Kompleksimoodustumise kineetika

0 5 10 15 20

0

5

10

15

20

25

Aeg (min)

0 5 10 15 20

0

5

10

15

20

25

Aeg (min)0 5 10 15 20

0

5

10

15

20

25

Ko

nts

entr

atsi

oo

n (

nM

)

Ko

nts

entr

atsi

oo

n (

nM

)

Kompleksimoodustumine võib toimuda väga erineva kiirusega

Mõlema interaktsiooni Kd väärtus (afiinsus) on sama 7.5 nM, kuid kineetika erinev.

[P]

[PL2][PL1]

[P]

[L1] [L2]

Interaktsiooni koordinaat

Energia

kompleksimoodustumise aktivatsiooni vabaenergia muutus, määrab protsessi kiiruse

kompleksimoodustumise vabaenergia muutus, määrab protsessi võimalikkuse

Massitoimeseadus järgi on reaktsiooni kiirus on igal ajahetkel võrdeline lähteainete

kontsentratsioonide korrutisega vastavates stöhhiomeetriliste kordajate astmetes :

v=k[A]a[B] b

aA + bB cC + dD

See kehtib ka mittekovalentsete komplekside tekkimise ja lagunemise kiiiruse jaoks

Reaktsiooni (interaktsiooni) molekulaarsus – samaaegselt omavahel interakteeruvate molekulide arv.

A → C v = k[A] monomolekulaarne

A + B → C + D v = k[A][B] bimolekulaarne

Reaktsiooni/interaktsiooni järk ja kiiruskonstandid

-dc/dt = k0c0 = k0 0. järku reaktsioon, reaktsiooni kiirus ei sõltu lähteaine kontsentratsioonist

-dc/dt = k1c1 = k1c I järku reaktsioon, reaktsiooni kiirus on

võrdeline lähteaine algkontsentratsiooniga

-dc/dt = k2c2 II järku reaktsioon, reaktsiooni kiirus on võrdeline

substraadi algkontsentratsiooni ruuduga

k0 , k1 ja k2 - vastavate reaktsioonide kiiruskonstandid

Reaktsiooni järk näitab, kuidas sõltub reaktsiooni kiirus reageerivate

ainete kontsentratsioonidest

Kineetilised võrrandid

Aeg (s)

Kon

tsen

trat

sio

on

(M

)

Reaktsiooni kiiruse määramine

Keskmine kiirus ajavahemikus t

𝑣 = −[𝐶]

𝑡

𝑣 = −𝑑[𝐶]

𝑑𝑡= tan α

Hetkkiirus ajamomendil t2

Selleks peab olema meetod, mis võimaldab jälgida vähemalt ühe interaktsioonis või reaktsioonisosaleva ühendi kontsentratsiooni muutumist aja jooksul

Esimest järku protsess on monomeerse valgu denaturatsioon

+

Teist järku protsess on dimeeri moodustumine kahest monomeerist

d P

[P]= - kdt

𝑃0

[𝑃]d P

[P]=

0

𝑡

𝑘𝑑𝑡

P = P 0 e-k’t

P + L PL𝑑 PL

𝑑𝑡= kass P L - kdiss PL

5beZsF&@OG1) [L]=[L]0=konstant, seega ka kass L =konstant, mille tähistame tähega k’ ehk k’=kass [L]2) kui kdiss on väga väike, siis kdiss[PL] on ka väike võrreldes k’ P

𝑑 PL

𝑑𝑡= k P või

PL = P 0− P 0 e-k’t

Kompleksimoodustumise kineetika kui [L]0>>[P]0 ja kdiss on väga väike(pseudo-esimest järku tingimused)

−d P

dt= k[P]

Varieerides ligandi kontsentratsiooni [L] on võimalik leida k väärtus

P + L PL𝑑 PL

𝑑𝑡= kass P L - kdiss PL

[L]≈[L]0=konstant, seega ka kass L =konstant, mille tähistame tähega k’ ehk k’=kass [L]

Kompleksimoodustumise kineetika kui [L]0>>[P]0, kuid assotsiatsioon ja dissotsiatsioon toimuvad võrreldava kiirusega

d PL

dt= k’ P - kdiss PL

Tasakaalu saabudes k’ P t = kdiss PL t , kus P t ja PL t on tasakaalulised kontsentratsioonid.

Viies läbi teisendused saame:d PL

dt=(kdiss + k’) ([PL]t-[PL]), mille intergreerimine annab: ln

PLt

PLt−[PL]

= (kdiss + k’)t

Sellee võrrandi vasakpoolne avaldis on võrdeliselt sõltuv ajast t. Vastava sirge tõus on kdiss + k’ . Varieerides [L], hoides selle samal ajal [L]≫ [𝑃]0, saab leida nii kass ja kdiss väärtuse.

Interaktsioonide kiiruskonstantide määramine

Aeglaste reaktsioonide korral, kui tekib stabiilne kompleks, saab kasutada kromatograafiat ja

massispektromeetriat. Ajahetkel t võetakse proov, milles määratakse kompleksi kontsentratsioon.

Pidevalt saab komplekside moodustumist jälgida kasutades fluorestsents-spektrofotomeetriat,

tuumamagnetresonantsi spektromeetriat, pinnaplasmonite resonantsi, termoforeesi.

Kiirete interaktsioonide probleem - kuidas tagada ainete piisavalt kiire segamine ning kineetiliste

kõverate piisavalt kiire registreerimine.

Kiirete interaktsioonide jälgimiseks sobib pinnaplasmonite resonants ja peatatud joa meetod

Peatatud joa meetod (stopped flow technique)

Mõeldud kiirete interaktsioonide uurimiseks

Süstaldes on reageerivad/interakteeruvad ained,mis viiakse voolus väga kiiresti segajasse (mixer) ja sealt edasimõõterakku (observation chamber). Siis vool peatataksekolmanda süstlaga(stopping syringe). Mõõterakus toimuvate protsesside jälgimiseks määratakse optilist tihedust ja/võifluorestsentsi intensiivsuse muutust. Segajast mõõterakku viimiseks kulub 1- 2 ms.

Meetod eeldab, et kompleksi tekkimise või reaktsiooniga kaasneb optilise tiheduse või fluorestsentsi muutus.

Võimaldab interakteeruvate ühendite kiire segamise ning kineetilise kõvera kiire registreerimise

Kiiruskonstandid

Assotsiatsiooni kiiruskonstant

kass

Dissotsiatsiooni kiiruskonstant

kdiss

Definitsioon

kass

P+ L PLkdiss

PL P + L

Ühik [M-1s-1] [s-1]

Kirjeldab või iseloomustab Näitab, kui suure

tõenäosusega kompleks tekib.

Iseloomustab kompleksi

stabiilsust. Näitab, milline osa

kompleksist dissotseerub ühe

sekundi jooksul.

Väärtuste vahemik 1x10-3 – 1x107 1x10-1 – 5x10-6

Valk/valk interaktsioonide assotsiatsiooni kiiruskonstantide väärtused

10. november - loeng

17. november - loeng, praktikum esimene rühm 6-7 inimest, algus 12.30 ruum 332

24. november - seminar

1. detsember - loeng M.Reimund

8. detsember - test

15. detsember - ettekanded, loeng, praktikum teine rühm

22. detsember - ettekanded, praktikum kolmas rühm, eksam

Pinnaplasmonite resonantsi kasutamine interaktsioonide analüüsis

Biomolecular Interaction Analysis = BIAcore

BIAcore A1000BIAcore X100

BIAcore 3000

Pinnaplasmonite resonantsi kasutusvõimalused

1) kiirus- ja tasakaalukonstantide määramine2) interaktsioonimehhanismide detailne analüüs3) interaktsioonide spetsiifilisuse ja termodünaamika uurimine4) interaktsioonipartnerite identifitseerimine (kombinatsioonis massispektromeetriaga)

Meditsiinis1) ravimiarenduses - uute ravimikandidaatide väljaselgitamine2) haiguste biomarkerite määramine

Toiduainete analüüsisMürkainete, vitamiinide jne määramine

SpordisDopingainete analüüs

...

Biokeemias

Pinnaplasmonite resonantsi meetod (SPR, surface plasmon resonance technology)

võimaldab mõõta refraktsiooniindeksi muutusi sensorkiibiga kontaktis olevas

veekihis.

Sensorkiibiks on tavaliselt 50-100 nm paksune kulla- või hõbedakile, mille pind on

kaetud mõne sobiva maatriksainega. Refraktsioonimuutused on detekteeritavad kuni

300 nm kaugusel sensorkiibi pinnast.

