Embed Size (px)
Citation preview
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------
Lƣu Thị Thanh Huế
NGHIÊN CỨU BACTERIOCIN CỦA VI KHUẨN Lactobacillus
plantarum PHÂN LẬP TỪ MẪU CHAO TẠI HUẾ
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Hà Nội – Năm 2017
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------
Lƣu Thị Thanh Huế
NGHIÊN CỨU BACTERIOCIN CỦA VI KHUẨN Lactobacillus
plantarum PHÂN LẬP TỪ MẪU CHAO TẠI HUẾ
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60420107
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Nguyễn Quỳnh Uyển
TS. Mai Thị Đàm Linh
Hà Nội – Năm 2017
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Quỳnh Uyển, cán bộViện
Vi sinh học và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình hướng
dẫn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm, giúp tôi giải quyết các vấn đề nảy sinh trong quá
trình làm luận văn và hoàn thành luận văn theo đúng định hướng ban đầu.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới :
TS. Mai Thị Đàm Linh, PGS. TS. Bùi Thị Việt Hà, cán bộ tại Bộ môn Vi
sinh vật học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo điều kiện
bước đầu cho tôi hoàn thành luận văn này.
CN Hoàng Thu Hà, CN Lê Hồng Anh cùng toàn thể cán bộ, sinh viên tại
Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội đã nhiệt tình
giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành luận văn của mình.
Đề tài “Đánh giá nguồn gen vi khuẩn lactic bản địa định hướng ứng dụng
trong thực phẩm, dược phẩm và thức ăn chăn nuôi” - Bộ khoa học và Công nghệ đã
hỗ trợ hóa chất, dụng cụ thí nghiệm trong suốt quá trình thực hiện luận văn.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè và các anh
chị đồng học luôn ở bên giúp đỡ, động viên, khích lệ tôi vượt qua những khó khăn
trong học tập suốt 2 năm vừa qua.
Hà Nội, ngày tháng năm 2017
Học viên
Lƣu Thị Thanh Huế
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN..................................................................................... 3
1.1. Vi khuẩn lactic (LAB) .................................................................................... 3
1.1.1. Đặc điểm hình thái ..................................................................................... 3
1.1.2. Quá trình lên men lactic ............................................................................. 5
1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn lactic. 6
1.2. Ứng dụng của vi khuẩn lactic ........................................................................ 8
1.2.1. Ứng dụng của vi khuẩn lactic nói chung ................................................... 8
1.2.2. Ứng dụng của vi khuẩn L. plantarum ........................................................ 9
1.3.Bacteriocin...................................................................................................... 10
1.3.1. Định nghĩa ............................................................................................... 10
1.3.2. Phân loại .................................................................................................. 10
1.3.3. Cơ chế hoạt động của bacteriocin ........................................................... 11
1.3.4. Đặc điểm của bacteriocin ở các nhóm vi khuẩn ...................................... 12
1.3.5. Các đặc tính của bacteriocin .................................................................... 13
1.3.6. Bacteriocin từ vi khuẩn lactic .................................................................. 14
1.3.7. Phương pháp tinh sạch bacteriocin .......................................................... 17
1.4. Tình hình nghiên cứu bacteriocin từ vi khuẩn lactic ................................ 19
1.4.1. Các nghiên cứu trên thế giới .................................................................... 19
1.4.2. Các nghiên cứu trong nước ...................................................................... 21
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 24
2.1. Nguyên liệu .................................................................................................... 24
2.1.1. Chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum ................................................ 24
2.1.2. Chủng vi khuẩn kiểm định ....................................................................... 24
2.1.3. Môi trường, hóa chất và thiết bị .............................................................. 24
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................. 26
2.2.1. Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp bacteriocin
........................................................................................................................... 27
2.2.2. Một số tính chất của bacteriocin .............................................................. 28
2.2.3. Tinh sạch bacteriocin bằng hệ thống AKTA ........................................... 29
2.2.4. Điện di SDS PAGEvà kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn ........................... 30
2.2.5. Khảo sát khả năng chịu muối mật và pH thấp ......................................... 32
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 33
3.1. Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp bacteriocin
của chủng vi khuẩn L. plantarum UL485 .......................................................... 33
3.1.1. Tối ưu hóa thời gian nuôi cấy .................................................................. 33
3.1.2. Tối ưu hóa nhiệt độnuôi cấy .................................................................... 34
3.2. Một số tính chất của bacteriocin từ chủng vi khuẩn Lactobacillus
plantarum UL485 ................................................................................................. 36
3.2.1. Hoạt độ bacteriocin (AU/ml) ................................................................... 36
3.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính bacteriocin .................................. 37
3.2.3. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính bacteriocin .......................................... 38
3.2.4. Ảnh hưởng của enzym trypsin đến hoạt tính bacteriocin ........................ 40
3.3. Sơ bộ tinh sạch bacteriocin sinh tổng hợp từ chủng Lactobacillus
plantarum UL485 ................................................................................................. 41
3.3.1. Chương trình tinh sạch trên hệ thống AKTA .......................................... 42
3.3.2. Kết quả của quá trình tinh sạch bacteriocintrên hệ thống AKTA ........... 45
3.3.3. Kết quả điện di SDS PAGE và kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn ............. 46
3.4.Khảo sát khả năng chịu pH, muối mật của chủng vi khuẩn Lactobacillus
plantarum UL485 ................................................................................................. 47
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................... 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 51
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
LAB : Lactic Acid Bacteria
CFU : Colony Formong Unit
AU : Activity Unit
kDa : Kilo Dalton
SDS : Sodium dodecyl sulfate
SDS PAGE : Sodium Dodecyl Sulphate
Polyacrylamide Gel Electrophoresis
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Độ bền nhiệt, pH và enzym thủy phân của một số bacteriocin sinh tổng
hợp bởi vi khuẩn lactic ............................................................................ 13
Bảng 1.2: Các bacteriocin phổ biến được tổng hợp bởi vi khuẩn lactic ................... 14
Bảng 1.3: Một số bacteriocin sản xuất bởi L. plantarum được phân lập từ các mẫu
thực phẩm khác nhau ............................................................................... 15
Bảng 1.4: Tinh sạch một số bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn
Lactobacillus plantarum .......................................................................... 18
Bảng 2.1: Các chủng vi khuẩn kiểm định ................................................................. 24
Bảng 2.2: Thành phần của gel sử dụng trong điện di Trixin - SDS PAGE .............. 30
Bảng 2.3: Thành phần của gel sử dụng trong điện di Glyxin - SDS PAGE ............. 31
Bảng 3.1: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt tính bacteriocin của chủng vi
khuẩn L. plantarum UL485 ..................................................................... 34
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến hoạt tính bacteriocin của chủng vi
khuẩn Lactobacillus plantarum UL485 ................................................... 35
Bảng 3.3: Hoạt độ AU của L. plantarum UL485 với 5 chủng vi khuẩn kiểm định .. 36
Bảng 3.4: Tổng kết quá trình tinh sạch bacteriocin của chủng L. plantarum UL485
bằng cột sắc ký trao đổi cation ................................................................ 45
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Cơ chế hoạt động của bacteriocin .......................................................... 12
Hình 2.1: Sơ đồ quy trình thí nghiệm ..................................................................... 27
Hình 2.2: Cách pha loãng mẫu theo hệ số 2 ........................................................... 28
Hình 3.1: Hoạt tính bacteriocin của chủng vi khuẩn L. plantarum UL485 với
KĐ28 tại các thời điểm nuôi cấy khác nhau .......................................... 33
Hình 3.2: Hoạt tính bacteriocin của chủng vi khuẩn L. plantarumUL485 với
KĐ28 tại các nhiệt độ nuôi cấy khác nhau ............................................. 35
Hình 3.3: Hoạt tính bacteriocin từ chủng L. plantarum UL485 ở 60oC, 100
oC,
121oC ...................................................................................................... 37
Hình 3.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính bacteriocin của chủng
Lactobacillus plantarum UL485 ............................................................ 38
Hình 3.5: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính bacteriocin của chủng
Lactobacillus plantarumUL485 ............................................................. 39
Hình 3.6: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính bacteriocin của L. plantarum
UL485 .................................................................................................... 39
Hình 3.7: Ảnh hưởng của enzym trypsin đến hoạt tính bacteriocin của chủng
Lactobacillus plantarumUL485 ............................................................. 40
Hình 3.8: Sắc ký đồ dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus plantarumUL485
qua cột Hitrap SP FF 1 ml ...................................................................... 42
Hình 3.9: Kết quả kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn các phân đoạn sắc ký với
KĐ28 ...................................................................................................... 43
Hình 3.10: Sắc ký đồ dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus plantarumUL485
qua cột Hitrap SP FF 1 ml ...................................................................... 44
Hình 3.11: Kết quả kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn các phân đoạn rửa giải với
KĐ28 ...................................................................................................... 44
Hình 3.12: Điện di Glyxin – SDS PAGE 18% ......................................................... 47
Hình 3.13: Khả năng chịu pH thấp, muối mật của chủng vi khuẩn
Lactobacillus plantarum UL485 ............................................................ 48
1
MỞ ĐẦU
Hiện nay, các loại chất phụ gia ngày càng được sử dụng phổ biến trong quá
trình sản xuất, chế biến và bảo quản thực phẩm nhằm cải thiện hương vị, duy trì
chất lượng dinh dưỡng cũng như độ tươi của sản phẩm. Tuy nhiên, hiện tượng lạm
dụng quá mức các chất này đã làm gia tăng tình trạng ngộ độc thực phẩm và mang
lại nhiều tác hại cho sức khỏe người tiêu dùng. Bởi vậy, việc nghiên cứu các chất
kháng khuẩn để ứng dụng trong bảo quản thực phẩm cần phải đi theo một hướng
mới, hiệu quả hơn, an toàn hơn. Khác với những hóa chất phụ gia và kháng sinh,
bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất peptit hoặc protein được tổng hợp theo
con đường riboxom ở vi khuẩn, có hoạt tính kìm hãm, ức chế sự phát triển của một
số vi khuẩn. Bacteriocin đã được công nhận là an toàn, không gây dị ứng và không
gây hại cho sức khỏe con người do nó bị phân hủy bởi proteinaza, lipaza ở đường
ruột. Điển hình là nisin, một chất bảo quản được bổ sung trong các loại rau, sữa,
pho mát, thịt…do nó có khả năng ức chế các vi sinh vật làm hỏng thực phẩm. Từ đó,
có thể thấy rằng, việc ứng dụng các bacteriocin có nguồn gốc từ vi khuẩn và các
bacteriocin có nguồn gốc tự nhiên sẽ mang lại những lợi ích vô cùng to lớn cho
cuộc sống của con người.
