Maapähkinää (Arachis hypogaea) ja kudzua (Pueraria lobata · 2007-03-20 · Maapähkinää (Arachis hypogaea) ja kudzua (Pueraria lobata)nystyröivien kiinalaistenBradyrhizobium-kantojen

Maapähkinää (Arachis hypogaea) ja kudzua (Pueraria lobata)nystyröivien kiinalaisten Bradyrhizobium-kantojen geneettinen

diversiteetti ja sukulaisuus.

Iiris Mattila

Mikrobiologian pro gradu –työ

Soveltavan kemian ja mikrobiologian laitos

Helsingin yliopisto

Maaliskuu 2007

HELSINGIN YLIOPISTO HELSINGFORS UNIVERSITET UNIVERSITY OF HELSINKI

Tiedekunta/Osasto Fakultet/Sektion Faculty

Maatalous- metsätieteellinen tiedekuntaLaitos Institution Department

Soveltavan kemian ja mikrobiologian laitosTekijä Författare AuthorIiris MattilaTyön nimi Arbetets titel TitleKiinalaista maapähkinää (Arachis hypogaea) ja kudzua (Pueraria lobata) nystyröivien Bradyrhizobium-kantojen sukulaisuus ja geneettinen diversiteetti.Oppiaine Läroämne SubjectMikrobiologiaTyön laji Arbetets art Levelpro gradu –työ

Aika Datum Month and year5.3.2007

Sivumäärä Sidoantal Number of pages82 s. + liitteet 6 s.

Tiivistelmä Referat AbstractBradyritsobit tunnetaan useiden erilaisten palkokasvien typensitojasymbiontteina. Ne muodostavatsymbiooseja esimerkiksi maailmanlaajuisesti tärkeiden viljelykasvien soijapavun (Glycine max) jamaapähkinän (Arachis hypogaea) kanssa. Bradyrhizobium-suvun edustajien ekologiasta, evoluutiosta jataksonomiasta tiedetään toistaiseksi melko vähän. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tarkastellakiinalaisten, maapähkinää, kudzua (Pueraria lobata) ja eräitä muita palkokasveja nystyröivienBradyrhizobium-kantojen sukulaisuutta, geneettistä diversiteettiä sekä suhdetta muun maailmanbradyritsobeihin. Maapähkinä on alunperin eteläamerikkalainen viljelykasvi, joka nystyröityy eri tavoin kuinesimerkiksi soijapapu. Eräs tämän tutkimuksen taustalla olevista kysymyksistä oli, mistä Kiinaan tuotuamaapähkinää nystyröivät bradyritsobit ovat peräisin, ja miten symbioosigeenien horisontaalinensiirtyminen maan (brady)ritsobipopulaatioissa on vaikuttanut symbioosin kehittymiseentulokaspalkokasvissa.

Etsin kysymyksiin vastauksia analysoimalla Bradyrhizobium-kantojen erilaisia geenejä RFLP-menetelmälläsekä kokonaista genomia AFLP-menetelmällä. Ydingeenien glnII ja recA, symbioosigeenien nifH ja nodCsekä ITS-alueen perusteella Bradyrhizobium-kannoista muodostui ryhmiä, jotka heijastivat kantojensukulaisuutta. Suurin osa tutkimistani kannoista oli eristetty maapähkinän (Arachis hypogaea) tai kudzun(Pueraria lobata) juurinystyröistä, lisäksi otin mukaan kansainvälisiä tyyppi- ja vertailukantoja. Käytinseuraavia kantoja: 22 maapähkinäkantaa (17 kiinalaista kantaa ja 5 vertailukantaa), 17 kudzua nystyröivääkantaa, 6 tyyppikantaa (Arachis-, Glycine-, Chamaecytisus- ja Vigna-sukuisia isäntäkasveja), 4Lespedeza-sukua nystyröivää kantaa sekä 9 kiinalaisia luonnonkasveja (Indigofera, Acacia,Aeschyomene, Phaseolus) nystyröiviä kantoja.

Tulokset selvittivät kiinalaista maapähkinää nystyröivien Bradyrhizobium-kantojen suhdetta muihinkiinalaisiin sekä kansainvälisiin Bradyrhizobium-kantoihin: i) Maapähkinää vaikutti nystyröivän useitaerilaisia mutta läheisessä sukulaisuussuhteessa olevia kantoja. ii) Maapähkinää ja kudzua nystyröivätkannat olivat erilaisia. iii) Kudzua nystyröi kaksi hyvin erilaista ryhmää, joista toinen sisälsi B. elkanii -kantoja ja toinen B. japonicum -kantoja. iv) Kansainväliset tyyppi- ja vertailukannat olivat kiinalaisillekannoille kaukaisempia sukulaisia. Kaiken kaikkiaan tutkittujen Bradyrhizobium-kantojen geneettinendiversiteetti oli suuri. Lisäksi huomattiin, että analysoidut geenit ryhmittyivät eri tavoin.

Maataloudessa voidaan energiansäästöön ja ekologiseen kestävyyteen käyttämällä hyväksi palkokasvienja ritsobien muodostamaa typensidontasymbioosia. Onnistuneen symbioosin aikaansaamiseksi onkuitenkin tärkeää tuntea symbioosin toiminta ja symbioosin osapuolten vaatimukset. Tämän takiaritsobitutkimus on tärkeää tulevaisuudessakin.Avainsanat Nyckelord Keywords

Bradyrhizobium, palkokasvi, nystyröinti, typensidonta, horisontaalinen geeninsiirto, symbioosigeeni,ydingeeni, ITS-alue, kromosomiSäilytyspaikka Förvaringsställe Where deposited

Muita tietoja Övriga uppgifter Further information

KiitoksetHaluan kiittää dos. Kristina Lindströmiä sekä ohjauksesta että tämän työn toteuttamisen

mahdollistamisesta. Kiitän myös dos. Lindströmin luotsaamaa "typpiryhmää" tutkijoineen

saamastani henkisestä tuesta ja useista käytännön neuvoista. Suuri kiitos MMT Leena A.

Räsäselle kärsivällisestä työn ohjaamisesta, neuvoista sekä laboratoriossa että tekstin tuottamisen

aikana, ja vielä kaikista tunneista joita omasta ajastasi korjausvaiheessa kulutit. Kiitos dos. Leena

Suomiselle tärkeästä kannustuksesta, kun kirjoittaminen oli vaikeinta, sekä raakileen

kommentoinnista. Kiitokset Paula Kokko-Gonzalesille kärsivällisestä tähän työhön liittyneisiin

laboratoriorutiineihin perehdyttämisestä sekä Tuomas Olkkoselle tätä tutkimusta varten tehdystä

esityöstä, eli erilaisten alukkeiden testaamisesta tutkituille kannoille.

Kaikista suurin kiitos Tuomas Mattilalle henkisestä tuesta, suurta apua tuoneista matemaattisista

oppitunneista ja teoreettisista keskusteluista, kriittisistä mielipiteistä aina pyydettäessä, sekä

varauksettomasta ja aidosta kiinnostuksesta työtäni ja sen tekijää kohtaan.

100

100

95

100

85

92

100

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

B.

Aneta Dresler-Nurmi

Zewdu Teref ework

Paula Kokko-Gonzales

Tuomas Olkkonen.

Leena Suominen

Kristina Lindström

Leena A. RäsänenISÄ

ÄITI

TUOMAS

sp.

i

Pueraria

Asiantuntijakommentit


Labra-apu

Labra-apu

Kirjoitustuki

Kirjoitustuki, tutkimus

Ohjaus

100

100

95

100

85

92

100

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

B.

Aneta Dresler-Nurmi

Zewdu Teref ework


Tuomas Olkkonen.

Leena Suominen

Kristina Lindström


ÄITI

TUOMAS

sp.

i

Pueraria



Labra-apu

Labra-apu

Kirjoitustuki


Ohjaus

100

100

95

100

85

92

100

100

100

95

100

85

92

100

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

B.

Aneta Dresler-Nurmi

Zewdu Teref ework


Tuomas Olkkonen.

Leena Suominen

Kristina Lindström


ÄITI

TUOMAS

sp.

i

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

B.

Aneta Dresler-Nurmi

Zewdu Teref ework


Tuomas Olkkonen.

Leena Suominen

Kristina Lindström


ÄITI

TUOMAS

sp.

i

Pueraria



Labra-apu

Labra-apu

Kirjoitustuki


Ohjaus

LyhenteetSTH infektio sivujuuren tyvihalkeaman kautta

ITS internally transcribed sequence

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism

HUM hiivauute-mannitoli

TY tryptoosi-hiivauute

PCR polymerase chain reaction

MDS multi-dimensional scaling

HAMBI Helsingin yliopiston mikrobiologinen kantakokoelma

CCBAU Culture Collection of Beijing Agricultural University

USDA the United States Department of Agriculture

LMG Collection of the Laboratorium voor Microbiologie en Microbie

UPGMA Unweighed Pair Group Method with Averages

Tiivistelmä

Kiitokset

Lyhenteet

1. Kirjallisuuskatsaus ...........................................................................................................1

1. 1 Typensidonta .............................................................................................................1

1.1.1 Typensidonnan biokemiaa .....................................................................................1

Nitrogenaasientsyymi ...................................................................................................1

Nitrogenaasin toiminta ..................................................................................................2

1.1.2 Typensidonnan mikrobiologiaa................................................................................3

Vapaana elävät typensitojat..........................................................................................4

Symbionttiset typensitojat .............................................................................................4

1.1.3 Biologisen typensidonnan merkitys .........................................................................4

1.2 Palkokasvit.....................................................................................................................5

1.2.1 Yleistä .....................................................................................................................5

1.2.2 Tässä tutkimuksessa käytettyjen ritsobikantojen isäntäksvit ...................................6

Maapähkinä (Arachis hypogaea) ..................................................................................6

Kudzu (Pueraria lobata)................................................................................................8

Soijapapu (Glycine max)...............................................................................................9

Lespedeza sp. & Indigofera sp. .................................................................................10

1.3. Ritsobit........................................................................................................................11

1.3.1 Yleistä ...................................................................................................................11

1.3.2 Ritsobien geenit.....................................................................................................11

Ylläpitogeenit ..............................................................................................................12

Symbioosigeenit .........................................................................................................12

Geenien siirtyminen....................................................................................................13

1.3.3 Taksonomia...........................................................................................................14

Yleistä.........................................................................................................................14

Tutkimusmenetelmät ..................................................................................................17

1.4. Bradyrhizobium-suku ..................................................................................................18

1.4.1 Yleistä ...................................................................................................................18

1.4.2 Bradyrhizobium-lajit...............................................................................................18

1.4.3 Bradyritsobien taksonomia ....................................................................................19

1.4.4 Bradyritsobien genomi...........................................................................................21

Bradyritsobien genominen diversiteetti .......................................................................21

Lateraalinen geeninsiirto.............................................................................................21

1.5 Palkokasvin ja ritsobin välinen symbioosi ....................................................................21

1.5.1 Yleistä ...................................................................................................................21

Symbioosin merkitys eri osapuolille ............................................................................22

1.5.2 Vuoropuhelu..........................................................................................................22

Symbioosin onnistumiselle oleelliset molekyylit ..........................................................22

1.5.3 Infektioprosessi .....................................................................................................23

Soijapapu infektoituu juurikarvan kautta ja ritsobit etenevät infektiokäytävää pitkin ...24

Maapähkinän infektioprosessi: sivujuuren tyvihalkeaman kautta (STH) ja

solunsisäisesti leviten .................................................................................................25

1.5.4 Nystyrätyypit..........................................................................................................26

Indeterminantti eli jatkuvasti kasvava nystyrä.............................................................27

Determinantti eli rajatusti kasvava nystyrä..................................................................27

1.5.5 Nystyräsolukon infektoituminen.............................................................................28

Juurinystyrän toiminta.................................................................................................28

Kokeellinen osa .................................................................................................................30

2. Työn tarkoitus ................................................................................................................30

3. Materiaalit ja menetelmät...............................................................................................31

3.1 Bakteerikannat .........................................................................................................31

Kantojen kasvatus ......................................................................................................32

Puhdasviljelmät...........................................................................................................32

Puhdistettujen kantojen säilöminen pakkaseen (-70°C)..............................................32

DNA:n eristys..............................................................................................................32

3.2 Käytetyt geenitekniset menetelmät...........................................................................35

3.2.1 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)............................................35

3.2.3 PCR (Polymerase Chain Reaction) ...................................................................36

3.2.4 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) .........................................36

3.5 Tulosten käsittely......................................................................................................39

Dendrogrammien rakentaminen BioNumerics-ohjelmalla...........................................39

MDS (Multi-Dimensional Scaling) ...............................................................................39

Tilastolliset testit .........................................................................................................39

4. Tulokset .........................................................................................................................40

4.1 Käsiteltyjen kantojen ominaisuudet ..........................................................................40

4.1.1 Bradyrhizobium-kantojen kasvu.........................................................................40

4.1.2 Bradyrhizobium-kantojen geenien monistuminen ..............................................41

4.2 Bradyrhizobium-kantojen kokonaisgenomin diversiteetti AFLP-menetelmällä

analysoituna ...................................................................................................................42

4.3 Yksittäisten geenien suhde toisiinsa ja kokonaisgenomiin analysoituina RFLP-

sormenjälkien avulla.......................................................................................................45

4.3.1 ITS.....................................................................................................................47

4.3.2 recA ...................................................................................................................49

4.3.3 glnII ...................................................................................................................51

4.3.4 nifH ....................................................................................................................53

4.3.5 nodC ..................................................................................................................55

5. Tulosten tarkastelu.........................................................................................................57

5.1 Tässä työssä käytettyjen metodien soveltuvuus taksonomiatutkimuksissa..............58

5.1.1 Yksittäisten geenien suhde 16S rDNA-perusteiseen lajinmääritykseen

Bradyrhizobium-suvussa, sekä sormenjälkimenetelmien tulkittavuus.........................58

5.1.2 Tyyppikantojen käyttö tutkimuksissa..................................................................59

5.1.3 UPGMA-dendrogrammit samankaltaisuuden kuvaajina ....................................59

5.2 Tutkittujen bradyritsobien geneettinen diversiteetti...................................................60

5.2.1 Tilastollisten testien tulokset heikensivät analyysitulosten luotettavuutta ja

tulkittavuutta ...............................................................................................................60

5.2.2 AFLP maapähkinää ja kudzua nystyröivien Bradyrhizobium-kantojen genomisen

diversiteetin kuvaajana ...............................................................................................61

5.2.3 Genomisen diversiteetin heijastuminen ITS-alueeseen .....................................62

5.2.4 Ydin- ja symbioosigeenien erilaisen ryhmittymisen taustaa...............................62

5.2.5 Typensidonnan tehokkuuden mahdolliset vaikutukset genomiin .......................65

5.2.6 Palkokasvien juurinystyröiden erilaisten infektiomekanismien heijastuminen niitä

nystyröivien bakteerikantojen diversiteettiin................................................................67

5.3 Maapähkinää (Arachis hypogaea) ja kudzua (Pueraria lobata) nystyröivät

bradyritsobit horisontaalisen geeninsiirron valossa ........................................................67

5.4 Typensitojabakteereiden käyttö - tulevaisuuden mahdollisuus?..........................70

6. Johtopäätökset ..............................................................................................................71

7. Kirjallisuus......................................................................................................................73

Liiteluettelo:

Liite 1. Alustat

Liite 2. Geelit

Liite 3. DNA:n eristys

Liite 4. Reagenssit

Liite 5. PCR-ohjelmat

1

1. Kirjallisuuskatsaus

1. 1 TypensidontaTyppi on biologisille prosesseille tärkeä alkuaine aminohappojen, proteiinien ja entsyymien

rakennusosana. Kasveille typen ja veden saatavuus ovat yleensä kasvua rajoittavia tekijöitä.

Ilmakehässä typpeä on runsaasti (21 %), mutta kaksiatomisena molekyylinä (N2) se ei ole kasvien

saatavissa. Kasvit käyttävät kasvuunsa nitraatti- ja ammoniumtyppeä (NO3-, NH4

+), joita on

muodostunut maahan mikrobien hajottaessa typpipitoista orgaanista ainesta, kuten kasvi- ja

eläinjätteitä tai kuollutta mikrobistoa. Useat mikrobit kykenevät myös pelkistämään typpeä suoraan

ilmakehästä kasveille käytettävään muotoon. Ilmakehän molekulaarisen typen pelkistämistä

ammoniumioniin ja sitä kautta orgaanisiksi yhdisteiksi, kutsutaan typensidonnaksi (Madigan ym.

2003, Burris 1999).

1.1.1 Typensidonnan biokemiaa

Ilmakehän typpimolekyyli N2 on sisältämänsä kovalenttisen kolmoissidoksen takia erittäin stabiili, ja

sen sidosten rikkominen vaatii runsaasti energiaa. Yhden typpimolekyylin pelkistämiseen kuluu

laboratorio-oloissa vähintään 16 ATP-molekyyliä (Burris 1999). Myös vetyä tarvitaan reaktion

toteuttamiseen. Kokonaisreaktio on lievästi eksoterminen. Typensidonnan kaava on seuraava:

N2 + 8H+ + 8e- 2NH3 + H2

NitrogenaasientsyymiTyppeä sitovassa organismissa typensidontareaktiota katalysoiva nitrogenaasientsyymi koostuu

kahdesta pienemmästä entsyymikomponentista: dinitrogenaasista (1-komponentti) ja

dinitrogenaasireduktaasista (2-komponentti). Dinitrogenaasi (kuva 1, vas.) rakentuu kahdesta

identtisestä alayksiköstä, joita rauta-rikki-kompleksit (Fe4S4) pitävät yhdessä (Burris 1999, Ludden

1999). Dinitrogenaasireduktaasi (kuva 1, oik.) on puolestaan tetrameeri, joka koostuu kahdesta α-

ja kahdesta β-alayksiköstä (Madigan ym. 2003). α-alayksiköissä kofaktoreina toimivat rauta-

molybdeeni –kofaktorit ja β-alayksiköissä P-klusterit. Kofaktorit liittävät yksiköt toisiinsa ja toimivat

elektroninsiirtäjinä typenpelkistysreaktiossa (Burris 1999). Jotkut mikrobit kykenevät sitomaan

typpeä vaihtoehtoisilla nitrogenaasientsyymeillä, joissa ei ole F-Mo-kofaktoria, vaan molybdeenin

sijasta käytetään vanadiinia tai rautaa. Vaihtoehtoisia entsyymejä tuotetaan vain, jos molybdeenia

ei ole saatavilla (Madigan ym. 2003, Burris 1999, Ludden 1999).

2

Kuva 1. Nitrogenaasientsyymin dinitrogenaasi (vasemmalla hapettunut ja pelkistynyt muoto) ja

dinitrogenaasireduktaasi (oikea; Ludden 1999).

Nitrogenaasin toimintaTypensidontareaktiossa elektronit kulkevat elektronin luovuttajalta nitrogenaasientsyymin kautta

typpimolekyylille N2. Aluksi ATP sitoutuu dinitrogenaasireduktaasiin ja aiheuttaa siinä

konformaatiomuutoksen, minkä jälkeen dinitrogenaasireduktaasi sitoutuu dinitrogenaasiin.

Elektronit kulkevat 1-komponentilta 2-komponentille, ja typpi pelkistyy dinitrogenaasin Fe-Mo-

kofaktorissa. Yhden typpimolekyylin pelkistäminen kuluttaa kuusi elektronia, mutta

kokonaisreaktioon niitä tarvitaan kahdeksan, sillä reaktiossa pelkistyy myös H2 (Burris 1999,

Ludden 1999). Tätä reaktiota kuvaa kaava:

N2 + nMgATP + 8e- + 10H+ --> 2NH4+ + nMgADP + H2 (n > 2 per elektroni)

Nitrogenaasin pelkistämä typpi liitetään ammonium-ioniin ja assimiloidaan heti solun proteiinin-

tuotantoketjuun. Typensitojamikrobin ympäristössä oleva vapaa ammoniumtyppi säätelee

typensidontaa estämällä joko nitrogenaasin tuotantoa tai sen toimintaa. Myös N2O ja H2 voivat

toimia entsyymin inhibiittoreina sitoutumalla kompleksiin ennen N2-typpeä. Entsyymikompleksi voi

pelkistää molekulaarisen typen lisäksi myös typpioksidia (N2O), protoneja ja muita kolmoissidoksen

sisältäviä molekyyleja. (esim. syanidi, asetyleeni). Ominaisuutta voidaan käyttää hyväksi

laboratorio-oloissa, kun halutaan selvittää typensidontasysteemin tehokkuutta, mittaamalla

kaasukromatografilla asetyleenin (HC=CH) pelkistymistä etyleeniksi (H2C=CH2) (Madigan ym.

2003, Burris1999).

Koska kofaktorit ovat herkkiä hapettumiselle, nitrogenaasi toimii vain hapettomissa

oloissa. Aerobisten mikrobien on siis luotava olosuhteet, jotka mahdollistavat sekä solun hapellisen

hengityksen, että hapettoman typensidonnan. Fakultatiivit bakteerit esimerkiksi vaihtavat elektronin

vastaanottajaa typensidonnan aikana. Obligaatit aerobit ovat ratkaisseet ongelman useilla eri

tavoilla: vapaa happi voidaan poistaa kiihdyttämällä soluhengitystä tai tuottamalla hapenkulkua

hidastavia limakerroksia (Madigan ym. 2003). Nitrogenaasientsyymi voidaan myös kompleksoida

suojaavaan proteiiniin: eräät lajit stabiloivat entsyymin hapettamalla sen alayksiköt ja liittämällä ne

flavoproteiiniin (Robson 1979). Jotkut rihmamaiset syanobakteerilajit ovat eristäneet nitrogenaasin

rihman keskellä sijaitseviin erilaistuneisiin soluihin, heterokysteihin. Erilaisissa symbiooseissa

3

elävät aerobiset bakteerit, kuten ritsobit ja Frankia-suvun aktinomykeetit, saavat isäntäeliöltä

suotuisat olosuhteet sekä aerobiseen hengitykseen, että anaerobiseen typensidontaan (Madigan

ym. 2003).

1.1.2 Typensidonnan mikrobiologiaa

Typensidontaan kykeneviä mikrobeja on runsaasti. Niistä suurin osa elää itsenäisesti maa- tai

vesiympäristöissä. Aitotumallisten kasvien, sienten (esim. jäkälät) ja hyönteisten (esim. termiitit)

kanssa symbioosin muodostavat typensitojamikrobit ovat elävän luonnon kannalta erittäin tärkeitä.

Taulukosta 1, johon on koottu useita typensitojia, voidaan huomata kuinka monipuolisissa

elinympäristöissä typensitojia esiintyy.

Taulukko 1. Esimerkkejä erilaisista typensitojamikrobeista. Taulukko on laadittu Brock Biology of

Microorganisms (2003) -teoksen mukaan (s. 606). Taulukko ei kata kaikkia tunnettuja typensitojia, vaan

etenkin symbionttisia lajeja löydetään jatkuvasti lisää.

Vapaana eläviä aerobeja

Kemo-organotrofit (bakteereja) Fototrofit KemolitotrofitAzotobacter spp., Azomonas,

Klebsiella, Bacillus polymyxa,

Mycobacterium flavum,

Azospirillum lipoferum,

Citrobacter freundii,

Acetobacter diazotrophicus,

Methylomonas, Methylococcus

useat syanobakteerit, mm:

Trichodesmium

Katagnymene

Cyanothece spp.

Nostoc

Nodularia

Alcaligenes

Thiobacillus (jotkut lajit)

Streptomyces thermoautotrophicus

Vapaana eläviä anaerobeja

Kemo-organotrofit (bakteereja) Fototrofit (bakteereja) Kemolitotrofit (arkkeja)Clostridium spp.

Desulfovibrio

Desulfotomaculum

Chromaticum, Thiocapsa, Chlorobium,

Rhodospirillum, Rhodopseudomonas,

Rhodomicrobium,Rhodophila,Rhodobacter,

Heliobacterium, Heliobacillus, Heliophilum

Methanosarcina, Methanococcus,

Methanobacterium,

Methanospirillum, Methanolobus

Symbionttisista

Palkokasvien yhteydessä elävät (bakteerit) Ei-palkolkasvien yhteydessä elävätRhizobium

Bradyrhizobium

Sinorhizobium

Mesorhizobium

Azorhizobium

Allorhizobium

Frankia-suvun aktinomykeetit

(isäntäkasveina Alnus, Myrica, Ceanothus, Comptonia,

Casuarina)

Nostoc- ja Anabaena- suvun syanobakteerit sekä jotkut

muut syanobaktreerit (isäntäkasveina mm. Azolla

(saniainen), jotkut sammalet ja sienet)

4

Vapaana elävät typensitojatVapaana eläviä typensitojia on lajillisesti eniten (taulukko 1). Heterotrofiset vapaana elävät

typensitojat ovat riippuvaisia ulkopuolisista hiilenlähteistä, minkä takia niitä esiintyy eniten kasvien

juuristojen ja muiden hajoavien orgaanisten ainesten läheisyydessä. Vapaana elävät typensitojat

ovat ympäristönsä kasvien kanssa usein assosiatiivisessa suhteessa, eli vuorovaikutuksessa,

jossa molemmat osapuolet elävät itsenäisesti, mutta hyötyvät toistensa läsnäolosta (Madigan ym.

