Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA
DE MÉXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN
Evaluación del efecto antigenotóxico del aceite esencial de
Decatropis bicolor mediante la técnica de micronúcleos en
células binucleadas de linfocitos humanos
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE:
LICENCIADO EN BIOQUÍMICA DIAGNÓSTICA
P R E S E N T A :
JAIR CARDONA SÁNCHEZ
ASESORA:
M. en C. Maritere Domínguez Rojas
CUAUTITLÁN IZCALLI, ESTADO DE MÉXICO, 2019
UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
Restricciones de uso
DERECHOS RESERVADOS ©
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL
Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México).
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor.
Este trabajo fue realizado en el Laboratorio de Citogenética L521 de la Facultad de Estudios
Superiores Cuautitlán, dirigido por la M. en C Maritere Domínguez Rojas.
Con el apoyo del Dr. Guillermo Pérez Ishiwara de la Escuela Nacional de Medicina y
Homeopatía del Instituto Politécnico Nacional, quien nos proporcionó el AE de D. bicolor.
NUESTRO MAYOR MIEDO
Nuestro miedo más profundo no es ser inadecuados
Nuestro mayor miedo es nuestro poder inconmensurable
Es nuestra luz, no nuestra oscuridad lo que nos aterra
Optar por la mezquindad no sirve al mundo
No hay lucidez en encogerse para que los
demás no se sientan inseguros junto a ti
Nuestro destino es brillar como los niños
No es el de unos cuantos, es el de todos
Y conforme dejamos que nuestra luz propia alumbre
Inconscientemente permitimos lo mismo a los demás
Y al liberarnos de nuestro propio miedo,
Nuestra presencia automáticamente libera a otros
Nelson Mandela
AGRADECIMIENTOS
A mis padres, Víctor y Claudia por darme la vida y permitirme estar aquí el día de hoy.
A mis abuelos, Bertha y Jaime por ser como mis padres y porque gracias a ellos soy lo
que soy.
A mis tíos, Adriana, Laura, Leonel y Abel por su apoyo incondicional y porque gracias a
ellos, hoy estoy donde estoy.
A los motores principales de mi vida, Ivan, Emiliano, Adrián y Paula que más que mis
primos, son mis hermanos y motivo suficiente para esforzarme al máximo día tras día.
Los amo a todos.
A mi amor, Abigail por ser mi amiga, compañera, cómplice y pilar fundamental de todos
mis logros y metas cumplidas. Te amo.
A la Maestra Maritere, toda mi admiración y gratitud por su paciencia, apoyo, confianza
y comprensión. Por ser mi mentora y abrirme paso al conocimiento en el hermoso
universo de la genética.
A mi alma mater por darme la oportunidad de realizarme profesional y personalmente.
A mi FES Cuautitlán por albergar mis días, tardes y noches durante mis años de
estudios, llenos de aprendizajes, experiencias y recuerdos que llevaré por siempre.
A mis amigos y colegas, Alejandro, Alethia, Jesus, Elena, Suellen y Alejandra por ser
parte de esta travesía llena de experiencias, risas y sobre todo cariño y apoyo
incondicional.
A Suzuki Méndez y Jesus Cabrera, por ser más que mis amigos durante todo este
tiempo dentro de Scotiabank y porque el estar aquí, también se los debo a ustedes.
A Jaime Terrón por ser como ese hermano que nunca tuve, por los consejos, las risas,
los regaños y por estar siempre para apoyarme, a pesar de las circunstancias y lo
complicado de la situación.
A todas las personas que estuvieron conmigo durante este viaje, de corazón gracias.
INDICE Tabla de abreviaturas ......................................................................................................................... 8
Índice de figuras. ................................................................................................................................ 9
RESUMEN .......................................................................................................................................... 11
I. INTRODUCCIÓN: ............................................................................................................................ 13
1. Definición de Cáncer ................................................................................................................. 13
1.1 Epidemiología del cáncer ................................................................................................... 14
1.2 Cáncer de mama ................................................................................................................. 15
1.2.1 Tratamiento para el cáncer de mama ............................................................................. 15
1.2.2 Alternativas para el tratamiento del cáncer de mama .................................................. 16
2.-Medicina tradicional ................................................................................................................ 16
2.1 Medicina Tradicional Mexicana ......................................................................................... 17
2.2 Importancia del estudio de las plantas medicinales. ........................................................ 18
3. Decatropis bicolor ..................................................................................................................... 19
3.1 Propiedades medicinales de D. bicolor .............................................................................. 19
3.1.1 Actividad antifúngica ....................................................................................................... 19
3.1.2 Actividad antiinflamatoria .............................................................................................. 19
3.1.3 Actividad antibacteriana ................................................................................................. 20
3.1.4 Actividad anticancerígena ............................................................................................... 20
3.2 Evaluación genotóxica de D. bicolor .................................................................................. 21
4. Metil-metanosulfonato (MMS) ................................................................................................ 22
4.1 Propiedades del MMS ........................................................................................................ 22
4.2 Mecanismo de acción ......................................................................................................... 23
5. Genotoxicidad ........................................................................................................................... 23
5.1 Herramientas para la evaluación del efecto genotóxico .................................................. 24
5.2 Importancia de evaluar la genotoxicidad .......................................................................... 24
6. Micronúcleos ............................................................................................................................ 25
6.1 Ensayo de micronúcleos ..................................................................................................... 25
6.2 Ensayo de micronúcleos con bloqueo de citocinesis. ....................................................... 26
6.3 Criterios para la identificación de Micronúcleos ............................................................... 27
6.4 Ventajas y desventajas ....................................................................................................... 28
II. JUSTIFICACIÓN .............................................................................................................................. 30
III. HIPÓTESIS. ................................................................................................................................... 32
IV. OBJETIVO GENERAL: ................................................................................................................ 32
Objetivos Particulares: ................................................................................................................. 32
V. DIAGRAMA DE FLUJO ................................................................................................................... 33
VI. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................................... 35
VI. RESULTADOS ............................................................................................................................... 40
Tabla N°2 Resultados de todos los tratamientos para el donador “B” .................................. 42
VII. ANÁLISIS DE RESULTADOS ......................................................................................................... 53
VIII. CONCLUSIONES ......................................................................................................................... 61
IX. PERSPECTIVA ............................................................................................................................... 61
X. REFERENCIAS ................................................................................................................................ 62
8
Tabla de abreviaturas ABREVIATURA SIGNIFICADO
AE Aceite esencial
CB Célula binucleada
MN Micronúcleo
CBMN Célula binucleada micronucleada
MMS Metil metanosulfonato
DMSO Dimetil sulfóxido
Cyt-B Citocalasina B
KCl Cloruro de potasio
PHA Fitohemaglutinina
µL Microlitros
µg Microgramo
mL Mililitro
SFB Suero Fetal bovino
C (+) Control positivo
C (-) Control negativo
C 1 Concentración 1
C 2 Concentración 2
C 3 Concentración 3
C (V) Control del vehículo
OECD Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos
SEM Error estándar
ADN Ácido Desoxirribonucleico
OMS Organización Mundial de la Salud
HUMN Proyecto humano de micronúcleos
CBPI Índice de Bloqueo por Citocinesis
9
Índice de figuras.
Figura 1.- Estructura de la molécula del Metil Metanosulfonato………………………………………19
Figura 2.- Microfotografía de una célula Mononucleada vista a 1000x, Tinción Giemsa……40
Figura 3.- Microfotografía de una célula Binucleada vista a 1000x, Tinción Giemsa…………40
Figura 4.- Microfotografía de una célula Trinucleada vista a 1000x, Tinción Giemsa………..40
Figura 5.- Microfotografía de una célula Tetranucleada vista a 1000x, Tinción Giemsa…….40
Figura 6.- Microfotografía de una célula Binucleada con Micronúcleo vista a 1000x, Tinción
Giemsa………………………………………………………………………………………………………………….…………40
Figura 7.- Evaluación genotóxica del donador “A” para los distintos tratamientos……….……41
Figura 8.- Evaluación genotóxica del donador “B” para los distintos tratamientos …..……..42
Figura 9.- Evaluación genotóxica del donador “A” y “B” para los distintos tratamientos……43
Figura 10.- Evaluación citotóxica del donador “A” para los distintos tratamientos…………….44
Figura 11.- Evaluación citotóxica del donador “B” para los distintos tratamientos………….…45
Figura 12.- Evaluación citotóxica de los donadores “A” y “B” para los distintos tratamientos
………………………………………………………………………………………………………………………………………..46
Figura 13.- Evaluación citotóxica mediante el % de Citocinesis del donador “A” ……………..47
Figura 14.- Evaluación citotóxica mediante el % de Citocinesis del donador “B"………………48
Figura 15.- Evaluación citotóxica mediante el % de Citocinesis de los donadores “A” y “B”
.............................................................................................................................................49
Tabla N°1.- Resultados de los distintos tratamientos para el donador “A”………………………38
Tabla N°2.- Resultados de todos los tratamientos para el donador “B”…………………………..39
Tabla N°3.- Media y error estándar de la genotoxicidad de los resultados del donador
"A”………………………………………………………………………………………………………………………………….40
10
Tabla N°4.- Media y error estándar de la genotoxicidad de los resultados del donador
"B”………………………………………………………………………………………………………………………………….42
Tabla N°5.- Media y error estándar de la genotoxicidad de los resultados de los donadores
“A” y “B”………………………………………………………………………………………………………………………….43
Tabla N°6.- Media y error estándar de los resultados del CBPI del donador “A”………………...44
Tabla N°7.- Media y error estándar de los resultados del CBPI del donador “B”…………..…….45
Tabla N°8.- Media y error estándar de los resultados del CBPI del donador “A” y “B”…..……46
Tabla N°9.- Media y error estándar de los resultados del % de Citostasis del donador
“A”…………………………………………………………………………………………………………………………………..47
Tabla N°10.- Media y error estándar de los resultados del % de Citostasis del donador
“B”…………………………………………………………………………………………………………………………………..48
Tabla N°11.- Media y error estándar de los resultados del % de Citostasis de los donadores
“A” y “B” ………………………………………………………………………………………………………………………….49
Tabla N°12.- Resultados del análisis estadístico “t” de muestras emparejadas de los
resultados de CBPI, genotoxicidad y % Citostásis…………………………………………………………….50
11
RESUMEN
El tratamiento actual contra el cáncer representa procedimientos invasivos que van desde
la radiación hasta la quimioterapia que en la mayoría de los casos afectan de manera directa
la calidad de vida de los pacientes, además de que estos tratamientos no solo afectan a las
células que presentan alteraciones, también afectan de manera directa a células que se
encuentran sanas.
De aquí la importancia de realizar estudios que nos permitan encontrar nuevas terapias que
reduzcan estos efectos secundarios de los antineoplásicos utilizados contra el cáncer. Todo
esto con relación a la medicina tradicional, ya que representa una fuente incalculable de
conocimiento que podemos utilizar a nuestro favor, estudiando las propiedades, así como
los beneficios y perjuicios que pueden provocar.
Parte fundamental del estudio de las plantas medicinales utilizadas como terapias desde
hace generaciones contra el cáncer, es importante determinar por medio de distintos
ensayos la capacidad que tienen para poder reducir los efectos secundarios, dentro de estas
técnicas se encuentra el ensayo de Micronúcleos, que son fragmentos esféricos
citoplásmicos detectados en interfase y que son originados por la pérdida de material
genético que pueden llegar a ser hasta cromosomas enteros.
Esta técnica cuenta con diversas variaciones, una de ellas es el ensayo realizado in vitro en
linfocitos de sangre periférica por bloqueo de citocinesis, utilizando la Citocalasina B, siendo
de las más sensibles y precisa para poder evaluar el daño cromosómico en células que solo
han pasado por el proceso de división celular una sola vez.
La gran diversidad de plantas que tiene México nos permite tener una amplia gama de
oportunidades para poder comenzar el estudio de estas plantas medicinales. En este
estudio se utilizó la planta Decatropis bicolor que es conocida como Aranto ya que por
generaciones ha sido utilizada para el tratamiento de ciertos padecimientos, entre ellos, el
cáncer de mama.