Những năm gần đây, vi khuẩn lactic (Lactic Acid Bacteria - LAB) đã được
ứng dụng trong nhiều ngành sản xuất, đặc biệt là ngành công nghiệp thực phẩm và
một số ngành chế biến khác vì chúng có khả năng sinh axit, tạo hương và ức chế sự
phát triển của một số vi khuẩn nhờ khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. Trong đó,
nhóm vi khuẩn Lactobacillus plantarum được đánh giá là ứng cử viên tiềm năng
trong việc sinh tổng hợp bacteriocin có khả năng tiêu diệt các tác nhân gây bệnh
như Listeria monocytogenes, Clostridium botulinum và Staphylococcus aureus.
Đã có nhiều công bố nghiên cứu sâu về bacteriocin từ vi khuẩn Lactobacillus
plantarum, bao gồm cả tinh sạch cũng như xácđịnhcác bacteriocin mới để ứng dụng
trong công nghệ thực phẩm nhằm mục đích kéo dài thời gian bảo quản, chống lại sự
phát triển của các tác nhân gây bệnh, điều trị một số bệnh và duy trì sức khỏe cho
con người. Tuy nhiên để có thể sử dụng bacteriocin, cần thiết phải chọn lựa những
chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp bacteriocin có phổ hoạt tính rộng hoặc có
2
hoạt độ cao để nghiên cứu sâu về bacteriocin đó nhằm tạo tiền đề cho việc thu nhận,
ứng dụng trong thực tế.
Xuất phát từ thực tiễn đó cùng với xu hướng chú trọng việc ứng dụng các
bacteriocin trong đời sống, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu bacteriocin
của vi khuẩn Lactobacillus plantarum phân lập từ mẫu chao tại Huế” nhằm góp
phần khai thác tiềm năng ứng dụng của các bacteriocin sinh tổng hợp từ vi khuẩn
LAB được phân lập từ các mẫu thực phẩm ở Việt Nam.
3
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Vi khuẩn lactic (LAB)
Vi khuẩn lactic đã được phát hiện và nghiên cứu từ rất lâu. Năm 1780, nhà
hóa học Scheele (Thụy Điển) lần đầu tiên tách chiết được axit lactic từ sữa bò lên
men chua. Sau đó, năm 1847, Blondeau đã công nhận axit lactic là sản phẩm cuối
cùng của chuỗi phản ứng lên men. Đến năm 1857, Louis Pasteur chứng minh rằng
việc làm sữa chua là kết quả hoạt động của một nhóm vi khuẩn đặc biệt gọi là vi
khuẩn lactic. Năm 1873, Lister đã phân lập thành công vi khuẩn lactic đầu tiên và
đặt tên là Bacterium lactics (hiện nay gọi là Streptococcus lactis). Từ đó đến nay,
nhiều loại vi khuẩn lactic khác nhau đã được phân lập, định danh và ngành công
nghiệp lên men để sản xuất axit lactic (hình thành từ năm 1881) được phát triển, mở
rộng[25,40,45].
Trong tự nhiên, vi khuẩn lactic có mặt ở nhiều điều kiện môi trường khác
nhau, chẳng hạn như trong phân, rác, niêm mạc ruột và đặc biệt là trong các sản
phẩm lên men chua. Ngày nay, vi khuẩn lactic ngày càng được ứng dụng trên quy
mô lớn, đặc biệt những chủng có hoạt tính sinh học cao thuộc chi Lactobacillus,
Streptococcus,...[33].
1.1.1. Đặc điểm hình thái
1.1.1.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic là tên gọi của một nhóm vi khuẩn thu nhận năng lượng nhờ
quá trình phân giải cacbonhydrat kị khívà sinh ra axit lactic. Chúng được xếp chung
vào họ Lactobacteriaceae. Mặc dù nhóm vi khuẩn này không đồng nhất về mặt
hình thái, bao gồm cả dạng que ngắn, que dài và hình cầu, song về mặt sinh lí chúng
lại tương đối thống nhất với nhau ở các đặc điểm:
Đều là vi khuẩn Gram dương
Không hình thành bào tử
Hầu hết không di động
Là vi sinh kị khí tùy ý.
Vi khuẩn lactic bao gồm các chi: Aerococcus, Alloiococcus, Carnobacter,
Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus,
Tetragenococcus, Streptococcus, Vagococcus và Bifìdobacterium. Trong đó, các vi
4
khuẩn thuộc chi Lactobacillus chiếm số lượng lớn nhất vàStreptococcus,
Leuconostoc, Lactococcusđược ứng dụng nhiều nhất trong ngành công nghiệp thực
phẩm [30].
Streptococcus
Tế bào có hình cầu hay hình oval, đường kính nhỏ hơn 2 m, xếp thành dạng
đôi, dạng chuỗi ngắn hoặc dài, ưa ấm, nhiệt độ sinh trưởng thích hợpkhoảng 37oC.
Vi khuẩn thuộc chi này có khả năng phân giải nhiều loại đường khác nhau như
glucozơ, mantozơ, lactozơ và đóng vai trò quan trọng trong việc tạo hương vị cho
sản phẩm, nhất là chất lượng của các sản phẩm làm từ sữa [53].
Leuconostoc
Tế bào hình oval xếp thành từng đôi, chuỗi ngắn hoặc chuỗi dài. Chúng có
nhu cầu cao về mặt dinh dưỡng. Quá trình lên men dị hình của chúng tạo thành axit
lactic và các sản phẩm phụ như axit axetic, etanol, CO2. Bên cạnh đó, vi khuẩn
thuộc chi Leuconostoc còn có khả năng tạo hương thơm cho bơ, sữa chua do tạo
thành các chất như axetyl metyl cacbinol hay axetonin [53].
Bifidiobacterium
Là những trực khuẩn kị khí, lên men lactic dị hình; sản phẩm chính là axit
lactic và axit axetic cùng với một lượng nhỏ axit formic, etanol, axit sucxinic. Không
giống với các vi khuẩn lên men lactic dị hình khác, chi Bifidiobacterium không sinh
CO2. Chúng thuộc loại ưa ấm và có nhiệt độ sinh trưởng tối ưu từ 31oC - 41
oC [53].
Lactobacillus
Tế bào không di động, có hình que dài hoặc ngắn, thường xếp thành hình
chuỗi với kích thước dao động trong khoảng 0,5 – 1,2 x 1 - 10 m. Hầu hết vi
khuẩn thuộc chi này là dạng kỵ khí không bắt buộc, một số ít chủng kỵ khí nghiêm
ngặt, có thể sinh trưởng ở nhiệt độ từ 50oC – 53
oC nhưng nhiệt độ sinh trưởng tối
ưu từ 30oC – 40
oC. Ngoài ra, chúng có thể sống ở điều kiện pH < 5 [53].
Lactobacillus gồm 25 loài, được chia thành 3 nhóm: lên men lactic đồng
hình bắt buộc, lên men lactic dị hình bắt buộc và lên men lactic dị hình tùy ý. Các
nhóm vi khuẩn lactic này đều tạo ra axit lactic nhưng axit do từng nhóm tạo ra lại
khác nhau về cấu hình đồng phân. Lactobacillus được ứng dụng nhiều trong công
nghiệp chế biến và bảo quản sữa, phomat, thịt, các chế phẩm probiotic [53].
5
1.1.1.2. Đặc điểm của Lactobacillus plantarum
Nằm trong chi vi khuẩn lactic có số lượng lớn nhất này, L. plantarum là
một trong những loài phổ biến nhất và đang được ứng dụng rộng rãi trong ngành
công nghệ thực phẩm. L. plantarum có dạng hình que, thường kết đôi hoặc chuỗi và
sinh trường tốt trong điều kiện vi hiếu khí. Tính chất đặc trưng của L. plantarum là
khả năng dị hóa arginin và sinh ra nitric oxit. L. plantarum không có khả năng phân
giải amino axit, ngoại trừ tyrosin và arginin. Chúng có đến 6 con đường chuyển hóa
arginin khác nhau và đều sinh ra nitric oxit (NO). Việc sinh ra NO giúp chúng ngăn
chặn các vi sinh vật gây bệnh như Candida abicans, Escherichia coli, Shigella,
Helicobacter pylory, các amip và kí sinh trùng [36]. Loài vi khuẩn này có khả năng
chịu axit thấp, được xếp vào nhóm vi sinh vật an toàn và có mối quan hệ gần gũi
với loài Lactobacillus pentosus, Lactobacillus paraplantarum và gần đây nhất là
Lactobacillus fabifermentans (mức độ tương đồng về trình tự rARN lên tới 99%)
[28]. L. plantarum có thể được tìm thấy trong các loại thực phẩm giàu tinh bột, các
loại ngũ cốc, thịt, sản phẩm từ sữa, rau, trái cây, đồ uống,…Nó tồn tại được trong
dạ dày, đường ruột của con người và các động vật có vú khác. Một số nghiên cứu
của Brinques và cộng sự (2010), Prins và cộng sự (2010), Todorov (2008) cho rằng,
khả năng thích ứng với các điều kiện môi trường khác nhau của L. plantarum là nhờ
quá trình lên men hỗn hợp hàng loạt cacbonhydrat[28].