2003, Stewart 1969). Fototrofit typensitojat, kuten syanobakteerit, kykenevät yhteyttämällä

sitomaan tarvitsemansa hiilen hiilidioksidista (CO2), ja voivat siten esiintyä ympäristöissä, joissa

orgaanisen aineksen määrä on vähäinen. Esimerkiksi merien typenkierrossa syanobakteereilla on

merkittävä rooli. Vaikka vapaana elävien mikrobien sitoma typpimäärä (n. 1-5 kg/ha/vuosi) ei yllä

lähellekään symbionttisten typensitojien tasoa (jopa 100-200 kg/ha/vuosi), ne ovat silti tärkeä lisä

muiden eliöiden kasvulle (Stewart 1969, Burris 1999).

Symbionttiset typensitojatTypensitojamikrobeista ritsobit, Frankia-suvun aktinomykeetit ja useat syanobakteerit muodostavat

symbioosisuhteita monien erilaisten aitotumallisten eliöiden kanssa. Symbioosisuhteessa isäntä-

eliö saa bakteerilta kasvulleen välttämättömiä typpiyhdisteitä. Isäntäeliö tarjoaa puolestaan

bakteerille yksinkertaisia hiiliyhdisteitä ja optimaalisen ympäristön typensidontaan ja

lisääntymiseen. Isäntäeliöt ovat rakentaneet erilaisia typensidontaelimiä (esim. kasveilla

juurinystyrät, alkueläimillä ja hyönteisillä rakot ja onkalot, sienillä sekovarret), joissa bakteerit elävät

usein erilaistuneina symbioosisolumuotoina. Symbioosin muodostumisvaiheeseen liittyy

isäntäeliön ja symbiontin välistä "kemiallista vuoropuhelua", jossa määritellään symbioosin

osapuolten yhteensopivuus (Sprent 2001, Spaink 2000, Hirsch 1992).

Symbionttiset syanobakteerit kuuluvat useimmiten heterokystejä muodostaviin

sukuihin, kuten Nostoc ja Anabaena. Sienet, protistit ja kasvit toimivat niiden isäntinä (Rai ym.

2000). Frankia-suvun aktinomykeetit kykenevät sekä itsenäiseen että symbionttiseen

typensidontaan. Niiden isäntäkasveja tavataan mm. seuraavissa suvuissa: Alnus (esim. lepät),

Casuarina, Ceanothus, Colletia, Elaeagnus, Itippophae ja Purshia spp. Lajeja on useita, ja niiden

isäntäspesifisyys vaihtelee (Lie 1984). Ritsobit voivat elää sekä vapaina maassa että muodostaa

symbiooseja erilaisten palkokasvien kanssa.

1.1.3 Biologisen typensidonnan merkitys

Ilmakehästä sateen mukana laskeutuvat typpiyhdisteet tuovat typpeä eliöiden saataville

huomattavasti vähemmän kuin aktiivisesti molekulaarista typpeä sitovat mikrobit. Eliöt, joilla on

typensitojasymbiontti, ovat typpiomavaraisuutensa vuoksi vahvassa kilpailuetuasemassa.

Kuoltuaan ne myös rikastavat elinympäristöjään vapauttamalla sitomansa typen muiden eliöiden

5

käyttöön. On arvioitu, että toimivissa maaekosysteemeissä pintamaan typpipitoisuus on 5000-10

000 kg N/ha (Crawley 1997), ja esimerkiksi puuvartiset kasvit eivät kykene elämään ennen kuin

maassa on typpeä 400-1200 kg/ha. Typpiomavaraisuutensa takia typensitojakasvit ovatkin usein

ekologisesti tärkeitä avain- ja pioneerilajeja (Stewart 1969).

Biologista typensidontaa suositaan kestävän kehityksen mukaisessa maataloudessa

kemiallisesti tuotettujen lannoitteiden sijaan, sillä myös teollinen typensidonta vaatii runsaasti

energiaa. Typpiomavaraisia kasveja – etenkin palkokasveja – on käytetty viherlannoitukseen ja

maanparannukseen erilaisissa viljelykierroissa ja vuoroviljelmissä jo vuosituhansia. Kasvien

lannoitusvaikutus perustuu siihen, että osa kasveista varastoi typpeä maaperään, osa voidaan

kyntää maahan varsineen hajoamaan ja vapauttamaan jo sidottua typpeä. On arvioitu, että

biologinen typensidonta tuottaa kaksi kertaa kemiallisen sidonnan verran orgaanista typpeä

vuosittain (n. 150 miljoonaa tonnia). Tämä pätee erityisesti viljellyillä maa-alueilla (Burris 1999).

1.2 Palkokasvit

1.2.1 Yleistä

Kasvin ja bakteerin typensidontasymbiooseista ritsobien ja palkokasvien yhteiselo on tunnetuin.

Palkokasvit kuuluvat Fabaceae-heimoon (entinen Leguminosae), jota kutsutaan myös palkokasvi-

/papuheimoksi. Fabaceae-heimon sisarheimoja on kaikkiaan kolme, ja ne kuuluvat Fabales-

lahkoon. Fabaceae jaetaan kolmeen alaheimoon: Mimosoideae, Caesalpinioideae ja Faboideae

(=Papilionoideae; taulukko 2).

Palkokasviheimoon kuuluu 630 sukua ja n. 18000 lajia ruohoja, pensaita, puita ja

köynnöksiä. Ensimmäisten palkokasvien uskotaan kehittyneen noin 50-60 miljoonaa vuotta sitten

(Lavin ym. 2005). Palkokasveja löytyy lähes kaikkialta maapallolta, ja niiden elinympäristöt ovat

hyvin erilaisia. Nopea typpiaineenvaihdunta ja symbioosin muodostaminen typpeä sitovien

ritsobien kanssa ovat palkokasveille tyypillisiä piirteitä. Niiden hedelmä on useimmiten palko (Judd

ym. 1999).

Palkokasvien ekologinen ja taloudellinen merkitys johtuu niiden

typpiomavaraisuudesta. Ihmisravintona tärkeitä kasveja ovat mm. Arachis (maapähkinät), Cicer

(kikherneet), Glycine (soijapavut), Lens (linssit), Phaseolus (pavut) ja Pisum (herneet).

Maatalouden kannalta lannoituksessa ja viljelykierrossa merkittäviä kasveja ovat mm. Medigaco

(sinimailanen), Trifolium (apila) ja Vicia (virna).

6

Taulukko 2. Fabaceae-heimon alaheimot ja niiden lajimäärät (Judd ym. 1999).

Mimosoideae Caesalpinioideae Faboideae

(=Papilionoideae)

Sukuja / Lajeja 40 / 2500 150 / 2700 429 / 12615

Esimerkkisukuja Acacia, Albizia,

Calliandra, Inga,

Leucaena, Mimosa

Bauhinia, Caesalpinia,

Cassia, Chamaecrista,

Cercis, Parkinsonia

Arachis, Glycine,

Indigofera Lespedeza,

Lupinus, Melilotus,

Phaseolus, Pisum,

Pueraria, Trifolium

1.2.2 Tässä tutkimuksessa käytettyjen ritsobikantojen isäntäksvit

Maapähkinä (Arachis hypogaea)Maapähkinä (Arachis hypogaea L.) on yksivuotinen, ruohovartinen, 30-50 cm:n mittaiseksi kasvava

palkokasvi, joka kuuluu Fabaceae-heimon alaheimoon Faboideae. Lajikkeesta riippuen verso voi

kasvaa ylöspäin tai maata pitkin. Lehdykät kasvavat pareittain, ja yleensä lehdessä on kaksi 1-7

cm:n mittaista sulkasuonista lehdykkää. Kasvi on itsepölytteinen. Hernekasveille tyypillinen

keltainen kukka tuottaa hedelmöityttyään palon, johon muodostuu 2-4 siementä. Maapähkinän

siemenet eroavat muiden palkokasvien, kuten papujen, siemenistä lähinnä ohuen siemenkuorensa

perusteella. Palko tunkeutuu useita senttimetrejä syvälle maan sisään kypsymään. Koska

siemenet hautautuvat maan pinnan alle, nostetaan sadonkorjuussa maasta koko kasvi.

Maapähkinä kasvaa parhaiten hiekkapitoisessa maassa, ja se vaatii 5 kk yli 30°C:n lämpötilan

sekä 500-1000 mm vuosittaisen sademäärän. Kasvukauden pituus on 120-150 päivää. Viljellyt

lajikkeet eroavat pääasiassa siemenen maun, öljypitoisuuden, koon, muodon ja taudinkestävyyden

suhteen (Smith 1950, ICRISAT 2005).

Nykyisin viljeltävä maapähkinä on alunperin kotoisin Etelä-Amerikasta. Oletetaan,

että sitä on viljelty ensimmäisen kerran Argentiinassa tai Boliviassa. Näillä alueilla tavataan

nykyään eniten kasvin villiä kantamuotoa. Espanjalaisten valloittajien mukana ja eurooppalaisten

kaupankäynnin avulla maapähkinä on levinnyt ympäri maailmaa. Nykyään maapähkinästä

viljellään tuhansia lajikkeita lähes 100 valtiossa, ja lajikkeita kehitellään koko ajan lisää.

Kehitysmaat hallitsevat yli 96% tuotantoalasta ja 92% tuotannosta. Maapähkinä on maailman

neljänneksi tärkein ruokaöljyn sekä kolmanneksi tärkein kasvisproteiinin lähde. Ravintorikkaana

viljelykasvina, typpeä sitovana maanparannuskasvina ja eläinten rehuna maapähkinä on erittäin

7

arvokas ruokaturvan osa etenkin Afrikassa, Etelä-Amerikassa ja Kaakkois-Aasiassa. On arvioitu,

että puoli miljardia ihmistä käyttää maapähkinää ensisijaisena proteiininlähteenä. Suurin osa näistä

on pienviljelijöitä (ICRISAT 2005, University of Georgia 2003).

Kuva 2. Maapähkinä

(kuva en.wikipedia.org/wiki/Arachis_hypogaea)

Kiinassa viitteitä maapähkinänviljelystä on jo 1300-luvulta. 1600-luvulla portugalilaisten

kauppiaiden Etelä-Amerikasta tuomat uudet lajikkeet yleistyivät ja syrjäyttivät aiemmin viljellyn

maapähkinälajikkeen (Yao 2004). Toinen maapähkinätyyppi rantautui 1800-luvulla amerikkalaisten

lähetyssaarnaajien mukana. Vuodesta 1978 lähtien maapähkinäntuotanto alkoi kasvaa

kommunistisen järjestelmän kaaduttua ja maataloustuotannon vapauduttua. Kiina ja Intia ovat

nykyään alalla maailman suurimmat tuottajat, mutta valtiot kuluttavat suuren osan tuotannostaan

itse, lähinnä maapähkinäöljynä.

Maapähkinää viljellään Kiinassa 28 provinssissa, jotka jaetaan seitsemään

tuotantoalueeseen maantieteen, ilmasto-olosuhteiden ja sijainnin perusteella. Eri alueilla viljellään

erilaisia maapähkinälajikkeita, ja niiden kanssa viljelykierrossa on erilaisia ravintokasveja (Yao

2004). Kiinassa viljellään eniten USA:ssa yleisten päälajikkeiden välimuotoja. Suosituimpia

lajikkeita ovat Xuzhou 68-4, Fuhauseng, Baisha 1016, Shixuan 64, Yueyou 551, Yueyou 116,

Haihua 1, Luhua 9 ja Luhua 8130 (ILDIS 2006, ICRISAT 2005, University of Georgia 2003).

8

Kudzu (Pueraria lobata)Kudzu (Pueraria lobata (Willd.) Ohwi) on yksi Pueraria-suvun n. 20 lajista. Japanista peräisin oleva

nimi, kudzu, pohjautuu köynnöstä tarkoittavaan japaninkieliseen sanaan. P. lobata -nimen ohella

kasvista on käytetty myös muita tieteellisiä nimiä: P. montana ja P. thunbergiana (ILDIS 2006).

Kudzu on kotoperäinen kasvi eteläisessä Japanissa, Kaakkois-Kiinassa ja itäisessä Aasiassa,

sekä ihmisen levittämänä tulokkaana eteläisessä USA:ssa. Muita Pueraria-lajeja esiintyy

eteläisemmässä Kaakkois-Aasiassa.

Kudzu on kiipeävä, puuvartinen ja monivuotinen köynnös, joka voi kasvaa yhden

kasvukauden aikana 20-30 metriä pitkäksi (jopa 30 cm/vrk). Laajasta juuristosta lähtee useita, jopa

kymmeniä köynnöksiä, jotka voivat kiivetä korkealle puita ym. pitkin tai madella maata pitkin.

Köynnöksen varren paksuus on yleensä noin 2,5 cm. Pääversosta lähtevät sivuversot ovat lyhyet

(alle 10 cm). Lehdet ovat noin 20 cm pituiset ja ovaalin muotoiset, toisinaan liuskoittuneet (2-3

liuskaa) sekä alapinnaltaan ohutkarvaiset. Vain maata pitkin kasvaviin köynnöksiin muodostuu

kukkia. Noin 1-1,5 cm:n kokoisista violeteista kukista kehittyy hedelmöittymisen jälkeen litteitä,

karvaisia palkoja, jotka sisältävät 4-10 siementä. Kudzu menestyy useimmissa maalajeissa. Se

tarvitsee runsaasti valoa, yli 27°C kesälämpötilan sekä yli 100 mm:n vuotuisen sademäärän.

Laajan juuristonsa ansiosta kudzu sietää kuivuutta kohtuullisesti. Köynnökset eivät kestä kylmää,

vaan kuolevat talveksi. Juuristo pystyy talvehtimaan jopa -15°C lämpötiloissa tuottaen keväällä

uutta köynnöstä. Kudzu ei leviä helposti siemenistä vaan pikemminkin juuriston avulla, sillä uusi

verso on heikko, ja juuriston kasvaminen kestää vuosia (Mitich 2000).

Kuva 3. Kudzu (Mititch 2000).

9

Aasiassa kudzua on käytetty jo yli 1300 vuotta. Se on yleinen ravintokasvi Jaavalla, Sumatralla ja

Malesiassa. Lehtiä ja kukkia käytetään salaatin tavoin. Tärkkelyspitoisia juuria syödään ja

käytetään sakeutusaineena. Kudzua on käytetty ja käytetään edelleenkin lääke- ja rohdoskasvina.

Sillä hoidetaan mm. krapulaa, alkoholin himoa, tulehduksia, ja migreeniä (yleistä idässä), sekä

ripulia, astmaa, vilustumisia ja kuumetta (luontaishoitoa lännessä). Kiinassa kudzua on pidetty

gingsengin veroisena yleiskuntoa korottavana rohtona vuosituhansien ajan (ILDIS 2006, Mitich

2000). Rehuna se on hyvin kilpailukykyinen muiden rehukasvien joukossa (Corley ym. 1997).

Amerikkalaiset toivat kudzun Japanista Yhdysvaltoihin koristekasviksi, maan-

parannus-, eroosionesto- ja rehukäyttöön 1800-luvun lopulla, minkä jälkeen se on levinnyt

räjähdysmäisesti. Vahvan juuristonsa ansiosta kudzu on erittäin kestävä. Se lähtee kasvamaan jos

vain osa juurista on jäänyt maahan. Kudzu on aiheuttanut ongelmia ja sadonmenetyksiä USA:ssa

siinä määrin, että sen viljely on kielletty.

Soijapapu (Glycine max)Laajaan Glycine-sukuun kuuluu kaksi alasukua: Glycine Soia ja Glycine Glycine. Soia-alasuvussa

on kolme lajia (Glycine max, Glycine soia Sieb. & Zucc. ja Glycine gracilis Skvortz), joista G. max

eli soijapapu on viljelykasvina levinnyt ympäri maailmaa. G. soia ja G. gracilis ovat villikasveja,

jotka esiintyvät luontaisesti vain Aasiassa (APHIS 2006). Oletetaan, että soijapapu on jalostettu

viljelykasviksi alunperin itäisessä Pohjois-Kiinassa n. 1000 e.Kr., minkä jälkeen sitä alettiin viljellä

laajemmin Mantsuriassa. Mantsuriaa pidetäänkin lajin alkuperäisenä geenivarastona (Hymowitz

1970).

Soijapapu on yksivuotinen ja kasvaa noin metrin korkeudelle maan pinnasta.

Lehtivarsissa on kolme lehteä, ja kukat ovat palkokasville tyypilliset. Pitkälti itsehedelmöittyvät

kukat kehittyvät paloiksi, jotka sisältävät 2-4 siementä (papua).

Elintarviketeollisuudelle ja maataloudelle tärkeä soijapapu on yksi maailman eniten

viljellyistä kasvilajeista. Se on myös sekä tärkeä ravintokasvi osassa maailmaa. Viime vuosisadan

alussa soijapavun viljely oli laajamittaisinta Kaakkois-Aasiassa, mutta nykyisin intensiivisin viljely

on siirtynyt Yhdysvaltoihin ja Brasiliaan. Se on silti edelleen tärkeä viljelykasvi kaikkialla

maailmassa (APHIS 2006, ILDIS 2006, Hymowitz 1970).

10

Kuva 4. Soijapapukasvustoa

(kuva Scott Bauer, saatavilla

http://www.ars.usda.gov/is/graphics/photos/)

Kuva 5. Soijapavun auenneita palkoja.

(http://fi.wikipedia.org/wiki/Glycine_max)

Lespedeza sp. & Indigofera sp.Lespedeza-sukuun kuuluu noin 30 lajia kukkivaa, monivuotista pensaslajia. Niitä esiintyy

luontaisesti Pohjois-Amerikan lauhkeilla ja subtrooppisilla alueilla, Itä- ja Etelä-Aasiassa sekä

Australaasiassa. Lespedeza juncea on suvusta ainut, jota tavataan sekä lauhkeilla että trooppisilla

alueilla. Laji tunnetaan myös nimillä L. cuneata ja L. sericea (ILDIS 2006).

Kuva 6. Lespedeza juncea (kuva Jackie Miles

http://thebegavalley.com/plants.html).

Kuva 7. Indigofera tinctoria eli Indigofera bungeana

(www.wikipedia.org).

Indigofera bungeana (myös I. hosiei, I. longispica, I. micrantha, I. pseudotinctoria) kuuluu

Fabaceae-heimon alaheimoon Faboideae. I. bungeana on monivuotinen pensas. Muiden lajien

http://www.ars.usda.gov/is/graphics/photos/

http://fi.wikipedia.org/wiki/Glycine_max

http://thebegavalley.com/plants.html

http://www.wikipedia.org

11

joukossa on myös ruohovartisia kasveja tai pieniä puita. Suvun edustajia kasvaa trooppisilla ja

subtrooppisilla alueilla ympäri maailman, muutama laji myös itäisen Aasian lauhkeilla alueilla

(ILDIS 2006).

1.3. Ritsobit

1.3.1 Yleistä

Ritsobit eli juurinystyräbakteerit ovat maaperäbakteereja, jotka voivat sitoa typpeä

muodostaessaan symbioosin palkokasvin kanssa. Yleensä symbioosi syntyy, kun bakteeri nystyröi

kasvien juuristoja, mutta jotkut palkokasvilajit (mm. Aeschyomene-suvun useat lajit) muodostavat

nystyröitä varsiin (Molouba ym. 1999). Bakteerit voivat elää myös vapaina maassa tai parasiitteina

nystyröissä. (Denison ja Kiers 2004). Ritsobit kuuluvat Rhizobiales-lahkoon, ja tunnetuimmat

ritsobilajit kuuluvat sukuihin Rhizobium, Mesorhizobium, Sinorhizobium, Bradyrhizobium, Allo-

rhizobium ja Azorhizobium. Yksittäinen ritsobilaji voi olla hyvin isäntäspesifinen, eli nystyröidä vain

yhtä tai muutamaa kasvilajia, tai se voi olla isäntänsä suhteen hyvin laaja-alainen. Sama pätee

palkokasveihin (Spaink 2000, Burris 1999, Young ja Haukka 1996, Willems ja Collins 1993).

Ritsobien tutkimus alkoi 1800-luvulla, kun juurinystyröiden ja typensidonnan välinen

yhteys havaittiin. Useat tutkijat eristivät palkokasvien nystyröistä bakteereita, ja lopulta koko suku

nimettiin eniten tutkitun lajin, Rhizobium leguminosarumin, mukaan. Uusien Rhizobium-suvun

lajien nimet sisälsivät usein sen kasvin nimen, josta kanta oli eristetty, koska bakteerien uskottiin

olevan hyvin valikoivia isäntänsä suhteen. Vasta 1900-luvun puolivälissä alettiin havaita, että lajista

riippuen sekä mikrobien fysiologiset ominaisuudet että isäntäspesifisyys vaihtelivat paljon. Vuonna

1982 Jordan erotti selvästi hitaammin kasvavat ritsobikannat nopeakasvuisen Rhizobium-suvun

edustajista, ja antoi uudelle suvulle nimen Bradyrhizobium (Suominen 2000, Young ja Haukka

1996). Tämän jälkeen on löydetty muita uusia ritsobisukuja ja lajeja. Vanhoja sukuja ja lajeja on

myös nimetty uudestaan. Kymmenen viimeisen vuoden aikana typpeä sitovia nystyröitä indusoivia

bakteerilajeja on löydetty myös perinteisten ritsobisukujen ulkopuolelta. Molekyylibiologisten

menetelmien kehittyminen on edistänyt taksonomista tutkimusta ja muuttanut ritsobien luokittelua

(Lindström ym. 2006, Sawada ym. 2003).

1.3.2 Ritsobien geenit

Ritsobin genomi koostuu kromosomista ja mahdollisista plasmideista. Kromosomi on yksi pitkä,

superkierteinen, kaksijuosteinen DNA-molekyyli, joka sisältää solun perusaineenvaihdunnan

kannalta tärkeät geenit sekä usein muitakin geenejä. Plasmidi on kromosomista erillinen lyhyt,

12

rengasmainen kappale kaksijuosteista DNA:ta. Yleensä plasmidissa sijaitsee geenejä, jotka eivät

ole bakteerin elintoiminnoille välttämättömiä, mutta jotka voivat tuottaa sille kilpailuedun tietyissä

olosuhteissa (Madigan ym. 2003). Ritsobin plasmidi sisältää kasvi-bakteerivuorovaikutuksessa

tärkeät symbioosi- ja typensidontageenit (mm. nod, nif, fix). Joillain ritsobilajeilla ei ole plasmidia,

vaan symbioosigeenit sijaitsevat kromosomissa (Sullivan ja Ronson 1998, Ueda 1995).

Transposoni on pala genomia, joka voi liikkua sekä genomin sisällä että genomista

toiseen eri mikrobiyksilöiden välillä. Se sisältää sekä geneettistä informaatiota (geenejä) että

sekvenssejä, joiden koodaamien proteiinien avulla plasmidi kykenee irroittautumaan genomistaan

ja liittymään uuteen (Madigan ym. 2003). Joskus ritsobien symbioosigeenit voivat liikkua

transposonien mukana lisäten siten geneettistä vaihtelua (Sullivan ja Ronson 1998).

YlläpitogeenitYlläpitogeenit sisältävät ribosomaaliset geenit sekä solun perusaineenvaihduntaan tarvittavat

(ATP-tuotanto, soluhengitys, DNA:n tuotanto ja korjaaminen jne.) geenit. Ne sijaitsevat bakteerin

kromosomissa. Tutkimuksessani käytin kahta ylläpitogeeniä, recA ja glnII. Nämä geenit liittyvät

DNA:n korjaamiseen ja proteiinintuotantoon. Eräs DNA:n korjausentsyymi sisältää RecA-proteiinin

(recA-geenin tuote), yksijuosteisen DNA-filamentin ja NTP-kofaktorin. Korjausentsyymin tehtäviä

ovat 1) yleinen geenirekombinaatio 2) SOS-responssin koordinointi, eli DNA:ta korjaavien geenien

säätely DNA:n vaurioituessa, ja 3) DNA:n korjaus (Bianco ym. 2005). GlnII-geeni koodaa

puolestaan glutamiinisyntetaasi II -entsyymiä, joka liittää ammoniumin glutamiiniin yhdessä

proteiinientuotannon vaiheessa (Fisher 1992). Glutamiinisyntetaasi II on kaikilla aitotumallisilla ja

se on löydetty pienestä osasta bakteereista. Esitumallisilla yleisempi glutamiinisyntetaasientsyymin

muoto on glutamiinisyntetaasi I (Kumada ym. 1993). Aktiivisessa, typpeä sitovassa nystyrässä

glutamiinisyntetaasia tuotetaan runsaasti (Brewin 1991).