Reeglina on vees lahustunud molekulide ja ioonide refraktsiooniindeksid vee

omast erinevad, seetõttu saab SPR –ga mõõta ühendite lokaalse kontsentratsiooni

muutusi sensorkiibi pinna vahetus läheduses. Immobiliseerides ühe huvipakkuva

komponendi kovalentselt otse sensorkiibile või seda katvale maatriksile ning süstides

teisi komponente voolus üle selle pinna, saab ajas jälgida komplekside moodustumist

ja dissotsieerumist kiibi pinnal.

Kuivõrd SPR-seadmete abil saab määrata mittekovalentseid interaktsioone

iseloomustavaid parameetreid, on nende peamine rakendus biointeraktsioonide

kineetika ja mehhanismi uurimisel.

prisma

kullakile(50 nm)

peegeldunud kiir

Täieliku sisepeegeldumise tingimustes põhjustab teatudnurga all langenud valguskiir kullakiles elektronide võnkumised(pinnaplasmonite resonants).Nende võnkumistega kaasnev elektiväli ulatub kuni 300 nmulatuses kullakilega kontaktis olevasse lahusesse. Seetõttumõjutavad lahuse optilised omadused ka elektronide võnkumisi.

langev kiir

Elektrone ergastav valguskiir „neeldub“, mistõttu vastavapeegeldunud kiire intensiivsus väheneb. Peegeldunudkiirtekimbus tekib sellele kohale vari, mille asukoht(nurka) detekteeritakse saab fotokordisti abil.

Kui kullakilega kontaktis olevas lahuses muutub refraktsiooni-indeks, siis muutub varju nurk peegeldunud kiirtes.

vesilahus

Aeg (s)

Intensiivsus

Nurk

SPR muut

kullakile

prisma

vool

vari

immobiliseeritudvalk

valgusallikas detektor

valguga interakteeruv ligand

Graafikuna esitatud sõltuvust SPR muut/aeg nimetataksesensorgramm

Kuidas tekib sensorgramm?

Algus Assotsiatsioon(ligand seostubimmobiliseeritudvalgule)

kullakile

süstitavlahusligandiga

Dissotsiatsioon(ligand dissotsieerubvalgult)

Aeg (s) Aeg (s) Aeg (s) Aeg (s)

immobiliseeritudvalk

Regenereerimine ehkligandi eemaldamine pinnalt.Selleks kasutatakse pH muutusi,kõrget NaCl kontsentratsiooni

Sensor Chips

SPR Detection

IFC Microfluidic

BIAcore T200

SPR-i kui meetodi üldiseloomustus

SPR detekteerib refraktsiooni muutusi sensorkiibi pinnale lähedases kihis.

Valkude puhul kehtib seos: pindtihedusele 1 pg/mm2 vastab SPR-i muutus 1RU.

Kõik biomolekulid mõjutavad refraktsiooni, seetõttu pole märgistamine vajalik.

Mõõdetav SPR-i signaali muutus on proportsionaalne seostunud aine massiga.

Mõõtmisi saab reaalajas jälgida. Mõõtmised on täielikult automatiseeritud.

SPR meetod on väga tundlik, mõõtmiseks on vaja väga väikesi ainekogusi.

Assotsiatsioon Dissosiatsioon

SPR

mu

ut

(RU

)

Aeg (s)

immobiliseeritud valk

valk/valk kompleks

Kahe valgu interaktsiooni kirjeldav sensorgramm

„vaba“ valk, (ligand,mida süstitakse voolussensorkiipi)

P + L PL

Rt=a[PL]

SPR-i muutus igal ajahetkel Rt on proportsionaalne kompleksi PL kontsentratsiooniga

a d[PL]

dt= kass P L − kdiss[PL]

d𝑅𝑡

dt= kass P L − kdiss[PL]

d[PL]

dt= kass P L − kdiss[PL]

Assotsiatsiooni kineetika

Lähtume võrrandist:

[P] – immobiliseeritud valgu kontsentratsioon, [L] – ligandi kontsentratsioon

1) Ühe mõõtmise piires on ligandi kontsentratsioon [L] sensorkiibist ülevoolas lahuses konstante2) Moodustuva kompleksi kontsentratsioon [PL] on võrdeline SPR-i muuduga antud ajahetkel ehk Rt=a[PL]3) Küllastusele vastav SPR-i muut on määratud immobiliseeritud valgu kontsentratsiooniga Rmax= b[P]0

Rt =RmaxkassL]

kassL +k

diss

(1 –𝑒− kass L +k diss t) ehk

Rt =Rmax[L]

L +Kd

(1 –𝑒− kass L +kdiss 𝑡), sest Kd=kdiss

kass

Dissotsiatsiooni kineetika

Rt = R0 e−k

disst

R0 – SPR-i väärtus ajahetkel t=0

Oluline: Dissotsiatsiooni kineetika ei sõltu assotsitsiooni kiiruskonstandist, samas mõjutab dissotsiatsiooni kiirusassotsiatsiooni kineetikat

Aeg (s)

Kineetika analüüsiks varieeritakse ligandi kontsentratsioone (antud joonisel tähistatud C),immobiliseeritud valgu kontsentratsioon hoitakse konstante.

tasakaal

küllastus

0

5

10

15

20

0 60 120

Signal [RU]

Time [s]

R𝑒𝑞 =𝑅𝑚𝑎𝑥 [𝐿]

𝐿 + 𝐾𝑑

Req

Kd määramine kasutades tasakaaluoleku SPR-muutude väärtusi Req

Erinevate ligandi kontsentratsioonide jaoks määratakse Req väärtus.Järgnevalt tehakse sõltuvus Req versus [L]

Kõvera analüüsiks kasutatakse valemit

Kiiruskonstantide kass ja kdiss määramine

Eksperimentaalselt saadud sensorgrammidele (mustad) leitakse kõige lähedasemad arvutuslikud kõverad (punased).Ehk - programm leiab teoreetilise kass ja kdiss väärtuse, millele vastav arvutuslik sensorgramm (kõver), mis erineb kõigevähem eksperimentaalsest sensorgrammist.

Sensorgrammide näiteid

Sensorgammide analüüs võimaldab uurida ka kompleksimoodustumise mehhanisme (lihtne 1: 1 ,mitmes etapis toimuv, kooperatiivne, difusioon-limiteeritud jne)

Ühesugune afiinsus (sama Kd=10nM), kuid erinev kineetika nelja erineva ligandi näitelSensorgrammid on esitatud kahe kontsentratsiooni jaoks – 100 nM ja 1 mMligand 1 - sinine, ligand 2 – roheline, ligand 3 – kollane, ligand 4 - punane

Küllastus,kõik sidumis-saidid on ligandi poolt hõivatud

kass k diss

Immobiliseerimine sensorkiibile

OtseneÜks interakteeruvatest komponentidest seotaksekovalentselt kiibi maatriksile

KaudneEsimese etapis seotakse kovalentselt kiibi pinnale ühend, mis moodustab ühe komponendiga tugeva kompleksi.

Sensorkiibid

CM5 sensorkiibi pinnal on dekstraan, millesse on viidud karboksümetüülrühmad

dekstraan

Dekstraan Br

BrDekstraan

Karboksüülrühmade sisseviimiseks kasutatakse bromoäädikhapet:

EDC – (N-(3-dimetüülaminoprpüül)-N’-etüülkarbodiimiid

NHS – N-hüdroksüsuksiinimiid

PDEA - 2-(2-püridinüüllditio) etaanamiin hüdrokloriid

NH2-NH2

DTT - ditiotreitool

DTT

Immobiliseerimine sensorkiibile CM-5

H

Immobiliseerimine sensorkiibile CM-5 aminorühmade kaudu

1) karboksüülrühmade aktiveerimine

karboksümetüleerituddekstraan

karbodiimiid

2) valgu (R-NH2) immobiliseerimine

valk

immobiliseeritud valk

3) reageerimata aktiveeritud rühmade neutraliseerimine etanoolamiiniga

aktiveeritud ester

etanoolamiin

N-hüdroksüsuksiinimiid

Activation

Blocking

Amine Coupling - Sensorgram

• Activation = EDC/NHS injection surface esters

• Ligand contact = reaction with amine groups on ligand

• Blocking = deactivation of free esters with ethanolamine

Sensor Chip NTA

• CM dextran matrix pre-immobilized with nitrilotriacetic acid (NTA)

• Capture of His-tagged ligands via metal chelation

• Controled steric orientation of ligand for optimal site exposure

• Regeneration by injection of EDTA to remove metal ions

Sensor Chip L1

• CM dextran matrix modified with lipophilic anchor molecules

• For rapid and reproducible capture of lipid membrane vesicles such as liposomes, with retention of lipid bilayer structure

• Allows studies of transmembrane receptors in a membrane-like environment , for example.

HPA sensorkiibi pind on hüdrofoobne, sest on kaetud oktadekaantiooligaSellele pinnale saab tekitada biomembraanile lähedase kihi.