L. plantarum sở hữu bộ gene lớn nhất trong số các vi khuẩn lactic với nhiễm
sắc thể dạng vòng có chứa 3.308.274 cặp base, % GC của nhiễm sắc thể là 44,5%
và các plasmid có % GC thấp hơn. L. plantarumWCFS1 có ba plasmid là
pWCFS101, pWCFS102, và pWCFS103 với kích thước tương ứng là 1.917 bp,
2.365 bp và 36.069 bp. Trình tự gen trên nhiễm sắc thể có tính có tính đa dạng di
truyền giúp vi khuẩn L. plantarum thích ứng với nhiều điều kiện môi trường khác
nhau[39].
1.1.2. Quá trình lên men lactic
Lên men lactic là quá trình chuyển hóa đường trong điều kiện kị khí với sản
phẩm là axit lactic tích lũy trong môi trường. Quá trình này có thể tóm tắt theo
phương trình sau:
6
Các loài vi khuẩn lactic khác nhau về cơ chế chuyển hóa glucozơ. Một vài
loài vi khuẩn lactic trải qua quá trình đường phân trong điều kiện kị khí tạo axit
lactic và nhóm này được gọi là lên men đồng hình. Một số nhóm khác ngoài axit
lactic còn tạo ra rượu, CO2 và nhóm này được gọi là lên men dị hình [19,21].
1.1.2.1. Lên men lactic đồng hình
Các vi khuẩn lactic lên men đồng hình phân giải đường theo con đường EMP
(Embden - Meyerhof – Parnas Pathway) và tạo ra sản phẩm chủ yếu là axit lactic
(hơn 85%). Phương trình tóm tắt của quá trình lên men đồng hình như sau:
C6H12O6 + 2ADP + 2Pi 2CH3CHOHCOOH + 2ATP
GlucozơAxit lactic
Một số vi khuẩn lactic lên men đồng hình thường gặp là Lactococus lactis,
L.casei, L. delbrueckii,…[19,21].
1.1.2.2. Lên men lactic dị hình
Ngoài axit lactic (chiếm đến 50%), quá trình lên men lactic dị hình còn có
các sản phẩm phụ khác như etanol, axetat, CO2,…. Phương trình tóm tắt của quá trình lên
men dị hình như sau:
C6H12O6CH3CHOHCOOH + CH3CH2OH + CO2 + xKcal
GlucozơAxit lactic Etanol
Một số vi khuẩn lactic lên men dị hình thường gặp là L. amylovorus, L.
reuteri, L. manihotivorans,... [19,21].
1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn
lactic.
1.1.3.1. Cacbonhydrat
Cacbonhydrat là nguồn cung cấp cacbon và năng lượng thiết yếu cho sự sinh
trưởng của vi khuẩn lactic. Ngoài ra, cacbon cũng có thể được lấy từ protein, axit
aminvà glyxerol. Vi khuẩn lactic sử dụng được hầu hết các loại đường, song
7
glucozơ là nguồn cacbon thích hợp nhất và tùy từng loại LAB khác nhau mà nguồn
cacbon phù hợp được lựa chọn. Chẳng hạn như L. acidophilus sinh trưởng mạnh
hơn khi thay thế glucozơ bằng mantozơ, salicin, raffinozơ hoặc melibiozơ; L.
fermentum sinh trưởng tốt nhất với nguồn cacbon là maltozơ; S. thermophilus phát
triển mạnh trong môi trường có lactozơ,… [21].
1.1.3.2. Axit amin và peptit
Nitơ ở dạng axit amin hoặc peptit là nguồn dinh dưỡng rất quan trọng cho
quá trình phát triển sinh khối của vi khuẩn lactic. Axit amin và peptit có thể thu
nhận qua các hoạt động của enzym proteaza hoặc sự phân giải protein. Theo đó,
các peptit sẽ được chuyển hóa thành các axit amin tự do và một số hợp chất khác.
Quá trình sinh trưởng của LAB phụ thuộc vào nguồn cung cấp nitơ hữu cơ do vi
khuẩn này ít có khả năng sinh tổng hợp axit amin từ nguồn nitơ vô cơ. Nhu cầu
axit amin của LAB khác nhau tùy theo chủng, loài. Ví dụ, chỉ có 3 axit amin cần
thiết cho sự phát triển của vi khuẩn L. plantarum trong khi L. acidophilus cần tới
14 axit amin [21].
1.1.3.3. Vitamin
Nhu cầu vitamin của vi khuẩn lactic có thể phân chia thành 3 nhóm: vitamin
thiết yếu, vitamin kích thích và vitamin không thiết yếu. Sự sinh trưởng và phát
triển của vi khuẩn lactic có thể giảm từ 34 – 67% nếu không có các nhóm vitamin
này trong môi trường dinh dưỡng. Trong đó, axit pantothenic (vitamin B5), axit
riboflavin (vitamin B2) và axit nicotinic (vitamin B3 hay vitamin PP) là những loại
vitamin rất cần thiết cho hầu hết các chủng LAB.Khi thiếu riboflavin, sự sinh
trưởng L. plantarum bị ức chế hoàn toàn. Một số vitamin (chẳng hạn như vitamin H,
vitamin C,…) có thể là yếu tố kích thích cho sự tăng trưởng của một số chủng LAB
nhưng lại không ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của một số chủng LAB khác [21].
1.1.3.4. Khoáng chất
Các khoáng chất cần thiết cho sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic là hỗn hợp
chứa các ion như kali, natri, magiê, mangan, sắt, clo và photphat. Trong đó, Mn2+
có tác động tích cực đến sự phát triển và quá trình sản sinh ra axit lactic. Ngoài ra,
Mg2+
còn tham gia vào trung tâm hoạt động của một số enzym hoặc đóng vai trò
hoạt hóa các enzym xúc tác trong quá trình lên men lactic, nhờ đó hỗ trợ vi khuẩn
8
sử dụng tốt hơn các loại đường. Mg2+
là khoáng chất thiết yếu cho sự phát triển
của các vi khuẩn L. casei, L. lactis, L. delbrueckii, L. helveticus và L. acidophilus .
Ngoài ra, nó đảm nhiệm chức năng là cofactor đối với nhiều enzym liên quan đến
quá trình vận chuyển và trao đổi chất như fructokinaza, photphoketolaza và axetat
kinaza [21].
1.1.3.5. Nhiệt độ
Khoảng nhiệt độ phát triển của vi khuẩn lactic khá rộng, trải dài từ 15oC –
40oC. Trong đó, 24 – 30
oC là khoảng nhiệt độ tối ưu nhất cho sự phát triển của LAB
cũng như quá trình lên men để tạo ra axit lactic. Các loài có nhiệt độ phát triển tối
ưu trong khoảng 40oC – 45
oC được gọi là vi khuẩn ưa nhiệt; các loài có nhiệt độ
phát triển tối ưu trong khoảng 20oC - 40
oC được gọi là vi khuẩn ưa ấm. Những loài
vi khuẩn lactic sống trong đường ruột của người và động vật hầu hết thuộc loại ưa
ấm[50].
1.1.3.6. pH
Vi khuẩn lactic hoạt động trong dải pH rộng. Khả năng điều chỉnh pH trong
tế bào chất là một trong những đặc điểm sinh lý quan trọng nhất giúp cho vi khuẩn
này có khả năng chịu axit thấp hơn so với nhiều loài vi khuẩn khác. Đa số các vi
khuẩn lactic có dải pH tối ưu cho sự phát triển là 5,5 - 6,2 (Lactobacilus); 6 – 6,5 (L.
plantarum); 5,5 - 6,5 (Pediococcus) và 6,3 - 6,5 (Leuconostoc)[50].
1.2. Ứng dụng của vi khuẩn lactic
1.2.1. Ứng dụng của vi khuẩn lactic nói chung
Vi khuẩn lactic được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như
công nghiệp, nông nghiệp, chế biến bảo quản thực phẩm, y học,… để sản xuất các
chế phẩm sinh học phục vụ đời sống. Trong công nghiệp chế biến thực phẩm, vi
khuẩn này được sử dụng để lên men các sản phẩm từ sữa, từ thịt và tạo ra các phụ
gia thực phẩm. Đáng kể nhất hiện nay là việc ứng dụng vi khuẩn lactic trong sản
xuất các chế phẩm sinh học để phục vụ nông nghiệp, chống ô nhiễm và bảo vệ môi
trường [36].
Trong quá trình lên men, ngoài axit lactic, vi khuẩn lactic còn sản sinh nhiều
hoạt chất có giá trị như chất thơm, vitamin, bacteriocin,… Do đó, chúng được sử
dụng trong ủ chua thức ăn gia súc nhằm tăng hàm lượng dinh dưỡng và năng suất
9
trong chăn nuôi. Một số chủng vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiều nhất là L.
plantarum, Leuconostoc mesenteroides [36].
1.2.2. Ứng dụng của vi khuẩn L. plantarum
Rất nhiều ứng dụng gắn liền với L. plantarum trong quá trình sản xuất các chế
phẩm probiotic đã được công bốtrên các tạp chí khoa học uy tín. Hầu hết các nghiên
cứu đều cho rằng, vi khuẩn lactic nói chung và L. plantarum nói riêng có vai trò bảo
vệ, tăng cường chức năng đường ruột và cải thiện các triệu chứng ruột kích thích.