12
En estudios previamente realizados se han encontrado resultados que indican que el aceite
esencial de esta planta genera efecto citotóxico selectivo en línea celular de cáncer de
mama MDA-MB-231, además de no presentar efecto genotóxico en linfocitos humanos.
Con estos antecedentes, en el presente trabajo se evaluó la capacidad de reducir el efecto
de un clastógeno aprobado por la OECD como el Metil Metanosulfonato, utilizando el
ensayo de Micronúcleos con bloqueo de citocinesis en linfocitos humanos.
Los resultados obtenidos nos indican que la reducción del efecto del Metil-metanosulfonato
es dosis dependiente, es decir, a mayor concentración del Aceite Esencial de D. bicolor,
mayor es el efecto. Estos resultados son importantes para poder continuar con los estudios
que nos permitan conocer más y dar un paso en el complejo proceso para poder garantizar
la inocuidad y actividad de esta planta. Así como brindarnos una idea más clara y cercana
de la posibilidad de utilizar D. bicolor en el tratamiento para el cáncer de mama, no solo en las
zonas donde se tiene conocimiento antiguo de las propiedades de esta planta, sino que sea utilizada
en todo el país
13
I. INTRODUCCIÓN:
1. Definición de Cáncer
El termino cáncer es utilizado para identificar y agrupar un conjunto de más de cien
enfermedades, todas ellas caracterizadas por un crecimiento celular acelerado e
indiscriminado, que con el tiempo provocan invasión, el daño a los tejidos y órganos
mediante la diseminación de estas células a través del sistema sanguíneo y/o el sistema
linfático (National Cáncer Institute, 2011).
Las células cancerosas difieren de las células normales de muchas maneras que les permiten
crecer sin control y se vuelven invasivas. Una diferencia importante es que las células
cancerosas son menos especializadas que las células normales. Esto quiere decir que,
mientras las células normales maduran en tipos celulares muy distintos con funciones
específicas, las células cancerosas no lo hacen. Esta es una razón por la que, al contrario de
las células normales, las células cancerosas siguen dividiéndose sin detenerse (National
Cáncer Institute, 2011).
Durante la vida de las células, estas tienen ciclos de división normales y periódicos con el
fin de renovar las células envejecidas o muertas para mantener la integridad del tejido y
mantener la funcionalidad del órgano. Este ciclo celular está regulado por una serie de
mecanismos de control que indican a la célula cuando dividirse y cuando permanecer
estática. Cuando se produce un daño celular que no puede ser reparado se produce una
autodestrucción celular que impide que el daño sea heredado por las células descendientes
(AECC, 2012).
En la actualidad el tratamiento contra el cáncer está limitado en gran parte a la radiación y
quimioterapia que son procedimientos muy invasivos para el paciente y que en muchos
casos reducen su calidad de vida. Además de que estos tratamientos repercuten no solo en
las células tumorales que están manifestando la enfermedad, sino a todas las células
contiguas sanas.
14
1.1 Epidemiología del cáncer
El cáncer es la tercera causa de muerte en México y cada año aparecen 128,000 casos de
cáncer en mexicanos según la Unión Internacional contra el Cáncer. Esta enfermedad es
curable en la mayoría de los casos, sin embargo, el 60% se detectan en etapas avanzadas.
Los cinco tipos de cáncer más comunes en México son el Cáncer de Próstata, Cáncer de
mama, Cáncer cervicouterino, Cáncer de pulmón y Cáncer de estómago (Secretaría de
Salud, 2013).
Se estima que del 5%-10% de todos los cánceres son hereditarios, es decir que las personas
que heredan una determinada alteración genética tienen un alto riesgo de desarrollar
cáncer en alguna etapa de su vida. Estos factores causales pueden actuar juntos o en
secuencia para iniciar o promover la carcinogénesis (García y cols, 2007).
La Organización Mundial de la salud (OMS) informó que el cáncer es responsable de
aproximadamente del 13 a 15% de todas las muertes a nivel mundial. Y que para el año
2020 el número será de 10 millones, el 47% en países desarrollados y el 55% en países en
vías de desarrollo (Compendio de cáncer, 2001) y que para el 2050 se espera que los casos
sean cerca de 27 millones (García y cols, 2007).
En nuestro país, el cáncer de mama se diagnostica en promedio a los 53 años, lo que
representa casi una década menor en comparación con los Estados Unidos de América,
Canadá y algunos países de Europa, donde el promedio oscila alrededor de los 60 años
(Cárdenas y cols. 2015).
Los factores epidemiológicos en nuestro país y Latinoamérica contemplan la edad, sexo,
etnicidad, tabaquismo y consumo del alcohol, donde estos dos últimos factores son los de
mayor importancia para el desarrollo de neoplasias, así como de las recurrencias
posteriores al tratamiento (Carrillo, 2011).
De acuerdo al género, los cinco principales tipos de neoplasias en las mujeres son el de
mama, colon y recto, pulmón, cuello uterino y estómago, mientras que en los varones son
el de pulmón, próstata, colon y recto, estómago e hígado (INEGI, 2016).
15
1.2 Cáncer de mama
De acuerdo con el Instituto Nacional de Estadística y Geografía (INEGI) en 2014, entre la
población de 20 años y más, dos de cada 10 casos de cáncer en varones son por tumor
maligno en órganos digestivos, y tres de cada 10 mujeres con cáncer padecen de tumor
maligno de mama, siendo las principales neoplasias malignas para cada sexo en la población
adulta del país.
En mujeres el cáncer de mama es el tipo de cáncer cuyas tasas de morbilidad hospitalaria
muestran los mayores incrementos con la edad (hasta los 64 años de edad), al pasar de 7.43
en el grupo de 20 a 29 años (por cada 100 mil mujeres de ese grupo de edad) a 218.24 (en
el grupo de 60 a 64 años de edad), confirmándose como el tumor maligno de mayor impacto
en su salud, y siendo esta última tasa la más alta de todas las de morbilidad hospitalaria por
principales tumores malignos entre las mujeres mayores de 20 años de edad (INEGI, 2016).
1.2.1 Tratamiento para el cáncer de mama
La secuencia de tratamiento recomendada es cirugía ± quimioterapia adyuvante ± terapias
específicas ± radioterapia ± terapia endocrina. El proceso quirúrgico es el método más
invasivo como medida de tratamiento para el cáncer ya que incluye la escisión de todo el
tejido involucrado con márgenes adecuados y el manejo de la axila, sin embargo, es el
óptimo junto con terapias complementarias para dar el mayor índice de supervivencia
global (Gaxiola, 2017).
Estas quimioterapias utilizan una gran variedad de fármacos que están destinados a destruir
las células cancerosas, sin embargo, la mayoría de ellos producen efectos adversos que
disminuyen de manera significativa la calidad de vida del paciente, provocando desde fatiga
hasta alteraciones en el Sistema nervioso, provocando en algunos casos, leve disminución
de funcionalidad mental. Pueden provocar de manera paralela daños al corazón, daño a los
nervios y aumentar la probabilidad de presentar síndromes mielodisplásicos (American
Cáncer Society, 2017).
Además de esto, se utilizan terapias hormonales y radioterapias que tienen como fin el
tratar la enfermedad y asegurar a toda costa la recuperación del paciente. Sin embargo,
todos los tratamientos antes mencionados provocan su efecto adverso de acuerdo con su
16
modo de acción. Es aquí donde debemos actuar, ya que no se conoce ningún tratamiento
químico contra el cáncer que actúe exclusivamente en las células cancerosas.
1.2.2 Alternativas para el tratamiento del cáncer de mama
El arsenal terapéutico disponible hasta hace 15-20 años eran únicamente los citostáticos o
lo que se conoce comúnmente como "quimioterapia". Los citostáticos constituyen un grupo
de fármacos con diferentes mecanismos de acción que inducen la apoptosis o muerte
celular mediante la interacción con distintos sistemas de la célula, en el ADN, o en el
citoesqueleto. La principal desventaja de esta familia de fármacos es su escasa especificidad
para atacar exclusivamente la célula tumoral, por lo que su mecanismo de acción
necesariamente afecta a células sanas.
Sin embargo, recientemente, se han introducido nuevas terapias dirigidas contra un
objetivo concreto, una proteína o un receptor de membrana ubicado en la célula tumoral.
Las primeras terapias anti-diana introducidas fueron anticuerpos monoclonales de
administración intravenosa, sin embargo, en los últimos años hemos presenciado un
verdadero avance en el desarrollo de una nueva familia de terapias dirigidas orales,
llamadas inhibidores de tirosinquinasa (Lluch, 2016).
De acuerdo con el National Cancer Institute, en septiembre de 2017 se realizó una encuesta
donde se indica que las terapias alternativas más utilizadas contra el cáncer son aquellas
que están involucradas con la parte psicológica y emocional del paciente, tales como
terapias espirituales y relajación. Así como complementos nutricionales, vitamínicos y de
origen natural, tales como infusiones, tópicos y aromaterapias.
2.-Medicina tradicional La medicina tradicional mexicana es un sistema de conceptos, creencias y prácticas de
recursos materiales y simbólicos “destinados a la atención de diversos padecimientos y
procesos desequilibrantes” cuyo origen se remonta a las culturas prehispánicas. (Reyes,
2010) y está presente en todos los pueblos y grupos etnolingüísticos de México.
Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), la medicina tradicional está definida
como todo el conjunto de conocimientos, aptitudes y prácticas basados en teorías,
17
creencias y experiencias indígenas de las diferentes culturas, sean o no explicables, usados
para el mantenimiento de la salud, así como para la prevención, el diagnóstico, la mejora o
el tratamiento de enfermedades físicas o mentales (OMS, 2016).
El conocimiento de las plantas medicinales en la actualidad ha llegado a un nivel muy
elevado. Ahora somos capaces de conocer, aislar y estudiar el efecto de algunos principios
activos de las plantas en nuestro organismo y sobre todo si estos principios activos son
capaces de beneficiar en nuestra salud de manera preventiva o curativa (Cortés, 2005).
2.1 Medicina Tradicional Mexicana
En México alrededor de 4 000 especies de plantas con flores tienen atributos medicinales,
es decir que más o menos una de cada siete especies posee alguna propiedad curativa
(Ocegueda y col. 2005). La utilización de plantas medicinales se ve afectada por un mayor
uso de medicamentos que de plantas medicinales que pudiesen prevenir o aliviar síntomas
de las enfermedades con apoyo de otros tratamientos médicos previamente establecidos.
Todo esto ocurre a pesar del conocimiento que existe por parte de la población que va
adquiriendo de generación en generación, razón por la cual es necesario e indispensable el
estudio más detallado de las propiedades y componentes de la planta medicinal en
cuestión, así como las posibles reacciones adversas que puede ocasionar (Sagrera, 1991).
Solo el 5% de las especies estudiadas cuentan con la validación química, farmacológica y
biomédica necesaria para su aceptación y adecuada utilización para coadyuvar en el
tratamiento de alguna enfermedad. Por esta razón, las industrias farmacéuticas cuentan
con líneas de investigación de etnobotánica y quimiotaxonomía para poder clasificar las
características químicas de las plantas medicinales y así ayudar a resolver algunas de las
enfermedades más importantes de la humanidad (Lozoya, 1997).
Las cifras anteriores son incoherentes si nos remontamos a nuestros antepasados y
analizamos la visión que tenían de la naturaleza, sus plantas y sus propiedades. Esto sin
considerar que en estos tiempos y gracias al avance de la tecnología podemos saber con
gran precisión la cantidad de compuestos que contiene una planta medicinal en cada una
18
de las partes que la conforman, así como sus propiedades fisicoquímicas y como pueden
ayudar a nuestro cuerpo.
2.2 Importancia del estudio de las plantas medicinales.
En el año 1991 la Organización Mundial de la Salud (OMS) dictaminó las “Pautas para la
evaluación y registro de medicamentos herbolarios”, con el fin de facilitar el desarrollo,
evaluación y registro realizado por los organismos de reglamentación, con fines científicos
e industriales. Estas pautas están adaptadas a las necesidades de cada país a modo de
aprovechar al máximo la variedad botánica que se encuentre en la zona. Pero dentro de
estas pautas se encuentran algunas que no pueden ser modificadas. Dentro de las cuales se
encuentran las siguientes: (OMS, 1991)
▪ Evaluación de calidad: Evaluación farmacéutica, material vegetal bruto, producto
acabado y estabilidad.