Sensorkiip HPA

biotinüleeritud peptiid

biotiin

Streptavidiin

valk, mis seostub peptiidile

Senorkiip SA

Biotiin ja streptavidiin (tetrameerne valk) moodustvad väga tugeva kompleksi (Kd=10-15 M)Biotiinirühma viimisega huvipakkuvasse molekulisse (tavaliselt valgusse või peptiidisse)võimaldab selle stabiilselt sensorkiibi pinnale immobiliseerida

LDL

Adipocytes or

myocytes

Extracellular

matrix

Endothelial cellsBlood

Chylo

VLDL

LDL

Chylo

heparan sulfate

Apolipoproteins

CII and CIIISynthesis of LPL

and Angptl 4

Endothelial lipolysis

Angptl 3

GPIHBP-1

Apolipoprotein

A-V

LPL

46

apolipoprotein CII

glycosaminoglycans

GPIHBP1

apolipoprotein A5

endothelium

Lipolysis

Lipolysis

apolipoprotein CIII

apolipoprotein CI

angiopoietin-like proteins 3 and 4

Lipoprotein

heparan sulfate

proteoglycan

lipoprotein lipase

GPIHBP1

Blood

Chylo

VLDL

LDL

Remnant

Chylo

sensorchip

VLDL LDL

lipoprotein lipase (LPL)

Model system

BIAcore

GPIHBP-1

heparansulfate proteoglycan

angiopoietin-like proteins 3 and 4

apolipoproteins CII, CIII and AV

OO

OOC

OO

O

OO

OH

CH2

O

N

1,4

1,4

H SO3–

SO3

–

–

H–

SO3

core protein

Heparansulfate proteoglycans

Endothelial localization of LPL

GPIHBP1 = glycosylphosphatidylinositol-

anchored high density lipoprotein-bnding

protein 1

GPI

anchor

Ly6 domain

Glükosüülfosfatidüülinositool-ankurdatud kõrge tihedusega lipoproteiine siduva valk 1 (GPIHBP1) seob lipoproteiinlipaasi endoteeli pinnale

NH2 -AQEDGDADPEPENYNYDDDDDEEEEEETC-COOH

GPIHBP1 struktuur

GPIHBP1 N-terminaalne domeen

Ly6 domeen

Schematic models illustrating how the two domains of GPIHBP1 interact with LPL. The N-terminal

domain and LPL form a tight but short lived complex, characterized by fast on- and off-rates.

Mart Reimund et al. J. Biol. Chem. 2015;290:13919-13934

©2015 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology

Spektroskoopiliste meetodite kasutamine interaktsioonide analüüsis

1. Spektrofotmeetria - neeldumisspektrite analüüs2. Fluorestsentsspektrofotomeetria

a) Fluorestsentsi-spektrite analüüsb) Fönster’i resonantsenergia ülekanne (FRET)c) Fluorestsentsi anisotroopia

3. Mikrotermoforees4. Tsirkulaardikroism

1) Spektrofotomeetriat saab kasutada, kui kompleksimoodustumisega kaasneb optilise tiheduse muutus.

2) Kromofoorideks on valkudes trüptofaani-, türosiini- ja fenüülalaniinijäägid:

Kompleksimoodustumisega kaasnevad optilise tiheduse muutused on reeglina väikesed. Lisaks on optilise tihedusemääramiseks vajalikud kõrged valgu kontsentratsioonid. Neil põhjustel on spektrofotomeetria kasutamine biomolekulide-vaheliste interaktsioonide uurimisel väga piiratud.

Spektrofotomeetria

Fluorestsentsspetkrofotomeetria

• Nähtus, kus molekulid neelavad

valguskiirgust madalamal lainepikkusel,

emiteerivad (kiirgavad) valguskvandi

kõrgemal lainepikkusel

• Emiteeritud valguskvant on väiksema

energiaga kui neelatud valguskvant

hE

kus E on energia, h on Planck’i

konstant, ν on sagedus

Fluorestsentsi põhimõte

• Energia neeldumine ehk

absorptsioon,

• elektroni ergastamine

• võnkerelaksatsioon

Pärast kiirgusevaba

võnkerelaksatsiooni 3 võimalust:

1. Fluorestsents

2. Konverteerumine

triplettolekusse ja järgnev

fosforestsents

3. Kiirgusevaba üleminek

ergastamata olekusse

• Millest oleneb? Protsessi

eluiga/kiirus – molekuli struktuur,

keskkond

S0 – põhiolek (singlett)S1 – elektroonse ergastuse esimene tase

fosforestsentsneeldumine(absorptsioon)

Energia

fluorestsents

võnke-relaksatsioon

mittekiirguslik

konverteeruminetriplettolekusse

Stokes’i nihe

• Emiteeritud valgus on suurema

lainepikkusega ning väiksema

energiaga

• Stokes’i nihe:

emissioonispektri maksimumi ja

absorptsioonispektri maksimumi

vahe

Mida jäigem on molekul, seda vähem on tal võimalusi mittekiirguslikult relakseeruda ning suurem tõenäosus fluorestseeruda.

fluoreenjäik struktuurfluorestseerub

bifenüülmobiilne struktuurei fluorestseeru

Aatomitevaheline kaugus Aatomitevaheline kaugus

Millised molekulid fluorestseeruvad?

KromofoorFluorofoor

ergastatud olek

põhiolek

fluorestsents

võnkerelaksatsioon

ergastatud olek

põhiolek

võnkeenergia tasemed

EnergiaEnergia

Fluorestseeruvad molekulid ja ioonid

Fluorestsentsi soodustavad rühmad:

• elektrondonoorsed (-NH2, -OH jne)

Fluorestsentsi kustutavad rühmad:

• elektronaktseptoorsed (-NO2, -COOH jne)

lantanoididekelaat-kompleksid

Fluorestsentsi kvantsaagis (quantum yield)

nrkQ

Q - kvantsaagis

Γ – fluorofoori emissiooni kiiruskonstant

knr – kiirgusevaba energia vähenemise kiiruskonstant

Fluoretsentsi intensiivsus on määratud kvantsaagisega Q , mis näitab, kui suur osa neeldunud energiast emiteeritakse valguskvandina ehk emiteeritud ja neeldunud footonite suhet. Suurem kvantsaagis

tähendab suuremat fluorestsentskiirguse intensiivsust.

Q =emiteeritud footonite arv

neeldunud footonite arv= If

Ia

If – fluorestsentskiirguse intensiivsusIa – neeldunud ergastuskiirgus

Fluorestents-spektrofotomeeter

• Kaks monokromaatorit

• Proov emiteerib (kiirgab)

valguskvandi kõikidesse

suundadesse

• Emissiooni mõõdetakse risti

ergastuse suunaga vältimaks

proovile pealelangeva

valguskiire detekteerimist

Küvett prooviga

Xe-lamp

Detektor

Ergastamisemonokromaator

Emissioonimonokromaator

Hiniini fluorestsentsi kustutamine kloriidioonide toimel

Fluorestsentsi kustutamine

Ergastatud olekust (S1) relakseerumine võib toimuda ka teise molekuliga vastastmõju

toimel. Seda nimetatakse fluorestsentsi kustutamiseks. Tugevad fluorestsentsi kustutajad

on halogeenid, akrüülamiid, ka molekulaarne molekulaarne hapnik.

Ergastatud molekulid võivad oma energia üle kanda ka mõnele teisele molekulile või

rühmale, mis ise seeläbi ergastub ja fluorestseerub

+NaCl -NaCl

Valkude fluorestsents (valkude omafluorestsents)

Kokkupakitud märgistamata valgu fluorestsentsi annavad panuse kolm aromaatset aminohappejääki:trüptofaan, türosiin, fenüülalaniin.

Peamine osa valgu omafluorestsentsist on määratud trüptofaanide poolt. Trüptofaani ergastuse maksimumon 280 nm. Emissiooni maksiumum varieerub sõltuvalt keskkonnast ning jääb 300 ja 350 nm vahele.

Trüptofaan on suhteliselt väheesinev aminohape valkudes. See võimaldab trüptofaani kasutada molekulaarsesondina, kui jälgida selle fluorestsentsi muutusi ligandi seostumisel. Hüdrofoobsemasse keskkonda paiknedes, nihkub trüptofaani fluorestsentsi maksimum lühema lainepikkuse poole (sininihe, blue shift). Trüptofaani liikuvuse vähenemisega kaasneb fluorestsentsi intensiivsuse suurenemine.