SymbioosigeenitSymbioosigeeneihin luetaan sekä nystyröinti- että typensidontageenit. Ne ovat välttämättömiä

palkokasvin ja bakteerin onnistuneelle typensidontasymbioosille. Nystyröintiin liittyvät geenit (nod-,

nol- ja noe-geenit) ovat ritsobeille tyypillisiä, mutta typensidontaan liittyviä geenejä (nif- ja fix-

geenit) löytyy myös vapaana eläviltä typensitojilta (Suominen 2000, Hennecke 1990).

Nystyröintigeenit tuottavat Nod-tekijöitä, säätelevät niiden tuotantoa, sekä toimivat

myöhemmässä nystyränmuodostusprosessissa (Spaink 2000). Nod-tekijät ovat

signaalimolekyylejä, jotka toimivat nystyränmuodostusta edeltävän kasvin ja bakteerin vuoro-

puhelun aikana. Ne ovat eri tavoin substituoituja oligosakkarideja, joihin on kiinnittynyt yksi tai

useampia rasvahapporyhmiä. Nod-tekijöitä kutsutaan myös lipo-kito-oligosakkarideiksi, koska

niiden perusrunko on kitiinin kaltainen (kuva 8). Eri palkokasvilajit tunnistavat erilaiset Nod-tekijät,

13

joten nod-geeneillä on suuri merkitys mikrobien isäntäspesifisyydessä (Gage 2000, Spaink 2000,

Haukka ym. 1998, Ueda ym. 1995, Spaink 1994).

Kuva 8. LCO:n perusrakenne (Spaink 2000).

Yleiset nystyröintigeenit (nodABC) tuottavat Nod-faktorien oligosakkaridirunkoja. Muut nystyröintiin

liittyvät nod- nol- ja noe-geenit osallistuvat runkojen erilaisiin substituointeihin (rasvahapot,

fukosylaatio, sulfaatio, asetylaatio, N-metylaatio jne.) (Perret ym. 2000, Spaink 2000). NodC-

geenin tuote, N-asetyyliglukosaminyylitransferaasi, liittää Nod-tekijän perusrunkoon

oligosakkarideja, eli määrittelee yhdisteen pituuden (Spaink 2000). Nod-tekijän pituus ja

substituentit ovat kasvin ja mikrobin vuoropuhelussa oikean "kumppanin" tunnistuksen kannalta

tärkeitä. Tämän takia nodC-geenillä on vahva vaikutus nystyränmuodostuksen onnistumiseen.

Edellä mainittua geeniä on ritsobin genomissa vain yksi kopio. Muita nystyröintigeenejä (esim.

Nod-tekijöiden tuotantoa säätelevä nodD- geeni) voi esiintyä useampana kopiona (Ueda ym.

1995).

Typensidontaan liittyvät nif-geenit löydettiin alun perin vapaana elävästä Klebsiella

pneumoniae –maabakteerista. Ritsobien ja muiden typensitojabakteerien nif-geenit ovat

rakenteellisesti ja toiminnallisesti samankaltaisia, liittyen yleensä nitrogenaasientsyymin tuotantoon

ja säätelyyn (Hennecke 1999). Dinitrogenaasireduktaasin identtiset alayksiköt muodostuvat NifH-

proteiinista (nifH-geenin tuote) ja Fe-kofaktorista. Fix-etuliitteellä nimettyjen geenien on alunperin

havaittu liittyvän symbioottiseen typensidontaan. Lisäksi niihin kuuluu muitakin

symbioositoimintoja, kuten mikrobin erilaistuminen nystyrässä ja sytokromin tuotanto hengitys-

ketjuun (Madigan ym. 2003, Haukka ym. 1998).

Geenien siirtyminenVertikaaliseksi geeninsiirroksi kutsutaan bakteerien jakaantumisesta johtuvaa genomin kloonin

siirtymistä seuraavalle sukupolvelle. Vertikaalisessa geenien siirtymisessä evoluution oletetaan

tapahtuvan mutaatioiden kautta. Eliökunnan sukupuu on piirretty tästä näkökulmasta.

14

Horisontaalinen (eli lateraalinen) geeninsiirto mahdollistaa bakteerin rekombinaation,

ja nopean muutoksen bakteerin ilmiasussa. Tapahtumassa bakteerin oman genomin ulkopuolista

geenimateriaalia liittyy genomiin. Horisontaalinen geeninsiirto voi tapahtua vektorin avulla (virus,

transposoni tms.) tai konjugaation (DNA siirtyy kahden bakteerin ollessa läheisessä kontaktissa

toisiinsa) ja transformaation (bakteeri ottaa vapaana olevaa DNA:ta) yhteydessä. Bakteerin

jakaantuessa horisontaalisen geeninsiirron jälkeen, se siirtää uudet ominaisuudet seuraavalle

sukupolvelle (Madigan ym. 2003).

Horisontaalista geeninsiirtoa on tapahtuu kaikenlaisten geenien osalta ja kaikkien

eliöiden välillä, mutta suurin vaikutus sillä on mikrobeihin. Sen vaikutuksesta bakteerien

pääjaksojen evoluutioon on esitetty useita eriäviä mielipiteitä (Kunin ym. 2005, Kurland ym. 2003,

Gogarten ym. 2002). Yleisesti on todettu, että mitä enemmän luovuttajan ja vastaanottajan

perusgenomit ovat samankaltaiset, sitä helpommin luovuttajan geenit liittyvät vastaanottajan

genomiin. Tämän takia geenit siirtyvät useammin läheisten heimojen, sukujen ja lajien välillä.

Huomattavin merkitys lateraaligeeninsiirrossa on sillä, että se lisää bakteerin kilpailukykyä uudessa

elinympäristössä tai ekologisessa lokerossa (Gogarten ym. 2002). Esimerkiksi patogeenisuutta tai

antibioottiresistanssia aiheuttavien geenien vastaanottaminen voi lisätä bakteerikannan elin- ja

lisääntymismahdollisuuksia huomattavasti sen sijoittuessa tyhjään ekologiseen lokeroon.

Ritsobit hyödyntävät lateraaligeeninsiirtoa siirtämällä symbioosigeenejä lajien välillä

plasmidin välityksellä, kun symbioosigeenit sijaitsevat ns. symbioosiplasmidissa (Rhizobium- ja

Sinorhizobium-suvut), tai transposonin kaltaisen elementin avulla, kun ko. geenit sijaitsevat

kromosomistossa (Mesorhizobium loti). Tätä teoriaa tukevat useat tutkimukset, joissa

symbioosigeenien fylogenia ei noudata 16S rRNA:n tai ydingeenien fylogeniaa. (Debellé 2001)

Usein esim. nod-geenien ryhmittyminen tapahtuu ritsobien isäntäkasvien mukaan, kun taas 16S

rRNA-ryhmät muodostuvat bakteerilajeittain. Tutkimukset viittaavavat myös siihen, että

symbioosigeenit siirtyisivät lähinnä saman suvun edustajien, mutta eivät eri sukujen välillä

(Suominen ym. 2001, Ueda ym. 1995, Dobert ym. 1994).

1.3.3 Taksonomia

YleistäNykyinen bakteeritaksonomia perustuu pitkälti kantojen 16S rRNA-sekvenssien fylogenian ja DNA-

DNA-hybridisaatioiden perusteella tehtyihin lajimääritelmiin. Taksonien paikkansapitävyys

määritellään lisäksi erilaisin feno- ja genotyyppisin sekä biokemiallisin menetelmin. Edellä

mainittujen menetelmien avulla tehtyjä lajinmäärityksiä kutsutaan polyfaasiseksi taksonomiaksi.

(Sawada ym. 2003)

Viimeisimmän luokituksen mukaan perinteiset ritsobisuvut sijoittuvat α-

proteobakteerien ryhmässä Rhizobiales-lahkoon (kuva 9). Lahko voidaan jakaa alaryhmiin, kuten

taulukossa 3 esitetään (Sawada ym. 2003). Lahkoon kuuluu lisäksi palkokasveja nystyröiviä lajeja

15

esimerkiksi suvuista Methylobacterium ja Devosia. Muutaman viimeisen vuoden aikana

palkokasveja nystyröiviä bakteerilajeja on löydetty myös –proteobakteereiden joukosta (Chen ym.

2003, Moulin ym. 2001). Sukupuussa ritsobisuvut ovat monessa tapauksessa fylogeneettisesti

läheisempiä sukulaisia lajeille, jotka eivät nystyröi tai muodosta symbioosia palkokasvin kanssa

lainkaan, kuin toisten ritsobisukujen edustajille (kuva 9). Taksonomisia ongelmia ratkotaan

genomisten tutkimusten avulla edelleen (Lindström ja Gyllenberg 2006, Rossello-Mora ja Amann

2001, Wernegreen ja Riley 1999, Haukka ym. 1998, Sullivan ja Ronson 1998, Young ja Haukka

1996, Ueda ym. 1995).

Taulukko 3. 16S rDNA:n perusteella määritetyt Rhizobiales-lahkon alaryhmät. Jako perustuu Sawadan ym.

(2003) artikkeliin.Rhizobiales-alaryhmä Ryhmän symbionttiset

bakteerisuvut

Ryhmän muut bakteerisuvut

1 "Rhizobiaceae" Rhizobium, Allorhizobium Agrobacterium, Blastobacter

2 "Rhizobiaceae" Sinorhizobium Einsifer

3 "Phyllorhizobiaceae" Mesorhizobium Aminobacter

4 "Bradyrhizobiaceae" Bradyrhizobium, Blastobacter Agromonas, Nitrobacter, Rhodopseudomonas, Afipia

(5 "Methylobacteriaceae" Methylobacterium)

6 "Hyphomicrobiaceae" Azorhizobium Xanthobacter

(7"Hyphomicrobiaceae" Devosia)

16

Kuva 9.

Rhizobiales-

lahkoon kuuluvien

-proteobakteerien

16S rDNA

-fylogenia.

Tummennetulla

pohjalla on

merkitty

palkokasveja

nystyröivät lajit

(Sawada ym.

2003).

17

TutkimusmenetelmätBakteerilajeja erotetaan toisistaan tutkimalla sekä geneettisiä että feneettisiä ominaisuuksia.

Fenotyyppisiä ominaisuuksia tutkitaan mm. kaupallisten metaboliatestien avulla. Muita

taksonomisessa tutkimuksessa ja lajien tunnistamisessa käytettyjä menetelmiä ovat SDS-PAGE

(Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) ja MLEE (Multi Locus Enzyme

Electrophoresis) solun proteiinikoostumuksen tai FAME (Fatty Acid Methyl Ester) rasvahappo-

koostumuksen selvittämisessä (Lindström ym. 2006, Lindström ja Gyllenberg 2006, Terefework

2002).

DNA:n monistaminen PCR-reaktion (Polymerase Chain Reaction) avulla on

vaikuttanut ratkaisevasti DNA-pohjaisten menetelmien kehitykseen. Käyttämällä eri geenialueita

monistavia alukkeita voidaan tutkia bakteerin genomin osia tai muodostaa kuva bakteerigenomin

ns. sormenjäljestä (taulukko 4). Sormenjälkimenetelmillä voidaan selvittää esimerkiksi ritsobien

genomien rakennetta, samankaltaisuutta, geenien liikkumista populaatioissa ja bakteerien

evoluutiota. Sormenjälkimenetelmien lisäksi geenien sekvenointia käytetään paljon taksonomisissa

tutkimuksissa, mutta menetelmän kalleuden ja työläyden takia sillä tutkitaan harvemmin koko

genomia tai edes kokonaisia geenejä. DNA-DNA –hybridisaation avulla selvitetään kantojen välistä

suhteellista DNA-homologiaa ja erotetaan kantoja eri lajeiksi. Saman lajin edustajilla DNA-

homologian tulisi olla yli 70% (Lindström ym. 2006, Sawada 2003, Terefework 2002).

Taulukko 4. Joitain bakteerien taksonomisissa tutkimuksissa käytettyjä DNA-sormenjälkimenetelmiä

(Lindström ym. 2006, Terefework 2002, Vos ym. 1995, Berg ym. 1994, Thormann ym. 1994, Versalovic ym.

1994).

Menetelmä Periaate SoveltuvuusRFLP (Restriction Fragment

Length Polymorphism)

Haluttua genomin osaa käsitellään restriktio-

entsyymeillä ja osat erotellaan

geelielektroforeesissa.

Keskenään hyvin samanlaisten DNA-alueiden

vertailuun. Esim. yksittäiset geenit, 16S rDNA.

AFLP (Amplified Fragment

Length Polymorphism)

Bakteerin koko genomi pilkotaan, tietyin adapteri-

alukkein valitaan fragmenteista PCR-

monistettavat.

Esitumallisten ja aitotumallisten

tutkimuksessa käyttökelpoinen metodi.

Kokonais-DNA:n tutkimus.

rep-PCR (Repetitive sequence

based)

Tunnetuilla alukkeilla monistetaan yleisesti

bakteerigenomissa toistuvia sekvenssejä.

Kokonais-DNA:n tutkimus. Sopii myös lajien

väliseen vertailuun.

PFGE (Pulsed field gel

electrophoresis)

Kokonais-DNA restriktoidaan. Geeli ajetaan

vaihtuvassa sähkökentässä.

Erottelee suuria DNA-paloja.

Kantatunnistukseen.

RAPD (Randomly Amplified

Polymorphic DNA)

ap-PCR (arbitrarily primed PCR)

DAF (DNA amplification

fingerprinting)

Kokonais-DNA:sta monistetaan PCR-reaktion

avulla spesifisillä alukkeilla sattumanvaraisia

fragmentteja.

Kokonais-DNA:n tutkimukseen. Sopivat

parhaiten erilaisten kantojen tutkimiseen

tunnetun lajin sisällä.

18

Ribosomaalisia 16S- ja 23S-alayksikköjä koodaavia DNA-sekvenssejä käytetään taksonomiassa

yleisesti lajien erotteluun, koska näiden geenien oletetaan olevan suhteellisen muuttumattomia

osia ritsobien ja muiden bakteerien genomeissa. 16S- ja 23S rDNA:ta monistetaan PCR-reaktion

avulla geenijaksoille spesifisin alukkein, ja niiden sormenjälki- tai sekvenssitutkimuksilla selvitetään

bakteerien lajiutumista. Ribosomaalisten alayksiköiden geenien väliin jäävä ITS-alue (Internal

Transcribed Spacer) puolestaan koodaa erilaisten aminohappojen l-RNA –molekyyleja. ITS-alueen

sekvenssin pituus ja emäsjärjestys vaihtelevat bakteerilajien välillä, jonka takia ITS-alue soveltuu

bakteerikantojen erotteluun (Terefework 2002).

1.4. Bradyrhizobium-suku

1.4.1 Yleistä

Hidaskasvuiset Bradyrhizobium-bakteerit erotettiin Rhizobium-suvusta vuonna 1982 (Jordan

1982). Ne kasvavat hitaasti hiiva-mannitolialustalla, jossa on 6-hiilisiä yhdisteitä: Halkaisijaltaan 1

mm kokoisia pesäkkeitä muodostuu vasta 7 päivän inkuboinnin jälkeen +28°C:ssa, kun muut

ritsobit kasvava kahdessa päivässä. Bradyrhizobium-suvun edustajat kasvavat paremmin

esimerkiksi 5-hiilisiä yhdisteitä käyttäen (Lindström ym. 2006). Tähän päivään mennessä on

kuvattu kuusi Bradyrhizobium-lajia: B. japonicum, B. elkanii, B. liaoningense, B. yuanmingense, B.

betae ja B. canariense (taulukko 5, Vinuesa ym. 2005).

Useat bradyritsobit ovat isäntäkasvinsa suhteen laaja-alaisia, eli ne muodostavat

symbiooseja monen palkokasvilajin kanssa (Perret 2000). Bradyrhizobium-sukuun kuuluu

juurinystyröitä muodostavien bakteerien lisäksi kantoja, jotka indusoivat nystyröitä tiettyjen

trooppisten kasvien varsiin ja ovat fotosynteesikykyisiä. Fylogeneettisesti bradyritsobit ovat

kaukaisempia sukulaisia Rhizobiaceae-heimon ritsobeille kuin joillekin ei-nystyröiville bakteereille

(Sawada 2003, Ueda ym. 1995).

1.4.2 Bradyrhizobium-lajit

Ensimmäinen kuvattu bradyritsobi oli B. japonicum (alunperin R. japonicum), jonka Jordan (1982)

erotti Rhizobium-suvusta. Tyyppikanta oli eristetty soijapavun juurinystyrästä. Seuraavaksi

löydettiin soijapapua nystyröiviä kantoja, jotka alhaisen DNA-homologian vuoksi määriteltiin

uudeksi B. elkanii -lajiksi (Kuykendall ym. 1992). Samaisessa tutkimuksessa todettiin, että

Bradyrhizobium-suvusta löytyy muitakin DNA-homologiaryhmiä, jotka voitaisiin erotella uusiksi

lajeiksi. Vuodesta 1995 lähtien on kuvattu vielä neljä lajia: B. liaoningense (Xu ym. 1995), B.

yuanmingense (Yao ym. 2002), B. betae (Rivas ym. 2004) ja B. canariense (Vinuesa ym. 2004).

Lajit ja niiden alkuperät on kuvattu taulukossa 5.

19

Taulukko 5. Tähän mennessä nimetyt Bradyrhizobium-lajit sekä niiden alkuperämaat ja isäntäkasvit.Lajin nimi Alkuperämaa Alkuperäinen isäntäkasvi Symbioosimuoto Kirjallisuus-viite

B. japonicum Glycine max

(soijapapu)

juurinystyrä Jordan 1982

B. elkanii Glycine max juurinystyrä Kuykendall ym. 1992

B. liaoningense Glycine max juurinystyrä Xu ym. 1995

B. yuanmingense Kiina Lespedeza cuneata juurinystyrä Yao ym. 2002

B. betae Espanja Beta vulgaris

(sokerijuurikas)

kasvaimenkaltainen

muodostuma varressa

Rivas ym. 2004

B. canariense Kanariansaaret, Marokko,

Espanja, Amerikka,

Australia

useita palkokasvilajeja juurinystyrä Vinuesa ym. 2004

Bradyritsobeista on tutkittu eniten taloudellisesti tärkeiden palkokasvien, soijapavun (G. max) ja

maapähkinän (A. hypogaea) symbiontteja. Bradyritsobien tiedetään kuitenkin nystyröivän laajalti

muitakin Mimosoideae ja Faboideae (Papilionoideae) -alaheimojen palkokasveja. Fotosynteettiset

bradyritsobit muodostavat ns. varsinystyröitä Aeschyomene-suvun kasveihin (Chaintreuil ym.

2000, Giraud ym. 2000, Molouba ym. 1999). Palkokasveihin kuulumattomista villistä ja viljellystä

riisistä (Oryza brevigulata, O. sativa) on löydetty endofyytteinä eläviä fotosynteettisiä

bradyritsobikantoja (Chaintreuil ym. 2000). Endofyyttikannat eivät välttämättä muodosta typpeä

sitovia nystyröitä, mutta ne voivat muuten edistää isäntäkasviensa kasvua (Tan ym. 2001, Perret

ym. 2000, Molouba ym. 1999).

1.4.3 Bradyritsobien taksonomia

16S rDNA-sekvenssien perusteella rakennetuissa fylogeneettisissä sukupuissa Bradyrhizobium

sijoittuu Bradyrhizobiaceae-heimoon, joka on erillään Rhizobiaceae-heimosta (kuva 10, Willems

ym. 2001). Bradyritsobien lisäksi edellä mainitussa heimossa on palkokasvisymbiontti Blastobacter

denitrificans sekä ei-symbionttiset Agromonas-, Nitrobacter-, Rhodopseudomonas- ja Afipia-lajit

(kuva 9, Sawada ym. 2003). Bradyritsobien tutkimuksessa yritetäänkin parhaillaan selventää niiden

taksonomista luokitusta, sillä siinä on paljon ratkaisemattomia kysymyksiä lajien nimityksistä,

keskinäisestä sukulaisuudesta ja tehtyjen lajinmääritysten paikkansapitävyydestä (Lindström ja

Gyllenberg 2006, Vinuesa ym. 2005, Sawada 2003).

20

Kuva 10. Bradyritsobien sukulaisuus muihin Bradyrhizobiaceae-heimon lajeihin sekä toisiin ritsobeihin. Puu

on rakennettu tutkimalla 16S rDNA:n ja geenien sekvenssejä sekä DNA-DNA -homologiaa (Willems ym.

2001).

21

1.4.4 Bradyritsobien genomi

Bradyritsobien genominen diversiteettiBradyritsobilajien määrittelyn perusteena käytetty 16S rDNA-sekvenssihomologia ei anna pätevää

kuvaa lajien sukulaisuudesta, sillä DNA-DNA-hybridisaatiot ja fenotyyppiin perustuvat tutkimukset

eivät läheskään aina noudata 16S rDNA:n fylogeniaa (van Rossum ym. 1995). Esimerkiksi B.

japonicum ja B. liaoningense ovat 16S-sekvenssin perusteella hyvin läheisiä, mutta niiden DNA-

DNA-homologia on alle 40 %, mikä määrittää ne eri lajeiksi. Samoin B. japonicum on

kokonaisgenomiltaan lähempänä muita Bradyrhizobiaceae-heimoon kuuluvia sukuja (Afipia,

Agromonas, Blastobacter, Nitrobacter ja Rhodopseudomonas) kuin tutkittuja B. elkanii-kantoja

(kuva 12) (Willems ym. 2001). Bradyritsobien genominen diversiteetti tuo suuren haasteen, kun

nimetään uusia Bradyrhizobium-lajeja ja määritellään niiden välisiä sukulaisuussuhteita. (Vinuesa

ym. 2005, Saito ym. 1998, van Rossum ym. 1995, Yanagi ja Yamasato 1993).

Lateraalinen geeninsiirtoLateraalinen geeninsiirto voi olla eräs syy bradyritsobien genomiseen diversiteettiin.

Bakteerikantojen ribosomaaliset ja ylläpitogeenit ryhmittelevät kannat usein lajeihin, mutta

symbioosigeenien paikan vaihtuminen kromosomissa ja niiden siirtyminen bakteerista toiseen saa

aikaan ristiriitaisuuksia lajien yhtenäisyydessä. Symbioosigeenit eivät yleensä sijaitse plasmidissa,

vaan yhtenäisenä ”symbioosisaarekkeena” bakteerin kromosomissa (Kaneko ym. 2002). Tämä

saareke voi siirtyä transposonin kaltaisesti (Laguerre ym. 2003, Sawada ym. 2003, Sullivan ja

Ronson 1998 Ueda ym. 1995).

Kun on tutkittu bradyritsobien symbioosigeenejä ja niiden isäntäkasvien

nystyröitymistä ja typensidontaa, on havaittu että bradyritsobien symbioosigeenit ja symbioosin

tehokkuus korreloivat. Typensidonta- (nif, fix) ja etenkin yleiset nystyröintigeenit (nod)

ryhmittäytyvät usein isäntäkasvien mukaan. Sen sijaan 16S rDNA ja ylläpitogeenit eivät aina

korreloi isäntäkasvien kanssa. Samasta isäntäkasvilajista, toisinaan samalta alueeltakin, eristetyt

bradyritsobikannat osoittautuvat usein geneettisesti hyvin monimuotoisiksi (Vinuesa ym. 2005,

Vinuesa ym. 2004, Sawada ym 2003, Yang ym. 2002, Urtz ja Elkan 1996).

1.5 Palkokasvin ja ritsobin välinen symbioosi

1.5.1 Yleistä

Symbionttinen typensidonta tapahtuu palkokasvin juuristoon - tai toisinaan varteen (Rivas ym.

2004, Giraud ym. 2000) - muodostuvassa erilaistuneessa ”typensidontakudoksessa”, nystyrässä.

Nystyränmuodostuksessa voidaan erottaa seuraavat vaiheet: i) kasvin ja bakteerin välinen

22

kemiallinen vuoropuhelu, jonka avulla ”sopivat” osapuolet löytävät toisensa, ii) bakteerin

kiinnittyminen juurikarvojen pintaan ja iii) tunkeutuminen juuren sisään kasvin valmistamaan

nystyrään. Kasvi tarjoaa nystyrässä bakteerille typensidontaan sopivat olot sekä luovuttaa

yksinkertaisia hiiliyhdisteitä bakteerin sitomia typpiyhdisteitä vastaan (Sprent 2001, Boogerd ja van

Rossum 1997, Hirsch 1992).

Symbioosin merkitys eri osapuolilleRitsobien määrä maassa on yleensä niin valtava, että vain murto-osa bakteereista päätyy lopulta

palkokasvin nystyrään, mutta nämä onnistuneet yksilöt kykenevätkin tuottamaan jälkeläisiä

huomattavasti tehokkaammin kuin vapaana elävät lajitoverinsa (Denison ja Kiers 2004). Nystyrään

voi päätyä myös parasiittisia bakteerikantoja, jotka eivät sido typpeä. Joissakin tapauksissa kasvit

voivat estää parasiittisten kantojen lisääntymistä nystyrän sisällä, toisinaan eivät. Kasvin ei

kannata muodostaa nystyrää, jos typpeä on muuten maassa saatavilla, sillä nystyrän

muodostaminen vaatii energiaa ja rakennusaineita. Tästä syystä kasvi pyrkii säätelemään

nystyröintiä maan typpipitoisuuden mukaan (Denison ja Kiers 2004, Madigan 2003, Schultze ja

Kondorosi 1998).