Ngoài ra, L. plantarum còn tác động tích cực đến hệ vi sinh vật trong đường ruột, quá
trình chuyển hóa lipit và làm giảm hội chứng viêm[36].
Vi khuẩn L. plantarum có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin hiện diện tự
nhiên trong nhiều nguồn thực phẩm khác nhau, do vậy nó góp phần cải thiện đặc
tính cảm quan và đóng một vai trò thiết yếu trong việc kéo dài thời hạn sử dụng
thực phẩm. Nhờ đó, những phương pháp xử lý vật lý sử dụng trong quá trình bảo
quản thực phẩm có khả năng được giảm thiểu. Do vậy, L. plantarum đáp ứng các
yêu cầu của người tiêu dùng trong việc sử dụng thực phẩm tươi sống và thực phẩm
đóng gói chứa ít hàm lượng chất bảo quản. Trong lĩnh vực y học, các ứng dụng của
L. plantarum được các nhà khoa học quan tâm nhờ khả năng bảo vệ bề mặt da và
điều trị nhiễm trùng vết thương gây ra do bỏng [36].
Một ứng dụng khác của L. plantarum liên quan đến việc xử lý mùi phân của
heo, đặc biệt là ở các trang trại lớn. Bình thường, chế độ ăn uống có thể giảm bớt
mùi hôi này nhưng lại tốn kém và hạn chế khả năng tiêu hóa chất dinh dưỡng.
Trong khi đó, việc bổ sung vi khuẩn L. plantarum vào chế độ ăn của heo, có hoặc
không bổ sung insulinlàm giảm đáng kể mùi phân của heo mà không ảnh hưởng đến
quá trình tiêu hóa thức ăn [36].
Nhờ khả năng ngăn chặn sự bám dính của E.coli vào màng nhầy, L.
plantarum làm giảm hoạt động của nội độc tố do E.coli tiết ra, đồng thời đóng vai
trò quan trọng trong việc chống lại các vi sinh vật gây bệnh. Ngoài ra, L.
plantarum cũng hỗ trợ tiêu hóa các chất xơ có trong lúa mì, lúa mạch đen, men
bia,… Do đó, những vấn đề tiêu hóa như đầy hơi, chướng bụng được cải thiện
đáng kể. L. plantarum còn được chứng minh là có khả năng làm giảm cholesterol
khi chúng hoạt động riêng lẻ hoặc kết hợp với Lactobacillus paracasei trong khẩu
10
phần ăn của chuột. Bên cạnh vai trò là giống khởi động trong quá trình lên men
thực phẩm, vi khuẩn L. plantarum và bacteriocin của nó cũng được ứng dụng rộng
rãi trong sản xuất các sản phẩm probiotic [18,36].
1.3.Bacteriocin
Công trình đầu tiên và lâu đời nhất về bacteriocin là công trình của Gratia và
cộng sự vào năm 1925. Họ đã nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của colicin V
được sinh tổng hợp bởi E. coli. Định nghĩa về bacteriocin đầu tiên đã dựa trên đặc
tính của colicin. Đó là một chất có khả năng gây chết nhiều vi sinh vật, có phổ hoạt
động hẹp và phổ hoạt động này bị giới hạn ở những loài tương tự như vi khuẩn sản
xuất. Các loài vi khuẩn Gram dương được nghiên cứu về khả năng sản sinh
bacteriocin lúc bấy giờ là: Bacillus sp.; Listeria sp. và Staphylococcus sp. Số lượng
công bố nghiên cứu về bacteriocin trong những năm 1980 đã có sự gia tăng đáng kể.
Từ thời điểm này những nghiên cứu về bacteriocin với định hướng như một chất
kháng khuẩn an toàn trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm đã bắt đầu phát triển [15].
1.3.1. Định nghĩa
Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất peptit hoặc protein được tổng
hợp theo con đường riboxom ở cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương để chống lại
các vi khuẩn khác có quan hệ gần gũi với chúng. Bacteriocin không gây dị ứng và
không gây hại cho sức khỏe con người (do nó bị phân hủy bởi proteinaza, lipaza ở
đường ruột) [10].
1.3.2. Phân loại
Cho đến nay có khoảng 200 loại bacteriocin đã được xác định. Các
bacteriocin rất đa dạng về cấu trúc và chức năng. Tuy nhiên, việc phân loại
bacteriocin hiện vẫn chưa được rõ ràng và đang còn tranh cãi. Các bacteriocin
thường được phân loại dựa trên các tiêu chí khác nhau. Trong đó, phương pháp
phân loại được chấp nhận và sử dụng phổ biến là dựa trên trọng lượng phân tử, cấu
trúc và một số đặc tính của bacteriocin. Theo đó, bacteriocin được chia thành 4 lớp:
lớp I, lớp II lớp III và lớp IV. Bacteriocin lớp I và lớp II là đối tượng được tìm hiểu
và nghiên cứu nhiều hơn hơn hai lớp còn lại [31].
11
1.3.2.1. Lớp I
Bacteriocin lớp I hay còn gọi là Lanbiotic là những peptit nhỏ (< 5 kDa), bền
nhiệt và tác động lên cấu trúc màng. Một bacteriocin tiêu biểu và được nghiên cứu
sâu của nhóm này là nisin. Các lantibiotic được chia thành 2 phân lớp là Ia, Ib dựa
trên cấu trúc hóa học và phương thức hoạt động [31,47].
1.3.2.2. Lớp II
Lớp II còn được gọi là lớp Non-Lanbiotic, bao gồm các bacteriocin có trọng
lượng phân tử <10 kDa, bền nhiệt và không chứa lanthionine. Các bacteriocin lớp II
có thể chia thành 3 phân lớp là IIa, IIb và IIc [31,47].
1.3.2.3.Lớp III
Lớp III bao gồm những peptit lớn, có trọng lượng phân tử > 30 kDa và
không bền nhiệt. Hầu hết các bacteriocin lớp này được phân lập từ các vi khuẩn
thuộc chi Lactobacillus. Đại diện cho lớp III là helveticin J được sản xuất bởi vi
khuẩn L. helveticus 481, lactacin B được sản xuất bởi L. acidophilus [31,47].
1.3.2.4. Lớp IV
Hiện nay có rất ít nghiên cứu về lớp này. Một cách tổng quát, các bacteriocin
lớp IV được định nghĩa là các bacteriocin phức tạp có chứa các nhóm chức lipit
hoặc cacbonhydrat. Ví dụ về bacteriocin của lớp này là các glycoprotein (lactocin
27), lipoprotein (lacstrepcins),…[31,47].
1.3.3. Cơ chế hoạt động của bacteriocin
Bacteriocin đóng vai trò như một hệ thống miễn dịch tự nhiên của vi khuẩn.
Theo đó, các vi khuẩn Gram dương và Gram âm có thể sinh tổng hợp nhiều loại
bacteriocin nhằm kìm hãm hoặc ức chế sự phát triển của một số vi khuẩn khác.
12
Hình 1.1: Cơ chế hoạt động của bacteriocin [51]
Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là protein hay peptit được tổng
hợp theo con đường riboxom. Khi được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn sản xuất,
bacteriocin có thể kết hợp với các thụ thể tương ứng trên bề mặt tế bào của các vi
khuẩn nhạy cảm để tiêu diệt vi khuẩn. Các bacteriocin có thể tạo thành các kênh
làm thay đổi tính thấm của màng tế bào; nó cũng có thể đóng vai trò như một loại
nucleazavới chức năng phân giải ADN, ARN hoặc tấn công vào lớp peptidoglycan
để làm suy yếu thành tế bào (Hình 1.1) [51].
1.3.4. Đặc điểm của bacteriocin ở các nhóm vi khuẩn
Bacteriocin được sinh tổng hợp ở cả vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram
dương với những đặc điểm sau:
Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm: Gồm nhiều loại khác nhau về kích
thước, kiểu tác động và cơ chế miễn dịch. Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm có
phổ kháng khuẩn hẹp hoặc có hoạt độ yếu hơn bacteriocin của vi khuẩn Gram
dương [43].
Bacteirocin của vi khuẩn Gram dƣơng: Các bacteriocin này rất đa dạng.
Tuy nhiên, quá trình sinh tổng hợp bacteriocin ở vi khuẩn Gram dương không gây
chết vi sinh vật chủ và quá trình này cần nhiều gen hơn ở vi khuẩn Gram âm [43].
13
1.3.5. Các đặc tính của bacteriocin
1.3.5.1. Tính chất hóa học
Bacteriocin có bản chất là protein, nhưng cũng có thể là hỗn hợp của protein
với các chất khác. Các enzym đặc trưng như proteinaza, lipaza,…được sử dụng để
kiểm tra bản chất protein. Phân tích hóa học cho thấy, bacteriocin là loại protein
đơn giản, có trọng lượng phân tử thấp. Tuy nhiên, bacteriocin đã được tinh sạch
từmột số vi khuẩn như Staphylococcus, Clostridium và Lactobacillus cho thấy
chúng là những phân tửphức tạp (ngoài cấu trúc protein chúng còn có thêm nhóm
chức lipit hoặccacbonhydrat)[12,41].
1.3.5.2. Tính chất vật lý
Các đặc tính lý học về độ bền nhiệt, pH hoạt động và khả năng bị thủy
phân bởi enzym của một số bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn lactic được
thể hiện trong Bảng 1.1.