Fluorestsenstieluiga (ns)

Absorptsioon (neeldumine) Fluorestsents

Lainepikkus (nm)

e Lainepikkus max Kvantsaagis

Trüptofaan 2.6 280 5,600 348 0.20

Türosiin 3.6 274 1,400 303 0.14

Fenüülalaniin 6.4 257 200 282 . 0.04

Valkude omafluorestsents

Neeldumise spektrid Fluorestsentsi spektrid

Fluorestsentsi kasutamine valk/ligand interaktsioonide analüüsis

Ligandi seostumisega kaasneb valgu omafluorestsentsi muutumine. See võib olla tingitud: 1) valgu konformatsiooni muutusest, mille tagajärjel keskkond trüptofaanide lähedusest muutub2) valgu trüptofaanide osalemisest interaktsioonis

a) Kd määramine fluorestsentsispektritest

Ligand 1, nM Ligand 2, nM

Fluorestsentsiintensiivsus

Apo C-III on oluline triglütseriidide taseme regulaator veres

Apo C-III üleproduktsioon põhjustab hüpertriglütserideemiat ja suurendab ateroskleroosi riski

Diabeedi ja neerupuudulikkuse korral on apo C-III tase suurenenud

Apo C-III taseme langetamine on oluline ravimiarenduse eesmärk

Trüptofaanide fluorestsentsi kasutamine apolipoproteiin C-III/lipiid interaktsiooni uurimisel

Sünteesitakse maksas ja soolestikus, lipoproteiinide komponent

Viiest a-heeliksist koosnev struktuur tekib ainult agregeerunud lipiidide pinnal, lahuses

sekundaarstruktuur puudub (random coil)

kolesterooli-rikkad

triglütseriidi-rikkad

Ateroskleroosi risk on seotud lipoproteiinide metabolismiga

Riski suurendavad: kõrge LDL, kõrge triglütseriidide tase, madal HDL

Apo CIII mutatsioonid

2) mutatsioon 19 (R19X) esineb ligikaudu 2.8 % Amish’i

usulahku kuuluvatel inimestel. Apo CIII kontsentratsioon

on veres kaks korda vähenenud ning ateroskleroosi risk

oluliselt väiksem.

Paremini uuritud mutatsioonid:

1) A23T on leitud kolmel Yucatan’i indiaanlasel

apolipoproteiin CIII

Apolipoproteiin CIII interaktsioon lipiididega

Kas trüptofaanid W42, W54 ja W65 osalevad selles interaktsioonis?

liposoom

Järeldus: kõik trüptofaanid osalevadinteraktsioonis lipiididega

Tryptophan probes reveal residue-specific phospholipid interactions of apolipoprotein C-III.Biochim Biophys Acta. 2015; 1848(11 Pt A):2821-8. Candace M. Pfefferkorn a, Robert L. Walker III a, Yi He b, James M. Gruschus a, Jennifer C. Lee a,⁎

Kui sügaval liposoomi fosfolipiidide kihis paiknevad apo CIII trüptofaanid W42, W54 ja W65?

Kasutati fosfolipiide, millede rasvhapete ahelate teatud asendid olid bromeeritud. Uuriti, kui efektiivselt kustutasidbroomiaatomid apo CIII trüptofaanide fluorestsentsi. Sellest järeldati, kui sügavale fosfolipiidide kaksikkihti iga trüptofaan tungib.

Br

bis –ANS [1,1'-Binaphthalene]-5,5'-disulfonic acid, 4,4'-bis(phenylamino)-, dipotassium salt

bis-ANS seostub valkude eksponeeritud hüdrofoobsetesse saitidesse. Seostunud bis-ANS fluoretsentsiintensiivsus kasvab 1000 korda. bis-ANS-i kasutatakse valkude hüdrofoobsete saitide tiitrimiseks.Samas ei võimalda selline analüüs määrata sidumissaitide arvu valgus, sest erinevate sidumissaitide mõju bis-ANS-i

fluorestsentsile on erinev.

Lipoproteiinlipaasi tiitrimine bis-ANS-igaKokkupakitud valk

veemolekulid

hüdrofoobsedalad

hüdrofiilsedalad

Lookene, A et al. J Biol Chem. 2003 Sep 26;278(39):37183-94

Näide2. Ligandi fluorestsents muutub seostumisel valgu pinnale

Valkude märgistamine fluorestseeruvate rühmadega

5-karboksütetrametüülrodamiin-suksiinimidüülester5-jodoatseetamidofluorestsiin

NH2-rühma spetsiifiline SH-rühma spetsiifiline

FRET ehk Förster’i resonantsenergia ülekanne (Förster

Resonance Energy Transfer)

doonor aktseptor

ergastuskiirgus,valgus FRET fluorestsents

kustumine

Ergastatud fluorestseeruv rühm (doonor) võib oma energia anda üle lähedal asuvale teisele fluorestseeruvale rühmale (aktseptor), mis seejärel kiirgab kvandi. Sellist protsessi toimumist nimetatakse Försteri resonantsenergia ülekandeks (FRET).

FRET’i paarid

Donor Acceptor R0 (Å)

Fluorescein Tetramethylrhodamine 55

IAEDANS Fluorescein 46

EDANS Dabcyl 33

Fluorescein QSY 7 and QSY 9 dyes 61 Tetramethylrhodamine (TMRA)

Sobib - ergastus 450 nm juures, mõõtmine emissiooni spektrit 490-650 nm

Fluorescein

Doonor Aktseptor

ErgastusErgastus Emissioon Emissioon

FRET’i eksperimendis ergastatakse doonorrühm ning mõõdetakse aktseptorrühma emissiooni. Selleks peavad doonoriemisioonispekter ja aktseptori ergastuspekter vähemalt osaliselt kattuma (= olema vähemalt osaliselt samas lainepikkustevahemikus).

need piirkonnad kattuvad

r = 10-100 Å, sobiv vahemaa

biomolekulide analüüsimisel

FRET tingimused

• Doonor ja aktseptor peavad asuma

lähestikku (10-100 Å)

• Doonori emissioonispekter peab

kattuma aktseptori

absorptsioonispektriga

• Doonori/aktseptori dipoolide

orientatsioon ei tohi olla üksteise

suhtes risti

• Doonori ergastatud elektroni eluiga

peab olema piisavalt pikk

- doonorrühm

- aktseptorrühm

valk

FRET-i mõjutavad faktorid

• Doonori ja aktsepori vaheline kaugus

• Doonori emissioonispektri ja aktseptori absorptsioonispektri kattuvus

• Doonori ja aktseptori orientatsioon

Doonori ja aktseptori vaheline kauguse (r) mõju FRET’ile

Förster’i raadius R0 – iseloomulik igale doonor-

aktseptor paarile. Näitab doonori-aktseptori

vahelist vahemaad, kus 50% doonori poolt

neelatud energiast kantakse üle aktseptorile

6/142

0 21,0 JqR D

η – lahuse refraktsiooniindeks

qD – doonori kvantsaagis ilma aktseptorita

J – D emissiooni ja A absorp. spektrite kattuvus

M-1cm-1(nm)4

66

0

6

0

rR

RE

Doonori emissioonispektri ja aktseptori

absoprtsioonispektri kattuvus (J)

Doonori ja aktseptori orientatsiooni (κ) mõju FRET’ile

• κ2 saab olla vahemikus 0 kuni 4

• κ2 vajalik Förster’i raadiuse (R0)

arvutamisel

• Biomolekulide puhul eeldatakse,

et κ2=2/3

• Tihti doonori/aktseptori tootja

poolt määratud

6/142

0 21,0 JqR D

η – lahuse refraktsiooniindeks

qD – doonori kvantsaagis ilma

aktseptorita

J – D emissiooni ja A absorp.

spektrite kattuvus

M-1cm-1(nm)4

doonorrühm

aktseptorrühm

2) Valkude konformatsiooniliste üleminekute uurimine. FRET-i paar doonor/aktseptor asub ühesvalgus. Kas ligandi seostumine põhjustab muutusi valgu konformatsioonis? Kui valgu konformatsioon muutub, siis võib ka doonori ja aktseptori vaheline kaugus muutuda. See mõjutab FRET’i.

FRET-i kasutamine interaktsioonide analüüsis

1) Valk/valk (valk/ligand) interaktsiooni uurimine. Ühes interaktsioonipartneris on doonorrühm ning teises aktseptor-rühm. Kompleksi tekkimine avaldub FRET-is

apoAI kahe monomeeri vahelise konformatsiooni

määramine HDL pinnal (HDL – high density lipoprotein)

Doonor: fluorestseiin

Aktseptor: TMRA

Quenching of OG-LPL fluorescence by TMRA-LPL.