▪ Evaluación de inocuidad: Estudios toxicológicos, documentación de la inocuidad
basada en la experiencia.
▪ Evaluación de la eficacia: Actividad, pruebas exigidas para respaldar las indicaciones,
productos combinados y uso previsto.
De acuerdo con estas pautas, los estudios toxicológicos son parte de los estudios de
inocuidad en los cuales es necesario demostrar que el producto herbolario no es peligroso
para la salud.
En México existen normativas oficiales que regulan estos estudios de igual modo a lo
estipulado por la OMS, estas normas son la NOM-248-SSA1-2011 que especifica las buenas
prácticas de fabricación para establecimientos dedicados a la fabricación de remedios
herbolarios y la NOM-220-SSA1-2002, Instalación y operación de la farmacovigilancia, que
se encarga de establecer los lineamientos sobre los cuales se deben hacer las actividades
de farmacovigilancia (DOF: 2011, DOF: 2002).
Debido a esto, en el presente trabajo se realizó un ensayo in vitro para evaluar la capacidad
que tiene el Aceite Esencial (AE) de Decatropis bicolor de funcionar como agente
19
antigenotóxico y reducir los efectos de la terapia utilizada en pacientes con cáncer de
mama.
3. Decatropis bicolor D. bicolor es una planta endémica de la región noreste de México y muy conocida por la
gente que vive en el Valle del Mezquital. Su nombre común es Aranto, chile anchillo, hoja
dorada y palo muerto. Florece durante los meses de febrero a abril y sus flores son
pequeñas y blancas (Cortes, 2005).
3.1 Propiedades medicinales de D. bicolor
D. bicolor ha sido utilizada debido al conocimiento que se fue adquiriendo de generación
en generación y con el paso del tiempo la comunidad científica analizó sus propiedades
fisicoquímicas y se han encontrado diversos tipos de moléculas que tienen actividad
antifúngica, antiinflamatoria, antibacteriana y anticancerígena.
Lo cual ha llevado a la comunidad a interesarse más por las propiedades específicas para
poder aprovechar al máximo sus componentes y ser utilizado de la mejor manera posible.
Análisis realizados por García y colaboradores en 1999 encontraron en sus propiedades
fitoquímicas la presencia de cumarinas y esteroles, que son vitales para sus efectos
terapéuticos (García, 1999).
3.1.1 Actividad antifúngica
En un estudio publicado por Cárdenas y colaboradores en 2005 se demostró la capacidad
que tiene D. bicolor de inhibir el crecimiento de Aspergillus flavus. Lo lograron mediante el
uso de 3 extractos diferentes: clorofórmico, hexánico y etanólico. Esto se realizó mediante
el análisis del diámetro de inhibición de crecimiento en medio Czpek, donde se encontró
que la dosis necesaria era de 25ug de extracto hexánico por caja petri (Cárdenas, 2005).
3.1.2 Actividad antiinflamatoria
Con anterioridad se ha determino que las cumarinas son compuestos que pueden ser
utilizados como antiinflamatorios y ya que el AE de D. bicolor contiene una gran cantidad
de estas, durante 1999 García y colaboradores realizaron un estudio para evidenciar sus
propiedades antiinflamatorias, ya que funciona inhibiendo peroxidación lipídica además de
“barrer” con los aniones radicales involucrados en este proceso (García, 1999).
20
El estudio utilizó ratones para evaluar la reducción de un edema inducido por 13-acetato
de 12-tetradecanoiforbol en donde se determinó que de los compuestos cumarínicos con
mayor eficacia fueron la heraclenina y heradenol que consiguieron una reducción de entre
73 y 75% del edema con una dosis utilizada de 1mg (García, 1999).
3.1.3 Actividad antibacteriana
En 2005 Cortés evidenció resultados que demuestran que la capacidad antibacteriana de
extractos de cloroformo y acetato de etilo que presentaban la mayor actividad mediante el
ensayo de la Concentración mínima bactericida, para este estudio se utilizaron cepas de
Escherichia coli, Salmonella typhmurium, Pseudomona aeruginosa, Entreococcus faecalis,
Staphylococcus aureus y Streptococcus pneumoniae. Elegidos de acuerdo con su
importancia clínica (Cortés, 2005).
3.1.4 Actividad anticancerígena
Durante generaciones se ha utilizado esta planta como tratamiento para personas con
cáncer de mama y cérvico uterino preparado a modo de infusión que se toma durante el
día, aunque se han presentado casos donde el abuso en el consumo de la infusión puede
provocar ceguera.
Las propiedades anticancerígenas que presenta esta planta han sido recientemente
estudiadas por Estanislao y colaboradores en 2016, en un proyecto que evaluó
específicamente la capacidad citotóxica de esta planta. Encontrando que el aceite esencial
de Decatropis bicolor en extracto acuoso no produce efecto citotóxico en líneas celulares
epiteliales de mama MCF-10, además de esto los resultados muestran una inducción de
apoptosis a tiempos cortos en línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231 (Estanislao,
2016).
Esto que quiere decir que el AE de D. bicolor activa las caspasas 9 y 3 y activa la vía intrínseca
de la apoptosis, viéndose evidenciado por los cambios morfológicos característicos que
presentan las células, llamados cuerpos apoptóticos. Este efecto es sin duda, uno de los más
importantes cuando se busca un tratamiento contra el cáncer ya que induce apoptosis en
lugar de provocar efectos necróticos que puedan dañar el resto de las células (Estanislao,
2016).
21
En otro estudio realizado por Cortés en 2005 también se demostró que no hubo actividad
citotóxica de D. bicolor en extracto etanólico en línea celular HeLa. Lo cual refuerza la
iniciativa de estudiar esta planta y encontrar una dosis efectiva para poder ser utilizada
como agente quimiprotector y coadyuvante en la terapia contra el cáncer (Cortés, 2005).
De acuerdo con Estanislao y Cortés, los compuestos utilizados que tienen un mayor efecto
contra las células cancerígenas son aquellos compuestos que tienen naturaleza no polar. Lo
cual es información valiosa para poder continuar la investigación más específica de estos
compuestos que puedan hacer cada vez más dirigido el tratamiento contra esta afección.
3.2 Evaluación genotóxica de D. bicolor
En 2017, Chavarría realizó la evaluación del efecto genotóxico del AE de D. bicolor. En este
estudio se realizó un ensayo de micronúcleos en células binucleadas en cultivo de linfocitos
humanos, encontrando que el AE no presenta efecto genotóxico en estas células en ninguna
de las concentraciones utilizadas durante el ensayo las cuales fueron: 20, 40 y 60 ug/mL ya
que el promedio de células binucleadas micronucleadas no mostró diferencias significativas
entre estas y el control negativo (Chavarría, 2017).
Así mismo, se demuestra también que a concentraciones de 40 y 60 ug/mL el AE se presenta
un efecto citotóxico en linfocitos humanos, lo cual no sucede a una concentración de
20ug/mL, esto nos permite utilizar este valor para comenzar estudios posteriores para
determinar la concentración ideal del AE para ser utilizado en el tratamiento contra el
cáncer de mama (Chavarría, 2017).
De acuerdo con los trabajos realizados por Cortés, Estanislao y Chavarría, queda
evidenciado que el AE de D. bicolor no produce ningún efecto genotóxico en células
normales por lo cual puede ser utilizado para interaccionar de manera directa con
mutágenos que pongan en riesgo la integridad del material genético y determinar la
capacidad que tiene el AE de proteger a las células normales de sufrir efectos adversos
durante las quimioterapias.
22
4. Metil-metanosulfonato (MMS) El Metilmetanosulfonato es un compuesto con fórmula C2H6O3S encontrado
comercialmente en estado líquido, de color amarillo claro y sin olor. Presenta una DL50 en
ratas de 225 mg/kg. En humanos tiene una toxicidad aguda de nivel 3. Provoca irritación
cutánea, ocular grave, de vías respiratorias y posible agente cancerígeno (Jenkins, 2005).
4.1 Propiedades del MMS
Este solvente fue anteriormente utilizado como insecticida y como tratamientos contra el
cáncer como fármaco antineoplásico o citostático. Fue uno de los primeros en utilizarse
contra tumores malignos, ya que es activo durante todo el ciclo celular, presentando su
mayor efecto en células en proceso de división ya que tiene la capacidad de agregar su
grupo alquilo a las bases nitrogenadas por la alta densidad electrolítica que poseen (Ahmad,
2015; Jenkins, 2005).
Figura 1: Estructura de la molécula del Metil-metanosulfonato (Jenkins, 2005).
23
4.2 Mecanismo de acción
Existen dos tipos de agentes genotóxicos, los directos e indirectos. Los directos son aquellos
que actúan directamente con el ADN o con las proteínas sin que sea necesaria su activación
enzimática. Por el contrario, los indirectos necesitan activación enzimática para poder
realizar su efecto en el organismo. De acuerdo con la clasificación anterior, el MMS está
catalogado como genotóxico directo.
Es un agente alquilante monofuncional que contiene un grupo CH3, con gran afinidad a los
centros nucleofílicos del ADN, alquilando el N7 de la guanina, N3 de la adenina de manera
preferente, y en menor cantidad el O6 de la guanina. Estos compuestos son citotóxicos y
mutagénicos ya que provocan aductos en el ADN, Cross-links entre dos moléculas ADN-ADN
y ADN-Proteínas, así como rompimientos que pueden generar aberraciones cromosómicas
y otros daños.
Las modificaciones producidas en los oxígenos de las bases producen transiciones y
transversiones. Mientras que por otro lado las N-alquipurinas no producen
desemparejamientos durante la replicación, pero tienden a formar sitios
apurinicos/apirimídicos que detendrán el proceso de replicación ya que la cadena molde no
es la adecuada. La ausencia de una base nitrogenada altera el código genético sí la cadena
implicada es la que se transcribe y se traduce. Si se inserta un nucleótido que no es el
correcto, el resultado se presenta como mutaciones (Jenkins, 2005).
5. Genotoxicidad Durante la división celular el material genético (ADN) contenido en el núcleo celular se
duplica y divide equitativamente dando lugar a dos células hijas idénticas; este proceso
puede producirse de manera errónea debido a errores durante la replicación y posterior
división del ADN, a roturas cromosómicas y al efecto de la radiación y de sustancias
genotóxicas, produciéndose pérdida cromosómica y haciendo que el reparto del material
genético no sea equitativo (Zalazain, 2005).
24
La genotoxicidad es una propiedad de los tóxicos químicos, físicos o biológicos, dando como
resultado el daño a la integridad del ADN, ya sea por mutaciones, intercambios de material
cromosómico, deleciones o rupturas de cadenas, lo cual conduce a las células a diversos
mecanismos como la apoptosis en el mejor de los casos y a la carcinogénesis o alteración
del fenotipo en el peor (Akthar, 2016).
5.1 Herramientas para la evaluación del efecto genotóxico
El efecto citotóxico y genotóxico de las sustancias que están a prueba llevan una serie de
pasos previos para poder ser utilizadas como tratamiento para alguna enfermedad,
dependiendo de la etiología de ésta, la naturaleza del compuesto y sus propiedades
fisicoquímicas. La Organización para la Cooperación y Desarrollo Económicos (OECD por sus
siglas en inglés) es la encargada de realizar la estandarización de dichas pruebas (OECD,
2014).
La genotoxicidad, es la capacidad que tiene una sustancia para causar daño en el material
genético. Este daño se traduce en rupturas de ADN y, por lo tanto, pérdida de material
genético, estas anormalidades pueden detectarse mediante distintas técnicas moleculares
y/o citogenéticas (Fenech y col 1986).
5.2 Importancia de evaluar la genotoxicidad
La evaluación genotóxica es de carácter obligatoria a nivel internacional para compuestos
de nueva síntesis y fitofármacos. La diversidad de efectos nocivos a los que está expuesto
el ADN son imposibles de detectar a través de un único sistema de ensayo, la gran cantidad
de mutaciones que pueden originarse no pueden abarcarse por un ensayo aislado, y sí lo
fuera ofrecería un ensayo poco preciso; por este motivo, es imprescindible utilizar un grupo
de ensayos in vivo e in vitro, que permitan una correcta exploración del efecto genotóxico
de la sustancia de interés, para poder predecir con certeza los efectos que pueda tener
(Arencibia, 2003).