Bảng 1.1: Độ bền nhiệt, pH và enzym thủy phân của một số bacteriocin sinh
tổng hợp bởi vi khuẩn lactic [22]
Bacteriocin Độ bền nhiệt pH hoạt động Enzym thủy phân bacteriocin
Megacin A-216 600C, 30 phút 2 – 7 Chymotrypsin, Pepsin, Trypsin
Clostosin A 1000C, 30 phút 4 – 9 Trypsin,Chymotrypsin, Dnaza,
Pronaza P, Rnaza
Clostosin B 800C, 10 phút 4 – 9 Trypsin, Chymotrypsin, Dnaza,
Pronaza P, Rnaza
Clostosin C 800C, 10 phút 4 – 9 Trypsin, Chymotrypsin, Dnaza,
Pronaza P, Rnaza
Clostosin D 1000C, 30 phút 4 – 9 Trypsin, Chymotrypsin, Dnaza,
Pronaza P, Rnaza
Boticin E-S5 1000C, 10 phút 1,1 – 9,5 Trypsin, Chymotrypsin, Dnaza,
Pepsin
Bioticin P 600C, 30 phút 6,5 – 7,5 Trypsin, Rnaza,
Alkalinphotphataza,
Photpholipaza C, D
Butyricin 7423 1000C, 10 phút 2 – 12 Trypsin
Perfringocin 11105 1000C, 30 phút 2 – 12 Trypsin
14
1.3.6. Bacteriocin từ vi khuẩn lactic
1.3.6.1. Bacteriocin từ vi khuẩn lactic nói chung
Ngày nay, các chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin được nghiên cứu nhiều
hơn do tính ưu việt của chúng trong bảo quản thực phẩm cũng như tính an toàn với
người sử dụng như không độc với tế bào nhân chuẩn và ít ảnh hưởng đến quần xã
sinh vật trong đường ruột. Thêm vào đó, bacteriocin hoạt động trong khoảng pH
rộng, có khả năng chống lại nhiều vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm, có cơ chế hoạt
động dựa trên màng tế bào vi khuẩn nên không gây ra tính kháng chéo với các
kháng sinh và thường được mã hóa bởi các gen nằm trên plasmid nên thuận tiện cho
thao tác di truyền là các ưu điểm của vi khuẩn lactic sinh bacteriocin[23,43].
Vi khuẩn lactic từ lâu đã được sử dụng trong thực phẩm vì chúng có hoạt
tính kháng các loại vi sinh vật khác. Đặc tính này là do vi khuẩn lactic sinh axit hữu
cơ và bacteriocin kháng khuẩn, kháng nấm. Rất nhiều bacteriocin đã và đang được
nghiên cứu ứng dụng trong bảo quản thực phẩm để chống lại các vi khuẩn tạp
nhiễm như Listeria, Clostridia, Bacilli,…[11].
Các bacteriocin phổ biến nhất do các chủng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp
được tóm tắt trong Bảng 1.2[52].
Bảng 1.2: Các bacteriocin phổ biến đƣợc tổng hợp bởi vi khuẩn lactic [52]
Bacteriocin Vi khuẩn lactic sản sinh bacteriocin
Lactacin F L. johnsonii spp.
Lactocin 705 L. casei spp.
Lactoccin G L. lactis spp.
Lactococcin MN Lactococcus lactis var cremoris
Nisin Lactococcus lactis spp.
Leucocin Leuconostoc spp.
Plantaricin EF, Plantaricin W
Plantaricin JK, Plantaricin S L. plantarum spp.
15
1.3.6.2. Bacteriocin từ vi khuẩn L. plantarum
Rất nhiều bacteriocin sinh tổng hợp từ L. plantarum đã được phát hiện và
nghiên cứu. Bảng 1.3 thể hiện các đặc điểm của một số bacteriocin được sản sinh
bởi vi khuẩn L. plantarum phân lập từ các sản phẩm lên men khác nhau [36].
Bảng 1.3: Một số bacteriocin sản xuất bởi L. plantarum đƣợc phân lập từ các
mẫu thực phẩm khác nhau [36]
Mẫu
phân
lập
Chủng vi
khuẩn Bacteriocin Đặc điểm cấu trúc Vi sinh vật bị ức chế
Thịt
L.plantarum
UG1
Plantaricin
UG1
Chuỗi peptit đơn, khối
lượng phân tử từ 3 – 10
kDa
L. monocytogenes, B. cereus,
C. perfringens,
C. sporogenes
L.plantarum
LT154 Plantacin 154
Chuỗi peptit đơn, khối
lượng phân tử nhỏ hơn
hoặc bằng 3 kDa
S. aureus, L.monocytogenes,
A. hydrophila
L.plantarum
SA6 Plantaricin SA6
Chuỗi peptit đơn, khối
lượng phân tử khoảng
3,4 kDa
L. plantarum,
Lactobacillus brevis,
Leuconostoc spp.,
Listeria grayi
L.plantarum
ST202Ch
ST216Ch
BacSt202Ch,
bacST216
Chuỗi peptit đơn với
khối lượng phân tử
tương ứng là 3,5 kDa và
10 kDa
Enterococcus faecium,
E. coli, L.monocytogenes
Pseudomonas spp.,
S. aureus
Cá
L.plantarum
PMU 33
ST28MS,
ST16MS
Chuỗi peptit đôi ( và
peptit), khối lượng phân
tử tương ứng là 3,2 kDa
và 3 kDa
L. monocytogenes, B. cereus,
S. aureus, E. faecium, E.
faecali
L.plantarum
BF001 Plantaricin F
Chuỗi peptit đơn, khối
lượng phân tử tương
ứng là 0,4 kDa và 4,6
kDa
S. aureus, S. typhimurium, L.
monocytogenes, P.
aeruginosa
16
Rau
quả
L.plantarum
ST28MS
ST16MS
ST28MS
ST16MS
Chuỗi peptit đơn, khối
lượng phân tử tương
ứng là 5,5 kDa và 2,8
kDa
L. sakei, S. aureus
E. faecalis, P. aeruginosa, E.
coli, A. baumanii
L.plantarum
C11
Plantaricin EF
Plantaricin JK
Plantaricin A
Chuỗi peptit đơn, khối
lượng phân tử chưa
được xác định
Lactobacillus sp.,
Pediococcus sp.,
Leuconostoc sp.,
Streptococcus sp.
L.plantarum
LPC010
Plantaricin S
Plantaricin T
Chuỗi peptit đôi với
khối lượng phân tử 2,5
kDa (đối với plantaricin
S) và chưa xác định
khối lượng (đối với
plantaricin T)
Propionibacterium sp.,
Clostridium tyrobutyricum,
E. faecalis
L.plantarum
ST16Pa ST16Pa
Chuỗi peptit đơn, khối
lượng phân tử 6,5 kDa
E. faecalis, E. faecium,
L. monocytogenes,
Listeria innocua, S. aureus,
Streptococcus
spp.,Pseudomonas spp.
L.plantarum
163 Plantaricin 163
Chuỗi peptit đơn, khối
lượng phân tử 3,5 kDa
S. aureus, L. monocytogenes,
B. pumilus, B. cereus, M.
luteus, L. thermophilus, L.
rhamnosus, E. coli, P.
aeruginosa , P. fluorescens
Các
sản
phẩm
từ sữa
L.plantarum
AMA-K AMA-K
Chuỗi peptit đơn, khối
lượng phân tử 2,9 kDa
Enterococcus spp., E. coli,
Klebsiella pneumonia,
Listeria spp.
L.plantarum
WHE92 AcH
Chuỗi peptit đơn, khối
lượng phân tử 4,6 kDa L. monocytogenes
L.plantarum
LB-B1 LB-B1
Chuỗi peptit đơn, khối
lượng phân tử từ 2,5 –
6,5 kDa
Listeria, Lactobacillus spp.,
Streptococcus spp.
Enterococcus spp.,
Pediococcus spp. , E. coli
L.plantarum
ST8KF BacST8KF
Chuỗi peptit đơn, khối
lượng phân tử khoảng
3,5 kDa
L. casei, Lactobacillus
salivarus, Lactobacillus
curvatus, L. innocua
17
Ngũ
cốc
L.plantarum
ST13BR ST13BR
Chuỗi peptit đơn, khối
lượng phân tử khoảng
10 kDa
P. aeruginosa, E. faecalis,
K. pneumonia, E. coli
L.plantarum
ST194BZ
ST194BZ (α)
ST194BZ (β)
Chuỗi peptit đơn, khối
lượng phân tử tương
ứng là 3,3kDa và 14
kDa
E. faecalis, E. coli,
Enterobacter cloacae, P.
aeruginosa
L.plantarum
423 Plantaricin 423
Chuỗi peptit đơn, khối
lượng phân tử là 3,5
kDa
B. cereus, C. sporogenes, E.
faecalis, Listeria spp.,
Staphylococcus spp.
Như vậy, bacteriocin từ vi khuẩn L. plantarum có cấu trúc là chuỗi peptit
đơn hoặc đôi với khối lượng phân tử nằm trong khoảng 0,4 – 14 kDa và có khả
năng ức chế nhiều vi sinh vật gây hại như S. aureus, E. faecalis, P. aeruginosa,
L.monocytogenes,…
1.3.7. Phương pháp tinh sạch bacteriocin
Quá trình tinh sạch là bước cần thiết để nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc phân
tử, trình tự amino axit, cơ chế hoạt động, các đặc tính của bacteriocin cũng như xác
định những thông tin về trọng lượng phân tử. Một số phương pháp tinh sạch
bacteriocin được sinh tổng hợp từ vi khuẩn lacticlà chiết dung môi, siêu lọc, hấp
phụ - giải hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel, kết tủa bằng muối, sắc ký
lỏng hiệu năng cao HPLC,…Trong đó, HPLC là kỹ thuật được áp dụng phổ biến
nhất bởi mức độ tinh sạch cao và chính xác. Kết quả tinh sạch một số bacteriocin
sinh tổng hợp bởi vi khuẩnLactobacillus plantarum được trình bày trong Bảng 1.4.