Lookene et al. J. Biol. Chem. 2004;279:49964-49972

Valkude dünaamika uurimine

FRET eelised ja puudused

Eelised:

• Unikaalne informatsioon: vahemaad, struktuuri muutused

• FRET vahemaad on heas kooskõlas biomolekulide suurusega

• Saab kasutada rakukultuurides

• Tundlik

Puudused:

• Molekule peab märgistama

• Täpsete distantside määramine, Förster’i raadius (R0) peab olema teada

• Orientatsiooni teguri määramine ebatäpne

• Lahuse refraktsiooniindeks

FRET kasutusalad

• Vahemaade määramine biomolekulis

• Valkude struktuuri ja konformatsiooni uuringud

• Valk komplekside moodustumise uurimine

• Retseptor – ligand interaktsioonid

• Nukleiinhapete struktuuri ja konformatsiooni uuringud

• Interaktsioonide uurimine rakukultuurides

Polarisatsioon kirjeldab valguslainete võnkesuunda. Valguslained, millel on üks võnkumissuund, nimetatakse polariseeritud laineteks.

valguslainete võnkumisedkõikvõimalike tasandites

Polarisatsioonifiltrid ehk lihtsalt polarisaatorid on seadmed, mis muudavad tavalise valguse polariseeritud valguseks

Polarisatsioonifilter ehk polarisaator

Polariseeritudvalgus, võnkumineühes tasandis

valguslainetelevimissuund

valgusallikas

Valguse polarisatsioon ja fluorestsentsi anisotroopia

polariseeritudergastusvalgus

polariseeritudergastusvalgus

emiteeritud valgus on depolariseerunud, sestmolekulide pöörlemine toimub kiiremini kuirelakseerumine

kiire pöörlemine

aeglanepöörlemine

emiteeritud valgus jääb polariseerituks,sest kompleksi pöörlemine toimub aeglasemalt kui relakseerumine

väiksemmolekul

suur kompleks

Paljude biomolekulide pöörlemisdifusioon on võrreldav paljude fluorofooride ergastatud oleku elueaga. See võimaldab fluorestsentsi polarisatsiooni kasutada valkude suuruse ja interaktsioonide uurimiseks.

fluorestseeruvrühm

𝑟 – fluorestsentsi anisotroopia,

𝐼ǁ – fluorestsentsi intensiivus vertikaalselt asetseva polarisaatori korral,

𝐼⊥ – fluorestsentsi intensiivsus horisontaalselt asetseva polarisaatori

korral.

𝑟 =𝐼ǁ − 𝐼⊥𝐼ǁ + 2𝐼⊥

Anisotroopia (r )

Kompleksimoodustumise uurimisel eeldame, et anisotroopia muutus r on võrdeline tekkinud kompleksi kontsentratsiooniga:

r = a [PL] (PL - valk/ligand kompleks)

Fluorestsentsi anisotroopia – kiirguse (emisiooni) intensiivsus on polarisatsiooni telgede suhtes ebavõrdne

Anisotroopia kasutamine lipoproteiinlipaasi ja glükosüülfosfatidüülinositool-ankurdatud kõrge tihedusega lipoproteiine siduva valk 1 (GPIHBP1) interaktsiooni uurimisel

Kui tugev on interaktsioon lipoproteiinlipaasi ja GPIHBP1 N-terminaalse domeeni vahel?Kas vereplasmas leidub komponente, mis mõjutavad seda interaktsiooni?

NH2 -AQEDGDADPEPENYNYDDDDDEEEEEETC-COOHGPIHBP1

GPIHBP1 N-terminaalne domeen

Ly6 domeen

GPIHBP1 N-terminaalsele domeenile vastava peptiidi karboksüterminaali on lisatud fluorestseeruv rühm DyLight488:

QQEEEEEDEDHGPDDYDEEDEDEVEEEETC –DyLight. Lipoproteiinlipaasi lisamine peptiidile suurendas

anisotroopiat, mis näitas kompleksi lipoproteiinlipaas/peptiid tekkimist. Sõltuvus anisotroopia muutus/lipoproteiinlipaasi

kontsentratsioon jõudis küllastuseni lipoproteiinlipaasi kontsentratsioonil 1000-1200 nM. Plasmas ja puhverlahuses

mõõdetud sõltuvused erinesid vähe. Järeldus: vereplasmas pole komponente, mis mõjutavad lipoproteiinlipaasi ja

GPIHBP1 N-terminaalse domeeni vahelist interaktsiooni.

Lipoproteiinlipaas (nM)

vereplasma

puhverlahus

Fluorestsentsmeetodid võimaldavad:

1) lokaliseerida biomolekuli (reeglina valgu) asukoha rakus või organismis

2) teha kindlaks, kas antud kompleks rakus tekib

3) jälgida komplekside tekkimist ajas

Fluorestsentsmeetodite kasutamine interaktsioonide uurimiseks in vivo

valgusallikas

detektor

okulaaremissioonfilter

ergastamis-filter

dikromaatne peegel-filter

objektiiv

Fluorestsentsmikroskoopia

Valgusallikast (näit. elavhõbedalamp või ksenoonlamp) tulev valgus läbib filtri, mis laseb edasi teatud kindla lainepikkusega

ergastusvalgust. Dikromaatne peegel (peegeldab lühema lainepikkusega valgust, kuid on läbitav pikema lainepikkusega valgusele)

suunab ergastusvalguse läbi objektiivi fluorestseeruvat märgist sisaldavale proovile. Ergastusvalguse toimel tekib selles

emissioonvalgus, mis on alati pikema lainepikkusega kui ergastusvalgus. Enne detektorisse jõudmist läbib emissioonvalgus veel üht

filtrit, mis püüab kinni võimaliku lühilainelise kiirguse.

Konfokaalmikroskoopia töötab nagu fluorestsentsmikroskoop, kuid valgusallikaks on laserikiir. Kujutis tekib ainult sellest

tasapinnast, mis on fookuses. Fookusest väljas olevad piirkonnad (mis tavalises mikroskoobis paistaksid ebateravate ja hägustena

ning mis seetōttu segavad vaatamist) jäävad mustaks, neid ei näe. Uuritavast objektist tehakse suur hulk optilisi lõike, igast

tasapinnast saadav kujutis salvestatakse arvutis pildifailina, mida on hiljem vōimalik ükshaaval analüüsida vōi sünteesida

ruumiliseks kujutiseks. Mikroskoobid võivad olla varustatud videokaameratega.

proov

Laialt kasutatakse immuunfluorestsents-meetodeid. See pōhineb fluorestseeruvate

ainetega konjugeeritud antikehade kasutamisel. Saab kindlaks teha, kas kaks biomolekuli

(valku) paiknevad raku samas piirkonnas. Kasutatakse otsest (1) ja kaudset meetodit (2)

antikehamärgistatudantikeha (konjugeeritud antikeha)

fluorestsents-märgis

(1)

(2)

antigeenfluorestsents

proov (rakk)

antikeha I

proov (rakk)antikeha II

(fluorestseeruv)

GFP

Mw= 26 kDa

Max emissioon: 510 nm

Fluorofoor on valgu keskel „peidus“ ja keskkonna mõjutuste eest kaitstud

Fluorofoor tekib koos valgu ruumilise struktuuri tekkimisega

Fluorestsents-valgud (fluorescent proteins)

4-(p-hüdroksübensülideen)- imidasolidiin-5-oon

Fluorestseeruvad nähtava valguse piirkonnas. GFP avastati organismis Aequorea victoria.GFP struktuuri alusel on disainitud teised fluorestsents-valgud.

Ser 65

Fluorestseeruva struktuuri tekkimine GFP sees

Fluorestseerub, max 510nm

Tyr 66

Gly 67

Fluorestsents-valgud (GFP perekond)

Näidatud on igas valgus moodustunud fluorestseeruv struktuur, mis jääb iga valgu sisemusse

FRET-i kasutamine interaktsioonide kindlakstegemiseks ja visualiseerimiseks in vivo

Kasutatakse rekombinantseid fluorestseeruvaid hübriidvalke – huvipakkuvatele valkudele on liidetudfluorestsents-valgud (fluorecence proteins). FRET-i jaoks valitakse liidetavad fluorestsentsvalgud nii, et nadmoodustaksid FRET-i paari (üks doonor ja teine aktseptor).

A

BFP GFP

A

BFP GFP

AKas valgud A ja B moodustavadkompleksi in vivo? B

Konstrueerime hübriidvalgud nii, et valgule A on liidetud fluorestseeruv valk BFP (Blue Fluorescence Protein) ning valguleB on liidetud valk GFP (Green Fluorescence Protein). Liitvalkudel on üks polüpeptiidahel, kuid kaks selgelt eristatavad domeeni.BFP ja GFP moodustavad FRET-i paari – BFP on doonor ja GFP on aktseptor.

Kompleksi A/B moodustumine avaldub FRET-is: ergastades BFP-i on detekteeritav GFP emisioon

B

B

Näide: Valk-valk interaktsiooni detekteerimine mitokondris

Selleks et veenduda, et kaks valku moodustavad ka kompleksi in vivo, võib need valgud ekspresseerida fluorestseeruvateliitvalkudena nii, et ühe struktuuri on lisatud BFP ning teise GFP. Kui kompleks moodustub, siis on fluorestsents-mikroskoopiagajälgitav FRET.