De acuerdo con los trabajos de Cortés en 2005 y Estanislao en 2016 se demostró que el
efecto que tiene el AE de D. bicolor en las células cancerígenas es beneficioso ya que no hay
evidencia que indique que pueda provocar daños al tejido contiguo. Así también durante
2017, Chavarría realizó un estudio donde utilizando este mismo método y demostró que el
25
AE de esta planta no produce un efecto genotóxico en linfocitos humanos a ninguna de las
concentraciones empleadas en el ensayo (20, 40, 60ug/mL). Lo cual nos permite seguir
avanzando de manera segura al siguiente paso de la investigación.
A partir de estos resultados, se realizó en el presente trabajo el ensayo de Micronúcleos en
cultivo celular de linfocitos humanos para evaluar la capacidad que tiene este AE para
impedir los efectos adversos que provocan los medicamentos utilizados para el tratamiento
contra el cáncer. En este caso se utilizó como control positivo el mutágeno Metil
metanosulfonato (MMS) para “retar” al aceite en cuestión.
6. Micronúcleos EL micronúcleo fue reconocido a finales del siglo XIX, cuando Howell-Jolly encontraron
pequeñas inclusiones en la sangre tomada de gatos y ratas. Las pequeñas inclusiones,
llamados Cuerpos de Howell-Jolly, también se observan en los eritrocitos de la sangre
periférica de pacientes con anemia grave (Hayashi, 2016).
Los micronúcleos son cuerpos pequeños, extracelulares que se originan a partir de
fragmentos acéntricos o cromosomas enteros que normalmente se pierden desde el núcleo
de la célula durante la mitosis. Estos fragmentos de cromosomas rodeados por membrana
nuclear son morfológicamente similares al núcleo normal, pero de menor tamaño, de ahí
su nombre: “Micronúcleos” (Kang, 2013).
Este evento puede ser inducido por estrés oxidativo, exposición a clastógenos o
aneugénicos, defectos genéticos en los mecanismos reguladores durante el ciclo celular,
genes reparadores y por deficiencias en los nutrientes requeridos como cofactores en el
metabolismo del ADN y segregación de los cromosomas (Iarmarcovai y cols. 2008).
6.1 Ensayo de micronúcleos
Los ensayos de MN, como se mencionó anteriormente eran realizados a partir de muestras
de médula ósea y eritrocitos en sangre periférica y hasta ahora siguen siendo una buena vía
de análisis para la genética toxicológica ya que estos ensayos son realizados in vivo. Sin
embargo, surgió la necesidad de emplear un ensayo que pudiera ser controlado de mejor
26
manera ya que los modelos de análisis como animales estaban expuestos a factores que no
podían ser controlados y que pueden alterar los resultados.
Para esto, fue necesario que se implementaran nuevas técnicas para poder ser
reproducidas in vitro, con la finalidad de tener un ambiente controlado durante la
experimentación que permitiera una mayor confiabilidad de los resultados obtenidos,
además de realizar el análisis cuando las células presentaran una única división. Por lo cual,
tiempo después se desarrolló la técnica usando linfocitos humanos cultivados de manera in
vitro (Fenech, 2000).
El uso de la técnica del recuento de MN como medida de daño cromosómico sobre cultivos
de linfocitos humanos fue propuesta por primera vez por Countryman y Heddle en 1976,
cuyo único requisito era la elección de tipos celulares con gran actividad mitótica (Zacalin,
2005).
Más tarde, en 1985, el ensayo de genotoxicidad fue mejorado por Fenech y Morley,
consiguiendo frenar el proceso de división celular cuando la célula sólo hubiese sufrido una
división mitótica, para ello desarrollaron la técnica del bloqueo de la citocinesis (CBMN:
cytokinesis-block micronucleus) cuyo fundamento es la utilización de un agente químico
denominado citocalasina-B cuya función es impedir la citocinesis celular (Checin, 2014;
OECD, 2014).
6.2 Ensayo de micronúcleos con bloqueo de citocinesis.
La citocinesis es un proceso por el cual una célula en división se separa en dos, con lo que
el citoplasma se divide en dos paquetes celulares. Las dos hijas resultantes de la mitosis y
la citocinesis tienen un contenido genético idéntico entre sí y al de la célula madre de la que
provienen. Aquí es donde interviene la Citocalasina-B (Cyt-B) (Karp, 2010).
De esta manera es cómo surge el ensayo de MN con bloqueo de citocinesis. Esto sucede
debido al mecanismo de acción de la citocalasina-B que impide la polimerización de la actina
requerida para el anillo de filamentos que se forma cuando se constriñe el citoplasma
durante la citocinesis. De esta manera, la cantidad de células encontradas en el cultivo serán
binucleadas en su mayoría (Fenech, 1999).
27
La cantidad de núcleos encontrados en las células dependerá de las veces que la célula se
divida. En este caso, la Cyt-B es agregada a las 44h para asegurar que las células encontradas
en mayor proporción sean las binucleadas, las cuales son el modelo de estudio primordial
para la realización de este ensayo (Fenech, 2002).
6.3 Criterios para la identificación de Micronúcleos
A lo largo de los años se han realizado diversos ensayos que permitieron establecer criterios
para la correcta identificación de estructuras donde se incluyen a los MN, donde se habla
de las características necesarias para ser reconocidos como tal y que permitan un recuento
fiable y objetivo a partir de criterios de selección de las células binucleadas (CB) y de los MN
(Fenech, 2002).
• Criterios para identificación de células binucleadas (Fenech, 2002).
o Las células deben ser binucleadas
o Ambos núcleos de la célula deben tener membranas nucleares intactas y
deben estar dentro del mismo límite citoplásmico.
o Los dos núcleos de una célula pueden estar unidos por un puente
nucleoplasmático fino que no es más ancho que un cuarto del diámetro
nuclear más grande.
o Los dos núcleos de la CB se pueden tocar, pero idealmente no deben
superponerse entre sí. En caso de estar superpuestos, se puede marcar sólo
si los límites nucleares de cada núcleo se pueden distinguir.
o El límite citoplásmico o membrana de una CB debe estar intacto y debe
distinguirse claramente de la frontera citoplasmática de las células
adyacentes.
28
• Criterios para la identificación de MN (Fenech, 2002).
o El diámetro del MN debe tener una medida entre 1/16 y 1/3 del diámetro
medio del núcleo principal y menos de la mitad.
o Deben ser redondos o de forma oval.
o No son refringentes.
o No están conectados con los núcleos principales
o No pueden estar superpuestos, si se tocan entre sí, ambos límites deben ser
distinguibles
o Deben tener a misma intensidad de tinción que los núcleos, pero puede ser
más intensa.
6.4 Ventajas y desventajas
Dependiendo de las características de cada estudio, y de lo que se desee evaluar, se pueden
utilizar diferentes tipos de células para aplicar el ensayo de micronúcleos. Los linfocitos de
sangre periférica, como sistema celular de ensayo, presentan una serie de características
que los hacen especialmente apropiados para su utilización en esta técnica.
➢ Ventajas
o La técnica de MN es simple, de fácil recuento y costo reducido
o Se pueden analizar una gran cantidad de células en un corto periodo de tiempo
o Se pueden utilizar una variedad extensa de células
o Permite detectar diversas lesiones en el material genético como:
• Rupturas de doble cadena o cadena sencilla (MN)
• Formación de puentes nucleoplasmáticos (Cromosomas
dicéntricos)
• Apoptósis.
29
➢ Desventajas
o Existen factores que modulan la frecuencia de micronúcleos los cuales deben
ser considerados en el análisis, tales como: edad, sexo, etnicidad, etc.
o Tabaquismo y exposición involuntaria a agentes genotóxicos.
o Las diferencias entre protocolos como la técnica y manipulación en los
distintos laboratorios son una fuente importante de variabilidad.
o Una tinción deficiente o mal realizada puede interferir en la lectura de los
MN
o El criterio del experimentador al momento de realizar la lectura.
30
II. JUSTIFICACIÓN De acuerdo con el Instituto Nacional de Geografía y Estadística (INEGI) 3 de cada 10 mujeres
con cáncer padecen tumor maligno de mama. Y según cifras de la OMS, es el principal tipo
de cáncer que afecta a mujeres a nivel mundial y cuyas tasas de morbilidad hospitalaria
muestran los mayores incrementos con la edad. Estos datos nos permiten saber con
claridad la importancia de la incidencia de este tipo de cáncer en nuestro país, por lo cual
debemos poner especial atención a evolucionar y renovar los medicamentos y
coadyuvantes que nos permitan tener un tratamiento adecuado y en pro de la salud y
pronta recuperación del paciente
La investigación de nuevas alternativas para el tratamiento de diversas enfermedades que
preocupan al ser humano se ha intensificado en las últimas décadas, esto gracias a las
interacciones y reacciones adversas que tienen la mayoría de los medicamentos empleados
para curarlas. De manera que, a modo de evitar estos efectos adversos, la medicina actual
está optando por retornar a la medicina tradicional, buscando respuestas en las plantas ya
conocidas y buscando nuevos conocimientos de algunas otras de las cuales no se conocían
efectos benéficos para la salud del ser humano.
De acuerdo con la OMS, el 80% de las personas confían en la medicina tradicional para
resolver las principales necesidades de salud. En Estados Unidos Eisenberg y Mac Lennan
en Australia estimaron entre 1993 y 1996 que el 50% de la población general de naciones
industrializadas usan la medicina alternativa.
La Revista Cubana de Oncología en 1999 realizó un estudio de revisión de 40 publicaciones
realizadas durante 10 años donde encontraron que los pacientes que estaban en
tratamiento farmacológico contra el cáncer de mama se inclinaban por la medicina
alternativa ya que era menos costosa, eran tratamientos naturales y por lo tanto eran poco
tóxicos además de no encontrar en la medicina convencional una expectativa para su
enfermedad.
Además de esto, encontraron que las terapias alternativas más utilizadas son la dieta,
acupuntura, relajación, terapia psicológica y la más importante, la medicina homeopática.
31
Esta última será la base para poder realizar este estudio, ya que la mayor parte de los
principios activos y moléculas contenidas en las plantas no han sido analizado a fondo y
mucho menos se han realizado estudios donde sea evaluada la capacidad de estos
principios y abundar así en el conocimiento de sus posibles efectos biológicos.
Decatropis bicolor es muy utilizada en el estado de Hidalgo, para diversas enfermedades,
una de las más importantes, el cáncer. De acuerdo con los estudios previamente realizados
por Estanislao y colaboradores, donde se evaluó la capacidad citotóxica contra células
cancerígenas y su ausente efecto en células no cancerígenas, se determinó que el
mecanismo por el cual ejerce su efecto es por medio de la inducción de apoptosis de
acuerdo con las características típicas de las células cancerígenas de cáncer de mama en
línea celular MDA-MB-231 además de haber encontrado que el tiempo en el que actúa es
inmediato. El aceite esencial de Decatropis bicolor activa las caspasas 9 y 3 activando la vía
intrínseca por la cual manda a apoptosis a las células cancerosas formando las estructuras
características de los cuerpos apoptóticos.
Esta propiedad es valiosa para un tratamiento para el cáncer ya que evita los efectos
necróticos que pudieran afectar a las demás células. Debido a estas razones se encuentra
la necesidad de seguir adelante con la investigación sus propiedades y efectos en el
organismo, por lo cual, en el siguiente trabajo se pretende evaluar la característica del
aceite esencial del Decatropis bicolor como agente antigenotóxico, como un paso más en la
serie de estudios que son necesarios realizar para garantizar su inocuidad.
32
III. HIPÓTESIS. Si el Aceite Esencial de D. bicolor genera un efecto antigenotóxico, entonces se reflejará en
la disminución de Células Binucleadas Micronucleadas al ser expuesto en un cultivo de
linfocitos humanos tratado con MMS.