18
Bảng 1.4: Tinh sạch một số bacteriocin đƣợc sinh tổng hợp bởi vi khuẩn
Lactobacillus plantarum[36].
Bacteriocin Các bƣớc tinh sạch Hoạt độ riêng
(AU/mg) Độ sạch
Plantaricin ZJ008
Dịch nuôi cấy thô 14,9 1
Cột hạt nhựa Macroporous 37,5 2,5
Trao đổi cation 369,9 24,8
Lọc gel 8556,7 573,1
Plantaricin từ
L. plantarum LP31
Dịch nuôi cấy thô 85,5 1
Sắc ký lọc gel 5900 689,5
RP – HPLC 506.000 5914,6
Plantaricin C19 Dịch nuôi cấy thô 455 1
RP – HPLC 409.600 900,2
Plantaricin MG
Dịch nuôi cấy thô 0,37 1
Kết tủa bằng muối amonium
sunphat
5,35 14,9
Lọc gel 44,64 20,0
RP – HPLC 9333,33 25,2
BacTN635
Dịch nuôi cấy thô 2083 1
Kết tủa bằng muối amonium
sunphat
9904 4,7
Lọc gel 146.104 70,1
HPLC 197.368 94,7
Plantaricin ASM1
Dịch nuôi cấy thô 253 1
Kết tủa bằng muối amonium
sunphat
1850 7,3
Trao đổi cation 11.900 47,0
HPLC 10.700 42,3
19
1.4. Tình hình nghiên cứu bacteriocin từ vi khuẩn lactic
Bacteriocin mang lại nhiều lợi ích và ứng dụng trong cuộc sống của con
người nhờ các tính chất đặc trưng của chúng. Tuy vậy, vẫn còn khá nhiều vấn đề
liên quan đến bacteriocin vẫn cần được làm sáng tỏ. Điều này đã thôi thúc các
nhà khoa học bắt tay vào nghiên cứu và đã có rất nhiều công trình đã được ứng
dụng thành công vào thực tế, góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống.
1.4.1. Các nghiên cứu trên thế giới
Bacteriocin từ vi khuẩn lactic nói chung
Budu-Amoako E. cùng cộng sự thuộc trung tâm Công nghệ thực phẩm PEI,
Canada đã nghiên cứu hiệu quả tiêu diệt Listeria monocytogenes trong các thùng
chứa bảo quản tôm hùm khi kết hợp nisin và nhiệt độ.Năm 2006, Marcinowski,
giám đốc điều hành nghiên cứu tại BASF cho biết, công ty hoá chất BASF của Đức
đã phát triển kẹo cao su có chứa chủng vi khuẩn Lactobacillus có lợi. Đây là sản
phẩm giúp người dùng loại trừ các bệnh về răng miệng. Chủng Lactobacillus mới
(có tên là Lanti-caries) có khả năng sinh bacteriocin làm cho vi khuẩn gây sâu răng
kết thành khối không thể dính trên bề mặt răng và bị loại bỏ dễ dàng khi súc
miệng.Nhóm tác giả Todorov và Dicks K. M. thuộc khoa vi sinh, đại học
Stellenbosch, Nam Phi đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng
Lactobacillus pentosus ST712BZ được phân lập từ boza (một loại đồ uống ngọt lên
men từ lúa mì ở Thổ Nhỹ Kỳ). Bacteriocin ST712BZ (kích thước 14 kDa) ức chế sự
phát triển của Lactobacillus casei, E.coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococus
faecalis, Klebsiellapneumoniae và Lactobacillus curvatus[48]. Một nghiên cứu
khác của Satish Kumar R, Arul V thuộc khoa Công nghệ sinh học trường đại học
Pondicherry, Ấn Độ đã tách chiết một loại bacteriocin, phocaecin PI80, sinh tổng
hợp từ chủng Streptococus phocae PI80 phân lập từ tôm thẻ chân trắng Ấn Độ. Chất
kháng khuẩn này nhạy cảm với trypsin, proteinaza, pepsin, chymotrypsin và ức chế
một số tác nhân gây bệnh quan trọng như: Listeria monocytogenes, Vibrio
parahaemolyticus, V.fischeri [26]. Năm 2011, Ozdemir cùng cộng sự thuộc khoa
Công nghệ sinh học, trường đại học Adnan Menderes, Thổ Nhĩ Kỳ đã xây dựng một
bộ sưu tập gồm 57 chủngEnterococcalphân lậptừ các nguồnkhác nhau(bao
gồmnướcsông, nước thải, đất, động vật, và các loại rau), được sử dụng để sản
20
xuấtbacteriocin [32]. Đến năm 2012, Samar L. cùng cộng sự thuộc phòng thí
nghiệm ERT62, trường đại họcBiopharmaAmbrilia S.A, Pháp đã tìm ra một loại
bacteriocin mới (lacticin LC14) sản sinh bởi Lactococcus lactis BMG6.14 được
phân lập từ môi trường nước thịt. Lacticin LC14 cho thấy khả năng diệt khuẩn cũng
như sinh tổng hợp nhiều hợp chất kháng khuẩn tiêu diệt một số vi khuẩn lactic và
các chủng gây bệnh bao gồm cả vi khuẩn Listeria monocytogenes [37].
Bacteriocin từ vi khuẩn L. plantarum
Năm 1990, Daeschel và cộng sự đã nghiên cứu bacteriocin từ vi khuẩn L.
plantarum C11 phân lập từ rau quả. Hai loại bacteriocin sản sinh từ vi khuẩn này là
plantaricin E và plantaricin JK có khả năng chống lại các tác nhân gây bệnh như
Lactobacillus sp., Pediococcus sp., Leuconostoc sp. và Streptococcus sp. [14]. Vào
năm 1992, Yang R., Joshnon M.C và Ray B. đã nghiên cứu phương pháp mới để
chiết tách một lượng lớn bacteriocin từ vi khuẩn lactic. Phương pháp này sử dụng
môi trường có bổ sung pediocin AcH, nisin, sakacin A, leuconocin Lcm1 giúp tăng
hiệu quả chiết tách và thu được lượng bacteriocin nhiều hơn.Năm 1993, nhà khoa
học Díaz cùng các cộng sự đã phát hiện ra 2 loại bacteriocin là plantaricin S và
plantaricin T. Hai bacteriocin này được sinh tổng hợp từ chủng vi khuẩn L.
plantarum LPC010 và có khả năng ức chế Propionibacterium sp., Clostridium
tyrobutyricum vàEnterococcus faecalis. Bacteriocin plantaricin F sinh tổng hợp bởi
vi khuẩn L. plantarum BF001 trong những nghiên cứu của Fricourt và cộng sự vào
năm 1995 có khối lượng phân tử nằm trong khoảng 0,4 – 6,7 kDa [16]. Plantaricin
SA6 sinh tổng hợp bởi vi khuẩn L. plantarum SA6 đã được Rekhif và cộng sự
nghiên cứu, tìm hiểu về khối lượng phân tử cũng như khả năng đối kháng với các vi
sinh vật khác. Những nghiên cứu xoay quanh vi khuẩn L. plantarum UG1 phân lập
từ thịt và bacteriocin của nó, plantaricin UG1, được tiến hành bởi Enan và cộng sự
vào năm 1996 [35]. Nhà khoa học Reenen cùng đồng nghiệp đã có những thông tin
bước đầu về khối lượng phân tử của bacteriocin plantaricin 423 (khoảng 3,5
kDa)[34].Nhóm tác giả Todorov S., Reenen C. V., Dicks L.thuộc khoa vi sinh, đại
học Stellenbosch, Nam Phi đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của
chủng L. plantarum ST13BR được phân lập từ bia Barley. Bacteriocin của L.
plantarum ST13BR có kích thước phân tử 10 kDa và ức chế sự phát triển của vi
21
khuẩnLactobacillus casein, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis,
Klebsiella pneumoniae và E. coli [46]. Và gần đây nhất vào năm 2016, Hu và cộng sự
đã tách chiết bacteriocin 163-1 có khối lượng phân tử là 825 Da được sinh tổng hợp
bởi chủng vi khuẩn L. plantarum 163 phân lập từ củ cải muối. Các axit amin đã được
xác định là YVCASPW dựa trên khối phổ. Bacteriocin 163-1 rất bền nhiệt và hoạt
động ổn định trong phạm vi pH rộng (pH 3 - 6), nhạy với proteaza K, pepsin, đồng
thời có khả năng chống lại những tác nhân gây bệnh bao gồm vi khuẩn Gram dương
và Gram âm. Với phổ hoạt tính kháng khuẩn khá rộng, loại bacteriocin này rất hữu
dụng trong bảo quản rau quả, thực phẩm và cũng kiểm soát các yếu tố sinh học
trong nông nghiệp [24].
1.4.2. Các nghiên cứu trong nước
Cũng như nhiều nước trên thế giới, các nhà khoa học Việt Nam cũng rất
quan tâm đến bacteriocin và cókhông ít những công trình khoa học nghiên cứu về
vấn đề này. Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu này vẫn chỉ tập trung vào xác
định các điều kiện nuôi cấy tối ưu của chủng LAB sinh tổng hợp bacteriocin, định
danh các chủng và xác định một số tính chất hóa sinh của bacteriocin cũng như độ
nhạy của chúng với enzym.