BFP GFP

Valk-valk interaktsioone on võimalik visualiseerida ka hiires

Mikrotermoforees

Mikrotermoforees (MST, inglise keeles - microscale thermophoresis) on hiljuti välja töötatud

tehnoloogia, millega saab biomolekulaarseid protsesse jälgida looduslikele tingimustele lähedastes

oludes, nagu vereplasma, tserebrospinaal vedelik ja rakulüsaadid. Vähem kui kolme aasta jooksul on

MST tõestanud oma potentsiaali biokeemia ja biofüüsika alases uurimistöös, selle meetodiga

saadud tulemusi on avaldatud enam kui kolmekümnes tippajakirjas (Nature, PNAS, J Biol Chem,

FAEB Journal jt) ilmunud artiklis. MST seade on patenteeritud NanoTemper Technologies GmbH

(Saksamaa) poolt. Sama firma on ka ainuke MST seadmete tootja.

MST peamine kasutusala on biomolekulaarsete mehhanismide analüüs. MST seadmed sobivad

valk-valk, valk-nukeliinhapped, nukleiinhape-nukleiinhape, makromolekul-madamolekulaarne

ühend ioon komplekside uurimiseks. Suure tundlikkuse tõttu võimaldab MST kovalentsete

modifikatsioonide ning konformatsiooniliste muutuste uurimist makromolekulides. Lisaks sobib see

meetod ka ravimikandidaatide testimiseks ning uute potentsiaalsete märklaud-molekulide

kindlakstegemiseks.

Võrreldes teiste biomolekulaarsete interaktsioonide uurimistöös kasutusolevate meetoditega on

MST eelised järgmised: 1) väga suur tundlikkus (alates 10 pM) 2) detekteeritavad on nii

madalmolekulaarsed molekulid ja ioonid kui ka suured makromolekulaarsed kompleksid (näiteks

viirused, ribosoomid, lipoproteiinid) 3) mõõtmised saab läbi viia väga väikeste ainekogustega, ühe

mõõtmise läbiviimiseks kulub 4 ml 4) eksperimendi läbiviimine on odav 5) uuritavad ained ei pea

olema puhastatud 6) mõõtmised saab läbi viia füsioloogilistes tingimustes. MST seade võimaldaks

oluliselt laiendada biomolekulaarsete interaktsioonide uurimise võimalusi TTÜ-s.

Mikroforees

Millest sõltub molekulide liikumine temperatuuri gradiendid?

Kuidas on ligand/valk kompleksi struktuur seotud interaktsiooni iseloomustavate parameetritega?

Valk/ligand struktuuri määramise klassikalised meetodid on tuumamagnetresonants ja röntgensstruktuuranalüüs.

Kiires arengujärgus on massispektromeetrial põhinevad meetodid (keemiline ristsidumine, vesinik-deuteeriumvahetus). Täiendavat informatsiooni saadakse kasutades modelleerimist, fluorestsentsil põhinevaid meetodeid, tsirkuklaardikroismi, aatomjõumikroskoopiat, krüo-elektronmikroskoopiat.

Peamine osa valk/ligand komplekside struktuuris on määratud röntenstruktuuranalüüsiga.Tuumaresonants-spektroskoopia sobib ainult väiksemate komplekside (Mw < 30kDa) struktuuride määramiseks.

Eesmärgiks on leida seosed kompleksi struktuuri ja funktsioonide vahel. Uuritakse, kuidas muutused struktuurisavaldavad mõju huvipakkuva kompleksi moodustumisele. Selleks viiakse läbi valkude mutantanalüüs.

Valkude ning valk/ligand komplekside ruumilise struktuuri uurimine

Ruumiline struktuur = aatomitevahelised kaugused

Valkude ruumilise struktuuri kindlaktegemise peamised meetodid on

1) Röntgenstruktuuranalüüsi (X-ray crystallography)

2) Tuumamagnetresonants-spektroskoopia (NMR, nuclear magnetic resonance)

Lineaarselt polariseeritud valgus Tsirkulaarselt polariseeritud valgus

Elektrivälja vektor pöörleb koos valguse levimisega,moodustades heeliksi. Elektrivälja vektori pöörlemine võibtoimuda päripäeva või vastupäeva, andes kas vasakule tsirkulaarseltpolariseeritud valguse või paremale tsirkulaarselt polariseeritud valguse.

Elektrivälja vektor võngub ühes tasapinnas, mison risti valguse levimissuunaga

Tsirkulaardikroismi-spektroskoopia

Mis on tsirkulaarselt polariseeritud valgus?

Mis on tsirkulaardikroism?

Tsirkulaardikroism väljendub selles, et asümmeetrilise struktuuriga molekulid neelavad paremale ja vasakuletsirkulaarselt polariseeritud valgust erinevalt.

vasakule tsirkulaarselt polariseeritud valgus - VTPparemale tsirkulaarselt polariseeritud valguse - PTP

lahus, mis sisaldab asümmeetrilistühendit

PTP

VTP

PTP ja VTP neelduvad erinevalt

Tsirkulaardikroismi kvantitatiivne iseloomustamine

1) difrentsiaalne ekstinktsioonikoefitsient :

e = (eL – eR)= (AL-AR)/(c× b) AL − optiline tihedus VTP korralAR - optiline tihedus PTP korralc − molaarne kontsentratsioonb – optilise teepikkus

2) molaarse elliptilisusega [], mille ühikuks on radiaan või mdeg (millidegrees)

kehtib seos:e = []/3300

Lisaks kiraalusele on tsirkulaardikroismi ilmnemiseks vajalik kromofoorsete rühmade olemasolu

Kromofoorsed rühmad valkudes

Valkude UV spektris kolm olulist piirkonda:

Valkude tsirkulaardikroism piirkonnas 180-240 nm on määratud polüpeptiidahelate amiidsidemete (peptiidsidemete) asetusega. Seetõttu on tsirkulaardikroismi spektri see osa määratud valgu sekundaarstruktuuriga.

kauge UV180 -240 nm

lähi UV240-320 nm

Lainepikkus, nm

Peptiidsidemed

W, S-S S-S

F, Y, W

Valkude sekundaarstruktuur ja tsirkulaardikroismi spektrid

-heeliks

-leht

-pööre

mitte-strukt.

polü-proliin

Valkude sekundaarstruktuuri tsirkulaardikroismi spektrid

Valgu tsirkulaarspektrite näited

Kasutades spetsiaalseid programme on võimalik hinnata erinevate sekundaarstruktuuri-tüüpidevahekorda valgus - mitu protsenti on -heeliksit, mitu protsenti -lehte jne

H- -heeliksS – -lehtT – -pööreO - mittestruktureeritud

Valk/ligand interaktsiooni uurimine kasutades tsirkulaardikroismi

Ligand industeerib valgus täiendava lehe struktuuri tekkimise. Mõõdeti, kui palju muutus elliptilisus ligandi kontsentratsiooni kasvades.Punane joon vastab valgu spektrile ligandi puudumisel, sinine joon valgu spektrile ligandi kõige kõrgema kontsentratsiooni juures, hallid pidevad jooned vastavad vahepealsetele ligandi kontsentratsioonidele. Hall katkendlik joon näitab, et ligandil puudub tsirkulaardikroismi spekterselles spektri piirkonnas. Sõltuvusest elliptilisuse muutus lainepikkusel 217 nm versus ligandi kontsentratsioon saadi küllastusega sidumis-kõver, millest leiti Ka väärtus.

Ka

ligand

Seostumine liposoomidele industeerib -heeliksi moodustumist apolipoproteiinis C-III

fosfolipiidide kontsentratsioon (mg/ml)-heeliksi osakaal

10.750.50.250

Kokkuvõte

Tsirkulaardikroismiga saab uurida: 1) ligand poolt põhjustatud konformatsioonilisi muutusi valgus

2) määrata ligand/valk interaktsiooni Kd väärtusi

Tsirkulaardikroism ei sobi valk/valk interaktsioonide uurimiseks. Miks?

Aatomjõumikroskoop (aatomteravikmikroskoop)

Aatomjõumikroskoop (AFM, atomic force microscope) on seade, mida kasutatakse pindade topograafiliste omaduste

uurimiseks. AFM lahutusvõime ulatub alla 1nm. AFM kuulub skaneerivate mikroskoopide hulka. AFM pilt sadakse objektile

lähendatud teraviku skaneermisega üle objekti pinna.AFM teraviku liikumise jälgimiseks kasutatakse laserkiirt, mis peegeldub

liikuva teraviku pinnalt. Peegeldumisnurk sõltub sellest,kui palju on jõusensor paindunud või kui palju on võnkeamplituud

muutunud.