1.5.2 Vuoropuhelu

Ritsobit suuntaavat maaperässä juurten läheisyyteen kasvien erittämien yhdisteiden

(hiilihydraatteja, orgaanisia happoja, aminohappoja, vitamiineja ja fenolisia yhdisteitä)

houkuttelemina (kuva 11). Ritsobit kerääntyvät juurten juurikarvojen läheisyyteen ja pinnoille ja

kiinnittyvät juurisolukon pintaan. Isäntäkasvin tuottamat erilaiset flavonoidiyhdisteet aloittavat

vuoropuhelun indusoimalla bakteerin nystyröintigeenit toimimaan. Vastauksena flavonoideihin

ritsobit tuottavat Nod-tekijöitä. Ne aiheuttavat kasvisolukossa morfologisia muutoksia (mm.

juurikarvan muodon muutoksia, flavonoidien tuoton lisääntymistä, esinystyräsolukon

muodostumista), jotka tähtäävät nystyränmuodostukseen (Perret 2000, Stougaard 2000, Schultze

ja Kondorosi 1998). Nystyröintigeeneihin voi vaikuttaa muillakin yhdisteillä kuin flavonoideilla.

Esimerkiksi maapähkinän ei tiedetä tuottavan flavonoideja, mutta sen juurieritteillä on silti

bradyritsobien nod-geenejä indusoiva vaikutus (Boogerd ja van Rossum 1997).

Symbioosin onnistumiselle oleelliset molekyylitPalkokasvit tuottavat useita erilaisia flavonoidiyhdisteitä (esim. isoflavonit, kalkonit, flavonolit,

flavonit, antosyanidiinit ym.; Schultze ja Kondorosi 1998). Ympäristötekijät voivat vaikuttaa niiden

indusoivaan tehoon (Angelini ym. 2003). Ritsobien tuottamien Nod-tekijöiden rakenne vaihtelee

lajin ja ”alalajin” mukaan. Ritsobeilla on tietynlaisille flavonoideille ja palkokasveilla tietynlaisille

23

Nod-tekijöille spesifiset reseptorit, joten vuoropuhelun aikana määritetään bakteerin ja kasvin

yhteensopivuus.

Ritsobi kiinnittyy kasvin juurisolun pintaan pintapolysakkaridiensa avulla (Schultze ja

Kondorosi 1998). Myös lektiineillä uskotaan olevan roolinsa isäntäspesifisyyden määrittelyssä ja

bakteerien kiinnittymisessä kasvin juureen (Hirsch 1999). Ritsobin soluseinän ulkomembraanin

eksopolysakkaridit, lipopolysakkaridit, K-antigeenit (Schultze ja Kondorosi 1998) ja sykliset

glukaanit ovat esimerkkejä muista bakteerien symbioosikumppanin valintaan ja symbioosin

onnistumiseen vaikuttavista yhdisteistä (Karr ym. 2000, Perret 2000, Boogerd ja van Rossum

1997). Niiden rakenteet ja koostumukset vaihtelevat riippuen ympäristön olosuhteista ja bakteeri-

kannoista. Yhteenvetona voidaan sanoa, että kaikilla vuoropuheluun osallistuvilla molekyyleillä on

oma tehtävänsä nystyröintiprosesin kulussa ja isäntäspesifisyydessä (Morgante ym. 2005,

Terefework 2002, Spaink 2000, Stougaard 2000).

Kuva 11. Palkokasvin ja bakteerin välinen vuoropuhelu: 1) Kasvin juuristo erittää erilaisia orgaanisia

yhdisteitä maahan 2) Bakteerit liikkuvat kohti juuristoa eritteiden houkuttelemina 3) Ritsobit kiinnittyvät

juuriin, ja tuottavat Nod-tekijöitä flavonoidien indusoimina 4) Nod-tekijät indusoivat nystyränmuodostusta ja

bakteerit siirtyvät nystyröihin. 5) Typpeä sitovia juurinystyröitä.

1.5.3 Infektioprosessi

Mikrobin ja kasvin välistä vuoropuhelua seuraa bakteerien tunkeutuminen kasviin. Isäntäkasvi

säätelee infektioprosessin etenemistä, määrää infektiotavasta (eli miten/millä ritsobi pääsee

juureen) ja päättää nystyrän muodon (Boogerd ja van Rossum 1997). On huomattu, että myös

ympäristötekijöillä on vaikutusta isäntäkasvin infektoitumiseen: olosuhteista riippuen bakteerit

24

voivat infektoida samaakin kasvia eri tavoin (Goormachtig ym. 2004). Tunnetuimmassa

infektiotavassa ritsobisolu pääsee juureen juurikarvan kautta ja etenee sieltä kohti nystyrää kasvin

muodostamaa infektiokäytävää eli infektiolankaa pitkin (engl. infection thread; Hirsch 1992).

Esimerkiksi sinimailanen, joka on ehkä tutkituin palkokasvi, ja soijapapu infektoituvat tällä tavoin.

Maapähkinässä bakteeri pääsee juureen pää- ja sivujuuren yhtymäkohtaan muodostuneesta

halkeamasta (Boogerd ja van Rossum 1997). Ritsobi voi myös tunkeutua suoraan juuren

pintasolukoiden läpi. Tätä harvinaista infektioreittiä on tavattu mm. Mimosa scrabella -lajilla (de

Faria ym. 1988). Muitakin infektiotapoja löytyy (Goormachtig ym. 2004, de Faria ym. 2001,

Boogerd ja van Rossum 1997). Koska työni käsittelee mm. soijapavun ja maapähkinän

bradyritsobeita, kuvaan seuraavissa kappaleissa infektiota näiden kahden esimerkkikasvin ja

bradyritsobin symbioosinmuodostuksen kautta.

Soijapapu infektoituu juurikarvan kautta ja ritsobit etenevät infektiokäytävää pitkinBradyritsobit pääsevät soijapavun juureen juurikarvan kautta. Kun bakteerit ovat juurten

läheisyydessä tai kiinnittyneet juurikarvan pintaan, isäntäkasvin tuottamat daidzeiini ja genisteiini

aktivoivat Nod-tekijöiden tuotannon. Nod-tekijät saavat aikaan nystyräsolujen jakaantumisen (Karr

ym. 2000), ja juurikarvan pää kihartuu bakteerien ympärille vangiten ne ”taskuun”, josta lähtee

juurikarvaa pitkin kasvamaan solunsisäinen käytävä, infektiolanka, kohti jakaantuvaa

nystyräsolukkoa eli esinystyrää. Bakteerit ovat käytännössä juurikarvan solujen ulkopuolella, koska

infektiokäytävä on erillinen "rakennelma". Bakteerit muuttuvat solunsisäisiksi vasta kun

infektiokäytävä tunkeutuu nystyräsolukkoon ja bakteerit vapautuvat nystyräsolujen sisään

isäntäsolun solukalvon ympäröiminä (Kuva 12).

Kuva 12. Soijapavun infektioprosessi. Bradyritsobi pääsee juureen juurikarvan kautta. a) Ritsobi kiinnittyy

kasvavaan juurikarvaan. b) Nod-tekijöiden vaikutuksesta juurikarva kihartuu ja vangitsee bakteerin

juurikarvan muodostamaan taskuun. Bakteerit jakaantuvat taskussa. c) Bakteerit etenevät kohti juurta ja

nystyrää isäntäkasvin muodostamaa infektiokäytävää pitkin. d) Infektiokäytävät kasvavat kohti juuren sisem-

piä osia ja kohti jakaantuvaa nystyrää (ns. esinystyrää).

25

Maapähkinän infektioprosessi: sivujuuren tyvihalkeaman kautta (STH) ja

solunsisäisesti levitenUseimmissa (sub)trooppisissa palkokasveissa (Arachis [maapähkinä], Aeschyomene, Sesbania,

Stylosanthes, Neptunia) ritsobit tunkeutuvat kasviin pää- ja sivujuuren väliseen haaraumaan

muodostuneesta halkeamasta (kuva 13). Ne pääsevät halkeamasta kasvin juuren soluväleihin.

Soluväleistä ne siirtyvät kasvisolujen sisään, lisääntyvät ja muodostavat ns. ”infektiotaskuja”.

Infektiotaskuista bakteerit kuljetetaan joko infektiokäytävää pitkin tai juuren soluväleissä,

kasvilajista riippuen, syvempiin juurisolukerroksiin ja nystyrään (Goormachtig ym. 2004). Kutsun

tätä infektiomekanismia sivujuuren tyvihalkeama (STH) -infektioksi, Goormachtigin ym. mukaan

(2004).

Maapähkinä ei muodosta infektiokäytävää kuljettaessaan bradyritsobeja nystyrään.

Juureen tunkeuduttuaan osa bradyritsobeista kolonisoi juuren pintasolukon alaisia tyvisoluja

lisääntyen siellä, osa leviää solujen välissä syvemmälle. Bradyritsobit kulkevat

maapähkinänjuuressa erottaen juurisolujen soluseinät kulkuväylän varrella toisistaan, mutta eivät

tunkeudu juurisolun sisään sytoplasman puolelle (Boogerd ja van Rossum 1997).

26

a) infektion tapahtumakohta

juuristossa

b) juurikarva (vas) ja sivujuuren

haarautumakohta (oik)

c) juurikarvan kihartuminen (vas) ja -

STH-infektio (oik)

d) infektiokäytävä (vas) ja solun-

sisäinen leviäminen (oik)

e) nystyrässä on infektoimattomia

soluja infektoitujen solujen välissä

tasaisesti levinneenä (vas) ja

”jakolinjana” (oik)

Kuva 13. Juurinystyrän muodostuminen, kun infektio tapahtuu sivujuuren tyvihalkeaman kautta (STH)

maapähkinässä (oikea) ja infektiolangan avulla soijapavussa (vasen; Boogerd ja van Rossum 1997).

1.5.4 Nystyrätyypit

Infektioprosessin tuloksena bakteerit päätyvät kasvavaan nystyrään. Palkokasveilla esiintyy

ulkonäöltään ja rakenteeltaan kahta nystyrätyyppiä (kuva 14). "Indeterminantit" eli jatkuvasti

kasvavat nystyrät ovat sylinterimiäisiä, ja "determinantit" eli rajatusti kasvavat nystyrät ovat

pallomaisia (Brewin 1991, Hirsch 1992).

Muodostuvan nystyrän tyypin päättää isäntäkasvi. Juuren pintasolukon

jakautumiskohta vaikuttaa nystyrän muotoon: Uloimman pintasolukon jakaantuminen johtaa

determinantteihin nystyröihin, kun sisemmästä pintasolukosta muodostuu indeterminantteja

nystyröitä (Hirsch 1992). Determinantteja nystyröitä muodostuu yleensä trooppisiin ruohovartisiin

palkokasveihin (esim. maapähkinä, soijapapu), kun taas indeterminantit nystyrät ovat yleisiä

Mimosoideae-heimon puuvartisissa palkokasveissa sekä lauhkean ilmaston ruohovartisissa

palkokasveissa (Räsänen 2002).

27

Kuva 14. Eri nystyrätyypit. Indeterminantissa nystyrässä voi erottaa eri vyöhykkeitä. Nystyrän kärjessä on

jatkuvasti kasvava meristeemisolukko. Determinantissa nystyrätyypissä koko nystyrä on suurin piirtein

samassa kehitysvaiheessa. m=meristeemisolukko, 1=infektio- ja erilaistumisvyöhyke,

2=typensidontavyöhyke, 3=vanhenemisvyöhyke. Kuvassa nystyräsolukko on rajattu sisempään

sylinteriin/palloon. Uloin solukerros muodostuu kasvin juurisoluista. Kuva A. M. Hirschin (1992) mukaan.

Indeterminantti eli jatkuvasti kasvava nystyräIndeterminantti nystyrä voidaan jakaa sisempään ja ulompaan kudokseen. Ulompi solukerros

muodostuu isäntäkasvin juurisolukosta, sisempi on erilaistunutta nystyräsolukkoa (Kuva 17).

Nystyrän kärjessä on jatkuvasti jakautuvaa ja erilaistuvaa meristeemisolukkoa, minkä takia

nystyrästä muodostuu sylinterinmuotoinen. Kärjen jatkuvan jakaantumisen vuoksi nystyrässä

voidaan erottaa erilaisia vyöhykkeitä: kärjessä solukko on nuorinta, lähinnä isäntäkasvin juurta

sijaitseva solukko on vanhinta. Myös infektio, bakteerien erilaistuminen bakteroideiksi,

typensidonta ja nystyrän vanheneminen tapahtuvat eri vyöhykkeissä (Kuva 14). Esimerkiksi

sinimailanen (Medigaco sp.), apila (Trifolium sp.), virna (Vicia sp.) ja herne (Pisum sp.)

muodostavat indeterminantteja nystyröitä (Hirsch 1992).

Determinantti eli rajatusti kasvava nystyräDeterminantti nystyrä on pallomainen, ja erotettavissa sisempään juuri- ja ulompaan

nystyräkudokseen kuten indeterminantti nystyrä. Verrattuna indeterminanttiin nystyrään

determinantissa nystyrässä ei ole jatkuvasti kasvavaa meristeemisolukkoa. Siinä ei ole

erotettavissa erilaisia toiminnallisia vyöhykkeitä. Nystyränmuodostuksen varhaisvaiheen jälkeen

solut lähinnä laajenevat (Kuva 14; Hirsch 1992, Brewin 1991). Soijapapu (Glycine max) ja

maapähkinä (Arachis hypogaea) muodostavat determinantteja nystyröitä. Maapähkinän kypsä,

28

determinantti nystyrä on pieni (1-5 mm) ja navoistaan hieman litistynyt (Boogerd ja van Rossum

1997).

1.5.5 Nystyräsolukon infektoituminen

Infektiokäytävässä bradyritsobit lisääntyvät ja etenevät käytävää pitkin nystyröihin, jotka ovat

muodostuneet infektioprosessin aikana. Infektiokäytävä sulautuu juurinystyrän uloimmaisiin

soluihin, jolloin ritsobit purkautuvat käytävän päästä. Ne ottavat nystyräsolujen solukasvosta kalvon

suojakseen, ja tunkeutuvat nystyräsolujen sisään. Bakteerien päälle jäävä kasvisolun solukalvo

suojaa symbioottisia bakteereita kasvin suojamekanismeilta. Nystyrässä bakteerit jakaantuvat ja

levittäytyvät edelleen (Stacey ym. 2006, Goormachtig ym. 2004, Gage 2000, Hirsch 1992).

Indeterminantti nystyrä infektoituu yleensä siten, että infektiokäytävä tunkeutuu

nystyräsolukkoon ja käytävän päästä eroaa soluseinättömiä infektiokäytävän kappaleita, "infektio-

pisaroita", jotka sisältävät yleensä 10-100 ritsobia (Vega-Hernandez ym. 2001, Brewin 1991).

Ritsobien kohdesolut ovat meristeemisolukossa, mutta infektiokäytävä ei tunkeudu

meristeemisolukkoon asti, vaan jää infektioalueelle (kuva 14). Infektiopisarat ja niiden sisältämät

ritsobit pääsevät kohdesoluihin fagosytoottisesti. Indeterminanteilla nystyröillä infektiotapa johtaa

siihen, että infektoimattomat nystyräsolut ovat tasaisemmin jakaantuneena infektoitujen solujen

seassa (Kuva 13). Osa nystyrän meristeemisoluista ei infektoidu ritsobeilla, vaan erilaistuu

nystyrän metabolian tarpeisiin. (Hirsch 1992, Brewin 1991).

Maapähkinän juuressa, STH-infektiossa, bradyritsobit kulkevat juurisolujen väleissä

kohti erilaistuvia nystyräsoluja. Juurisolujen soluseinä hajotetaan sellulolyyttisesti, ja bradyritsobit

otetaan nystyräsolujen sisään. Bradyritsobit infektoivat yleensä vain muutaman nystyräsolun ja

alkavat jakaantua nopeasti solujen sisällä. Samalla nystyräsolut jakaantuvat, ja siten infektoitujen

nystyräsolujen määrä kasvaa. Koska nystyräkudos muodostuu muutaman infektoidun solun

jakaantumisen tuloksena, voi nystyrään jäädä selkeitä infektoimattomien solujen linjoja

infektoituneiden solujen väliin (Brewin 2002, Boogerd ja van Rossum 1997, Hirsch 1992).

Juurinystyrän toimintaKun nystyrä on valmis, ritsobit erilaistuvat typpeä sitoviksi bakteroideiksi. Bakteroidit ovat yleensä

suurempia ja monimuotoisempia kuin maassa vapaana elävät ritsobit. Isäntäsolun solukalvosta

otetusta suojapeitteestä muodostuu peribakteroidinen (=symbiosomaalinen) membraani, jonka

sisällä on yksi tai useampi bakteroidi. Peribakteroidinen membraani mahdollistaa aineiden vaihdon

kasvin ja bakteerin välillä. Typpeä sitovaa yksikköä (bakteroidi[t] suljettuna peribakteroidiseen

membraaniin) kutsutaan myös symbiosomiksi (Stacey ym 2006, Brewin 2002, Verma ja Hong

1996).

29

Juurinystyrässä happiolosuhteet ovat tarkasti hallitut, koska ritsobin metabolia on

aerobinen mutta typpeä sitova nitrogenaasientsyymi vaatii hapettomat olot. Nystyrässä happea on

3-30 nmol/l, eli noin tuhannesosa ilmakehän happimäärästä (Brewin 2002). Toiminnaltaan ja

rakenteeltaan hemoglobiinin kaltainen leghemoglobiini sekä solujen väliset happitilat säätelevät

hapen saatavuutta juurinystyrässä. Leghemoglobiini sisältää rautaa, minkä takia sen muodostama

pigmentti värjää nystyrän vaaleanpunaiseksi. (Brewin 2002, Hirsch 1992). Juurinystyrässä ritsobit

ovat yhteydessä isäntäkasviin ulomman nystyräsolukon kuljetussolujen välityksellä. Kasvin

syntetisoimat yksinkertaiset hiilihydraatit diffundoituvat bakteerien energianlähteeksi, ja ritsobien

tuottamat typpiyhdisteet kuljetetaan suoraan kasvin aminohappojen tuotantoketjuun (Brewin 2002,

Stougaard 2000, Hirsch 1992).

30

Kokeellinen osa

2. Työn tarkoitusHidaskasvuiset Bradyrhizobium-bakteerit kuuluvat α-proteobakteerien pääjaksoon. Ne sijaitsevat

16S rDNA-sekvensseihin perustuvissa sukupuissa erillään nopeakasvuisemmista ritsobisuvuista

(Rhizobium, Mesorhizobium, Sinorhizobium, Allorhizobium, Azorhizobium). Bradyritsobien

muodostamia taksonomisia ryhmiä ei ole tutkittu yhtä kattavasti kuin esimerkiksi hyvin tunnettua

Rhizobium-sukua. Bradyritsobit luokitellaan ritsobeihin symbioosiominaisuuksiensa perusteella,

mutta muiden genomisten ominaisuuksiensa perusteella ne ovat usein läheisempiä sukulaisia

hyvin erilaisille, usein ei-symbioottisille bakteereille (esimerkiksi Rhodopseudomonas palustris)

(Sawada ym. 2003).

Toistaiseksi Bradyrhizobium-suvusta on nimetty kuusi lajia: B. japonicum (Jordan

1982), B. elkanii (Kuykendall ym. 1992), B. liaoningense (Xu ym. 1995), B. yuanmingense (Yao

ym. 2002), B. betae (Rivas ym. 2004) ja B. canariense (Vinuesa ym. 2004). Lajirunsaus on

epäilemättä laajempi, mutta lajien määrittäminen on vaikeaa bradyritsobien genomin laajan

diversiteetin takia. Ritsobitutkijoiden keskuudessa on pohdittu, mikä merkitys lateraalisella

geeninsiirrolla on Bradyrhizobium-suvun syntyyn ja kehitykseen. Lateraalisella geeninsiirrolla on

koetettu selittää suvun sisäistä genomista diversiteettiä ja toisaalta symbioottista

samankaltaisuutta (Vinuesa ym. 2005, Kurland ym. 2003). Myös ribosomaalisen 16S-geenin

määräävä rooli lajia määrittävänä sekvenssinä on kyseenalaistettu taksonomisessa tutkimuksessa,

kun geenien tutkimus on helpottunut ja yleistynyt (Sawada ym. 2003).

Maapähkinä (Arachis hypogaea), joka on levinnyt ihmisen mukana Etelä-Amerikasta

mm. Kiinaan 1300-1600 -luvulla, on useissa trooppisissa ja subtrooppisissa maissa tärkeä

ravintokasvi. Kiinalaisten maapähkinöitä nystyröivien bradyritsobien alkuperää ei tiedetä (Yao

2004). Kudzu (Pueraria lobata) on alun perin aasialainen, ja myös Kiinassa kasvava, ruoka- ja

lääkekasvina käytetty köynnösmäinen palkokasvi (University of Georgia 2003, Mititch 2000).

Työni tavoitteena oli tutkia i) maapähkinää nystyröivien kiinalaisten Bradyrhizobium-

kantojen diversiteettiä ja lajiutumista yleisimmin lajiutumisen tutkimisessa käytetyn 16S rDNA:n

ulkopuolella, tässä tapauksessa ydingeenien (recA ja glnII) ja symbioosigeenien (nifH ja nodC)

avulla, ii) selvittää kiinalaisten Bradyrhizobium-kantojen avulla, miten läheisiä tai kaukaisia

sukulaisia kotoperäisten villien palkokasvien, kuten kudzun, ja vierasperäisen maapähkinän

symbiontit ovat, iii) miten kiinalaiset maapähkinää ja luonnon palkokasveja (kudzu, Lespedeza- ja

Indigofera-lajit) nystyröivät Bradyrhizobium-kannat ryhmittyvät eri Bradyrhizobium -lajien

tyyppikantoihin ja soijapapua nystyröiviin bradyritsobeihin verrattuna.

Tutkimuksessani käytin Bradyrhizobium-kantoja, joita oli eristetty sekä viljellyistä

(maapähkinä ja soijapapu) että luonnonvaraisista (kudzu, Lespedeza-, Indigofera-, Acacia-,

31

Aeschyomene- ja Phaseolus-suvut) kasveista. Suurin osa kannoista oli peräisin kiinalaisista

kasveista, mutta vertailun vuoksi otin mukaan kansainvälisiä vertailu- ja tyyppikantoja.

Kokonaisgenomin yleistason vertailuun ja lajiutumisen tutkimiseen käytin AFLP-menetelmää, sekä

yksittäisten geenien tasolla PCR-RFLP-analyysia. Bakteerikantojen lajieroja analysoin

ribosomaalisia alayksiköitä koodaavien geenien välisellä ITS-alueella. ITS-alue soveltuu hyvin

bradyritsobien tutkimukseen, koska bradyritsobeilla on vain yksi ribosomaalisia alayksiköitä

koodaava rrn-operoni (Kündig ym. 1995). Erilaisten geenien merkitystä lajien ryhmittelyssä

tarkastelin kahden symbioosigeenin (nifH ja nodC) sekä kahden solun peruselintoimintoja

ylläpitävän ydingeenin (recA ja glnII) avulla.

Tutkimuksen taustalla oli kysymys kiinalaista maapähkinää nystyröivien brady-

ritsobien alkuperästä. Tarkastelen työni tuloksia mm. seuraavien hypoteesien valossa: i)

Symbioosigeenien horisontaalinen kulkeutuminen mahdollistaa paikallisten bakteerikantojen

mukautumisen uuden isäntäkasvin, maapähkinän, vaatimuksiin (Vinuesa ym. 2005, Kurland ym.

2003). ii) Maapähkinää nystyröivät bradyritsobit ovat levinneet Kiinaan maaperään maapähkinän

siementen mukana. iii) Kosmopoliitit, pitkien aikojen kuluessa erilaisiin ympäristöolosuhteisiin

sopeutuneet bradyritsobit ovat poikkeuksellisen aktiivisia geenien siirtäjiä, ja kykenevät sen takia

sopeutumaan uusiin tulokaspalkokasvilajeihin (Dresler-Nurmi ym. 2006, Woese 1987).