Năm 2002, Nguyễn Thị Hoài Hà, Phạm Văn Ty, Nguyễn Thị Kim Quy tại
Trung tâm Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã nghiên cứu khả năng
sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn lactic L24 phân lập từ nước dưa. Các phân
tích trình tự rADN 16S cho thấy chủng L24 thuộc loài L. plantarum [1]. Năm 2004,
TS. Lê Thị Hồng Tuyết, TS. Hoàng Quốc Khánh tại Viện Sinh học Nhiệt Ðới, Viện
Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã có những nghiên cứusơ bộ về một số đặc tính
của bacteriocin sản xuất bởi vi khuẩn Lactobacillus acidophilus. Vi khuẩn L.
acidophilus sản xuất bacteriocin có khả năng kháng một số vi khuẩn gây bệnh trong
thực phẩm như E. coli, Salmonella và một số vi khuẩn lactic khác. Quá trình sinh
tổng hợp bacteriocin bắt đầu từ 12 giờ. Điều kiện tối ưu để tạo bacteriocin của vi
khuẩn là là 30 - 37oC với pH từ 5 - 7. Chủng vi khuẩn có khả năng sử dụng tốt các
loại đường như manitol, maltozơ, lactozơ và glucozơ để sản xuất bacteriocin. Hoạt
tính bacteriocin tăng khi bổ sung 1% cao nấm men, còn các thành phần khác như
glucozơ, cao thịt, cazein pepton, NaCl không ảnh hưởng đến hoạt tính bacteriocin.
22
Bên cạnh đó, bacteriocin sản xuất bởi vi khuẩn L. acidophilus nhạy với proteaza
nhưng lại ổn định với các dung môi hữu cơ, pH và nhiệt độ [6].Một nghiên cứu
khác của TS.PhạmThùy Linhvềkhả năng tạo chất diệt khuẩn enterocin P tái tổ hợp
nhằm ứng dụng trong bảo quản thực phẩm. Đây là nghiên cứu đầu tiên về tạo
bacteriocin tái tổ hợp một cách có hệ thống tại Việt Nam. Sản phẩm của nghiên cứu
nàylà protein HisentP tái tổhợp có hoạt tính kháng khuẩn và các đặc tính sinh hóa
tương tự với enterocin P tự nhiên. Protein này bước đầu đã có khả năng kéo dài thời
gian bảo quản thực phẩm và được tiếp tục nghiên cứu phát triển làm phụ gia sinh
học dùng cho bảo quản [3]. Với mục tiêu thu nhận bacteriocin để ứng dụng trong
quá trình bảo quản thịt sơ chế tối thiểu, tác giả Nguyễn Thúy Hương đã nghiên cứu
việc cố định tế bào vi khuẩn Lactococcus lactic trên chất mang cellulose vi khuẩn
(Bacterial Cellulose - BC) [2].Năm 2014, tác giả Lê Ngọc Thùy Trang và Phạm
Minh Nhựt đã tiến hành phân lập các sản phẩm lên men truyền thống như sữa chua,
nem chua, cải chua, kim chi, măng chua. Theo đó, sau khi sàng lọc, chủng SC01
được chọn có khả năng đối kháng mạnh, đồng thời tạo ra các hợp chất kháng khuẩn
có tính ức chế mạnh đối với các vi khuẩn chỉ thị Salmonella, Staphylococcus aureus,
Escherichia coli, Listeria monocytogenes và Bacillus subtilis. Định danh bằng
phương pháp giải trình tự 16S rDNA cho thấy chủng SC01 là Lactobacillus
plantarum.Khả năng sản sinh các hợp chất kháng khuẩn của L. plantarum SC01
trên các môi trường khác nhau đã cho thấy môi trường MRS có cải tiến là tốt nhất.
Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nồng độ NaCl và thành phần môi trường
MRS đã xác định được môi trường MRS OPTSC01 là thích hợp nhất và môi trường
này bao gồm cao thịt bò (10 g/l), cao nấm men (5 g/l), trypton (10 g/l), sucrose (20
g/l), sodium acetate (5 g/l), K2HPO4 (4 g/l), ammonium citrate (2 g/l), MgSO4 (0,2
g/l), MnSO4 (0,05 g/l), Tween 80 (1 ml/l), pH 6,0,nhiệt độ nuôi cấy37oC. Năm
2015, tác giả Bằng Hồng Lam, Nguyễn Hữu Hiệp tiến hành phân lập được 148
dòng vi khuẩn lactic từ 56 mẫu thực phẩm lên men truyền thống (rau quả muối chua
và các sản phẩm lên men từ thịt và cá thu) từ 5 tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long. Tất
cả các dòng vi khuẩn này đều có khả năng sinhtrưởng và phát triển ở 40oC và 45
oC,
nhưng chỉ có 48 dòng vi khuẩn phát triển được ở 50oC và không có dòng vi khuẩn
nào sống được ở 55oC. Trong số 48 dòng vi khuẩn lactic chịu được 50
oC, hai dòng
23
vi khuẩn RM18 và CC4 có khả năng sinh bacteriocin ức chế sự tăng trưởng củavi
khuẩn chỉ thị Lactobacillus sakei subsp. sakei JCM 1157 khi sử dụngphương pháp
khuếch tán giếng thạch. Kết quả định danhbằng phương pháp giải trình tự đoạn gen
16S rRNA cho thấy dòng RM18 đồnghình 100% với dòng Lactobacillus plantarum
WCFS1 và dòng CC4 đồng hình100% với dòng Pediococcus acidilactici B3.
Mặc dù có rất nhiều nghiên cứu về vi khuẩn lactic, nhưng những nghiên cứu
về bacteriocin, cụ thể là những nghiên cứu cụ thể về bacteriocin được sinh tổng hợp
bởi L. plantarum hầu như vẫn chưa được tiến hành tại Việt Nam. Chính vì vậy,
chúng tôi thực hiện đề tài:“Nghiên cứu bacteriocin của vi khuẩn Lactobacillus
plantarum phân lập từ mẫu chao tại Huế” nhằm góp phần khai thác tiềm năng ứng
dụng của các bacteriocin sinh tổng hợp từ vi khuẩn LAB, được phân lập từ các mẫu
thực phẩm ở Việt Nam.
51
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Nguyễn Thị Hoài Hà,Phạm Văn Ty, Nguyễn Thị Kim Quy (2002), “Nghiên
cứu khả năng sinh tổng hợp bacterioxin của loài Lactobacillus plantarum
L24”, Tạp chí Di truyền học và ứng dụng, Chuyên san Công nghệ sinh học,
Hà Nội , tr. 47 - 52.
2. Nguyễn Thúy Hương, Trần Thị Tưởng An (2008), “Thu nhận bacteriocin
bằng phương pháp lên men bởi tế bào Lactococcus lactic cố định trên chất
mang Cellulose vi khuẩn (BC) và ứng dụng trong bảo quản thịt tươi sơ chế
tối thiểu”, Science & Technology Development, Đại học Quốc gia Thành phố
Hồ Chí Minh, 11 (9), tr. 100 – 109.
3. Phạm Thùy Linh (2011), Nghiên cưu kha năng tao chât diêt khuân enterocin
P tai tô hơp nhăm ưng du ng trong bao quan thưc phâm ,Luận án Tiến sĩ,
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Hà Nội.
4. Tổng cục Tiêu chuẩn - Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học, Công
nghệ và Môi trường (2016), Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6261 : 1997.
5. Nguyễn Văn Thanh, Nguyễn Vũ Tường Vy, Trần Thu Hoa (2007),“Khảo sát
khả năng chịu đựng muối mật và kháng sinh của một số vi sinh vật là nguyên
liệu sản xuất probiotic đường uống”, Tạp chí Dược học, 378.
6. Lê Thị Hồng Tuyết, Hoàng Quốc Khánh (2004),“Một sốđặc tính của
bacteriocin sản xuất bởi vi khuẩn Lactobacillus acidophilus”, Báo cáo Khoa
học, Viện Sinh học Nhiệt Ðới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Tiếng Anh
7. Ali W. S., Musleh R. M. (2015),"Purification and Characterization of
PlantaricinVGW8, A Bacteriocin Produced by Lactobacillus
PlantarumVGW8",Journal of Biology, Agriculture and Healthcare, 5 (1), pp.
147 - 152.
8. Ammor M. S., Mayo B. (2007), "Selection criteria for lactic acid bacteria to
be used as functional starter cultures in dry sausage production: An update",
Meat Science, 76 (1), pp. 138 - 146.
52
9. Bradford M. M. (1976),"A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation
of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye
Binding", Analytical Biochemistry , pp. 248 - 254.
10. Bromberg R., Moreno I., Zaganini C. L., Delboni R. R., Oliveira J. D. (2004),
"Isolation of bacteriocin-producing lactic acid bacteria from meat and meat
products and its spectrum of inhibitory activity",Brazilian Journal of
Microbiology, 35 (1), pp. 1678 - 4405.
11. Chen H., Hoover D. (2003),"Bacteriocins and their Food
Applications",Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2 (3),
pp. 82 - 100.
12. Crupper S. S., Iandolo J. J. (1996), "Purification and partial characterization
of a novel antibacterial agent (Bac1829) produced by Staphylococcus aureus
KSI1829", Applied and Environmental Microbiology , 62 (9), pp. 3171–3175.
13. Cui Y., Zhang C., Wang Y., Shi J., Zhang L., Ding Z. (2012),"Class IIa
Bacteriocins: Diversity and New Developments",International Journal of
Molecular Sciences, 13, pp. 16668-16707.
14. Daeschel M. A., McKenney M. C., McDonald L. C. (1990), "Bacteriocidal
activity of Lactobacillus plantarum C-11", Food Fermentation, 7, pp. 91 - 98.
15. Desriac F., Defer D., Bourgougnon N., Brillet B., Chevalier P. L., Fleury Y.
(2010), "Bacteriocin as Weapons in the Marine Animal-Associated Bacteria
Warfare: Inventory and Potential Applications as an Aquaculture Probiotic",
Marine Drugs, 8 (4), pp. 1153 - 1177.