AFM-iga saab uurida biomolekulide kuju, konformatsioonilisi muutusi ning komplekside moodustumist.

jõusensor

teravik

detektor(fotodiood)

laser

proov

elektroonilise tagasisidestuseseade

piesoelektrilineskänner

Jõu

d (

nN

)

0

Kaugus pinnast (nm)

tõmbumine

tõukumine

jõud=0

Teraviku tipu lähendamisel objekti pinnale hakkavad teatud kaugusel tipu ja pinna aatomite

vahel mõjuma van der Waalsi tõmbejõud. Tipu edasisel lähendamisel hakkavad mõjuma tõukejõud.

teravik (Si), tipu raadius nm skaalas

AFM töörežiimid

Kontaktse AFM (Contact-AFM) seadmega saadakse informatsioonobjekti topograafia kohta kas konstantse jõu või kõrguse režiimis.

Mittekontaktse AFM korral vibreeritakse jõusensorit sagedusega 30-400 kHz ning amplituudiga 1-10 nm.Objekti topograafia muutumisega kaasneb võnkeamplituudimuutus. Selle säilitamiseks muutub pieso-skänneri pikkust.Selles režiimis saab uurida „pehmeid“ objekte ja sobib biomekulideuurimiseks

Biotin-DNA seondumine streptavidiinile

Streptavidiin on tetrameerne valk, mis moodustab biotiiniga väga tugeva kompleksi Kd= 10-15M. Biokeemias kasutatakselaialdaselt biotinüleerimist ehk biotiini sisaldava rühma kovalentset liitmist mõne biomolekuli külge (DNA, valk, sahhariid)

Streptavidiin vilgukivi pinnal

Streptavidiin + biotiin-DNA vilgukivi pinnal(DNA ahela pikkus - 152 aluspaari, 50nm)

50 nm

50 nm

50 nm

Ligandi seostumise mõju streptavidiinile

Streptavidiin

Streptavidiin + biotiin

Streptavidiin + biotiin-DNA

Streptavidiini ruumala

25 nm

AFM võimaldab visualiseerida erineva arvu biotiin-DNA molekuli seostumise streptavidiinile(AFM-iga saab määrata kompleksi stöhhiomeetriat)

Kompleks lipoproteiinlipaas/angiopoietiini sarnane valk 4

LPL – lipoproteiinlipaasANGPTL4 – angiopoetiini sarnane valk 4

Kuidas on ligand/valk kompleksi struktuur seotud interaktsiooni iseloomustavate parameetritega?

Valk/ligand struktuuri määramise klassikalised meetodid on tuumamagnetresonants ja röntgensstruktuuranalüüs.

Kiires arengujärgus on massispektromeetrial põhinevad meetodid (keemiline ristsidumine, vesinik-deuteeriumvahetus). Täiendavat informatsiooni saadakse kasutades modelleerimist, fluorestsentsil põhinevaid meetodeid, tsirkuklaardikroismi, aatomjõumikroskoopiat, krüo-elektronmikroskoopiat.

Peamine osa valk/ligand komplekside struktuuris on määratud röntenstruktuuranalüüsiga.Tuumaresonants-spektroskoopia sobib ainult väiksemate komplekside (Mw < 30kDa) struktuuride määramiseks.

Eesmärgiks on leida seosed kompleksi struktuuri ja funktsioonide vahel. Uuritakse, kuidas muutused struktuurisavaldavad mõju huvipakkuva kompleksi moodustumisele. Selleks viiakse läbi valkude mutantanalüüs.

Valkude röntgenstruktuuranalüüs

Aeg (s)

valgu produtseerimine valgu puhastamine

valgu kristallidesaamine

difraktsioonipilt

elektrontiheduse kaart

struktuuri modelleerimine

Valgu röntgenstruktuuranalüüsi etapid

Röntgenstruktuuranalüüs algab valgu kristallimisega

valgu

lahus

valgu

kristall

lahus valku sadestava

komponendiga

Valkude röntgenstruktuur-analüüsil saadakse difraktsioonipilt, mille tekkimine on analoognedifraktsioonipildile, mis saadakse juhul, kui valgus läbib mitut lähestikku paiknevat pilu.

Interferentsimaksimumideasukoha ja intensiivsuse järgi saab kindlaksteha pilude vahelise kauguse

kristall

detektor

kiirgus-

allikas sekundaarsed

kiired

d

primaarne

kiirtekimp

Difraktsioonipildi saamine

Röntgenikiirte lainepikkus on võrreldav aatomitevaheliste kaugustega

Kristalli läbides toimub röntgenikiirte difraktsioon ehk kõrvalekaldumine esialgsest

liikumissuunast

Röntgenikiired ergastavad aatomite elektrone, mis paiknevad sisemistel elektronkih-

tidel.

Ergastatud elektronid on uuteks kiirguseallikateks (sekundaarne kiirgus)

Erinevatelt aatomitelt pärit sekundaarsete kiirte kohtumisel tekib interferents, s.t.

teatud suundades kiirgus võimendub ja teatud suundades kiired kustutavad

üksteist. Detektoriga fikseeritakse tekkinud difraktsioonipilt.

Difraktsioonipildil paiknevate ‘laikude’ paigutus ja intensiivsus sõltub aatomite

ruumilisest paigutusest kristallis

Difraktsioonipildi alusel arvutatakse elektrontiheduste kaart, mille alusel modelleritakse valgu

oletatav ruumiline struktuur

Elektrontiheduste kaart Valgu ruumiline struktuur

Rosliglitasoon (diabeedi ravim) on seotud retseptori PPARγ aktiivsaiti

Röntgenstruktuuranalüüsiga saab kindlaks teha, millisesse valgu piirkonda ligand seostub ning millised

funktsionaalrühmad interaktsioonis osalevad. Peamine osa valk/ligand kompleksi struktuuridest on saadud

röntgenstruktuuranalüüsiga

Röntgenstruktuuranalüüsi eelised: 1) aatomlahutusega struktuur 2) sobib ka suuremate kompleksi struktuuri

kindlakstegemiseks.

Röntgenstruktuuranalüüsi puudused: 1) paljusid valke ja nende komplekse ei õnnestu kristallida 2) kristallide

saamine on aeganõudev ning selleks on vaja suuri koguseid ülipuhtaid aineid 3) kristallstruktuur saadakse on

staatiline ning saadakse mittefüsioloogilistes tingimustes.

Tuumamagentresonants-spektroskoopia

Kui valk asub tugevas magnetväljas, siis magnetmomendiga aatomite (1H, 13C, 15N ja 31P) tuumad orienteeruvad vastavalt magnetvälja suunale. Selles olekus saab nende aatomite tuumad raadiosagedusega viia üle kõrgemale energiatasemele. Kui need tuumad naasevad algolekusse, siis emiteeritakse kiirgus, mis registreeritakse. Igale tuumale vastav kiirguse sagedus sõltub sellest, millise aatomtuumaga on tegemist, samuti sellest millised teised tuumad paiknevad antud tuuma läheduses (molekulaarne keskkond). Mõõdetavad sagedused registreeritakse suhtelises skaalas - erinevusega referentssagedusest ja nimetatakse keemiliseks nihkeks.

Põhimõtteliselt on iga valgu aatomi jaoks võimalik saada spetsiifiline keemiline nihe, välja arvatud ekvivalentsed aatomid (näiteks H-aatomid CH3 rühmas). Kuid igas valgus on palju aatomeid, millede keemilised nihked paiknevad üksteisele väga lähedal või kattuvad. Teiste sõnadega, erinevused keemilistes nihetes on väiksemad kui lahutusvõime. Seetõttu kasutatakse valkude puhul mitmedimensionaalset tuumamagentresonantsi.

Tsellulaasi C-terminaalne domeen

Etanool

Keemiline nihe

Etanooli ja tsellulaasi (valgu) C-terminaalse domeeni ühedimensionaalse TMR-spektri võrdlus

Etanooli puhul on piigid selgelt eristatavad. Tsellulaasi spektris paiknevad paljud piigid üksteisele väga lähedal ja onüksteisest praktiliselt eristamatud.

Keemiline nihe

Kahedimensionaalne NMR (TMR)

Keemiline

nihe

Keemiline

nihe

2D spektri saamiseks mõõdetakse mitu ühedimensionaalset spektrit, muutes ergastamiseks vajaliku raadiosagedusliku impulsi reziimi. COSY ehk korrelatsioonspektroskoopiat kasutades saab tuvastada, millisedaatomid on üksteisest ühe või kahe kovalentse sideme kaugusel. Kahedimensionaalsel diagrammil on homonukleaarse spektroskoopia korral on mõlemal teljel sama isotoobi spektrid. Spektri diagonaal vastab tavalisele ühedimensionaalsele spektrile, ristpiikide järgi saab tuvastada, millised tuumad asuvad üksteise läheduses. Heteronukleaaarses spektrist (HETCOR) saab informatsiooni millised süsinikud või lämmastikud on vesinikega seotud.