3. Materiaalit ja menetelmät

3.1 Bakteerikannat

Tutkimukseen otettiin mukaan mahdollisimman kattava otos erilaisia bradyritsobeja, joita oli

eristetty ja tunnistettu eri puolilla maailmaa (taulukot 3.1 ja 3.2). Kiinalaisia, maapähkinää (Arachis

hypogaea) nystyröiviä Spr-kantoja (17 kpl) valittiin kahden tutkimuksen perusteella, joissa

Bradyrhizobium sp. –kantoja oli tyypitetty 16S rDNA:n ja AFLP:n mukaan (Zhang ym. 1999, Chen

ym 2003). Kannat kuuluivat myös Helsingin yliopiston HAMBI-kantakokoelmaan. Vertailun vuoksi

tutkimukseen otettiin mukaan israelilaisen ja zimbabwelaisen kantakokoelman bradyritsobeja (5

kantaa). Pueraria- (17 kantaa) ja Lespedeza-sukujen (4 kantaa) palkokasveista eristetyt kannat

olivat peräisin kiinalaisesta CCBAU-kantakokoelmasta (Culture Collection of Beijing Agricultural

University, Peking). Tutkimuksessa mukana oli seuraavien Bradyrhizobium-lajien tyyppikannat: B.

japonicum (USDA6/HAMBI2314), B. elkanii (USDA76/HAMBI2123), B. liaoningense (HAMBI2298),

B. yuanmingense (HAMBI2220) ja B. canariense (BC-C2). Näistä useimmat (4 kpl) nystyröivät

Glycine-suvun palkokasveja, B. canariense (BC-C2) Chamaecytisus-suvun, HAMBI1661 Arachis-

suvun ja HAMBI2128 Vigna-suvun palkokasveja.

32

Kantojen kasvatusKantoja kasvatettiin hiiva-mannitoliliemessä (HUM) ja tryptoni-hiivauuteliemessä (TY) (liite 1)

+28°C:ssa ravistelussa (150 rpm) kannasta riippuen 2-5 päivää. Kantoja säilytettiin HUM-agarilla

(liite 1) huoneenlämmössä työn ajan (kolme kuukautta).

PuhdasviljelmätPakasteputkiin säilöttyjen kantojen puhtaus tarkistettiin, sillä aiemmissa tutkimuksissa oli

osoittautunut, että ”yksi kanta” saattoi sisältää useamman kannan, jotka muodostivat erilaisia

pesäkkeitä. Puhdistusta varten HUM-liemessä kasvaneesta kannasta tehtiin laimennossarja

Tween-puskurissa 10-6 -laimennokseen saakka. Laimennossarjasta pipetoitiin ja pintalevitettiin

HUMP-agarille (HUM + kongopuna) laimennokset 10-7 ja 10-8. Maljoja inkuboitiin +28°C:ssa,

kunnes pesäkkeet alkoivat näyttää selkeiltä. Erinäköisiä yksittäispesäkkeitä poimittiin

jatkotarkistusta varten sektoreihin jaetulle HUMP-agarille ja maljoja inkuboitiin 5 päivää

+28°C:ssa.

Puhdistettujen kantojen säilöminen pakkaseen (-70°C)HUM-liemen bakteerisuspension ollessa sopivan samea (noin 107 pmy yleensä 2-5 d kasvatuksen

jälkeen), siitä pipetoitiin 800 µl pakastusputkiin, joissa oli valmiiksi 200 µl 100% glyserolia (yli 20%

glyseroli). Putket pakastettiin ja säilöttiin -70°C:ssa.

DNA:n eristysDNA-eristys suoritettiin Terefeworkin (Soveltavan kemian ja mikrobiologian laitos, Helsingin

yliopisto) ohjeen mukaan (liite 3). Eristetyn DNA:n määrä ja puhtaus tarkistettiin

geelielektroforeesissa. 5 µl:n DNA-näyte, johon oli lisätty 5 µl 2x Loading Dye -väriainetta

(Promega 6x Loading Dye, laimennettu steriilillä vedellä 1:2) pipetoitiin agaroosigeeliin, ja ajettiin

HoeferSuper Sub -geelielektroforeesilaitteella 100 V:n jännitteellä 1 h ajan. Standardeina käytettiin

lambda-DNA:ta (Promega D150A 488 mg/ml), joka laimennettiin steriilillä vedellä 1:10 ja 1:100.

33

Taulukko 3.1. Tutkimuksessa käytetyt, maapähkinää nystyröivät Bradyrhizobium-kannat sekä eri Bradyrhizobium-lajien tyyppikannat. Kannat elvytettiinkylmäkuivatuista kokoelmakannoista, paitsi tähdellä* merkityt, jotka kasvatettiin pakakkasessa säilytetyistä putkista.HAMBI Muu koodi Laji Alkuperämaa Isäntäkasvi (lajike) ViiteHAMBI2125 Spr7-10 Arachis hypogaea (Tianfu No. 3) Zhang ym. (1999)HAMBI2126 Spr7-9 Arachis hypogaea (Tianfu No. 3) Zhang ym. (1999) Chen ym. (2003)HAMBI2133 Spr3-1 Arachis hypogaea (Tianfu No. 3) Zhang ym. (1999)

Chen ym. (2003)HAMBI2134 Spr2-8 Arachis hypogaea (Tianfu No. 3) Zhang ym. (1999)

Chen ym. (2003)HAMBI2135 Spr2-9 Arachis hypogaea (Tianfu No. 3) Zhang ym. (1999)

Chen ym. (2003)HAMBI2136 Spr3-3 Arachis hypogaea (Tianfu No. 3) Zhang ym. (1999)HAMBI2137 Spr3-4 Arachis hypogaea (Tianfu No. 3) Zhang ym. (1999)

Chen ym. (2003)HAMBI2138 Spr3-5 Arachis hypogaea (Tianfu No. 3) Zhang ym. (1999)HAMBI2140 Spr4-2 Arachis hypogaea (Local) Zhang ym. (1999)HAMBI2142 Spr4-6 Arachis hypogaea (Local) Zhang ym. (1999)HAMBI2143* Spr6-3 Arachis hypogaea (Tianfu No. 3) Zhang ym. (1999)

Chen ym. (2003)HAMBI2145* Spr7-1 Arachis hypogaea (Tianfu No. 3) Zhang ym. (1999)

Chen ym. (2003)HAMBI2146* Spr7-5 Arachis hypogaea (Tianfu No. 3) Zhang ym. (1999)HAMBI2147* Spr7-7 Arachis hypogaea (Tianfu No. 3) Zhang ym. (1999)HAMBI2149 Spr3-2 Arachis hypogaea (Tianfu No. 3) Zhang ym. (1999)

Chen ym. (2003)HAMBI2151 Spr3-6 Arachis hypogaea (Tianfu No. 3) Zhang ym. (1999)HAMBI2152 Spr3-7

B. sp. Kiina, Sichuaninmaakunta

Arachis hypogaea (Tianfu No. 3) Zhang ym. (1999)HAMBI2153 287 A B. sp. Israel Arachis hypogaea Zhang ym. (1999) - 283 A* Arachis hypogaea Zhang ym. (1999)HAMBI2115 LMG14299, MAR253 Arachis hypogaea Zhang ym. (1999),Chen ym. (2003)HAMBI2150 LMG14300, MAR411 Arachis hypogaea Zhang ym. (1999),Chen ym. (2003)HAMBI2116 LMG14303, MAR1445

B. sp. Zimbabwe

Arachis hypogaea Zhang ym. (1999),Chen ym. (2003)TyyppikannatHAMBI2314 ATCC10324, USDA6 B. japonicum Meksiko Glycine hispida (ATCC) Int. J. Syst. Bacteriol., 1982, 32, 136-139HAMBI2298 2281 (Chen ym. 2003) B.

liaoningenseGlycine max Int. J. Syst. Bacteriol,l 45, 706-711

HAMBI2123 LMG6134, USDA76 B. elkanii Glycine max (experimental inoculation) Int. J. Syst. Bacteriol., 1993, 43, 398-399BC-C2* B. canariense

Kiina

Chamaecytisus proliferus Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2005, 55,569-575

HAMBI1661 TAL1000 Bradyrhizobium sp.

NifTAL-kokoelmaHavaji

Arachis hypogaea Int.J.Syst.Bacteriology, 1991, 41, 104-113

HAMBI2128 TAL309, MAR1510 B. sp. Vigna ungiculata Appl. soil ecology 2005, 29(3), 236-251.(HAMBI2237) DE454* (CAAS) B. sp. Kiina Glycine max

34

Taulukko 3.2. Tutkimuksessa käytetyt kiinalaisista luonnon palkokasveista eristetyt Bradyrhizobium-kannat. X-merkityistä kannoista on tehty vain AFLP-analyysi.Kantakokoelman koodi Muu koodi Laji (16SrDNA-sekvenssin

perusteella)Alkuperämaa Isäntäkasvi Viite

HAMBI2220 B071 Bradyrhizobiumyuanmingense

Kiina Lespedeza cuneata Int. J. Syst. Evol. Microb.,2002, 52, 2219-2230,Chen ym. 2003

HAMBI2217 3211 Bradyrhizobium sp. Kiina Lespedeza juncea var. sericea Chen ym. 2003HAMBI2227 3203 Kiina Lespedeza capitata Chen ym. 2003HAMBI2228 3204 Kiina Lespedeza stipulacea Chen ym. 2003CCBAU61104 Bradyrhizobium japonicum Kiina Pueraria lobata (Wlld.) Ohwi Chen 2004CCBAU61105 X Bradyrhizobium sp. Kiina Pueraria lobata (Wlld.) Ohwi Chen 2004CCBAU61106 -”- Kiina Pueraria lobata (Wlld.) Ohwi Chen 2004CCBAU61107 X -”- Kiina Pueraria lobata (Wlld.) Ohwi Chen 2004CCBAU61109/1 X Bradyrhizobium japonicum Kiina Pueraria lobata (Wlld.) Ohwi Chen 2004CCBAU61109/2 X Bradyrhizobium sp. Kiina Pueraria lobata (Wlld.) Ohwi Chen 2004CCBAU61112/1 Bradyrhizobium sp. Kiina Pueraria lobata (Wlld.) Ohwi Chen 2004CCBAU61112/2 X Bradyrhizobium elkanii Kiina Pueraria lobata (Wlld.) Ohwi Chen 2004CCBAU61112/3 Bradyrhizobium sp. Kiina Pueraria lobata (Wlld.) Ohwi Chen 2004CCBAU61113/1 Bradyrhizobium sp. Kiina Pueraria lobata (Wlld.) Ohwi Chen 2004CCBAU61114/1 X Bradyrhizobium Kiina Pueraria lobata (Wlld.) Ohwi Chen 2004CCBAU61114/2 Bradyrhizobium sp. Kiina Pueraria lobata (Wlld.) Ohwi Chen 2004CCBAU61114/3 X Bradyrhizobium sp. Kiina Pueraria lobata (Wlld.) Ohwi Chen 2004CCBAU61114/4 X Bradyrhizobium elkanii Kiina Pueraria lobata (Wlld.) Ohwi Chen 2004CCBAU61116/1 X Bradyrhizobium Kiina Pueraria lobata (Wlld.) Ohwi Chen 2004CCBAU61116/2 Bradyrhizobium elkanii Kiina Pueraria lobata (Wlld.) Ohwi Chen 2004CCBAU61116/3 Bradyrhizobium sp. Kiina Pueraria lobata (Wlld.) Ohwi Chen 2004CCBAU61177 Bradyrhizobium sp. Kiina Acacia kalkoraCCBAU61178 Bradyrhizobium sp. Kiina Acacia kalkoraCCBAU61221 Bradyrhizobium sp. Kiina Phaseolus angularisCCBAU61301/1 Bradyrhizobium elkanii Kiina Aeschynomene indicaCCBAU61301/3 X Bradyrhizobium elkanii Kiina Aeschynomene indicaCCBAU61307/1 Bradyrhizobium elkanii Kiina Indigofera bungeanaCCBAU61307/2 Bradyrhizobium sp. Kiina Indigofera bungeanaCCBAU61307/3 X Bradyrhizobium sp. Kiina Indigofera bungeanaCCBAU61307/4 Bradyrhizobium sp. Kiina Indigofera bungeana

35

3.2 Käytetyt molekyylibiologiset menetelmät

3.2.1 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)AFLP-menetelmän on alun perin kuvannut Vos ym. (1995). Menetelmä perustuu kokonais-DNA:n

restriktointiin tiettyjen sekvenssien kohdalta ja digestoitujen restriktiofragmenttien valikoivaan

monistamiseen selektiivisillä PCR-alukkeilla. Alukkeisiin liitetty fluoresoiva väriaine (esim. HEX tai

FAM) mahdollistaa sen, että ABI-kapillaarielektroforeesilaitteen UV-valo havaitsee eri pituiset DNA-

fragmentit. Laite piirtää jokaiselle bakteerikannalle profiilin eri pituisten fragmenttien määrään

perustuen, minkä jälkeen profiili voidaan käsitellä tietokoneohjelmalla (esimerkiksi BioNumerics)

analysoitavaan muotoon. Ohjelmalla saadaan aikaan lajeille tai kannoille tyypillisiä

sormenjälkikuvioita.

Restriktio-ligaatiossa yhden näytteen 25 µl:n reaktiotilavuus sisälsi 2,5 µl 10x ligaatio-

puskuria (Fermentas), 5 u EcoR1 –restriktioentsyymiä (Promega, USA), 5 u Mse1I(Tru1I) –

restriktioentsyymiä (Fermentas), 10 pmol EcoR1-adapteria (TAG Copenhagen A/S), 20 pmol

Mse1I(Tru1I)-adapteria (TAG Copenhagen A/S), 1 u T-4 DNA-ligaasia (Fermentas) sekä 3 µl

DNA:ta. Tilavuus täydennettiin steriloidulla vedellä. Restriktion ja ligaation annettiin tapahtua

+37°C:ssa yön yli.

AFLP-PCR:ssa yhden näytteen 25 µl reaktiotilavuus sisälsi 2,5 µl 10x DyNAzyme

puskuria (Finnzymes Ltd), 6250 pmol dNTP-sekoitusta, 5 pmol EcoR1+AC+FAM –aluketta (Tag

Copenhagen, Tanska), 10 pmol Mse1I(Tru1I)+GC –aluketta (Tag Copenhagen, Tanska) , 2 u

DyNAzymeII DNA-polymeraasia (Finnzymes Ltd) sekä 2 µl restriktio-ligaatio –reaktiotuotetta.

Tilavuus täydennettiin steriilillä vedellä. PCR-reaktioon käytettiin PTC-200 Programmable Thermal

Controller -laitteen ohjelmaa "Zewdu-BACAFLP" (liite 5). Reaktiotuotteen määrä tarkistettiin

ajamalla sitä 1,5% agaroosigeelissä HoeferSuper Sub –elektroforeesilaitteella (1 h 100 V). Geelin

näytekaivoihin pipetoitiin 5 µl latausväriainetta (Promega, laimennettu 6x perusliuoksesta 1:3

steriilillä vedellä) ja 5 µl PCR-tuotetta. Kokostandardina käytettiin 10 µl laimennettua pGEM:a (liite

4). Geeli kuvattiin UV-valossa Kodak DC Zoom digitaalikameralla ja kuvat käsiteltiin Kodak ID

versio 3.5.0 –ohjelmalla. AFLP-PCR -tuotteita säilytettiin pakasteessa -20°C.

AFLP-PCR -tuotteet puhdistettiin MicroSpin S-400 HR (Amersham Biosciences

Europe, Suomi) -kolonneilla kaupallisen tuotteen ohjeen mukaan. ABI-ajoa varten näytteet

valmistettiin seuraavasti: yhtä näytettä kohti reaktioputkessa oli 12 µl deionisoitua formamidia, 0,5

µl fluoresoivaa kokostandardia GeneScanTM -500 TAMRA TM SizeStandard (AB Applied

Biosystems, UK) ja 3 µl PCR-tuotetta. Ennen ABI-ajoa seos denaturoitiin +98°C:ssa 2 min ja

asetettiin inkuboinnin jälkeen välittömästi jäihin. Näytteet ajettiin ABI PRISM 310 Genetic

36

Analyzer:lla. Injektioajaksi säädettiin 10 s ja näytteen ajoajaksi 60 min. ABI-laite piirsi PCR-

tuotteiden fragmenteista profiilit, jotka siirrettiin BioNumerics-tietokoneohjelmaan.

3.2.3 PCR (Polymerase Chain Reaction)Monistettaviksi geeneiksi valittiin nodC, nifH, glnII ja recA. Symbioosigeeneistä nodC liittyy

nystyränmuodostukseen polymerisoimalla Nod-tekijän kitiinirankaa, ja nifH typensidontaan

tuottamalla nitrogenaasientsyymin toisen komponentin, dinitrogenaasireduktaasin, alayksiköiden

proteiinirunkoja. Bakteerin perusaineenvaihdunnassa vaadittavia ydingeenejä olivat tässä

tutkimuksessa glnII ja recA, joista edellinen tuottaa glutamiinisyntetaasi II –entsyymiä ja

jälkimmäisen tuote, RecA-proteiini, on osa erästä DNA:n korjausentsyymiä. Myös bakteeri-

kromosomissa sijaitseva ITS-alue (Internal Transcribed Spacer), joka sijaitsee ribosomaalisten

16S- ja 23S-geenien välissä, monistettiin. Edellä mainittujen geenien monistuksessa käytetyt

alukkeet on mainittu taulukossa 3.3.

Yhteen PCR-reaktioon, jonka reaktiotilavuus oli 50 µl, lisättiin seuraavia aineita: 5,0 µl

10 x DyNAzyme puskuriliuosta (Finnzymes, Suomi), 25 pmol jokaista aluketta, 4000 pmol

nukleotidiseosta (Finnzymes, Suomi), 1,5 u DyNAzyme II polymeraasia (Finnzymes) sekä 1 µl

DNA-templaattia. Reaktiotilavuus täydennettiin 50 µl:aan steriilillä vedellä. Reaktiot ajettiin PTC-

200 Programmable Thermal Controller PCR-laitteella taulukossa 3.3 esitetyillä geenikohtaisilla

ohjelmilla. Ohjelmat kokonaisuudessaan löytyvät liitteestä 5.

PCR-tuotteiden määrä tarkistettiin, geeli kuvattiin ja kuvat käsiteltiin kuten

kappaleessa 3.2.1 on kerrottu. Mikäli PCR-reaktiossa oli monistunut useampi fragmentti,

oikeankokoinen DNA-fragmentti leikattiin geelistä ja puhdistettiin se kaupallisen MinEluteTM Gel

Extraction Kit:n (Qiagen) ohjeen mukaan.

3.2.4 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)RFLP-analyysia varten PCR –tuotetta pilkottiin kahdella eri restriktioentsyymillä, HaeIII (Promega,

USA) ja MspI (Fermentas). Reaktioputkeen pipetoitiin 5 µl PCR-tuotetta ja 2,7 µl jompaakumpaa

entsyymiä (1,5 u/µl). Jos PCR-tuotetta oli muodostunut reaktiossa vähän, sitä lisättiin 8 tai 10 µl:a

DNA:n määrästä riippuen. Restriktioentsyymiä oli kaikissa reaktiotilavuuksissa noin 4 u. Jos PCR-

reaktiossa oli monistunut usean kokoisia DNA-fragmentteja, geelistä puhdistettujen fragmenttien

RFLP-seokseen lisättiin myös 1 µl entsyymin puskuria: HaeIII:lle Buffer C 10X -puskuria

(Promega), ja MspI:lle Buffer Tango 10X -puskuria (Fermentas). Restriktioseosten annettiin

reagoida yön yli + 37°C:ssa, jotta kaikki DNA olisi restriktoitunut. Geelielektroforeesia varten koko

reaktiotilavuuteen lisättiin 1,5 µl laimentamatonta 6x Load Dye –väriainetta. Kokostandardeina

käytettiin 10 µl laimennettua pGEM-liuosta sekä 5 µl 50 bp DNA ladder liuosta (liite 4).

37

Restriktionäytteet ajettiin 3% agaroosigeelissä 100 V:n jännitteellä huoneenlämmössä noin 2

tuntia. Geelit kuvattiin ja kuvat käsiteltiin kuten PCR-geelit. Kuvat siirrettiin BioNumerics –tietokone-

ohjelmaan.

38

Taulukko 3.3. Tutkimuksessa monistetut geenit, monistetun sekvenssin koko ja monistamisessa käytetyt alukkeet sekä PCR-ohjelmat. Tähdellä on merkitty

alukeparit, joilla halutun geenin monistus onnistui.

Geeni Alukepari Alukkeen sekvenssi Alukkeella monistettavansekvenssin koko

Viite PTC-200Ohjelma

* FGPS 1490-72 5’-TGC GGC TGG ATC CCC TCC TT-3’ITS

*FGPL-132 5’-CCG GGT TTC CCC ATT CGG-3’

1200 bp Andronov ym. 2003 Aneta-APEKKA

(liite 5.)

nodCF

nodCI

nodCF 5’-AYG THG TYG AYG ACG GTT-3’

nodCI 5’-CGY GAC AGC CAN TCK CTA TTG-3’

930 bp Laguerre ym. 2001

*nodCF4

*nodCI

nodCF4 5’-AYG THG TYG AYG ACG GTT C-3’ 900 bp Laguerre ym. 2001

nodC

nodCFu

nodCI

nodCFu 5’-AYG THG TYG AYG ACG GIT C-3’ 900 bp Laguerre ym. 2001

Jyrki-NODD

(liite 5.)

*nifH 40F

*nifH 817R

nifH 40F 5’-GGN ATC GGC AAG TCS ACS AC-3’

nifH 817R 5’-TCR AMC AGC ATG TCC TCS AGC TC-3’

800 bp Vinuesa ym. 2005nifH

nifH-F

nifH-I

nifH-F 5’-TAC GGN AAR GGS GGN ATC GC AA-3’

nifH-I 5’-AGC ATC TCY TCS AGY TCN TCC A-3’

780 bp Laguerre ym. 2001

Aneta-NIF-H

(liite 5.)

recA *recA-41F

*recA-640R

recA-41F 5’-TTC GGC AAG GGM TCG RTS ATG-3’

recA-640R 5’-ACA TSA CRC CGA TCT TCA TGC-3’

800 bp Vinuesa ym. 2005

glnII-12F

glnII-689R

glnII-12F 5’-YAA GCT CGA CTA CAT YTC-3’

glnII-689R 5’-TGC ATG CCS GAG CCG TTC CA-3’

650 bp Vinuesa ym. 2005

Jyrki-CELB

(liite 5.)

glnII

*GSII-1

*GSII-2

GSII-1 5’-AAC CGA GAT CAA GGA ATT CG-3’

GSII-2 5’ATG CCC GAG CCG TTC CAG TC-3’

600 bp Turner ja Young 2000 Aneta-APEKKA1

(liite 5.)

39

3.5 Tulosten käsittely

Dendrogrammien rakentaminen BioNumerics-ohjelmallaRFLP- ja AFLP-geelit analysointiin BioNumerics –ohjelmalla (Applied Maths BVBA/Inc,

Belgia/USA). ABI-ajojen AFLP-profiilit muunnettiin BioNumerics-ohjelman ymmärtämään muotoon,

jolloin diagrammit muunnettiin sormenjälkikuvioiksi. Geelielektroforeesikuvien sormenjälkikuvioiden

fragmentit vahvistettiin ja kuvat rajattiin. Kunkin geenin kahden restriktion (MspI ja HaeIII) kuvat

yhdistettiin yhdeksi sukupuuksi.

Tulosten samankaltaisuusarvot laskettiin Dice-kaavalla, SD, joka on

sormenjälkikuvien yhteisten fragmenttien lukumäärä jaettuna näytteiden fragmenttien lukumäärän

keskiarvolla (kaava 1).

SD(i,j)= Nyht(i,j) (1)

[N(i)+N(j)]/2 , missä

SD(i,j) = rivin i ja sarakkeen j samankaltaisuusarvo matriisissa

Nyht(i,j) = i:lle ja j:lle yhteisten fragmenttien lukumäärä

N(i) = näytteen i fragmenttien lukumäärä

N(j) = näytteen j fragmenttien lukumäärä

Ohjelma vertasi jokaisen kannan kyseistä sormenjälkikuviota kaikkien muiden kantojen saman

analyysin sormenjälkikuvioihin. Samankaltaisuusarvoista muodostui samankaltaisuusmatriisi, jonka

pohjalta ohjelma piirsi UPGMA (Unweighed Pair Group Method with Averages) –menetelmällä

puun. Puut haarautuvat samanlaisuusprosenttien mukaan. Samanlaisuusprosentit näkyvät puun

yläpuolella kuvien vasemmassa ylälaidassa.

MDS (Multi-Dimensional Scaling)Multi-Dimensional Scaling –analyysit esittävät Dice-kertoimeen perustuvan samankaltaisuus-

matriisin kolmiulotteisessa muodossa. Ritsobikantojen muodostamien ryhmien väliset etäisyydet ja

suhteet näkyvät MDS-avaruudessa todenmukaisemmin kuin kaksiulotteisessa UPGMA-puussa.

Tilastolliset testitYhteisfeneettinen korrelaatioluku (cophenetic correlation) kertoo, miten hyvin dendrogrammi kuvaa

samankaltaisuusmatriisia. Jos puun haaran korrelaatioluku on yli 90%, dendrogrammi

havainnollistaa sen sisältämien ryhmien keskinäiset suhteet hyvin. Jos luku on alle 90%, suhteet

40

ovat monimutkaisemmat kuin mitä dendrogrammi voi esittää (Dresler-Nurmi ym. 2000). AFLP- ja

RFLP-analyysin tuloksista koostetuista UPGMA-puista muodostettiin genotyyppiryhmiä pääasiassa

sellaisten puiden haaroista, joiden yhteisfeneettinen korrelaatioarvo ylitti 90%.