IV. OBJETIVO GENERAL:
• Evaluar si el aceite esencial de D. bicolor tiene la capacidad de funcionar como
agente antigenotóxico mediante el ensayo de micronúcleos con bloqueo de
citocinesis en células binucleadas.
Objetivos Particulares: o Determinar la frecuencia de células binucleadas micronucleadas en un
cultivo de linfocitos humanos expuestos a diferentes concentraciones del
aceite esencial de Decatropis bicolor con el reto del mutágeno metil
metanosulfonato (MMS), para determinar el efecto antigenotóxico.
o Determinar cómo se ve afectado el % CBPI y el % de Citostasis al exponer a
diferentes concentraciones del aceite esencial de Decatropis bicolor con el
reto del mutágeno metil metanosulfonato (MMS)
33
V. DIAGRAMA DE FLUJO
1
332.5 uL de AE de
D. bicolor (20uL/mL)
332.5 uL de AE de
D. bicolor (40 uL/mL) 332.5 uL de AE de
D. bicolor (60 uL/mL)
34
35
VI. MATERIALES Y MÉTODOS 1. Obtención del AE
El extracto utilizado para este estudio fue proporcionado por el Instituto Politécnico
Nacional (IPN) y fue extraído en la Escuela Nacional de Medicina y Homeopatía, mediante
la técnica reportada por Estanislao en 2016(Estanislao, 2016).
2. Cultivo celular
Para realizar el cultivo celular, se seleccionaron dos donadoras femeninas, clínicamente
sanas y no fumadoras. La obtención de la muestra se realizó por medio de una punción
venosa con jeringa estéril heparinizada con Inhepar 1000UI/mL en solución inyectable.
El cultivo se realizó en una campana de flujo laminar de tipo A2 con material nuevo,
desechable y estéril. El medio utilizado fue RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute
Medium), suplementado con 10% de SFB por cada 5mL de medio, además de 10uL de
antibiótico Estreptomicina/Penicilina al 1% y 200uL de PHA GIBCO.
Posteriormente se agregó 250uL de sangre heparinizada a cada cultivo por 5mL de medio
suplementado. Esto se realizó para cada tratamiento y donante por duplicado, con un total
de 24 cultivos. Los tratamientos empleados fueron los siguientes: Control positivo, control
negativo, control de vehículo, concentración 1 (20ug/mL), concentración 2 (40ug/mL) y
concentración 3 (60ug/mL) preparados como se explica en el siguiente punto. Todos los
medios de cultivo se incubaron a 37°C durante 44h, posteriormente fueron sometidos a su
tratamiento.
3. Descripción de los tratamientos.
Después de 44h de incubación a 37°C se adicionaron a cada cultivo 60uL de una solución de
Cyt-B a una concentración de 0.5ug/µL. Dando como concentración final en cada cultivo de
6uL/mL. Al finalizar se agregaron los compuestos correspondientes a cada tratamiento, de
la siguiente manera.
36
Control positivo:
El compuesto utilizado como control positivo fue el Metil metanosulfonato (MMS) al 99%
Sigma-Aldrich en una concentración inicial de 50ug/mL. Esto basado en el estudio realizado
por Günter y sus colaboradores en 2012 donde utilizaban concentraciones similares en las
lecturas apegadas a los criterios de la OECD no permitían que el efecto citotóxico fuera
significativo para tomarlo en cuenta como control positivo (Günter, 2012).
Durante 2017, Chavarría en un estudio realizó un gradiente de concentración que manejaba
valores de 15ug, 25ug y 35ug/mL basadas en distintos autores que usaban al MMS como
control positivo en sus ensayos. En este estudio, se determinó que la concentración ideal
era de 20ug/mL para el control positivo en las mismas condiciones experimentales. Ya que
dicho estudio fue realizado en las mismas instalaciones que el presente trabajo (Chavarría,
2017).
El mutágeno se agregó a las 44h de la incubación inicial, adicionando 6.65uL con lo cual se
tuvo una concentración de 20ug/mL en el cultivo. Además, se agregó un volumen de
325.85uL de medio RPMI 1640 para igualar el volumen con el de los otros tratamientos.
Control de vehículo
Para el control del vehículo se tomó en cuenta la concentración mayor utilizada en los
tratamientos con el AE, esa concentración fue de 7.6uL/mL del vehículo, DMSO para lo cual
se agregaron 33.5 µL de una solución (0.1154uL/µL) para alcanzar dicha concentración.
Control negativo
Para el control negativo, se utilizaron 332.5uL de RPMI 1640 para igualar el volumen final
de los demás tratamientos.
37
Concentraciones
Para los tratamientos se utilizaron las mismas concentraciones del MMS que en el control
positivo, además de utilizar 3 distintas concentraciones de AE de D. bicolor preparando
soluciones cuyo volumen fuera igualado a 332.5uL dando las siguientes concentraciones
C1= 20µL/mL, C2= 40µL/mL y C3= 60µL/mL.
Cosecha celular
La cosecha se realizó a las 72 horas de la primera incubación y se centrifugó a 3000rpm por
10 minutos y se retiró el sobrenadante. Posteriormente se realizó el shock hipotónico con
una solución de KCl 0.075M a 37°C y se dejó reposar durante 30 min a la misma
temperatura. Posterior a esto, se centrifugó a la misma velocidad por 5 minutos. Después
se retiró el sobrenadante para realizar la primera fijación, para lo cual se agregó en agitación
constante a 5mL de solución fijadora recién preparada (metanol/ácido acético) en
proporciones 6:1 a 4°C dejando reposar 15 minutos. Se volvió a centrifugar bajo las mismas
condiciones y se retiró el sobrenadante. Esto último se repite 2 veces más con la solución
fijadora y en la tercera fijación se dejó solución suficiente para resuspender las células.
Esta solución se utilizó para realizar el goteo en portaobjetos nuevos y mantenidos a 4°C en
etanol. El goteo se realizó dejando caer la gota a lo largo del portaobjetos a una distancia
no mayor a 10 cm de altura para evitar la ruptura de las células. Se gotearon 2 laminillas por
tratamiento.
Tinción
La tinción se realizó utilizando el colorante de Giemsa en un vaso Coplin donde se agregaron
40mL de agua destilada y 5mL del colorante previamente filtrado y 5mL de buffer de
fosfatos pH 6.8. Las preparaciones secas se tiñeron por 12 minutos, se enjuagaron con agua
corriente y se secaron a condiciones ambientales (Chein, 2014).
38
Evaluación del efecto antigenotóxico
Se observaron las preparaciones antes mencionadas para cada tratamiento en un
microscopio óptico con el objetivo de 100x y se contaron 2000 células, determinando el
número de células binucleadas micronucleadas de cada tratamiento. Además de analizar el
efecto citotóxico, se contaron 2000 células determinando la cantidad de mononucleadas,
binucleadas y multinucleadas en cada tratamiento.
La OECD determinó en 2013 que con la finalidad de estimar la actividad citotóxica y
citostática de un tratamiento comparándolo con los controles, se debe calcular el Índice de
Bloqueo por Citocinésis (CBPI), esto se realizó por medio de la siguiente formula:
𝐶𝐵𝑃𝐼 =((𝑁° 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑚𝑜𝑛𝑜𝑛𝑢𝑐𝑙𝑒𝑎𝑑𝑎𝑠) + (2𝑥 𝑁° 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑏𝑖𝑛𝑢𝑐𝑙𝑒𝑎𝑑𝑎𝑠) + (3𝑥 𝑁° 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑚𝑢𝑙𝑡𝑖𝑛𝑢𝑐𝑙𝑒𝑎𝑑𝑎𝑠))
𝑁° 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠
Otro parámetro para calcular es el % de Citostasis para cada tratamiento con la siguiente
fórmula:
% Citostasis =( N° células binucleadas + (2x N° células multinucleadas) ÷ (𝑁° 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠))𝑇
( N° células binucleadas + (2x N° células multinucleadas) ÷ (𝑁° 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠))𝐶= 𝑋100
Posteriormente se restó 100 al resultado obtenido, determinando así el % de Citostásis.
39
Análisis estadístico
Los resultados fueron obtenidos con el cálculo de la media y el error estándar. Cada uno de
los tratamientos para cada uno de los donadores (A y B) se realizaron por duplicado y el
análisis entre los tratamientos fue realizado mediante un análisis de varianza (ANOVA),
considerando resultados estadísticamente significativos cuando p<0.05.
Para realizar el análisis estadístico correspondiente a los dos donadores, se utilizó el modelo
t de student debido a que también es importante determinar si existe alguna diferencia
significativa entre nuestros dos grupos, comparando las dos medias poblacionales.
40
VI. RESULTADOS Evaluación anitgenotóxica y citotóxica del donador “A” y “B”
Para evaluar los efectos antigenotóxicos y citotóxicos del AE de D. bicolor se realizó el
ensayo de micronúcleos in vitro utilizando la sangre de los donadores “A” y “B”. Los
resultados se muestran en las tablas 1 y 2, las cuales se expresan en porcentaje y número
de células divididas en células mononucleadas, binucleadas, binucleadas con micronúcleos
y multinucleadas. En el apartado de genotoxicidad se muestran el número de micronúcleos
encontrados en 2000 células binucleadas, además del CBPI.
Cabe aclarar que en este ensayo se realizó por duplicado cada tratamiento para hacer más
representativa la evaluación en cuanto a número de datos a analizar se refiere.
41
Tabla N°1 Resultados de los distintos tratamientos para el donador “A”
En la tabla 1 se presentan los datos obtenidos en la lectura de las laminillas de los cultivos
para el donador “A”, presentándose el Índice de proliferación por bloque de citocinesis
(CBPI) y el % de Citostasis obtenidos mediante las fórmulas previamente mencionadas
CITOTOXICIDAD Control negativo
Control positivo Control vehículo
Concentración 1 (20ug/ml)
Concentración 2 (40ug/mL)
Concentración 3
(60ug/mL)
A1 A2 A1 A2 A1 A2 A1 A2 A1 A2 A1 A2
% Células mononucleadas
68 66.95 62.85 61.45 68.85 68.4 65.3 68.1 68.95 67.05 68.8 67.95
No. De células mononucleadas
1360 1339 1257 1229 1377 1368 1361 1362 1379 1641 1376 1359
% Células binucleadas
31.5 32.65 35.4 36.9 31 31.4 34 31.1 30.45 32.5 31.1 32
No. De células binucleadas
631 653 708 738 620 628 625 622 609 630 622 640
% Células multinucleadas
0.45 0.4 1.75 1.65 0.15 0.2 0.7 0.8 0.6 0.45 0.1 0.05
No. De células multinucleadas
9 8 35 33 3 4 14 16 12 9 2 1
CBPI 1.325 1.335 1.389 1.402 1.313 1.318 1.354 1.327 1.317 1.334 1.313 1.321
% Citostasis 5.01 3.49 0.91 0.76 3.95 1.67 5.01 2.58
TOTAL 2000
GENOTOXICIDAD Control negativo
Control positivo Control vehículo
Concentración 1
Concentración 2
Concentración 3
Células binucleadas con
Micronúcleo.
0 0 19 16 1 2 8 6 4 6 2 1
TOTAL 2000
42
Tabla N°2 Resultados de todos los tratamientos para el donador “B”
La tabla 2 se presentan los resultados del donador “B”, replicando las condiciones que
fueron implementadas para el donador “A”, en ambos donadores se realizaron por
duplicado cada uno de los cultivos para tener una muestra más significativa para el posterior
análisis estadístico y así reducir lo más posible el error estándar.
CITOTOXICIDAD Control negativo
Control positivo Control vehículo
Concentración 1 (20ug/ml)
Concentración 2 (40ug/mL)
Concentración 3
(60ug/mL)
B1 B2 B1
B2 B1 B2 B1 B2 B1 B2 B1 B2
% Células mononucleadas
66.7 64.75 63.8 62.9 66.8 66.25 69.1 66.45 68.7 67.25 69.9 68.4
No. De células mononucleadas
1334 1295 1276 1258 1336 1325 1382 1329 1374 1345 1398 1368
% Células binucleadas
32.8 34.85 34.3 35.3 33 33.5 30.3 33 31 32.25 30.1 31.5
No. De células binucleadas
656 697 686 706 660 670 606 660 620 645 602 630
% Células multinucleadas
0.5 0.4 1 1.8 0.2 0.25 0.6 0.55 0.3 0.5 0 0.1
No. De células multinucleadas
10 8 38 36 4 5 12 11 6 10 0 2
CBPI 1.338 1.357 1.381 1.389 1.334 1.340 1.315 1.341 1.316 1.33 1.301 1.317
% Citostasis 3.82 2.09 9.29 1.8 9.0 4.25 13.32 8.71
TOTAL 2000
GENOTOXICIDAD Control negativo
Control positivo Control vehículo
Concentración 1
Concentración 2
Concentración 3
Células binucleadas con
Micronúcleo.