16. Díaz R. J., Barba J. L., Cathcart D. P., Holo H., Nes I. F., Sletten K. H.
(1995), "Purification and Partial Amino Acid Sequence of Plantaricin S, a
Bacteriocin Produced by Lactobacillus plantarum LPCO10, the Activity of
Which Depends on the Complementary Action of Two Peptides",American
Society for Microbiology, 61 (12), pp. 4459 - 4463.
17. Dobson A., Cotter P. D., Ross R. P., Hill C. (2012), "Bacteriocin Production:
a Probiotic Trait?",Applied Environmental Microbiology, 78 (1), pp. 1 - 6.
18. El-Shafie H. A., I.Yahia N., Ali H. A., Khalil F. A., El-Kady E. M. (2009),
"Hypocholesterolemic Action of Lactobacillus plantarum NRRL-B-4524 and
53
Lactobacillus paracasei in Mice with Hypercholesterolemia Induced by
Diet",Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 3 (1), pp. 218 - 228.
19. Fugelsang K. C., Edwards C. G. (2007), Wine Microbiology, Springer, 2, pp.
29 - 44.
20. Hashium A. J., Hamza S. J., Aldujaili N. H. (2010), "Antimicrobial Activity
of Bacteriocin Produced by Weissella cibaria NRIC0136", Al-Kufa Journal
for Biology, 2 (1).
21. Hayek A. S., Ibrahim A. S. (2013), "Current Limitations and Challenges with
Lactic Acid Bacteria: A Review", Food and Nutrition Sciences, 4, pp. 73 - 87.
22. Héchard Y., Sahl H.-G. (2002), "Mode of action of modified and unmodified
bacteriocins from Gram-positive bacteria", Biochimie , pp. 545 - 557.
23. Hoover D. G. (1992), "Bacteriocins: activities and applications, Encyclopedia
of microbiology",Encyclopedia of microbiology, 1, pp. 181 - 192.
24. Hu M., Dang L., Zhao H., Zhang C., Lu Y., Yu J. (2016), "Characterization
and Antibacterial Mode of a Novel Bacteriocin with Seven Amino Acids
from Lactobacillus plantarum in Guizhou Salted Radish",Journal of
Agricultural Science, 8 (10), pp. 120 - 130.
25. Ibrahim O. O., Day D. F. (2014), "Biotechnology in Nutrition and Food
Engineering", Journal of Nutritional Health & Food Engineering, 1 (5).
26. Kumar R. S., Arul V. (2009), "Purification and characterization of phocaecin
PI80: an anti-listerial bacteriocin produced by Streptococcus phocae PI80
Isolated from the gut of Peneaus indicus (Indian white shrimp)", J Microbiol
Biotechnol , 19 (11), pp. 1393 - 1400 .
27. Laemmli U. K. (1970), "Cleavage of Structural Proteins during the Assembly
of the Head of Bacteriophage T4", Nature, 227, pp.680 - 685.
28. Mahawar B. P. (2012), "Multilocus sequence typing for differentiation of
closely related species of indigenous probiotic Lactobacilli",Master science
in Dairy Microbiology, Nation Dairy Research Institute , pp. 30 - 31.
29. Nespolo C. R., Brandelli A. (2010), "Production of bacteriocin-like
substances by lactic acid bacteria isolated from regional ovine cheese",
Brazilian Journal of Microbiology, 41, pp. 1009 - 1018.
54
30. Noordiana N., Fatimah A. B., Mun A. S. (2013), "Antibacterial agents
produced by lactic acid bacteria isolated from Threadfin Salmon and Grass
Shrimp", International Food Research Journal, 20(1), pp. 117 - 124.
31. Oscáriz J. C., Pisabarro A. G. (2001), "Classification and mode of action of
membrane-active bacteriocins produced by gram-positive bacteria",
International Micribiology, 4 (1), pp.13 - 19.
32. Özdemir G. B., Oryaşın E., Bıyık H. H., Özteber M., Bozdoğan B. (2011),
"Phenotypic and Genotypic Characterization of Bacteriocins in Enterococcal
Isolates of Different Sources", Indian J Microbiol, 51 (2), pp. 182 - 187.
33. Patrick O. M. (2012), "Lactic acid bacteria in health and disease", Rwanda
Journal of Health Sciences, 1 (1), pp. 39 - 50.
34. Reenen V., Dicks L. M., Chikindas M. (1998),"Isolation, purification and
partial characterization of plantaricin 423, a bacteriocin produced by Lactobacillus
plantarum", Journal of Applied Microbiology, 84 (6), pp. 1131 - 1137.
35. Rekhif N., Atrih A., Lefebvrexy G. (1995), "Activity of plantaricin SA6, a
bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum SA6 isolated from
fermented sausage", Journal of Applied Microbiology, 78 (4), pp. 349 - 358.
36. Sabo S. D., Vitolo M., González J. J., Oliveira R. P. (2014),"Overview of
Lactobacillus plantarum as a promising bacteriocin producer among lactic
acid bacteria", Food Research International, 64, pp.527 – 536.
37. Samar L., Hadda O., Nicolas A., Ziad F., Pascal M., Abdellatif B. (2012),
"Lacticin LC14, a new bacteriocin produced by Lactococcus lactis BMG6.14:
isolation, purification and partial characterization",Infect Disord Drug
Targets, pp. 316 - 325.
38. Sankar N., Priyanka V., ReddyP.S., RajanikanthP., Kumar V., Indira M.
(2012), "Purification and Characterization of Bacteriocin Produced by
Lactobacillus plantarum Isolated from Cow Milk",International Journal of
Microbiology Research, 3 (2), pp. 133 - 137.
39. Savadogo A., Ouattara A. C., Bassole H. I., Traore S. A. (2006),
"Bacteriocins and lactic acid bacteria",African Journal of Biotechnology, 5
(9), pp.678 - 683.
55
40. Schägger H., Jagow G. V. (1987), "Trixin-Sodium Dodecyl Sulfate-
Polyacrylamide Gel Electrophoresis for the Separation of Proteins in the
Range from 1 to 100 kDa",Analytical Biochemistry, 166, pp. 368 - 379.
41. Schlegel R., Slade H. D. (1972), "Bacteriocin Production by Transformable
Group H Streptococci", Journal of Bacteriology, 112 (2), pp. 824–829.
42. Sifour M., Tayeb, I., Haddar, H. O., Namous, H., & Aissaoui, S. (2012).,
"Production and characterization of bacteriocin of Lactobacillus plantarum
F12 with inhibitory activity against Listeria monocytogenes", Journal of
Science and Technology, 2 (1), pp. 56 - 61.
43. Smaoui S., Elleuch L., Bejar W., Karray-Rebai I., Ayadi I. (2010),
"Inhibition of fungi and gram-negative bacteria by bacteriocin BacTN635
produced by Lactobacillus plantarum sp. TN635",Biochemistry and
Biotechnology,, 162 (4), pp.1132 - 1146.
44. Song D. F., Zhu M.Y., Gu Q. (2014), "Purification and Characterization of
Plantaricin ZJ5, a New Bacteriocin Produced by Lactobacillus plantarum
ZJ5",Plos One, 9 (8).
45. Stackebrandt E., Teuber M. (1988), "Molecular taxonomy and phylogenetic
position of lactic acid bacteria", Biochimie, 90 (3), pp. 317-324.
46. Todorov S. D. (2008), "Bacteriocin production by Lactobacillus plantarum
AMA-K isolated from Amasi, a Zimbabwean fermented milk product and
study of the adsorption of bacteriocin AMA-K to Listeriasp", Brazilian
Journal of Microbiology, 39 (1), pp. 178 - 187.
47. Todorov S. D. (2009), "Bacteriocins from Lactobacillus plantarum –
production, genetic organization and mode of action", Brazilian Journal of
Microbiology, 40 (2), pp. 209 - 221.
48. Todorov S. D., Dicks L. M. (2007), "Bacteriocin production by
Lactobacillus pentosus ST712BZ isolated from boza", Braz. J. Microbiol, 38
(1), pp. 1678 - 4405.
49. Todorov D. S., Vaz-Velho M., Gibbs P. (2004), "Comparison of two
methods for purification ofplantaricin ST31, a bacteriocinproduced
56
byLactobacillusplantarum ST31", Brazilian Journal of Microbiology, 35(1 -
2), pp. 157-160.
50. Tripuraneni S. (2011), Effect of Nutrient Supplements on Cucumber
Fermentation by Lactic Acid Bacteria, A thesis submitted in partial
fulfillment of the requirements for the degree of Master of Science in Food
Science, University of Arkansas.
51. Yang S. C., Lin C. H., Sung C. T., Fang, J. Y. (2014), "Antibacterial
activities of bacteriocins: application in foods and pharmaceuticals",
Frontiers in Microbiology, 5, pp. 2 - 10.
52. Zacharof M., Lovitt R. (2012), "Bacteriocins Produced by Lactic Acid
Bacteria", Biotechnology and Food Science, 2, pp. 50 - 56.
53. Zhang H., Cai Y. (2014), Lactic Acid Bacteria, Springer, 2, pp. 103 - 203.
54. Zhang H., Liu L., Hao Y., Xie Y. (2013), "Isolation and partial
characterization of a bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum BM-1
isolated from a traditionally fermented Chinese meat product", Microbiology
and Immunology, 57 (11), pp. 746 - 755.
55. Zhou J., Esmaily-Moghadam M., Conover T. A., Hsia T.Y., Marsden A. L.,
Figliola R. S. (2015), "In Vitro Assessment of the Assisted Bidirectional
Glenn Procedure for Stage One Single Ventricle Repair",Cardiovasc Eng
Technol, 6 (3), pp. 256 - 267.
56. Perez H. R.,Zendo T. , Sonomoto K. (2014), "Novel bacteriocins from lactic
acid bacteria (LAB): various structures and applications", Microb Cell Fact,
13(1): S3, pp. 1 - 13.