Bootstrap-analyysillä pyrittiin testaamaan, kuinka toistettavia tutkimuksen tulokset

olivat. Testillä arvioitiin fylogeneettisessä analyysissä muodostuneiden ryhmien luotettavuutta.

Testissä (jonka tässä tapauksessa teki BioNumerics-ohjelma) n-kokoisen otoksen (esim. kolmen

ryhmän kantojen lukumäärä) bootstrap-arvo laskettiin seuraavasti: Tuotettiin sattumanvaraisia, n-

kokoisia otoksia poimien analyysitulosjakaumasta satunnaisia sormenjälkiä. Näin saaduista

otoksista laskettiin estimaatin arvot. Saatujen estimaattien arvojen keskiarvo lähestyy

analyysitulosmatriisin estimaatin odotusarvoa ja varianssia (Laininen 2001, Felsenstein 1985).

Käytännössä ohjelma teki analyysituloksista 200 kpl bootstrapreplikaatteja, joista bootstrap-arvot

laskettiin. Replikaattien lukumäärä (200 kpl) on Hillisin ja Bullin (1993) ehdottama minimilukumäärä

tilastollisen luotettavuuden kannalta, kun ryhmien toistettavuutta arvioidaan. Jos bootstrap-arvo on

>95%, on ryhmä tilastollisesti toistettava (Felsenstein 1985).

4. Tulokset

4.1 Käsiteltyjen kantojen ominaisuudet

4.1.1 Bradyrhizobium-kantojen kasvuEnnestään HUM-agarilla kasvaneet Bradyrhizobium-kannat kasvoivat HUM- ja TY-ravintoliemissä

nopeammin kuin lyofilisoidut kannat. Suurin osa kannoista kasvoi huomattavasti paremmin HUM-

liemessä kuin TY-liemessä. Lisäksi HUM-liemessä kasvatetuista kannoista DNA:n eristäminen oli

helpompaa, ja eristetty DNA oli puhtaampaa. Kantojen kasvuaika kohtuulliseen sameuteen (noin

107 pmy/ml) kesti liemessä 3-5 päivää, kuten Jordan (1982) on artikkelissaan esittänyt.

HUM-agarilla kasvaneiden kantojen muodostamien pesäkkeiden ulkonäkö ja väri

vaihtelivat hieman. Pesäkkeiden limaisuus (eksopolysakkaridien tuotto), liman väri (samea tai

kirkas) ja bakteerikasvuston väri (valkoinen tai kellertävä) olivat kannoilla erilaisia. Pesäkkeiden

ulkonäkö ei noudattanut taksonomista ryhmäjakoa. Kuukauden huoneenlämmössä inkuboinnin

jälkeen pesäkkeet olivat yleensä sulautuneet yhteen ja bakteerikasvusto saattoi peittää maljan

lähes kokonaan.

Tutkimuslaitoksista lähetettyjen kantojen puhtaus tarkistettiin ennen jatkotutkimuksia,

sillä aiempien tutkimusten yhteydessä oli toisinaan ilmennyt, että ympäristöstä "äskettäin" eristetty

ritsobikanta koostuikin kahdesta tai kolmesta eri ritsobikannasta tai –lajista. Tuolloin eri

41

bakteerikannat olivat tuottaneet erinäköisiä pesäkkeitä. Tässä työssä puhdistetut kannat

osoittautuivat ”puhdasviljelmiksi” (eli ne sisälsivät vain yhden kannan), sillä niiden bakteeri-

pesäkkeet olivat samannäköisiä, kasvoivat yhtä nopeasti ja keräsivät HUMP-agarilla punaista

pigmenttiä samalla tavalla.

4.1.2 Bradyrhizobium-kantojen geenien monistuminenValittujen geenien monistamista varten testatuista alukkeista kaikki eivät toimineet. Taulukossa 4.1

on ilmoitettu geenejä monistaneet alukeparit sekä alukeparien kanssa käytetyt PCR-ohjelmat.

Geenien monistaminen tehtiin kaikkien kantojen kohdalla samalla alukeparilla.

Pienikin ero alukkeen aloituskohdan sekvenssin ja tutkittavan bakteerikannan geenisekvenssin

välillä voi estää alukkeen liittymisen tutkittavaan DNA:han. Seitsemän Bradyrhizobium-kannan

kohdalla molempien symbioosiin osallistuvien geenien (nodC ja nifH) monistaminen epäonnistui.

Symbioosigeenit vaikuttivat vaihtelevan pitkälti isäntäkasvin mukaan, ja monistamisvaikeuksien

perusteella tutkimuksen Bradyrhizobium-kantojen symbioosigeenien voidaan sanoa olevan moni-

muotoisempia kuin ydingeenien. HAMBI2152 ja HAMBI2115:n nodC-geenin kohdalla

monistaminen onnistui toisilla alukkeilla (nodC-F ja nodCI). Nämä sekvenssit eivät olleet

kuitenkaan vertailukelpoisia alkuperäisillä alukkeilla monistettuihin geeneihin, sillä ne monistivat

hieman eri aluetta nodC-geenistä. Tästä syystä kannat on jätetty nodC-RFLP –analyysista pois.

Alukeparilla GSII-1 ja GSII-2 saatiin glnII-geenin PCR-tuotetta kaikista kannoista,

mutta suuri osa tuotteista jouduttiin puhdistamaan, koska DNA:sta monistui kaksi tai kolme

fragmenttia. Kannat HAMBI2150 (LMG14300) ja HAMBI 2128 (LMG14306, TAL309) tuottivat PCR-

reaktiossa muista kannoista poikkeavan, noin 1000 emäsparin kokoisen fragmentin, joita käytettiin

RFLP-analyyseissä.

recA –geenin monistaminen onnistui recA-41F ja recA640R –alukeparin avulla, mutta

fragmentti oli pienempi kuin Vinuesan ym. (2005; 800bp) kokeissa. PCR-tuote sisälsi vain yhden

noin 600 emäsparin kokoisen fragmentin, mutta joillakin kannoilla fragmentti näkyi agaroosi-

geelissä erittäin heikosti. Kantojen CCBAU61221 ja HAMBI2152 recA-geenit eivät monistuneet

lainkaan useista yrityksistä huolimatta. Molempien ydingeenien monistamisen epäonnistuminen

CCBAU61221-kannasta viittaa siihen, että sen ydingeenit poikkeavat huomattavasti muista

analysoiduista Bradyrhizobium-kannoista.

ITS-alueen monistaminen onnistui hyvin FGPL-132 ja FGPS1490-72 –alukeparien

avulla. PCR-tuote sisälsi yhden, yleensä n. 1200 emäsparin kokoisen fragmentin. Kannat

HAMBI1661, CCBAU61307/2 ja CCBAU61307/3 tuottivat hieman suuremman fragmentin (n. 1600

emäsparia).

42

Taulukko 4.1. Geenien monistuksessa toimineet PCR-ohjelmat ja alukkeet

Monistettava geeni PCR-ohjelma Alukepari

ITS Aneta-APEKKA FGPL-132 – FGPS1490-72nodC Jyrki-NODD nodCF4 – nodCInifH Aneta-NIFH nifH 40F – nifH 817RrecA Jyrki-CELB recA-41F – recA-640RglnII Aneta- APEKKA1 GSII-1 – GSII-2

4.2 Bradyrhizobium-kantojen kokonaisgenomin diversiteetti AFLP-

menetelmällä analysoituna

AFLP osoittaa bakteerikantojen erilaisuutta kokonaisgenomin tasolla. AFLP:lla tuotettujen

sormenjälkien avulla voidaan ryhmitellä bakteerikantoja genomin perusteella, joka osoittaa

lajiutumista. Toisaalta AFLP-sormenjälkien avulla voidaan tunnistaa identtiset kannat (kloonit), sillä

tämä menetelmä osoittaa pieniäkin kokonais-DNA:n eroavuuksia, toisin kuin 16S rDNA:han

perustuvat identifiointimenetelmät (RFLP, osittaissekvennointi). Tässä työssä AFLP:n avulla

pyrittiin selvittämään, miten bradyritsobit eroavat toisistaan kokonaisgenomin tasolla, ja miten tämä

ryhmittely suhteutuu erillisten geenien perusteella tapahtuvaan ryhmittymiseen.

Osa Bradyrhizobium-kannoista jätettiin myöhemmistä tutkimuksista pois, koska

niiden AFLP-profiilit osoittautuivat identtisiksi. Toisin sanoen kyseessä oli sama kanta (taulukko

4.2).

Taulukko 4.2. AFLP-profiilien perusteella toisille kannoille identtisiksi osoittautuneet CCBAU-kannat. Kannat

jätettiin pois RFLP-tutkimuksesta.

Kanta Laji (Bradyrhizobium) Identtinen AFLP-profiiliCCBAU61105 B. sp. CCBAU61106CCBAU61107 B. sp. CCBAU 61106CCBAU61109/2 B. sp. CCBAU61109-1CCBAU61112/2 B. elkanii CCBAU61112-1CCBAU61114/1 B. sp.CCBAU61114/3 B. sp.CCBAU61114/4 B. elkanii

CCBAU61114-2 CCBAU61114-2

CCBAU61116/1 B. sp. CCBAU61116/2 ja CCBAU61116/3CCBAU61301/3 B. elkanii CCBAU61301-1CCBAU61307/3 B. sp. CCBAU61307-2

AFLP-dendrogrammissa (kuva 4.1b) yhteisfeneettiset korrelaatioarvot olivat yleensä yli 90%, kun

kantojen samankaltaisuusarvo oli yli 50%. Tämän vuoksi ryhmät muodostettiin yli 50%

samankaltaisuusarvon ylittäviin haaroihin. Yli 70% bootstrap-arvoja oli vain ryhmissä, joiden

samankaltaisuus oli yli 50%.

43

AFLP-analyysin tulosten mukaan Bradyrhizobium-kantojen kokonaisgenomin

diversiteetti oli suuri, mitä osoitti neljä seikkaa: 1) Ryhmiä muodostui paljon (13 kpl). 2) Ryhmien

samankaltaisuusarvo oli alhainen (yli 50%). 3) Ryhmät olivat pieniä, käsittäen 2-7 kantaa. 3)

Dendrogrammin antamat samankaltaisuusarvot kuvasivat huonosti ryhmien suhteita toisiinsa.

Taulukko 4.3 havainnollistaa, että AFLP-tulokset heijastivat Bradyrhizobium-kantojen

kokonaisgenomin mosaiikkimaisuutta: erilaiset geenityypit (geeniryhmät) järjestäytyivät hyvin

vaihtelevasti genomiin, taulukko näyttää lähes palapelin paloista koostetulta.

AFLP-tulosten MDS-analyysi (kuva 4.1a) esittää ryhmien väliset suhteet toisiinsa

selkeämmin kuin UPGMA-puu. Etenkin MDS-kuvassa ilmenee, että maapähkinää nystyröi useita

pieniä bradyritsobiryhmiä, jotka olivat kokonaisgenomiltaan erilaisia, mutta kuitenkin lähes aina

läheisempiä toisilleen kuin kudzun nystyräbakteereille. Kudzua nystyröivistä kannoista erosi kolme

hyvin erityyppistä ryhmää: ryhmä 8 (B. elkanii –kantoja), ryhmä 13 (B. elkanii –kantoja) ja ryhmä 11

(B. japonicum kantoja).

Kuva 4.1a AFLP-analyysin tuloksista Dice-kaavalla lasketut kantojen väliset etäisyydet esitettynä MDS-analyysin avulla. Kuva

vasemmalla esittää itsenäisten kantojen väliset suhteet, ja kuva oikealla dendrogrammin kolmiulotteisena. Ryhmien värit vastaavat

taulukon 4.3 värejä: Punasävyiset kannat nystyröivät kudzua, vihreäsävyiset kannat maapähkinää ja keltaiset kannat Lespedeza-lajeja.

Etenkin oikeanpuoleinen kuva näyttää selkeästi, kuinka kudzua nystyröivät B. elkanii –kannat (punaisen sävyt) eroavat B. japonicum –

kannoista (vaaleanpunaiset).

Seuraavalla sivulla: Kuva 4.1b. Bradyrhizobium-kantojen kokonaisgenomin diversiteetti AFLP-menetelmällä analysoituna. Diversiteetti

on suuri, mitä osoittavat kannoista muodostuneet useat, pienet ryhmät, joiden suhteet toisiinsa ovat epäselvät. UPGMA-dendrogrammi

perustuu Dice-kaavalla analyysituloksista laskettuun samankaltaisuusmatriisiin. Ryhmät on muodostettu hyvän yhteisfeneettisen

korrelaation (yli 90%) perusteella yli 50% samankaltaisuusarvoilla. Korrelaatioarvot näkyvät dendrogrammin haarassa, yli 70%

bootstrap-arvot on merkattu B:llä.

44

AFLPbradyrhizobium AFLP

100

9080706050403020

10085

68

10071, B=70

100, B=100

98

96

100, B=72

96

88

100

85

100, B=77

85

100, B=92

100

10078

83, B=97

93

100, B=97

95

79

100

78

100, B=9999

98

100, B=81

88, B=97

97

83

83

100

100

93

82

100, B=8995

100, B=8396

97

98, B=87

94

97

96

79

100, B=80

79

10098

80

100100

93

79

80

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

sp.

sp.

sp.

canariense

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

elkanii

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

liaoningense

sp.

sp.

sp.

sp.

elkanii

sp.

sp.

elkanii

elkanii

sp.

sp.

sp.

sp.

elkaniisp.

sp.

sp.

japonicum

sp.

sp.

japonicum

sp.

sp.

japonicum

yuanmingense

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

elkanii

elkanii

sp.

sp.

sp.

HAMBI2116/LMG14303

HAMBI2217

HAMBI2227

BC-C2

HAMBI2146

HAMBI2147

HAMBI2145

HAMBI2126

HAMBI2125

HAMBI2228

HAMBI2135

HAMBI2143

HAMBI2134

HAMBI2142

HAMBI2140

CCBAU61178

HAMBI2123/USDA 76

HAMBI2151

HAMBI2133

HAMBI2137

HAMBI2138

HAMBI2149

HAMBI2136

HAMBI2298

DE454

HAMBI1250/LMG14300

HAMBI2128/LMG14306

CCBAU61112-1

CCBAU61112-2

CCBAU61113-1

CCBAU61112-3

CCBAU61301-1

CCBAU61301-3

CCBAU61116-1

HAMBI1661/TAL1000

CCBAU61114-1

CCBAU61114-3

CCBAU61307-1CCBAU61307-4

283A

HAMBI2153

HAMBI2314/USDA6

CCBAU61106

CCBAU61107

CCBAU61109-1

CCBAU61105

CCBAU61109-2

CCBAU61104

HAMBI2220

CCBAU61307-2

CCBAU61307-3

HAMBI2152

CCBAU61221

CCBAU61177

CCBAU61114-4

CCBAU61116-2

CCBAU61116-3

CCBAU61114-2

LMG 14299

Arachis

Lespedeza

Lespedeza

Chamaecytisus

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Lespedeza

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Acacia

Glycine

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Glycine

Glycine

Arachis

Arachis

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Aeschynomene

Aeschynomene

Pueraria

Arachis

Pueraria

Pueraria

IndigoferaIndigofera

Arachis

Arachis

Glycine

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Lespedeza

Indigofera

Indigofera

Arachis

Phaseolus

Acacia

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Arachis

Zimbabwe

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

Zimbabwe

Zimbabwe

China

China

China

China

China

China

China

Hawai

China

China

ChinaChina

Israel

Israel

Mexico

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

Zimbabwe

.

13

11

12

9

10

7

8

6

5

4

3

2

1


100

9080706050403020

10085

68

10071, B=70

100, B=100

98

96

100, B=72

96

88

100

85

100, B=77

85

100, B=92

100

10078

83, B=97

93

100, B=97

95

79

100

78

100, B=9999

98

100, B=81

88, B=97

97

83

83

100

100

93

82

100, B=8995

100, B=8396

97

98, B=87

94

97

96

79

100, B=80

79

10098

80

100100

93

79

80

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

sp.

sp.

sp.

canariense

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

elkanii

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

liaoningense

sp.

sp.

sp.

sp.

elkanii

sp.

sp.

elkanii

elkanii

sp.

sp.

sp.

sp.

elkaniisp.

sp.

sp.

japonicum

sp.

sp.

japonicum

sp.

sp.

japonicum

yuanmingense

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

elkanii

elkanii

sp.

sp.

sp.

HAMBI2116/LMG14303

HAMBI2217

HAMBI2227

BC-C2

HAMBI2146

HAMBI2147

HAMBI2145

HAMBI2126

HAMBI2125

HAMBI2228

HAMBI2135

HAMBI2143

HAMBI2134

HAMBI2142

HAMBI2140

CCBAU61178

HAMBI2123/USDA 76

HAMBI2151

HAMBI2133

HAMBI2137

HAMBI2138

HAMBI2149

HAMBI2136

HAMBI2298

DE454

HAMBI1250/LMG14300

HAMBI2128/LMG14306

CCBAU61112-1

CCBAU61112-2

CCBAU61113-1

CCBAU61112-3

CCBAU61301-1

CCBAU61301-3

CCBAU61116-1

HAMBI1661/TAL1000

CCBAU61114-1

CCBAU61114-3


283A

HAMBI2153

HAMBI2314/USDA6

CCBAU61106

CCBAU61107

CCBAU61109-1

CCBAU61105

CCBAU61109-2

CCBAU61104

HAMBI2220

CCBAU61307-2

CCBAU61307-3

HAMBI2152

CCBAU61221

CCBAU61177

CCBAU61114-4

CCBAU61116-2

CCBAU61116-3

CCBAU61114-2

LMG 14299

Arachis

Lespedeza

Lespedeza

Chamaecytisus

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Lespedeza

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Acacia

Glycine

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Glycine

Glycine

Arachis

Arachis

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Aeschynomene

Aeschynomene

Pueraria

Arachis

Pueraria

Pueraria


Arachis

Arachis

Glycine

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Lespedeza

Indigofera

Indigofera

Arachis

Phaseolus

Acacia

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Arachis

Zimbabwe

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

Zimbabwe

Zimbabwe

China

China

China

China

China

China

China

Hawai

China

China

ChinaChina

Israel

Israel

Mexico

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

Zimbabwe

.


100

9080706050403020

10085

68

10071, B=70

100, B=100

98

96

100, B=72

96

88

100

85

100, B=77

85

100, B=92

100

10078

83, B=97

93

100, B=97

95

79

100

78

100, B=9999

98

100, B=81

88, B=97

97

83

83

100

100

93

82

100, B=8995

100, B=8396

97

98, B=87

94

97

96

79

100, B=80

79

10098

80

100100

93

79

80

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.


100

9080706050403020

10085

68

10071, B=70

100, B=100

98

96

100, B=72

96

88

100

85

100, B=77

85

100, B=92

100

10078

83, B=97

93

100, B=97

95

79

100

78

100, B=9999

98

100, B=81

88, B=97

97

83

83

100

100

93

82

100, B=8995

100, B=8396

97

98, B=87

94

97

96

79

100, B=80

79

10098

80

100100

93

79

80

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

sp.

sp.

sp.

canariense

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

elkanii

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

liaoningense

sp.

sp.

sp.

sp.

elkanii

sp.

sp.

elkanii

elkanii

sp.

sp.

sp.

sp.

elkaniisp.

sp.

sp.

japonicum

sp.

sp.

japonicum

sp.

sp.

japonicum

yuanmingense

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

elkanii

elkanii

sp.

sp.

sp.

HAMBI2116/LMG14303

HAMBI2217

HAMBI2227

BC-C2

HAMBI2146

HAMBI2147

HAMBI2145

HAMBI2126

HAMBI2125

HAMBI2228

HAMBI2135

HAMBI2143

HAMBI2134

HAMBI2142

HAMBI2140

CCBAU61178

HAMBI2123/USDA 76

HAMBI2151

HAMBI2133

HAMBI2137

HAMBI2138

HAMBI2149

HAMBI2136

HAMBI2298

DE454

HAMBI1250/LMG14300

HAMBI2128/LMG14306

CCBAU61112-1

CCBAU61112-2

CCBAU61113-1

CCBAU61112-3

CCBAU61301-1

CCBAU61301-3

CCBAU61116-1

HAMBI1661/TAL1000

CCBAU61114-1

CCBAU61114-3


283A

HAMBI2153

HAMBI2314/USDA6

CCBAU61106

CCBAU61107

CCBAU61109-1

CCBAU61105

CCBAU61109-2

CCBAU61104

HAMBI2220

CCBAU61307-2

CCBAU61307-3

HAMBI2152

CCBAU61221

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

sp.

sp.

sp.

canariense

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

elkanii

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

liaoningense

sp.

sp.

sp.

sp.

elkanii

sp.

sp.

elkanii

elkanii

sp.

sp.

sp.

sp.

elkaniisp.

sp.

sp.

japonicum

sp.

sp.

japonicum

sp.

sp.

japonicum

yuanmingense

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

elkanii

elkanii

sp.

sp.

sp.

HAMBI2116/LMG14303

HAMBI2217

HAMBI2227

BC-C2

HAMBI2146

HAMBI2147

HAMBI2145

HAMBI2126

HAMBI2125

HAMBI2228

HAMBI2135

HAMBI2143

HAMBI2134

HAMBI2142

HAMBI2140

CCBAU61178

HAMBI2123/USDA 76

HAMBI2151

HAMBI2133

HAMBI2137

HAMBI2138

HAMBI2149

HAMBI2136

HAMBI2298

DE454

HAMBI1250/LMG14300

HAMBI2128/LMG14306

CCBAU61112-1

CCBAU61112-2

CCBAU61113-1

CCBAU61112-3

CCBAU61301-1

CCBAU61301-3

CCBAU61116-1

HAMBI1661/TAL1000

CCBAU61114-1

CCBAU61114-3


283A

HAMBI2153

HAMBI2314/USDA6

CCBAU61106

CCBAU61107

CCBAU61109-1

CCBAU61105

CCBAU61109-2

CCBAU61104

HAMBI2220

CCBAU61307-2

CCBAU61307-3

HAMBI2152

CCBAU61221

CCBAU61177

CCBAU61114-4

CCBAU61116-2

CCBAU61116-3

CCBAU61114-2

LMG 14299

Arachis

Lespedeza

Lespedeza

Chamaecytisus

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Lespedeza

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Acacia

Glycine

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Glycine

Glycine

Arachis

Arachis

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Aeschynomene

Aeschynomene

Pueraria

Arachis

Pueraria

Pueraria


Arachis

Arachis

Glycine

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Lespedeza

Indigofera

Indigofera

Arachis

Phaseolus

Acacia

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Arachis

Zimbabwe

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

Zimbabwe

Zimbabwe

China

China

China

China

China

China

China

Hawai

China

China

ChinaChina

Israel

Israel

Mexico

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

Zimbabwe

.

13

11

12

9

10

7

8

6

5

4

3

2

1

45

4.3 Yksittäisten geenien suhde toisiinsa ja kokonaisgenomiin

analysoituina RFLP-sormenjälkien avulla

RFLP perustuu restriktioentsyymien kykyyn katkaista kaksijuosteinen DNA tietyn sekvenssin

kohdalta. Katkaisukohdan sijoittuminen DNA-fragmentin eri kohtaan saa aikaan erikokoisten DNA-

fragmenttien syntymisen. Kun restriktoidut DNA-fragmentit ajetaan agaroosigeelissä, muodostuu

sormenjälkikuvioita, jotka voivat olla tutkittavasta fragmentista riippuen suku-, laji- tai

kantaspesifisiä.

Verrattuna 16S rDNA-geeniin ITS on kohtalaisen nopeasti muuntuva alue. Sen on

esitetty erittelevän kantoja ”lajeittain tai alalajeittain”. Ydingeenien (recA, glnII) RFLP-analyyseillä

pyrin mm. selvittämään, korreloivatko ydingeenit Bradyrhizobium-lajin identifioinnin mukaan

(identifiointi on yleensä perustunut 16S rDNA -geenin osittais- tai kokonaissekvennointiin) tai

lajiutumista indikoivaan ITS-RFLP –analyysiin. Symbioosigeenien RFLP-analyysin avulla pyrin

mm. selvittämään, ryhmittävätkö ne Bradyrhizobium-kannat isäntäkasvin mukaan, ja minkälainen

on symbioosigeenien diversiteetti. Pyrin myös saamaan selvää lateraalisen geeninsiirron

vaikutuksesta kiinalaisten kantojen genomiin, koska bradyritsobien kromosomistossa sijaitsevien

symbioosigeenien tiedetään voivan siirtyä ns. symbioosisaarekkeina bakteerista toiseen (Sullivan

ja Ronson 1998).

Tutkimuksessa analysoitujen Bradyrhizobium-kantojen ryhmittymiset eri geenien

mukaan näkyvät dendrogrammeissa 4.2b-4.6b, kantojen sekä kantaryhmien väliset suhteet MDS-

analyyseissa 4.2a-4.6a, sekä genotyyppiryhmät kannoittain taulukossa 4.3.