0 0 18 16 0 1 7 5 4 3 2 1
TOTAL 2000
43
En las siguientes figuras se muestran los tipos de células que se presentaron al momento
de la lectura de resultados de las preparaciones de la experimentación.
Figura 2.- Microfotografía
de una célula
Mononucleada vista a
1000x, Tinción Giemsa.
Figura 3.- Microfotografía
de una célula Binucleada
vista a 1000x, Tinción
Giemsa.
Figura 6.- Microfotografía
de una célula Binucleada con
Micronúcleo vista a 1000x,
Tinción Giemsa.
Figura 5.- Microfotografía
de una célula
Tetranucleada vista a
1000x, Tinción Giemsa.
Figura 4.- Microfotografía
de una célula Trinucleada
vista a 1000x, Tinción
Giemsa.
44
Tabla N°3: Media y error estándar de la
genotoxicidad de los resultados
del donador "A”
Figura 7.- Evaluación genotóxica del donador “A” para los distintos tratamientos, donde C
1, C 2 y C 3 presentan concentraciones distintas del AE del D. bicolor (20µg/mL, 40µg/mL
y 60µg/mL), con una F= 52.72, encontrando diferencias estadísticamente significativas
entre C (+) (**) y el resto de los tratamientos, con una P< 0.0001
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
CONTROL - CONTROL + CONTROL V C1 C2 C3
CB
MN
GENOTIXICIDAD A
**
**
*
*
*
GENOTOXICIDAD
A MEDIA SEM
+/-
C (-) 0.0000 0.0000
C (+) 17.5000 2.1213
CV 1.5000 0.7071
C1 7.0000 1.4142
C2 5.0000 1.4142
C3 1.5000 0.7071
45
Tabla N°4: Media y error estándar de la
genotoxicidad de los resultados
del donador "B”
Figura 8.- Evaluación genotóxica del donador “B” para los distintos tratamientos, donde C
1, C 2 y C 3 presentan concentraciones distintas del AE del D. bicolor (20µg/mL, 40µg/mL y
60µg/mL), con una F= 89.18 se encuentran diferencias estadísticamente significativas
entre C (+) (**) y el resto de los tratamientos, con una P<0.0001.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
CONTROL - CONTROL + CONTROL V C1 C2 C3
CB
MN
GENOTOXICIDAD B
**
*
*
*
**
GENOTOXICIDAD B MEDIA SEM +/-
C (-) .000 .0000
C (+) 17.000 1.4142
CV .5000 .7071
C1 6.000 1.4142
C2 3.500 .7071
C3 1.500 .7071
46
Tabla N°5: Media y error estándar de la
genotoxicidad de los resultados
de los donadores “A” y “B”
.
Figura 9.- Evaluación genotóxica del donador “A” y “B” para los distintos tratamientos,
donde C 1, C 2 y C 3 presentan concentraciones distintas del AE del D. bicolor (20µg/mL,
40µg/mL y 60µg/mL), con una F= 115.15 se encuentran diferencias estadísticamente
significativas entre C (+) (**) y el resto de los tratamientos, con una P < 0.0001
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
CONTROL - CONTROL + CONTROL V C1 C2 C3
CB
MN
GENOTOXICIDAD AB
GENOTOXICIDAD AB
Estadístico Estadístico
C (-) .0000 .00000
C (+) 17.2500 1.5000
C (V) 1.0000 .81650
C1 6.5000 1.291
C2 4.2500 1.2583
C3 1.5000 .5773
*
**
*
*
* *
47
Tabla N°6: Media y error estándar
de los resultados del CBPI
del donador “A”
CBPI A
MEDIA SEM +/-
C (-) 1.33000 .007071
C (+) 1.39550 .009192
C (V) 1.31550 .003536
C1 1.34050 .019092
C2 1.32550 .012021
C3 1.31700 .005657
Figura 10.- Evaluación citotóxica del donador “A” para los distintos tratamientos, donde C
1, C 2 y C 3 presentan concentraciones distintas del AE del D. bicolor (20µg/mL, 40µg/mL y
60µg/mL) con una F= 15.61 se encuentran diferencias estadísticamente significativas entre
C (+) (**) y C (-) (*) y el resto de los tratamientos, con una P< 0.002.
0
0.5
1
1.5
CONTROL - CONTROL + CONTROL V C1 C2 C3
CB
PI
CBPI A
*** * * * *
48
Tabla N°7: Media y error estándar
de los resultados del CBPI
del donador “B”
CBPI B
MEDIA SEM +/-
C (-) 1.3475 .0134
C (+) 1.3850 .0056
C (V) 1.3370 .0042
C1 1.3280 .0183
C2 1.3230 .0098
C3 1.3090 .0113
Figura 11.- Evaluación citotóxica del donador “B” para los distintos tratamientos, donde C
1, C 2 y C 3 presentan concentraciones distintas del AE del D. bicolor (20µg/mL, 40µg/mL y
60µg/mL), con una F= 10.46, C (-)(**) presenta diferencias significativas con C (V)(*), C 1(*),
C2(*) y C 3(*), con una P= 0.006.
0
0.5
1
1.5
CONTROL - CONTROL+ CONTROL V C1 C2 C3
CB
PI
CBPI B
** ****
49
Tabla N°8: Media y error estándar
de los resultados del CBPI
del donador “A” y “B”
CBPI AB
MEDIA SEM +/-
C (-) 1.33875 .01338
C (+) 1.39025 .0087
C (V) 1.32625 .01282
C1 1.33425 .01692
C2 1.32425 .00911
C3 1.31300 .00864
Figura 12.- Evaluación citotóxica de los donadores “A” y “B” para los distintos tratamientos,
donde C 1, C 2 y C 3 presentan concentraciones distintas del AE del D. bicolor (20µg/mL,
40µg/mL y 60µg/mL), con una F= 17.71, se encuentran diferencias estadísticamente
significativas entre C (+)(**) y C (-)(*), C (V)(**) y C 1(*), C2(*) y C3(*) con una P< 0.0001.
0
0.5
1
1.5
CONTROL - CONTROL+ CONTROL V C1 C2 C3
CB
PI
CBPI AB
* ** ** ** *
50
Tabla N°9: Media y error estándar
de los resultados del % de Citostasis
del donador “A”
%CITOSTASIS
A Media SEM +/-
C (V) 4.2500 1.0748
C1 .83000 .0989
C2 2.8100 1.6122
C3 3.7950 1.7182
Figura: 13 Evaluación citotóxica mediante el % de Citostásis del donador “A” para los distintos tratamientos, donde C 1, C 2 y C 3 presentan concentraciones distintas del AE del D. bicolor (20µg/mL, 40µg/mL y 60µg/mL), con una F=13.73, no se encuentran diferencias
estadísticamente significativas entre los tratamientos con una P= 0.007
0
2
4
6
8
10
12
14
CONTROL V C1 C2 C3
% C
ITO
STÁ
SIS
% CITOSTÁSIS A
51
Tabla N°10: Media y error estándar
de los resultados del % de Citostasis
del donador “B”
%CITOSTASIS
B Media SEM +*-
C (V) 2.95500 1.2232
C1 5.54500 5.2962
C2 6.62500 3.3587
C3 11.0150 3.2597
Figura 14.- Evaluación citotóxica mediante el % de Citostásis del donador “B” para los
distintos tratamientos, donde C 1, C 2 y C 3 presentan concentraciones distintas del AE del
D. bicolor (20µg/mL, 40µg/mL y 60µg/mL), con una F=1.76, no se encuentran diferencias
estadísticamente significativas entre los tratamientos, con una P=0.294.
0
2
4
6
8
10
12
14
CONTROL V C1 C2 C3
% C
ITO
STÁ
SIS
% CITOSTÁSIS B
52
Tabla N°11: Media y error estándar
de los resultados del % de Citostasis
de los donadores “A” y “B”
%CITOSTASIS
AB Media SEM +/-
C (V) 3.603 1.2010
C1 3.33 4.00
C2 4.64 3.180
C3 7.41 4.680
Figura 15.- Evaluación citotóxica mediante el % de Citostasis de los donadores “A” y “B”
para los distintos tratamientos, donde C 1, C 2 y C 3 presentan concentraciones distintas del
AE del D. bicolor (20µg/mL, 40µg/mL y 60µg/mL), con una F= 1.12 se encuentra una
diferencia estadísticamente significativa entre C 1 y C3, con una P= 0.379
0
2
4
6
8
10
12
14
CONTROL V C1 C2 C3
% C
ITO
STÁ
SIS
% CITOSTÁSIS AB
*
*
53
Tabla N°12.- Resultados del análisis estadístico “t” de muestras emparejadas de los
resultados de CBPI, genotoxicidad y % Citostasis
GENOTOXICIDAD CBPI % CITOSTASIS
DONADORES A B A B A B
MEDIA 3.083 3.000 1.337 1.338 2.92 6.53
t 0.035 -0.15 -2.61
VII. ANÁLISIS DE RESULTADOS En la actualidad existe la necesidad de encontrar nuevas alternativas que nos permitan
avanzar en la lucha incesable contra el cáncer, desarrollando nuevos fármacos
antineoplásicos que tengan menos efectos adversos sobre las células sanas en el organismo,
motivo por el cual la utilización de fármacos naturales y sus compuestos toman más fuerza
en este ámbito.
En México se cuenta con una amplia gama de plantas medicinales que poseen diversas
propiedades farmacológicas y cada vez son más los estudios que se realizan para poder
descubrir por medio del método científico cuales son las propiedades de cada una de ellas.
Esto nos llevó a realizar el estudio sobre cómo el aceite esencial de D. bicolor puede aportar
en el tratamiento contra el cáncer de mama, ya que en la medicina tradicional esta planta
es recomendada para mujeres que sufren de esta enfermedad. El estudio fue realizado
mediante el ensayo de micronúcleos in vitro.
Se realizaron cultivos de dos donadoras, elegidas de una población similar en edad y
procurando evitar que se encontraran en contacto constante con factores genotóxicos tales
como el tabaquismo, alcoholismo y consumo de sustancias nocivas para la salud, con la
finalidad de homogenizar la población para la obtención de las muestras para los cultivos.
Se realizaron preparaciones celulares utilizando el mutágeno MMS como control positivo,
en estudios realizados previamente por Chavarría en 2017 se determinó que la
concentración ideal para el control positivo era de 20µg/mL donde se determinó que se
podían obtener un % de células binucleadas entre 40.4-52.95% y entre 9 y 6 CBMN
(Chavarría, 2017).
54
Cabe recalcar que, en los proyectos realizados anteriormente con este tipo de ensayos, se
utilizaba como control positivo mitomicina C, sin embargo, en la guía de la OECD número
487, el MMS también está considerado como mutágeno que no necesita
biotransformación; condición indispensable para poder ser utilizado en el estudio, además
de ser más económico.
Para realizar el estudio fue necesario obtener el aceite esencial de D. bicolor, mismo que
nos fue proporcionado por el Instituto Politécnico Nacional y utilizado anteriormente para
ensayos desarrollados por Estanislao y colaboradores en 2016. Las concentraciones
utilizadas fueron de 20, 40 y 60µg/mL, mismas que serán expuestas directamente con la
concentración de 20µg/mL de MMS para realizar la determinación de la posible capacidad
anitgenotóxica que tiene el aceite esencial de esta planta.
Para el ensayo se realizó el conteo de 2000 células, entre ellas se diferenció y registro si se
trataban de células mononucleadas, células binucleadas (CB) y células multinucleadas,
diferenciando si las CB eran Células Binucleadas, Multinucleadas (CBMN) con la finalidad de
poder obtener resultados que pudieran ser analizados mediante métodos estadísticos.
