a procedure to isolate the chloroplasts

The Future French Pressure Cell‐ Exact pressure created to break open the cells

Immunofluorescence staining with CDCA antibody to localize the enzyme, if any, in the chloroplasts

A follow‐up experiment of measuring CA activity in TW under low (7.7), medium (8.1) and high (8.5) pH conditionsconditions Preliminary Results

Summary of Overall Experience