46

Taulukko 4.3. Bradyrhizobium-kantojen AFLP- ja RFLP-analyyseissä muodostuneet Bradyrhizobium-

kantojen genotyyppiryhmät. Ryhmät muodostettiin UPGMA-dendrogrammien mukaan, kun yhteisfeneettisen

korrelaation arvo oli yli 90% (kuvat 4.2-4.6). u = ryhmien ulkopuolella, p = PCR-tuote puuttuu, x = kannasta

analysoitu vain AFLP ja ITS.Kanta Laji Isäntäkasvi Alkuperäm

aaAFLP ITS recA glnII nifH nodC

CCBAU61112/2 B. elkanii P. lobata (Wlld.) Ohwi Kiina 8 1 x x x xCCBAU61114/1 B. sp. P. lobata (Wlld.) Ohwi Kiina u 1 x x x xCCBAU61301/3 B. elkanii A. indica Kiina 8 1 x x x xCCBAU61112/1 B. sp. P. lobata (Wlld.) Ohwi Kiina 8 1 1 8 4 1CCBAU61112/3 B. sp. P. lobata (Wlld.) Ohwi Kiina 8 1 1 8 4 1CCBAU61113/1 B. sp. P. lobata (Wlld.) Ohwi Kiina 8 3 1 8 4 1CCBAU61116/2 B. elkanii P. lobata (Wlld.) Ohwi Kiina 13 1 9 7 4 1CCBAU61116/3 B. sp. P. lobata (Wlld.) Ohwi Kiina u 1 9 7 4 1CCBAU61114/2 B. sp. P. lobata (Wlld.) Ohwi Kiina u 2 9 7 4 1CCBAU61301/1 B. elkanii A. indica Kiina 8 1 8 7 4 1CCBAU61307/1 B. elkanii I. bungeana Kiina 9 1 8 1 4 4CCBAU61307/4 B. sp. I. bungeana Kiina 9 2 8 1 4 4CCBAU61116/1 B. sp. P. lobata (Wlld.) Ohwi Kiina u 2 x x x xH2125/Spr7-10 B. sp. A.hypogaea (Tianfu 3) Kiina 2 3 5 1 3 4CCBAU61114/4 B. elkanii P. lobata (Wlld.) Ohwi Kiina 13 3 x x x xH2217 (3211) B. sp. L. juncea var. Sericea Kiina 1 4 u 2 u pH2227 (3203) B. sp. L. capitata Kiina 1 4 4 2 u pH2228 (3204) B. sp. L. stipulacea Kiina 2 4 8 3 u uCCBAU61177 B. sp. A. kalkora Kiina u 5 9 u 4 pCCBAU61221 B. sp. P. angularis Kiina u 5 p u u uH2133/Spr3-1 B. sp. A.hypogaea (Tianfu 3) Kiina 6 6 5 u 2 4H2136/Spr3-3 B. sp. A.hypogaea (Tianfu

No. 3)Kiina,Sichuan

6 6 7 6 2 2

H2137/Spr3-4 B. sp. A.hypogaea (Tianfu 3) Kiina 6 6 7 3 2 2H2143/Spr6-3 B. sp. A.hypogaea (Tianfu 3) Kiina 3 7 3 5 p pH2145/Spr7-1 B. sp. A.hypogaea (Tianfu 3) Kiina 2 7 4 12 3 4H2146/Spr7-5 B. sp. A.hypogaea (Tianfu 3) Kiina 2 7 4 12 3 4H2147/Spr7-7 B. sp. A.hypogaea (Tianfu 3) Kiina 2 7 4 12 3 4H2126/Spr7-9 B. sp. A.hypogaea (Tianfu 3) Kiina 2 7 5 1 3 4H2149/Spr3-2 B. sp. A.hypogaea (Tianfu 3) Kiina 6 7 7 11 2 2H2151/Spr3-6 B. sp. A.hypogaea (Tianfu 3) Kiina 6 7 7 10 2 2H2142/Spr4-6 B. sp. A. hypogaea Local) Kiina 4 8 3 u 1 4H2134/Spr2-8 B. sp. A.hypogaea (Tianfu 3) Kiina 4 8 7 3 1 4H2135/Spr2-9 B. sp. A.hypogaea (Tianfu 3) Kiina 3 8 7 3 u 4CCBAU61104 B. japonicum P. lobata (Wlld.) Ohwi Kiina 11 9 2 9 u 3CCBAU61106 B. sp. P. lobata (Wlld.) Ohwi Kiina 11 9 2 9 u 3CCBAU61109/1 B. japonicum P. lobata (Wlld.) Ohwi Kiina 11 9 2 10 u 3CCBAU61105 B. sp. P. lobata (Wlld.) Ohwi Kiina 11 9 x x x xCCBAU61107 B. sp. P. lobata (Wlld.) Ohwi Kiina 11 9 x x x xCCBAU61109/2 B. sp. P. lobata (Wlld.) Ohwi Kiina 11 9 x x x xCCBAU61178 B. sp. A. kalkora Kiina 5 10 u p 1 pH2220 (B071) B.

yuanmingenseL. cuneata Kiina u 10 u 11 u p

H2153 /287 A B. sp. A. hypogaea Israel 10 11 6 5 1 1283 A B. sp. A. hypogaea Israel 10 11 6 4 1 4H2150/LMG14300 B. sp. A. hypogaea Zimbabwe u 11 11 13 u 3H2116/LMG14303 B. sp. A. hypogaea Zimbabwe 1 11 u 4 p pH2314/USDA6 B. japonicum G. hispida (ATCC) Meksiko u 12 2 3 u 2H2128/LMG14306 B. sp. Vigna ungiculata u 12 11 13 2 2H2115/LMG14299 B. sp. A. hypogaea Zimbabwe u u 2 4 u pH2138/Spr3-5 B. sp. A.hypogaea (Tianfu 3) Kiina 6 u 7 6 2 2CCBAU61307/2 B. sp. I. bungeana Kiina 12 u 8 u p pH2123/USDA76 B. elkanii G. max? 6 u 10 6 2 2DE454* (CAAS) B. sp. G. max Kiina 7 u 10 6 p pH2298/2281 B.

liaoningenseG. max Kiina 7 u 10 6 u p

H2152/Spr3-7 B. sp. A.hypogaea (Tianfu 3) Kiina u u p 2 u pBC-C2* B. canariense C. proliferus u u u 4 u pH1661/TAL1000 B. sp. Arachis hypogaea nifTAL u u u u p pH2140/Spr4-2 B. sp. A. hypogaea (Local) Kiina 5 u u u p pCCBAU61114/3 B. sp. P. lobata (Wlld.) Ohwi Kiina u u x x x xCCBAU61307/3 B. sp. I. bungeana Kiina 12 u x x x x

47

4.3.1 ITSTutkittujen Bradyrhizobium-kantojen ITS-alueen diversiteetti oli suuri. ITS-alue korreloi pitkälti

kannan isäntäkasvin ja maantieteellisen alkuperän mukaan. ITS-dendrogrammissa määritettiin

ryhmät yli 70% samankaltaisuusarvolla, sillä alempien samankaltaisuuksien kohdalla

yhteisfeneettisen korrelaation arvot olivat <90% (kuva 4.2b). Ryhmät 6, 7, 8 ja 9 muodostettiin,

vaikka niiden korrelaatioarvot olivat alhaiset. Yli 70% bootstrap-arvot tukivat vain 100%

samankaltaisia ryhmiä sekä muutamaa kahden kannan ryhmää (ryhmät 5 ja 10).

Bradyrhizobium-kantojen ITS-alueen laajaa diversiteettiä kuvaa kolme seikkaa: 1)

Ryhmiä muodostui runsaasti (12 kappaletta). 2) Ryhmät olivat pääasiassa pieniä, käsittäen 2-9

kantaa. 3) Ryhmien sisäiset samankaltaisuusarvot olivat korkeat, mutta niiden väliset suhteet olivat

epäselvät. MDS-analyysi (kuva 4.3.1a) havainnollistaa kuinka kaukaisia sukulaisia kudzua

nystyröivät B. japonicum -kannat (vaaleanpunaiset) ja B. elkanii -kannat (punasävyiset ja oranssit)

ovat, sekä miten kiinalaiset maapähkinää nystyröivät kannat sijoittuvat niiden välimaastoon. ITS-

alueen perusteella Lespedeza-sukua nystyröivät kannat olivat läheisiä kudzua nystyröiville

kannoille. Tyyppikannat olivat hyvin hajanainen joukko. UPGMA-puussa ne erosivat muista

bradyritsobikannoista jo 30% samankaltaisuudella.

Kuva 4.2a. ITS-alueen RFLP:n tuloksista Dice-kaavalla lasketut kantojen etäisyydet esitettynä MDS-analyysin avulla. Ryhmien värit

noudattavat taulukon 4.3 värejä: Punaisen sävyiset ovat kudzua nystyröiviä B. elkanii –kantoja, vaaleanpunainen B. japonicum, vihreän

sävyt esittävät maapähkinää nystyröiviä kantoja ja keltaiset Lespedezaa nystyröiviä kantoja. Kuva havainnollistaa tehokkaasti, että

kiinalaista maapähkinää nystyröivät kannat jäävät kudzua nystyröivien kantojen väliin, ja että tyyppikannat ovat kaukaisia sekä toisilleen

että kiinalaisille kannoille. Oikeanpuoleisessa kuvassa dendrogrammi havainnollistaa kantojen suhteet toisiinsa puussa, ja kuvan

kiertyneisyys tuo parhaiten esiin tyyppikantojen hajanaisuuden analyysituloksissa.

Seuraava sivu: Kuva 4.2b. Bradyritsobien ITS-RFLP-analyyseista rakennettu UPGMA-puu. Puu perustuu Dice-kertoimella laskettuun

analyysitulosten samankaltaisuusmatriisiin. Puun haaroissa näkyvät yhteisfeneettisen korrelaation arvot sekä 70% ylittävät bootstrap-

arvot (B). Ryhmien sisäinen suuri samankaltaisuus (70%) osoittaa kantojen läheisyyttä, ja ryhmien väliset epäselvät suhteet yleisesti

suurta diversiteettiä.

48

ITSMspI+ITSHaeIIIITS-RFLP-Iiris

100

908070605040302010100

100, B=70

100, B=1000

0

00

100

96

96

100

100

100

65

100, B=82100

76

87

100, B=78

88

89

90

91

10050

100, B=70100

82

82

100

100, B=850

100

83

83

74

10050

74

81

100, B=83

100, B=88

100

100, B=89

84

84

100, B=7694

83

84

88

89

100

100, B=870

92

100, B=89

87, B=70

90

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

sp.

sp.

sp.

sp.

elkanii

elkanii

elkanii

sp.

elkanii

sp.

elkanii

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

elkanii

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.sp.

liaoningense

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.sp.

canariense

sp.sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.sp.

sp.

japonicum

sp.

japonicum

sp.

sp.sp.

yanmingense

sp.

sp.

elkanii

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

japonicum

sp.

HAMBI1661/TAL1000

CCBAU61307-2

CCBAU61112-1

CCBAU61114-1

CCBAU61301-1

CCBAU61301-3

CCBAU61307-1

CCBAU61112-3

CCBAU61116-2

CCBAU61116-3

CCBAU61112-2

CCBAU61114-3

CCBAU61114-2

CCBAU61116-1

CCBAU61307-4

CCBAU61113-1

CCBAU61114-4

HAMBI2217

HAMBI2228

HAMBI2227

CCBAU61177

CCBAU61221

HAMBI2152HAMBI2140

HAMBI2298

HAMBI2138

DE454

HAMBI2136

HAMBI2137

HAMBI2126HAMBI2133

BC-C2

HAMBI2151HAMBI2149

HAMBI2143

HAMBI2145

HAMBI2147

HAMBI2146

HAMBI2125

HAMBI2134HAMBI2142

HAMBI2135

CCBAU61109-1

CCBAU61109-2

CCBAU61104

CCBAU61107

CCBAU61105CCBAU61106

HAMBI2220

CCBAU61178

HAMBI2115/LMG14299

HAMBI2123/USDA 76

CCBAU61307-3

HAMBI2153

HAMBI2116/LMG14303

283A

LMG14300

HAMBI2150/LMG14300

HAMBI2314/USDA 6

HAMBI2128/LMG14306

Arachis

Indigofera

Pueraria

Pueraria

Aeschynomene

Aeschynomene

Indigofera

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Indigofera

Pueraria

Pueraria

Lespedeza

Lespedeza

Lespedeza

Acacia

Phaseolus

ArachisArachis

Glycine

Arachis

Glycine

Arachis

Arachis

ArachisArachis

Chamaecytisus

ArachisArachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

ArachisArachis

Arachis

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

PuerariaPueraria

Lespedeza

Acacia

Arachis

Glycine

Indigofera

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Glycine

Arachis

Hawaii

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

ChinaChina

China

China

China

China

China

ChinaChina

ChinaChina

China

China

China

China

China

ChinaChina

China

China

China

China

China

ChinaChina

China

China

Zimbabwe

China

Israel

Zimbabwe

Israel

Zimbabwe

Zimbabwe

Mexico

Zimbabwe

.

.

.

1

2

3

4

5

7

6

8

9

10

11

12

B=86

B=100


100

908070605040302010100

100, B=70

100, B=1000

0

00

100

96

96

100

100

100

65

100, B=82100

76

87

100, B=78

88

89

90

91

10050

100, B=70100

82

82

100

100, B=850

100

83

83

74

10050

74

81

100, B=83

100, B=88

100

100, B=89

84

84

100, B=7694

83

84

88

89

100

100, B=870

92

100, B=89

87, B=70

90

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

sp.

sp.

sp.

sp.

elkanii

elkanii

elkanii

sp.

elkanii

sp.

elkanii

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

elkanii

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.sp.

liaoningense

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.sp.

canariense

sp.sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.sp.

sp.

japonicum

sp.

japonicum

sp.

sp.sp.

yanmingense

sp.

sp.

elkanii

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

japonicum

sp.

HAMBI1661/TAL1000

CCBAU61307-2

CCBAU61112-1

CCBAU61114-1

CCBAU61301-1

CCBAU61301-3

CCBAU61307-1

CCBAU61112-3

CCBAU61116-2

CCBAU61116-3

CCBAU61112-2

CCBAU61114-3

CCBAU61114-2

CCBAU61116-1

CCBAU61307-4

CCBAU61113-1

CCBAU61114-4

HAMBI2217

HAMBI2228

HAMBI2227

CCBAU61177

CCBAU61221

HAMBI2152HAMBI2140

HAMBI2298

HAMBI2138

DE454

HAMBI2136

HAMBI2137

HAMBI2126HAMBI2133

BC-C2

HAMBI2151HAMBI2149

HAMBI2143

HAMBI2145

HAMBI2147

HAMBI2146

HAMBI2125

HAMBI2134HAMBI2142

HAMBI2135

CCBAU61109-1

CCBAU61109-2

CCBAU61104

CCBAU61107


HAMBI2220

CCBAU61178

HAMBI2115/LMG14299

HAMBI2123/USDA 76

CCBAU61307-3

HAMBI2153

HAMBI2116/LMG14303

283A

LMG14300

HAMBI2150/LMG14300

HAMBI2314/USDA 6

HAMBI2128/LMG14306

Arachis

Indigofera

Pueraria

Pueraria

Aeschynomene

Aeschynomene

Indigofera

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Indigofera

Pueraria

Pueraria

Lespedeza

Lespedeza

Lespedeza

Acacia

Phaseolus

ArachisArachis

Glycine

Arachis

Glycine

Arachis

Arachis

ArachisArachis

Chamaecytisus

ArachisArachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

ArachisArachis

Arachis

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

PuerariaPueraria

Lespedeza

Acacia

Arachis

Glycine

Indigofera

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Glycine

Arachis

Hawaii

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

ChinaChina

China

China

China

China

China

ChinaChina

ChinaChina

China

China

China

China

China

ChinaChina

China

China

China

China

China

ChinaChina

China

China

Zimbabwe

China

Israel

Zimbabwe

Israel

Zimbabwe

Zimbabwe

Mexico

Zimbabwe

.

.

.


100

908070605040302010100

100, B=70

100, B=1000

0

00

100

96

96

100

100

100

65

100, B=82100

76

87

100, B=78

88

89

90

91

10050

100, B=70100

82

82

100

100, B=850

100

83

83

74

10050

74

81

100, B=83

100, B=88

100

100, B=89


100

908070605040302010100

100, B=70

100, B=1000

0

00

100

96

96

100

100

100

65

100, B=82100

76

87

100, B=78

88

89

90

91

10050

100, B=70100

82

82

100

100, B=850

100

83

83

74

10050

74

81

100, B=83

100, B=88

100

100, B=89

84

84

100, B=7694

83

84

88

89

100

100, B=870

92

100, B=89

87, B=70

90

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

sp.

sp.

sp.

sp.

elkanii

elkanii

elkanii

sp.

elkanii

sp.

elkanii

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

elkanii

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.sp.

liaoningense

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.sp.

canariense

sp.sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.sp.

sp.

japonicum

sp.

japonicum

sp.

sp.sp.

yanmingense

sp.

84

84

100, B=7694

83

84

88

89

100

100, B=870

92

100, B=89

87, B=70

90

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

sp.

sp.

sp.

sp.

elkanii

elkanii

elkanii

sp.

elkanii

sp.

elkanii

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

elkanii

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.sp.

liaoningense

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.sp.

canariense

sp.sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.sp.

sp.

japonicum

sp.

japonicum

sp.

sp.sp.

yanmingense

sp.

sp.

elkanii

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

japonicum

sp.

HAMBI1661/TAL1000

CCBAU61307-2

CCBAU61112-1

CCBAU61114-1

CCBAU61301-1

CCBAU61301-3

CCBAU61307-1

CCBAU61112-3

CCBAU61116-2

CCBAU61116-3

CCBAU61112-2

CCBAU61114-3

CCBAU61114-2

CCBAU61116-1

CCBAU61307-4

CCBAU61113-1

CCBAU61114-4

HAMBI2217

HAMBI2228

HAMBI2227

CCBAU61177

CCBAU61221

HAMBI2152HAMBI2140

HAMBI2298

HAMBI2138

DE454

HAMBI2136

HAMBI2137

HAMBI2126HAMBI2133

BC-C2

HAMBI2151HAMBI2149

HAMBI2143

HAMBI2145

HAMBI2147

HAMBI2146

HAMBI2125

HAMBI2134HAMBI2142

HAMBI2135

CCBAU61109-1

CCBAU61109-2

CCBAU61104

CCBAU61107


HAMBI2220

CCBAU61178

HAMBI2115/LMG14299

HAMBI2123/USDA 76

CCBAU61307-3

HAMBI2153

HAMBI2116/LMG14303

283A

LMG14300

HAMBI2150/LMG14300

HAMBI2314/USDA 6

HAMBI2128/LMG14306

Arachis

Indigofera

Pueraria

Pueraria

Aeschynomene

Aeschynomene

Indigofera

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Indigofera

Pueraria

Pueraria

Lespedeza

Lespedeza

Lespedeza

Acacia

Phaseolus

ArachisArachis

Glycine

Arachis

Glycine

Arachis

Arachis

ArachisArachis

Chamaecytisus

ArachisArachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

ArachisArachis

Arachis

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

PuerariaPueraria

Lespedeza

Acacia

Arachis

Glycine

Indigofera

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Glycine

Arachis

Hawaii

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

ChinaChina

China

China

China

China

China

ChinaChina

ChinaChina

China

China

China

China

China

ChinaChina

China

China

China

China

China

ChinaChina

China

China

Zimbabwe

China

Israel

Zimbabwe

Israel

Zimbabwe

Zimbabwe

Mexico

Zimbabwe

.

.

sp.

elkanii

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

japonicum

sp.

HAMBI1661/TAL1000

CCBAU61307-2

CCBAU61112-1

CCBAU61114-1

CCBAU61301-1

CCBAU61301-3

CCBAU61307-1

CCBAU61112-3

CCBAU61116-2

CCBAU61116-3

CCBAU61112-2

CCBAU61114-3

CCBAU61114-2

CCBAU61116-1

CCBAU61307-4

CCBAU61113-1

CCBAU61114-4

HAMBI2217

HAMBI2228

HAMBI2227

CCBAU61177

CCBAU61221

HAMBI2152HAMBI2140

HAMBI2298

HAMBI2138

DE454

HAMBI2136

HAMBI2137

HAMBI2126HAMBI2133

BC-C2

HAMBI2151HAMBI2149

HAMBI2143

HAMBI2145

HAMBI2147

HAMBI2146

HAMBI2125

HAMBI2134HAMBI2142

HAMBI2135

CCBAU61109-1

CCBAU61109-2

CCBAU61104

CCBAU61107


HAMBI2220

CCBAU61178

HAMBI2115/LMG14299

HAMBI2123/USDA 76

CCBAU61307-3

HAMBI2153

HAMBI2116/LMG14303

283A

LMG14300

HAMBI2150/LMG14300

HAMBI2314/USDA 6

HAMBI2128/LMG14306

Arachis

Indigofera

Pueraria

Pueraria

Aeschynomene

Aeschynomene

Indigofera

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Indigofera

Pueraria

Pueraria

Lespedeza

Lespedeza

Lespedeza

Acacia

Phaseolus

ArachisArachis

Glycine

Arachis

Glycine

Arachis

Arachis

ArachisArachis

Chamaecytisus

ArachisArachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

ArachisArachis

Arachis

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

PuerariaPueraria

Lespedeza

Acacia

Arachis

Glycine

Indigofera

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Glycine

Arachis

Hawaii

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

ChinaChina

China

China

China

China

China

ChinaChina

ChinaChina

China

China

China

China

China

ChinaChina

China

China

China

China

China

ChinaChina

China

China

Zimbabwe

China

Israel

Zimbabwe

Israel

Zimbabwe

Zimbabwe

Mexico

Zimbabwe

.

.

.

1

2

3

4

5

7

6

8

9

10

11

12

B=86

B=100

49

4.3.2 recArecA-geenin RFLP-tuloksissa ryhmät muodostettiin yli 60% samankaltaisuusarvoilla (kuva 4.3b).

Bootstrap-arvot olivat hyvin harvoissa ryhmissä yli 70% (kuva 4.3b).

recA-RFLP-analyysit osoittivat, että Bradyrhizobium-kantojen recA-geenin

diversiteetti oli suuri. recA-geeni ryhmitti kannat yleensä samaa isäntäkasvia, maantieteellistä

taustaa ja 16S rDNA-perusteista lajinmääritystä noudattaen. MDS-analyysi (kuva 4.3a) osoitti, että

ryhmät eivät olleet toisilleen yhtä läheisiä kuin ITS-alueen analyysissa, mutta sijoittuivat toistensa

suhteen samankaltaisesti kuin ITS-RFLP-analyysissä.

Kuva 4.3a. recA-RFLP:n tuloksista Dice-kaavalla lasketut kantojen etäisyydet kuvattuna MDS-analyysina. Kuvassa on esitetty

läheisimpien kantojen suhteet, ja osa poikkeavimmista kannoista on jäänyt MDS-avaruuden ulkopuolelle. Ryhmät, joissa kannoilla on

identtiset recA-geenit, näkyvät yhtenä pisteenä. Ryhmien värit noudattavat taulukon 4.3 värejä: Punaisen sävyt kuvaavat kudzua

nystyröiviä B. elkanii –kantoja, vaaleanpunaiset B. japonicum -kantoja, vihreän sävyt esittävät maapähkinää nystyröiviä kantoja ja

keltaiset Lespedezaa nystyröiviä kantoja. Maapähkinää ja kudzua nystyröivien kantojen väliin jää paljon tyyppikantoja.

50

Kuva 4.3.b. Bradyritsobien recA-geenin RFLP-analyysista muodostetun Dice-samankaltaisuusmatriisin perusteella muodostuneet

ryhmät UPGMA-dendrogrammilla kuvattuna. Puun haaroissa näkyvät yhteisfeneettisen korrelaation arvot, sekä 70% ylittävät bootstrap-

arvot (B). Ryhmät muodostettiin yhteisfeneettisen korrelaation arvoilla, jotka ylittävät 90%. Ryhmät olivat pieniä ja niiden väliset suhteet

epäselviä. Geenin diversiteetti oli yleisesti suuri. Lyhenteet: Chi=China, Zim=Zimbabwe, Mex=Mexico, Ha=Hawaiji.

recA HaeIII+recA MspI

recA-RFLP-Iiris

100

9080706050403020100, B=99

100

96

96

1000

100

98, B=75

94

100

87

18

100, B=970

100

100, B=94

100

95

83

100, B=80

94

100. B=84

100

100, B=98

87

100

91

91

77

79

79

100

100, B=83

93

90

100, B=98

100

93

94

94

100

94

100, B=100

100

95

91

76

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

sp.

sp.

sp.

canariense

sp.

japonicum

sp.

japonicumsp.

japonicum

sp.

sp.

yuanmingense

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

elkanii

elkanii

sp.

sp.

elkanii

sp.

sp.

sp.

elkanii

sp.

liaoningense

sp.sp.

sp.