Dichos resultados son presentados en las tablas 1 y 2 donde también se muestran los
porcentajes obtenidos para cada conteo por donador, así como el CBPI y el % de Citostasis
calculado. Con base en estos resultados podemos encontrar que los valores de CB se
encuentran dentro del rango de 30-60%, ideales para realizar el estudio según lo dicta el
HUMN. (Fenech y cols, 2003)
Para el análisis de este ensayo se tomaron como control los resultados de los cultivos
pertenecientes a ambos donadores del control positivo, ya que la finalidad es determinar sí
el AE de D. bicolor tiene capacidad de disminuir el efecto genotóxico del MMS identificando
sí el número de CBMN disminuye en función de la concentración utilizada del AE.
Después de haber hecho el proceso estadístico ANOVA para los resultados del donador “A”,
podemos inferir que son significativos, como puede observarse en la figura 7 las diferencias
se encuentran entre el control positivo y los tratamientos restantes. Misma tendencia se
encuentra reflejada en los tratamientos correspondientes al donador “B” presentados en la
55
figura 8. De primera instancia, podemos decir que se puede observar una disminución del
efecto provocado por el MMS.
Para corroborar esta información se realiza el conteo de 2000 células en cada tratamiento,
en donde se diferenció, cuántas de ellas eran CBMN, en el caso del donador “A” como se
muestra en la tabla 3 posterior al análisis ANOVA muestran una diferencia significativa de
todos los cultivos con relación al control positivo, mostrando una tendencia marcada en la
disminución de CBMN en función de la concentración utilizada del AE de D. bicolor.
En el caso del control de vehículo también podemos observar que existe la presencia de
CBMN, sin embargo, estos resultados no son estadísticamente significativos contra el
control negativo, con lo cual podemos corroborar lo establecido previamente por Chavarría
en 2017, es decir, que el vehículo utilizado (DMSO) no provoca efecto genotóxico. Por lo
que lo podemos descartar como factor que provoque alguna interferencia con los
resultados obtenidos ya que se trata del compuesto vehículo utilizado para el AE de D.
bicolor.
En el caso del donador “B” encontramos que los resultados presentan la misma tendencia.
Ya que después de haber realizado el ANOVA podemos observar que las medias presentan
una diferencia significativa con respecto al control positivo tal y como se observa en la tabla
4 y la figura 8. Esto indica que existe un efecto antigenotóxico del AE de D. bicolor
Además de los análisis individuales, se decidió realizar un análisis de los resultados en
conjunto de ambos donadores, a lo que denominaremos “AB”, una vez realizado este
análisis encontramos que existen las mismas diferencias significativas marcadas en los casos
individuales. Se presenta la misma tendencia de los resultados, como se puede observar en
la tabla 5 y figura 9, se observa una disminución en la aparición de CBMN en función del
aumento en la concentración utilizada del AE de D. bicolor
Además de este análisis, se realizó la prueba “t” para poder evaluar sí existen diferencias
significativas entre ambos grupos de estudio, y como podemos observar en la tabla 12 en
las columnas de “Genotoxicidad” encontramos que las medias de cada donador son
similares y el valor de “t” nos indica que no hay dichas diferencias entre ellos. Por lo que se
56
observa una actividad antigenotóxica por parte de D. bicolor para cada una de las
concentraciones que fueron utilizadas para este ensayo.
Si se realiza el contraste con el control positivo utilizado a la concentración previamente
mencionada, se encuentra una disminución marcada mayormente en el tratamiento con la
concertación 3 (60µg/mL) del AE de D. bicolor, lo cual nos indica que la tendencia en la
disminución de CBMN está relacionada estrechamente con la concentración que sea
utilizada.
Además del análisis genotóxico, también se pretende evaluar si el AE D. bicolor es capaz de
reducir efectos citotóxicos, para lo cual se calculó el Índice de Proliferación por Bloqueo de
Citocinesis (CBPI) obteniendo los resultados del donador “A” plasmados en la tabla 6 y figura
10.
Después de haber realizado el análisis estadístico ANOVA. Donde podemos encontrar
diferencias significativas de entre el C (+) y todos los tratamientos restantes, además de
encontrar que el error estándar es bajo, lo que nos indica que puede ser utilizado como un
control confiable dentro del ensayo. Sin embargo, no se encuentran diferencias
significativas entre C (-) y los demás tratamientos, lo cual nos indica que no existe aparente
efecto citotóxico.
En el caso del donador “B” se presentan también datos con diferencias significativas
tomando en cuenta el C (+) con el resto de los tratamientos. A su vez, el C (-) presenta
diferencias significativas con C (V), C1, C2 y C3 encontrando una disminución en el CBPI
relacionado con la concentración más alta (60µg/mL) lo cual es indicador de citotoxicidad.
Tal y como había sucedido en los estudios realizados por Estanislao y colaboradores en 2016
y Chavarría en 2017, se presenta un efecto citotóxico al entrar en contacto con el AE de D.
bicolor.
Sin embargo, es importante recalcar que el estudio se realizó utilizando MMS como agente
genotóxico y citotóxico y tomando en cuenta el ambiente propiciado para los cultivos C 1,
C2 y C3 en los que están presentes los efectos del MMS y el AE de D. bicolor, lo que generaría
57
una tendencia a un mayor efecto citotóxico al incrementar la concentración utilizada del
mismo, sin embargo, no es así.
Estos resultados pueden darnos una idea de cómo funcionaría la combinación de algunos
antineoplásicos utilizados en la terapia contra el cáncer de mama con compuestos extraídos
del AE de D. bicolor ya que se presenta una tendencia que, si bien no reduce el efecto, se
encuentra evidencia suficiente para inferir que mantiene en un promedio el efecto
generado. Y hablando en términos relacionados con la terapia contra el cáncer es muy
importante ya que estaría contrarrestando de manera importante los efectos en células no
cancerosas provocados por los mismos compuestos que buscan aliviar esta enfermedad.
Posteriormente se realizó el análisis en conjunto de los dos donadores, los resultados
pueden apreciarse en la tabla 8 y figura 12. Donde encontramos que el error estándar
calculado es bajo y se muestra una tendencia similar a los análisis individuales para cada
donador, por lo cual podemos identificar que no existen diferencias significativas entre ellos
ya que después de hacer el análisis “t” encontramos que el valor es cercano a 0.
Otro parámetro calculado para evaluar la citotoxicidad fue el % de Citostásis, este
coeficiente calculado nos indica el porcentaje de inhibición del crecimiento celular, es decir,
la capacidad que tiene algún compuesto o sustancia para detener el proceso de la mitosis.
En el caso de ambos donadores (A y B) no se encontraron diferencias significativas entre los
controles y las concentraciones utilizadas, además de encontrar que el error estándar es
elevado, por lo cual no podemos realizar el análisis estadístico adecuado.
De acuerdo con el análisis ANOVA del donador “A” no existen diferencias significativas entre
el C (V) y el resto de los tratamientos, sin embargo, al analizar el comportamiento
encontrado en la figura 13, podemos observar como el % de Citostásis aumenta mientras la
concentración del AE de D. bicolor también lo hace. Así mismo podemos observar que el C
(V) presenta un resultado mayor al de C 1.
La causa de la disminución del % de Citostásis del C (V) al C 1 es porque en C (V) se utiliza la
máxima concentración de DMSO, por el contrario, C 1 no presenta la misma concentración
y aunque el AE de D. bicolor presente acción citostática no será mayor a la utilizada en la
58
concentración máxima del vehículo. En el caso de C 2, el % es mayor ya que se presenta una
mayor concentración del AE. 478
En el caso del donador “B” podemos encontrar que las diferencias tampoco son
estadísticamente significativas, en la figura 14 se observa que C (V) tiene un menor % de
Citostásis que C (1), motivo por el cual no podemos tomarlo como control adecuado para el
análisis estadístico.
Sin embargo, podemos encontrar que en C 1, C 2 y C 3 el % de Citostásis aumenta
respectivamente, lo cual nos indica, igual que en el caso del donador “A” que tiene relación
a la concentración presentada del AE. Pero al no tener datos estadísticamente significativos,
no podemos asegurar este hecho.
Posteriormente se realizó el análisis “t”, donde encontramos que este valor calculado se
encuentra lejos de 0, esto debido a que las medias de los dos donadores no son similares
entre sí. Puede distinguirse la referencia marcada entre ambos valores. Así mismo se puede
identificar que el error estándar en los resultados en la tabla 10 correspondiente al %
citocinesis del donador “B” se encuentran elevados en comparación a la tabla 9 que
presenta los resultados del donador “A”. Esto nos indica que la medición realizada sobre
este parámetro no fue realizada de manera precisa, misma cuestión que puede ser atribuida
a errores experimentales durante el ensayo. Sin embargo, podemos observar un
comportamiento similar en los dos donadores ya que el porcentaje se encuentra
incrementado al aumentar la concentración del AE de D. bicolor.
El comportamiento de los resultados del donador “A” concuerda con lo realizado
previamente por Chavarría, donde se comprueba esta tendencia ya que el C (V) se realizó
con la concentración máxima del DMSO, es decir, C 1 contiene menos acción citostática que
la causada por solo el DMSO, en el caso de C 2, el aumento se refleja porque la
concentración del AE es mayor, por consecuencia el valor del DMSO también se encuentra
aumentado (Chavarría, 2017).
59
Sin embargo, aunque se encuentra esta tendencia reflejada, no podemos garantizar este
dato, ya que no se encuentran diferencias significativas con respecto al C (V). Por lo cual
podemos identificar que existe un aumento en la actividad citostática del cultivo.
Resumiendo todo lo anterior encontramos que la evaluación de la antigenotóxicidad
mostró resultados significativos, donde podemos encontrar que el efecto se encuentra en
aumento en relación con la concentración implementada para cada cultivo, siendo la
concentración 3 (60µg/mL) aquella concentración que muestra un mayor efecto.
Los resultados obtenidos para la evaluación citotóxica mostraron que existe hay una
disminución significativa del CBPI, lo cual nos indica que se ejerce una acción sobre la
proliferación celular además de encontrar una tendencia indirectamente proporcional con
el % de Citostásis, ya que mientras el CBPI disminuye en función de la concentración, el %
de Citostásis aumenta.
Durante los estudios realizados por Estanislao y colaboradores se obtuvieron resultados
sumamente importantes, ya que se encontró que el AE de D. bicolor presenta una afinidad
importante en línea de cáncer de mama MDA-MB-231 y al mismo tiempo se determinó que
en una línea celular de epitelio mamario MCF10A no se encontró evidencia de efecto
citotóxico utilizando concentraciones entre 20 y 80µg/mL (Estanislao, 2016).
Durante este ensayo se pudo determinar que el efecto genotóxico que ejerce el AE de D.
bicolor es significativo ya que reduce el impacto del MMS en los cultivos analizados, sin
embargo, encontramos que existe evidencia para inferir que en concentraciones de
40µg/ml y 60µg/mL se presenta un efecto citotóxico que comprometen la integridad celular
de los linfocitos que, en este caso fueron utilizados como modelo biológico para realizar el
ensayo.
Sin embargo, hay que tomar en cuenta que C 1, C 2 y C 3 presentaron condiciones similares,
se realizó el ensayo agregando una concentración determinada del MMS (20µg/mL) lo cual
influye únicamente en la evaluación del % de Citostásis, ya que al haberse encontrado en
estudios anteriores la capacidad citotóxica que presenta el AE per se y al adicionar a los
60
sistemas el mutágeno, se esperaría una respuesta aún mayor reflejada en los resultados,
pero no es así.
Estos estudios y coeficientes determinados nos pueden apoyar para avanzar en esta carrera
contra el tiempo para encontrar alternativas que puedan ayudar a mejorar la calidad de
vida de los pacientes que sufren de cáncer de mama. Estos resultados son prometedores,
sin embargo, aún falta camino por recorrer y pruebas a realizar para poder determinar las
concentraciones exactas, vías de administración y combinación con otros productos.