Vesinikuaatomite vastastikused mõjutused valkudes

Vesinikuaatomite vastastikused mõjutused COSY eksperimendis alaniini ja seriini jaoks

Igale aminohappejäägile vastab spetsiifiline komplekt kovalentsete sidemete kaudu seotud vesinikuaatomeid, mis annavadristpiikide spetsiifilise kombinatsiooni COSY spektris. Nii saab identifitseerida aminohappejäägi tüübi ehk millise amino-happejäägiga on tegemist. Samas ei saa selle spektri põhjal öelda, millisele konkreetsele aminohappejäägile uuritavas valgussee piik vastab, sest valkudes on reegilna iga aminohapppejääki mitu (näit. millised on valgu lac-repressor jääkidele

Ser 16, Ser 28 või Ser 31 vastavad piigid). Iga jäägi kindlakstegemiseks valgu järhjestuses kasutatakse NOE spektrite analüüsi.

NOE eksperimendis saadud spektris avalduvad mõjutused ka (vesiniku)aatomite vahel, mis paiknevad ruumis üksteisele lähedal (kaugus on väiksem kui 5Å). See annab võimaluse tuvastada valgu iga aminohape , tehes kindlaks millisedaminohappejäägid paiknevad järjestikku (joonis a) (valgu primaarjärjestus peab olema teada). NOE spektroskoopiaga tehakse kindlaks ka valgu sekundaarstruktuur (joonis b).

NOE spektroskoopia

(NOE= nuclear Overhauser effect)

b)a)

Tuumamagnetresonantsi kasutamine valk/ligand komplekiside uurmisel

1) Kd määramine

2) Kompleksi valk/ligand dünaamika uurimine (kass ja kdiss määramine)

3) Ligandi sidumissaidi tuvastamine

4) Valgu dünaamika muutused, mis on seotud ligandi seostumisega

Valk/ligandi kompleksimoodustumise domineerivaks jõuks on hüdrofoobne efekt ja van der Waalsi interaktsioonid.

Spetsiifilisuse tagavad ioonsed (elektrostaatilised) jõud, vesinik-sidemed, pp ning katioon-p interaktsioonid.

Hüdrofoobse interaktsiooni olulisus väljendub selles, et interaktsioonis osalevad valgu pinnapiirkonnad sisaldavad reeglina rohkem hüdrofoobseid aminohappeid kui valkude teiste piirkondadepinnad. See kehtib nii valk/valk kui ka valk/madalmolekulaarne ligand interaktsiooni jaoks.

Ligand/valk kompleksi moodustumises on oluline geomeetriline ja elektrostaatilne komplementaarsus(vastavus, sobivus). Lähestikku paiknemisel tagab geomeetriline komplementaarsus valgu ja ligandi rühmade optimaalse vastasmõju.

Reeglina domineerib valgu sidumissaidis ligandi laengule vastandmärgiga laeng. Elektrostaatilsed jõud mõjuvad kaugemalt ning soodustavad ligandi difusiooni valgu sidumissaiti. Elektrostaatilistel jõududel on ka orienteeriv mõju. Elektrostaatilste jõudude osakaal sõltub lokaalsest dielektrilise konstandi väärtusest sidumissaidi piirkonnas.

Madalmolekulaarse ligandi sidumissaidiks on tavaliselt süvend või lohk valgu struktuuris. Valk/valk interaktsioonidesidumisalad on seevastu lamedad ja suurema pindalaga.

Valk/ligand interaktsioonide üldiseloomustus

Lukk/võti mudel

Indutseeritud sobivus

Sobiva konforamatsiooni selektsioon

valk

ligand

Kuidas moodustub valk/ligand kompleks?

Näide: Ligand/valk interaktsioon

Atsetüülkoliinesteraas

Atsetüülkoliinesteraas (AKE) on ensüüm, mis osaleb närviimpulside ülekandes, hüdrolüüsides neurotransmitteratsetüülkoliini koliiniks ning äädikhappeks:

AKE

+ H2O+

RetseptoridAtsetüülkoliin

Neuron Neuron

AKE

Valguline toksiin faskikuliin-2 (maost nimega roheline mamba; ing.k. green mamba) on postiivselt laetud ning seostub negatiivselt laetud AKE aktiivtsentri avausse. Sellega blokeerib faskuliin-2 atsetüülkoliini seostumise AKE aktiivtsentrisse, mis paikneb sügavalAKE struktuuris (punase ala keskel). Tugev elektrostaatiline tõmbejõud tagab kiire ja stabiilse kompleksi AKE/faskuliin-2 moodustumise.

faskikuliin

AKE

faskikuliin

AKE

laengute jaotus faskikuliini ja AKE ruumilisesstruktuuris: punane - negatiivselt laetud, sinine –positiivseltlaetud

AKE aktiivtsenter

AKE aktiivtsenter

Kuidas tagatakse atsetüülkoliini (substraadi) kiire seostumine AKE aktiivtsentrisse?

AKE aktiivsait paikneb sügaval ensüümi sees, 20Å kaugusel pinnast. Elektrostaatiline gradient pinnalt kuni põhjaniviib atetüülkoliini AKE aktiivtsentrisse (sellist protsessi nimetatakse elektrostaatiliseks suunamiseks, ing. k. electrostatic steering), mispaikneb süviku põhjas. Aminohappejäägid W84 ja E327, mis asuvad süviku põhjas fikseerivad atestüülkoliini katalüüsi jaoks sobivasse asendisse. Huvitav on see, et negatiivse elektrostaatilise potentsiaali tekkimises osalevad aromaatsed aminohapped W279, Y121 ja F330.

atsetüülkoliin AKE aktiivtsentis

Valk/valk interaktsioonid

Sidumisalade üldiseloomustus:1. Pindala 700-2000Å2

2. Kujult lamedam (tasaem) kui valk/madamolekulaarne ligand interaktsioonide pinnad3. Võrreldes interaktsioonides mitteosalevate pindadega vähem polaarne ning aatomid on tihedamini pakitud;

lisaks on konserveerunud aminohapete osakaal suurem. 4. Hüdrofoobsel efektil on keskne koht komplekside tekkimises, samas määravad elektrostaatilised interaktsioonid

spetsiifilisuse

Valk/valk interaktsioonide üldiseloomustus

BSA, Å2

Kui oluline on interaktsioonis osaleva pinna suurus?Kas on olemas seos pinna suuruse ja afiinsuse vahel?

Interaktsioonis osaleva pinna suuruse hindamiseks määratakse kompleksi tekkimisega kaasneva peidetud pinna pindala BSA (ing. k. buried surface area). See avaldub:

BSA= ASAL + ASAP – ASAPL

ASAL – ligandi pinna suurusASAP – valgu pinna suurusASAPL – kompleksi pinna suurus

-G

(kc

al/m

ol)

Ruut, ring ja kolmnurk tähistavadkolme erinva valgu interaktsiooneerinevate ligandidega

HS aminohappejäägid valk/valk interaktsioonides

Mutantanalüüsiga on tehtud kindlaks, et keskmiselt on iga interaktsioonis osaleva rühma panus sidumisenergiasseligikaudu 0.4 kcal/mool. Siiski on teatud aminohappejääkide panus suurem - G > 1.5 kcal/mool. Neid aminohappejääke kutsutakse inglise keeles „hot spots“ ja kasutatakse lühendit HS. On näidatud, et F, W, Y ja M on kõige sagedamini HSjääkideks. HS aminohappejäägid moodustavad sageli valgu pinnal klastreid (vt joonis).

HS-jäägid

Lühikese eluaega valk/valk kompleks Valk/valk püsikompleks

Interaktsioonis osalevad pinnad on„siledamad“, vähesopistunud

Kompleksimoodustumisega ei kaasne olulisi muutusi konformatsioonides

Interaktsioonis osalevad pinnad ontugevasti sopistunudKompleksimoodustumisega kaasneb reeglina olulisi muutusi mõlema valgu konformatsioonis

Valk/valk interaktsioonitüüpide võrdlus

valk 1 valk 2 valk 3

valk 4

Veemolekulid (rohelised) võivad osaleda komplekside tekkimises, moodustades vesiniksidemete võrgustikuInteraktsioonipartnerite vahel. Veemolekulid on vahendaja rollis.

Näide: Valk/peptiid interaktsioonInteraktsioonis osalev valk on esitatud lillana, peptiid helesinisenaNäidatud on valgu aminohappejäägid, mis osalevad interaktsioonis veemolekulidega: N114, S113, N96, N94 ja H95

Vee osalus valk/ligand kompleksides