Por último, cabe recalcar la importancia de regresar a la medicina tradicional, ya que
durante generaciones se han utilizado plantas medicinales como tratamiento o alivio de
síntomas provocados por alguna enfermedad, mientras el hombre se encuentra en una
constante lucha e investigación por la generación de nuevas patentes, tenemos todo en una
presentación noble, en la mayoría de las ocasiones fácil de conseguir y preparar.
Sin embargo, nuestra actual falta de conocimiento nos limita en cuanto a la amplia variedad
de plantas medicinales que tienen una aplicación adquirida de generaciones anteriores
mediante el conocimiento empírico.
Este proyecto incentiva esta situación, hay que comenzar a utilizar lo que la naturaleza nos
da para poder mejorar nuestra calidad de vida, hay que hacer estudios sobre la gran
variedad de plantas, utilizar lo más importante para el desarrollo de nuevos tratamientos y
coadyuvantes y tal vez algún día encontrar la respuesta a una de las enfermedades más
importantes para la humanidad o en su defecto, para alguno de los diversos tipos.
61
VIII. CONCLUSIONES • Los resultados obtenidos indican que el AE de D. bicolor presenta una acción
antigenotóxica en presencia de un mutágeno como el MMS, dicho efecto es dosis
dependiente, siendo a la concentración de 60µg/mL la que presentó mayor efecto.
• El AE de D. bicolor a concentraciones de 40µg/mL y 60µg/mL presenta un efecto
citotóxico que compromete la integridad de los linfocitos humanos.
IX. PERSPECTIVA El presente trabajo permite contribuir en el estudio de D. bicolor abundando en conocer los
efectos biológicos que puede inducir el Aceite Esencial en el modelo utilizado como lo son
el cultivo de linfocitos in vitro. Los resultados obtenidos en este estudio nos permiten
avanzar un paso más en la investigación sobre esta planta y sus posibles usos como
tratamientos coadyuvantes contra el cáncer.
Hay mucho camino aún por recorrer, sin embargo, los resultados obtenidos en este estudio
y en los previamente citados han demostrado ser prometedores, esto nos invita a continuar
en el mismo camino, continuar evaluando estos resultados, realizar pruebas
complementarias que nos permitan conocer más a fondo cada uno de los efectos, para
poder así, encontrar dentro de la medicina tradicional una nuevas fórmulas que nos
permitan ampliar las posibilidades en cada tratamiento y poder así ayudar a los pacientes a
mejorar su calidad de vida.
62
X. REFERENCIAS • A.E.C.C (2012) Asociación Española Contra el Cáncer. Consultado en la web:
http://www.aecc.es/sobreelcancer/elcancer/Paginas/Origendelaenfermed.aspx
• Ahmad, S. Ali, A., Afzal, M. (2015) Anticarcinogenic and antimutagenic activity of
Alstonia scholaris on the albino mice bone marrow cells and peripheral human lymphocyte
culture against methyl methane sulfonate induced genotoxicity, Advanced Biomedical
Research, DOI: 10.4103/2277-9175.183140
• Akthar (2016). Genotoxic and cytotoxicactionpotential of Terminalia citrina, a
medicinal plant fethnopharmacologiscalsinificance.EXCLI Journal Experimental and Clinical
Sciences. Vol. 15. [En línea]. Consultado el 15 de noviembre de 2017, desde:
http://www.excli.de/vol15/Akthar_24102016_proof.pdf.
• American Cáncer Society (2017) Quimioterapia para el cáncer de seno. Consultado
en la web: https://www.cancer.org/es/cancer/cancer-de-seno/tratamiento/quimioterapia-
para-el-cancer-de-seno.html
• Arencibia, (2003). Actualización sobre el ensayo cometa y de micronúcleos in vitro.
Retel: Revista de toxicología en línea. [En línea]. Consultado el día 18 de noviembre de 2017,
desde: http://www.sertox.com.ar/img/item_full/20003.pdf
• Cárdenas, N. C., Pérez, S., Zavala, M. A., Aguirre, J. R., Pérez, C. (2005). Actividad
antifúngica de seis plantas sobre Aspergillus flavus Link. Revista Mexicana de Ciencias
Farmacéuticas, Vol. 26 (No. 1) 193-197 pp.
• Cárdenas J, Bargalló J, Erazo A, Potevein A, Valero V y Pérez V. (2015). Consenso
Mexicano sobre Diagnóstico y tratamiento para el cáncer mamario. México: Masson Doyma
México S.A.
• Carrillo RJ., Simón NE., Rodríguez FR. (2011) Cáncer oral en México. Revisión
bibliográfica y presentación de caso clínico. Vol. 7 No. 3 pp. 104-110. -consultado de la web:
http//www.mediagraphic.com/pdfs/cirugiabucal/cb-2011/cb113f.pdf
• Castillo E., Guevara M.L., Fujita, R. (2011) Optimización del test de micronúcleos en
linfocitos cultivados usando una metodología de gradiente y frotis. R.P.B. Vol. 18. (N°2) Pp.
261-263
63
• Chavarría, I. (2017) Evaluación del efecto del aceite esencial de Decatropis bicolor
sobre la inducción de micronúcleos en células binucleadas en cultivo de linfocitos humanos.
(Tesis de pregrado) Universidad Nacional Autónoma de México, Edo de México.
• Chavez M. (2006) Aplicación de Citogenética Molecular para la detección de
aneuploidía y clastogenicidad en células humanas expuestas a arsénico. Universidad
autónoma de Barcelona. España
• Chehin, A. (2014). Estudio del efecto del compuesto LQM 731 sobre la inducción de
células binucleadas micronucleadas en cultivo de linfocitos humanos (Tesis de pregrado).
Universidad Nacional Autónoma de México, Edo de México.
• Compendio de cáncer /RHNM/2001/Morbilidad/mortalidad/Secretaría de
Salud/Dirección General de Epidemiología/Registro histopatológico de neoplasias malignas.
(2001) Consultado en la página web: http//dgepi.salud.gob.mx/diveent/RHNM.htm.
• Cortes, J. (2005). Actividad biológica de extractos de plantas usadas para el
tratamiento del cáncer e infecciones en Tepatepec. Hidalgo (Tesis de pregrado).
Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo, Pachuca de Soto, Hgo. México.
• DOF, (2002) Norma Oficial Mexicana NOM-220-SSA1-2002, Instalación y operación
de la farmacovigilancia, recuperado de
http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/220ssa102.html
• DOF, (2011) Norma Oficial Mexicana NOM-248-SSA1-2011, Buenas prácticas de
fabricación para establecimientos dedicados a la fabricación de remedios herbolarios.
Recuperado de http://www.dof.gob.mx/normasOficiales/4676/salud/salud.htm
• Estanislao, C. C., (2016) evaluación citotóxica de Decatropis bicolor (Zucc) Radlk en
un modelo in vitro e in vivo de cáncer de mama. (Tesis Doctoral) ENMH-IPN
• Fenech, M., y cols. (1986) Cytokinesis blocks micronucleus method in human
lymphocytes. Effect of in vivo ageing and low dose X radiation. M.R. Vol. 161. Pp. 193-198
• Fenech, M., Holland, N., Chang, W, P., Zeiger, E., Bonassi, S. (1999) The Human
Micronucleus Project an international collaborative study on the use of the micronucleus
technique for measuring DNA damage in humans. Mutation Research, Vol. 428, 27-283 pp.
• Fenech, M. (2000) The in vitro micronucleus technique, Mutat. Res. 455 81-95
64
• Fenech, M., Kirsch, M., Chang, M., Holland W. P., Zeiger, E., Bonassi, S. (2002) HUMN
project: detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus
assay using isolated human lymphocyte cultures. Mutation Research, Vol 534, 65-75 pp.
• Fenech, M., Chang, W., Krisch-Volders, M., Holland, N., Bonassi, S., & Zeiger, E.
(2003) “HUMN Project: Detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block
micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures”. Mutation
Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 534 (1), 65-75
• García, A. N., Ramírez A., Parra, H., Velázquez, G., Martínez, M. (1999). Anti—
inflammatory Activity of Coumarins from Decatropis bicolor on TPA Ear Mice Model, Planta
Med, Vol 66 (No. 2000). 279-281 pp.
• García M., Jernal A., Ward EM, Center MM., Hao Y., Siegel RL., Thun MJ. (2007)
Global Cancer Facts and Figures. Atlanta GA. American Cancer Society. USA.
• Gaxiola J. (2017) Experiencia de tratamiento de radioterapia en pacientes con cáncer
de mama, evaluación de neumotoxicidad y calidad en hospital general de México “Dr.
Eduardo Liceaga”. (Tesis de posgrado) UNAM. Facultad de Medicina.
• Günter, S., Linsenmeyer, R., Schütz, P., Kuehner, S. (2012) Intensivity of the in vitro
cytokinesis-block microucleus assay with human lymphocytes for the detection of DNA
damage present at the start of the cell culture Mutagenesis, Vol. 27 (N°6). Pp 744-746
• Hayashi M. (2016). Themicronucleus test-mostwidelyusedin vivogenootoxicity test.
BioMed Central. V 38. PMC
• Iarmarcovai G, Bonassi S, Botta A, Baan R. A., Orsiere T. (2008) Genetic
polymorphisms and micronucleus formation: A review of the literature. Mutation Research
658 215–233
• Irekani, (2010). Decatropis bicolor (Zucc.) Radlk. [en línea]. México, 25 de mayo del
2010. Disponible en la web:
http://siba.ibiologia.unam.mx/irekani/handle/123456789/16500?proyecto=Irekani
• INEGI. “ESTADÍSTICAS A PROPÓSITO DEL DÍA MUNDIAL CONTRA EL CÁNCER (4 DE
FEBRERO) DATOS NACIONALES” (2016) Consultado en la web:
http://www.inegi.org.mx/saladeprensa/aproposito/2017/cancer2017_Nal.pdf
65
• Jenkins GJS, Doak SH, Johnson GE, Quick E, Waters EM, Parry. (2005) Do dose
response thresholds exist for genotoxic alkylating agents? Mutagenesis 20: 389-389
• Kang, (2013). RecentAdvances in In Vivo Genotoxicity Testing: Prediction of
CarcinogenicPotentialUsingComet and MicronucleusAssay in Animal Models. Vol. 18(4).
Journal of CancerPrevention. PMC
• Karp, G. (2010) Biología celular y molecular. Ciudad de México. México McGraw-Hill
• Lluch A. (2016) New Challenges in the treatment and research of breast cancer Med.
segur. trab. vol.62 supl. extra-Madrid 2016
• Lozoya X. (1997). Plantas, medicina y poder; Breve historia herbolaria mexicana.
México. D.F.: Editorioal Pax México.
• Ocegueda, S., Moreno E., y Koleff, P. (2005) Plantas utilizadas en la medicina
tradicional y su identificación científica. CONABIO. Biodiversitas 62:12-15
• OECD, (2014). OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Test No. 487: In Vitro
Mammalian Cell Micronucleus Test. DOI: 10.1787/20745788. Paris, Francia. Disponible en
la web: http://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-487-in-vitro-mammalian-cell-
micronucleus-test_9789264224438-en
• OMS, (1991). Pautas para la evalación de medicamentos herbarios. Ottawa,
WHO/TRM/91.4
• OMS, (2016). Medicina tradicional: definiciones. [en línea]. Ginebra. Disponible en
la web: http://www.who.int/topics/traditional_medicine/definitions/es/
• National Cancer Institute. (2011) Diccionario del cáncer. Consultado en la web:
http://www.cancer.gov/diccionario
• Reyes, G. (2010) Estudio fitoquímico de la hierba del cáncer (Cuphea aequipetala
Cav.), usada en la medicina tradicional. (Tesis de pregrado), UNAM-FESC, México
• Sagrera, J. (1991). Plantas medicinales. Edo. De México: Editorial del Valle de México
• Secretaría de Salud (2013). Los cinco tipos de cáncer que más afectan a los
mexicanos [en línea] http://www.spps.gob.mx/noticias/1445-5-tipos-cancer-mas-afectan-
mexicanos.html
66
• Zacalin, M., Sierrasesúmaga, L., Patiño, A. (2005) El ensayo de micronúcleos como
medida de inestabilidad genética inducida por agentes genotóxicos. Anales Sis San Navarra
vol.28 (no.2) Pamplona may./ago.