CCBAU61112-1

CCBAU61112-3

CCBAU61113-1

BC-C2

HAMBI2217

CCBAU61104

CCBAU61106

CCBAU61109-1HAMBI2115/LMG14299

HAMBI2314/USDA6

HAMBI2142

HAMBI2143

HAMBI2220

HAMBI2116/LMG14303

HAMBI2145

HAMBI2146

HAMBI2147

HAMBI2227

HAMBI2126

HAMBI2125

HAMBI2133283A

HAMBI2153

HAMBI1661/TAL1000

HAMBI2136

HAMBI2138

HAMBI2137

HAMBI2134

HAMBI2135

HAMBI2151

HAMBI2149

HAMBI2140

CCBAU61307-2

CCBAU61307-4

CCBAU61301-1

CCBAU61307-1

HAMBI2228

CCBAU61114-2

CCBAU61116-2

CCBAU61116-3

CCBAU61177

CCBAU61178

HAMBI2123/ USDA76

DE454

HAMBI2298

HAMBI2150/LMG14300HAMBI2150/LMG14300

HAMBI2128/LMG14306

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Chamaecytisus

Lespedeza

Pueraria

Pueraria

PuerariaArachis

Glycine

Arachis

Arachis

Lespedeza

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Lespedeza

Arachis

Arachis

ArachisArachis

Arachis

Arachi

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Indigofera

Indigofera

Aeschynomene

Indigofera

Lespedeza

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Acacia

Acacia

Glycine

Glycine

Glycine

ArachisArachis

Arachis

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.Zim.

Mex.

Chi.

Chi.

Chi.

Zim.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.Israel

Israel

Ha.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Zim.Zim.

Zim.

.

.

.

11

10

9

8

6

7

4

5

2

3

1


recA-RFLP-Iiris

100

9080706050403020100, B=99

100

96

96

1000

100

98, B=75

94

100

87

18

100, B=970

100

100, B=94

100

95

83

100, B=80

94

100. B=84

100

100, B=98

87

100

91

91

77

79

79

100

100, B=83

93

90

100, B=98

100

93

94

94

100

94

100, B=100

100

95

91

76

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

sp.

sp.

sp.

canariense

sp.

japonicum

sp.

japonicumsp.

japonicum

sp.

sp.

yuanmingense

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

elkanii

elkanii

sp.

sp.

elkanii

sp.

sp.

sp.

elkanii

sp.

liaoningense

sp.sp.

sp.

CCBAU61112-1

CCBAU61112-3

CCBAU61113-1

BC-C2

HAMBI2217

CCBAU61104

CCBAU61106


HAMBI2314/USDA6

HAMBI2142

HAMBI2143

HAMBI2220

HAMBI2116/LMG14303

HAMBI2145

HAMBI2146

HAMBI2147

HAMBI2227

HAMBI2126

HAMBI2125

HAMBI2133283A

HAMBI2153

HAMBI1661/TAL1000

HAMBI2136

HAMBI2138

HAMBI2137

HAMBI2134

HAMBI2135

HAMBI2151

HAMBI2149

HAMBI2140

CCBAU61307-2

CCBAU61307-4

CCBAU61301-1

CCBAU61307-1

HAMBI2228

CCBAU61114-2

CCBAU61116-2

CCBAU61116-3

CCBAU61177

CCBAU61178

HAMBI2123/ USDA76

DE454

HAMBI2298


HAMBI2128/LMG14306

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Chamaecytisus

Lespedeza

Pueraria

Pueraria

PuerariaArachis

Glycine

Arachis

Arachis

Lespedeza

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Lespedeza

Arachis

Arachis

ArachisArachis

Arachis

Arachi

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Indigofera

Indigofera

Aeschynomene

Indigofera

Lespedeza

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Acacia

Acacia

Glycine

Glycine

Glycine

ArachisArachis

Arachis

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.Zim.

Mex.

Chi.

Chi.

Chi.

Zim.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.Israel

Israel

Ha.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Zim.Zim.

Zim.

.

.

.


recA-RFLP-Iiris

100

9080706050403020100, B=99

100

96

96

1000

100

98, B=75

94

100

87

18

100, B=970

100

100, B=94

100

95

83

100, B=80

94

100. B=84

100

100, B=98

87

100

91

91

77

79

79

100

100, B=83

93

90

100, B=98

100

93

94

94

100

94

100, B=100

100

95

91

76


recA-RFLP-Iiris

100

9080706050403020100, B=99

100

96

96

1000

100

98, B=75

94

100

87

18

100, B=970

100

100, B=94

100

95

83

100, B=80

94

100. B=84

100

100, B=98

87

100

91

91

77

79

79

100

100, B=83

93

90

100, B=98

100

93

94

94

100

94

100, B=100

100

95

91

76

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

sp.

sp.

sp.

canariense

sp.

japonicum

sp.

japonicumsp.

japonicum

sp.

sp.

yuanmingense

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

elkanii

elkanii

sp.

sp.

elkanii

sp.

sp.

sp.

elkanii

sp.

liaoningense

sp.sp.

sp.

CCBAU61112-1

CCBAU61112-3

CCBAU61113-1

BC-C2

HAMBI2217

CCBAU61104

CCBAU61106


HAMBI2314/USDA6

HAMBI2142

HAMBI2143

HAMBI2220

HAMBI2116/LMG14303

HAMBI2145

HAMBI2146

HAMBI2147

HAMBI2227

HAMBI2126

HAMBI2125

HAMBI2133283A

HAMBI2153

HAMBI1661/TAL1000

HAMBI2136

HAMBI2138

HAMBI2137

HAMBI2134

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

sp.

sp.

sp.

canariense

sp.

japonicum

sp.

japonicumsp.

japonicum

sp.

sp.

yuanmingense

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

elkanii

elkanii

sp.

sp.

elkanii

sp.

sp.

sp.

elkanii

sp.

liaoningense

sp.sp.

sp.

CCBAU61112-1

CCBAU61112-3

CCBAU61113-1

BC-C2

HAMBI2217

CCBAU61104

CCBAU61106


HAMBI2314/USDA6

HAMBI2142

HAMBI2143

HAMBI2220

HAMBI2116/LMG14303

HAMBI2145

HAMBI2146

HAMBI2147

HAMBI2227

HAMBI2126

HAMBI2125

HAMBI2133283A

HAMBI2153

HAMBI1661/TAL1000

HAMBI2136

HAMBI2138

HAMBI2137

HAMBI2134

HAMBI2135

HAMBI2151

HAMBI2149

HAMBI2140

CCBAU61307-2

CCBAU61307-4

CCBAU61301-1

CCBAU61307-1

HAMBI2228

CCBAU61114-2

CCBAU61116-2

CCBAU61116-3

CCBAU61177

CCBAU61178

HAMBI2123/ USDA76

DE454

HAMBI2298


HAMBI2128/LMG14306

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Chamaecytisus

Lespedeza

Pueraria

Pueraria

PuerariaArachis

Glycine

Arachis

Arachis

Lespedeza

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Lespedeza

Arachis

Arachis

ArachisArachis

Arachis

Arachi

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Indigofera

Indigofera

Aeschynomene

Indigofera

Lespedeza

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Acacia

Acacia

Glycine

Glycine

Glycine

ArachisArachis

Arachis

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.Zim.

Mex.

Chi.

Chi.

Chi.

Zim.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.Israel

Israel

Ha.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Chi.

Zim.Zim.

Zim.

.

.

.

11

10

9

8

6

7

4

5

2

3

1

51

4.3.3 glnIIglnII-RFLP –dendrogrammissa (kuva 4.4b) ryhmät muodostettiin yli 60% samankaltaisuusarvolla,

koska yhteisfeneettiset korrelaatioarvot olivat yli 90%. Bootstrap-arvot tukivat vain ryhmää 12 (kuva

4.4b) ja 100% samankaltaisten kantojen muodostamia joukkoja. Muussa dendrogrammissa arvot

olivat alle 70%.

Analysoitujen Bradyrhizobium-kantojen glnII-geenien diversiteetti oli erittäin suuri

(taulukko 4.3). Dice-dendrogrammi kuvasi ryhmien suhteita melko heikosti (kuva 4.4b). Ryhmät

muodostuivat yleensä saman isäntäkasvin, maantieteellisen taustan ja 16S rDNA-perusteisen

lajinmäärityksen mukaan. Ryhmien väliset suhteet voidaan parhaiten havaita MDS-kuvassa.

Ryhmä 13, joka sisälsi kannat HAMBI2150 (zimbabwelainen maapähkinäkanta) ja

HAMBI 2128 (isäntäkasvina Vigna sp.) poikkesi selvästi muista tutkimuksen bradyritsobeista,

koska niiden recA-fragmentin koko oli huomattavasti suurempi (1000 bp) kuin muilla kannoilla (600

bp).

Kuva 4.4a. glnII-RFLP:n tuloksista Dice-kaavalla lasketut kantojen etäisyydet esitettynä MDS-analyysilla. Ryhmät, joiden kantojen glnII-

geeni oli identtinen, on esitetty yhtenä pisteenä, ja hyvin erilaiset kannat ovat jääneet rajallisen MDS-avaruuden ulkopuolelle. Ryhmien

värit vastaavat taulukon 4.3 värejä: punasävyiset pisteet ovat kudzua nystyröiviä B. elkanii -kantoja, vaaleanpunaiset B. japonicum –

kantoja. Vihreän sävyt edustavat kiinalaista maapähkinää nystyröiviä kantoja ja keltaiset Lespedeza-kantoja. Vasemman puoleisessa

kuvassa on esitetty kantojen väliset suhteet toisiinsa, oikeanpuoleisessa kuvassa on dendrogrammi kolmiulotteisena. Kuva

havainnollistaa, että bradyritsobien glnII vaihtelee erittäin paljon. Kudzua nystyröivät kannat ovat tämän geenin perusteella läheisempiä

kuin muiden analysoitujen geenien perusteella.

52

Kuva 4.4b. Bradyritsobien glnII-geenin RFLP-analyysista muodostetun Dice-samankaltaisuusmatriisin perusteella piirretty UPGMA-

dendrogrammi. Puun haaroissa näkyvät yhteisfeneettisen korrelaation arvot sekä yli 70% bootstrap-arvot (B). Geenin diversiteetti oli

suuri. Kannoista muodostui useita pieniä ryhmiä, ja niiden väliset suhteet eivät kuvautuneet puussa selkeästi. Ryhmien muodostus yli

90% yhteisfeneettisillä korrelaatioarvoilla oli samankaltaista kuin recA-geenin kohdalla.

GlnIIHaeIII +GlnIIMspIGlnII -RFLP -Iiris

1009080706050403020

100

100, B=93

88

100

73

82

100, B=97

100

100

96

69

71

100

64

84

100

75

100

89

100

64

63

70

100

50

63

100, B= 89

100

80

82

100

81

100

100

70

75

66

100

65

100

100

100, B=98

100

96

68

100, B=1000

71

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

sp .

sp .

elkanii

sp .

sp .

sp .

sp .

sp .

sp .

sp .

sp .

japonicum

sp .

sp .

sp .

canariense

sp .

sp .

sp .

sp .

sp .

liaoningense

elkanii

sp .

elkanii

sp .

elkanii

sp .

sp .

sp .

sp .

sp .

japonicum

sp .

sp .

sp .

sp .

japonicum

sp .

sp .

sp .

yuanmingense

sp .

sp .

sp .

sp .

sp .

sp .

sp .

HAMBI2126

HAMBI2125

CCABU61307 -1

CCBAU61307 -4

HAMBI2217

HAMBI2227

HAMBI2152

HAMBI2134

HAMBI2135

HAMBI2228

HAMBI2137

HAMBI2314/USDA6

HAMBI1661/TAL1000

283A

HAMBI2115/LMG14299

BC-C2

HAMBI2116/LMG14303

HAMBI2153

HAMBI2143

HAMBI2136

HAMBI2138

HAMBI2298

HAMBI2123/USDA76

DE454

CCBAU61301 -1

CCBAU61116 -3

CCBAU61116 -2

CCBAU61114 -2

CCBAU61112 -3

CCBAU61113 -1

CCBAU61112 -1

CCBAU61177

CCBAU61104

CCBAU61106

HAMBI2133

CCBAU61221

HAMBI2151

CBAU61109 -1

HAMBI2140

HAMBI2142

HAMBI2149

HAMBI2220

HAMBI2145

HAMBI2147

HAMBI2146

CCBAU61307 -2

HAMBI2150/LMG14300

HAMBI2150/LMG14300

HAMBI2128/LMG14306

Arachis

Arachis

Indigofera

Indigofera

Lespedeza

Lespedeza

Arachis

Arachis

Arachis

Lespedeza

Arachis

Glycine

Arachis

Arachis

Arachis

Chamaecytisus

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Glycine

Glycin

Glycine

Aeschynomene

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Acacia

Pueraria

Pueraria

Arachis

Phaseolus

Arachis

Pueraria

Arachis

Arachis

Arachis

Lespedeza

Arachis

Arachis

Arachis

Indigofera

Arachis

Arachis

Arachis

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

Mexico

Hawaii

Israel

Zimbabwe

Zimbabwe

Israel

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

Zimbabwe

Zimbabwe

Zimbabwe

.

.

13

11

12

10

9

8

7

6

5

3

4

2

1


1009080706050403020

100

100, B=93

88

100

73

82

100, B=97

100

100

96

69

71

100

64

84

100

75

100

89

100

64

63

70

100

50

63

100, B= 89

100

80

82

100

81

100

100

70

75

66

100

65

100

100

100, B=98

100

96

68

100, B=1000

71

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

sp .

sp .

elkanii

sp .

sp .

sp .

sp .

sp .

sp .

sp .

sp .

japonicum

sp .

sp .

sp .

canariense

sp .

sp .

sp .

sp .

sp .

liaoningense

elkanii

sp .

elkanii

sp .

elkanii

sp .

sp .

sp .

sp .

sp .

japonicum

sp .

sp .

sp .

sp .

japonicum

sp .

sp .

sp .

yuanmingense

sp .

sp .

sp .

sp .

sp .

sp .

sp .

HAMBI2126

HAMBI2125

CCABU61307 -1

CCBAU61307 -4

HAMBI2217

HAMBI2227

HAMBI2152

HAMBI2134

HAMBI2135

HAMBI2228

HAMBI2137

HAMBI2314/USDA6

HAMBI1661/TAL1000

283A

HAMBI2115/LMG14299

BC-C2

HAMBI2116/LMG14303

HAMBI2153

HAMBI2143

HAMBI2136

HAMBI2138

HAMBI2298

HAMBI2123/USDA76

DE454

CCBAU61301 -1

CCBAU61116 -3

CCBAU61116 -2

CCBAU61114 -2

CCBAU61112 -3

CCBAU61113 -1

CCBAU61112 -1

CCBAU61177

CCBAU61104

CCBAU61106

HAMBI2133

CCBAU61221

HAMBI2151

CBAU61109 -1

HAMBI2140

HAMBI2142

HAMBI2149

HAMBI2220

HAMBI2145

HAMBI2147

HAMBI2146

CCBAU61307 -2

HAMBI2150/LMG14300

HAMBI2150/LMG14300

HAMBI2128/LMG14306

Arachis

Arachis

Indigofera

Indigofera

Lespedeza

Lespedeza

Arachis

Arachis

Arachis

Lespedeza

Arachis

Glycine

Arachis

Arachis

Arachis

Chamaecytisus

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Glycine

Glycin

Glycine

Aeschynomene

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Acacia

Pueraria

Pueraria

Arachis

Phaseolus

Arachis

Pueraria

Arachis

Arachis

Arachis

Lespedeza

Arachis

Arachis

Arachis

Indigofera

Arachis

Arachis

Arachis

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

Mexico

Hawaii

Israel

Zimbabwe

Zimbabwe

Israel

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

Zimbabwe

Zimbabwe

Zimbabwe

.

.


1009080706050403020

100

100, B=93

88

100

73

82

100, B=97

100

100

96

69

71

100

64

84

100

75

100

89

100

64

63

70

100

50

63

100, B= 89

100

80

82

100

81

100

100

70

75

66

100

65

100

100

100, B=98

100

96

68

100, B=1000

71


1009080706050403020

100

100, B=93

88

100

73

82

100, B=97

100

100

96

69

71

100

64

84

100

75

100

89

100

64

63

70

100

50

63

100, B= 89

100

80

82

100

81

100

100

70

75

66

100

65

100

100

100, B=98

100

96

68

100, B=1000

71

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

sp .

sp .

elkanii

sp .

sp .

sp .

sp .

sp .

sp .

sp .

sp .

japonicum

sp .

sp .

sp .

canariense

sp .

sp .

sp .

sp .

sp .

liaoningense

elkanii

sp .

elkanii

sp .

elkanii

sp .

sp .

sp .

sp .

sp .

japonicum

sp .

sp .

sp .

sp .

japonicum

sp .

sp .

sp .

yuanmingense

sp .

sp .

sp .

sp .

sp .

sp .

sp .

HAMBI2126

HAMBI2125

CCABU61307 -1

CCBAU61307 -4

HAMBI2217

HAMBI2227

HAMBI2152

HAMBI2134

HAMBI2135

HAMBI2228

HAMBI2137

HAMBI2314/USDA6

HAMBI1661/TAL1000

283A

HAMBI2115/LMG14299

BC-C2

HAMBI2116/LMG14303

HAMBI2153

HAMBI2143

HAMBI2136

HAMBI2138

HAMBI2298

HAMBI2123/USDA76

DE454

CCBAU61301 -1

CCBAU61116 -3

CCBAU61116 -2

CCBAU61114 -2

CCBAU61112 -3

CCBAU61113 -1

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

sp .

sp .

elkanii

sp .

sp .

sp .

sp .

sp .

sp .

sp .

sp .

japonicum

sp .

sp .

sp .

canariense

sp .

sp .

sp .

sp .

sp .

liaoningense

elkanii

sp .

elkanii

sp .

elkanii

sp .

sp .

sp .

sp .

sp .

japonicum

sp .

sp .

sp .

sp .

japonicum

sp .

sp .

sp .

yuanmingense

sp .

sp .

sp .

sp .

sp .

sp .

sp .

HAMBI2126

HAMBI2125

CCABU61307 -1

CCBAU61307 -4

HAMBI2217

HAMBI2227

HAMBI2152

HAMBI2134

HAMBI2135

HAMBI2228

HAMBI2137

HAMBI2314/USDA6

HAMBI1661/TAL1000

283A

HAMBI2115/LMG14299

BC-C2

HAMBI2116/LMG14303

HAMBI2153

HAMBI2143

HAMBI2136

HAMBI2138

HAMBI2298

HAMBI2123/USDA76

DE454

CCBAU61301 -1

CCBAU61116 -3

CCBAU61116 -2

CCBAU61114 -2

CCBAU61112 -3

CCBAU61113 -1

CCBAU61112 -1

CCBAU61177

CCBAU61104

CCBAU61106

HAMBI2133

CCBAU61221

HAMBI2151

CBAU61109 -1

HAMBI2140

HAMBI2142

HAMBI2149

HAMBI2220

HAMBI2145

HAMBI2147

HAMBI2146

CCBAU61307 -2

HAMBI2150/LMG14300

HAMBI2150/LMG14300

HAMBI2128/LMG14306

Arachis

Arachis

Indigofera

Indigofera

Lespedeza

Lespedeza

Arachis

Arachis

Arachis

Lespedeza

Arachis

Glycine

Arachis

Arachis

Arachis

Chamaecytisus

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Glycine

Glycin

Glycine

Aeschynomene

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Acacia

Pueraria

Pueraria

Arachis

Phaseolus

Arachis

Pueraria

Arachis

Arachis

Arachis

Lespedeza

Arachis

Arachis

Arachis

Indigofera

Arachis

Arachis

Arachis

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

Mexico

Hawaii

Israel

Zimbabwe

Zimbabwe

Israel

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

Zimbabwe

Zimbabwe

Zimbabwe

.

.

13

11

12

10

9

8

7

6

5

3

4

2

1

53

4.3.4 nifHnifH-RFLP –dendrogrammissa ryhmät muodostettiin yli 60% samankaltaisuusarvolla (kuva 4.5b),

jotta ryhmiä voitaisiin vertailla muiden geenien RFLP-tuloksista muodostettuihin ryhmiin (kuvat

4.2b-4.6b). Yhteisfeneettisen korrelaation arvot olivat kuitenkin lähes koko dendrogrammissa yli

90%. Yli 70% bootstrap-arvot tukivat vain ryhmää 3, joitain 100% samankaltaisten kantojen

muodostamia joukkoja (kuva 4.5b).

Verrattuna ydingeeneihin ja ITS-alueeseen bradyritsobikantojen nifH-geenit

osoittivat laajaa, mutta luonteeltaan erilaista diversiteettiä: 1) ryhmiä muodostui vähemmän (5

kappaletta), 2) ryhmät olivat laajempia kuin ydingeeniryhmät, käsittäen jopa 10 kantaa, ja 3)

ryhmien ulkopuolelle jäi runsaasti toisilleen kaukaisia, ryhmiin kuulumattomia kantoja (kuvat 4.5a ja

4.5b). Kudzua nystyröineet B. japonicum –kannat olivat keskenään erilaisia, ja erottuivat selkeästi

myös tutkimuksen muista Bradyrhizobium-kannoista. B. japonicum –kantojen välinen etäisyys

kuvautuu parhaiten MDS-kuvan dendrogrammissa (kuva 4.5a, oikeanpuoleinen kuva). Analyysien

mukaan samaakin isäntäkasvia nystyröivillä Bradyrhizobium-kannoilla saattoi olla erilaiset nifH-

geenit.

Kuva 4.5a. nifH-RFLP:n tuloksista Dice-kaavalla lasketut kantojen etäisyydet esitettynä MDS-analyysilla. Ryhmissä nifH-geeniltään

identtiset kannat on esitetty yhtenä pisteenä, ja selvästi poikkeavat kannat ovat jääneet rajallisen MDS-avaruuden ulkopuolelle. Ryhmien

värit vastaavat taulukon 4.3 värejä: punasävyiset pisteet ovat kudzua nystyröiviä B. elkanii -kantoja, vaaleanpunaiset B. japonicum –

kantoja. Vihreän sävyt edustavat kiinalaista maapähkinää nystyröiviä kantoja ja keltaiset Lespedeza-kantoja. Vasemmalle kantojen

suhteet toisiinsa, oikealla dendrogrammi esitettynä kolmiulotteisena. Kuva havainnollistaa, että bradyritsobien nifH voi olla erilainen

samaakin isäntäkasvia nystyröivillä kannoilla.

54

Kuva 4.5b. Bradyritsobien nifH-geenin RFLP-analyysistä muodostetun Dice-samankaltaisuusmatriisin perusteella piirretty UPGMA-

dendrogrammi. Puun haaroissa näkyvät yhteisfeneettisen korrelaation arvot sekä 70% ylittävät boostrap-arvot (B). Ryhmät

muodostettiin yli 90% yhteisfeneettisen korrelaation arvoilla. Ryhmät olivat suurempia ja yhtenäisempiä kuin ydingeenien perusteella

muodostuneet. Lisäksi nifH-ryhmät noudattivat paremmin isäntäkasvin ja alkuperän mukaista jakoa kuin ITS, recA ja glnII.

NifH HaeIII+NifH MspI

nifH-RFLP-Iiris

100

908070605040302010

100

100

81

100

100, B=82

86

83

100

100

100

100

80

90

94

88

91

90

100

100, B=870

90, B=78

99

92

100

100

100, B=990

0

0

0

0

100

90

91

96

91

100, B=100

100

91

100

99

90

91

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

sp.

sp.

sp.

yuanmingense

sp.sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

elkaniisp.

sp.canariense

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

liaoningense

japonicum

sp.

sp.sp.

elkanii

elkanii

sp.

sp.

sp.

elkanii

sp.

sp.

sp.

sp.sp.

sp.

japonicum

sp.

japonicum

HAMBI2150/LMG14300

HAMBI2228

LMG14300

HAMBI2220

283AHAMBI2153

HAMBI2134

HAMBI2142

CCBAU61178

HAMBI2137

HAMBI2138

HAMBI2136

HAMBI2151

HAMBI2149

HAMBI2123/ USDA76HAMBI2133

HAMBI2128/LMG14306BC-C2

HAMBI2126

HAMBI2125

HAMBI2145

HAMBI2146

HAMBI2147

HAMB2135

HAMBI2298

HAMBI2314/USDA6

CCBAU61307-4

CCBAU61116-3CCBAU61177

CCBAU61301-1

CCBAU61307-1

CCBAU61112-3

CCBAU61113-1

CCBAU61114-2

CCBAU61116-2

CCBAU61112-1

CCBAU61221

HAMBI2217

HAMBI2227HAMBI2152

CCBAU61106

CCBAU61109-1

HAMBI2115/LMG14299

CCBAU61104

Arachis

Lespedeza

Arachis

Lespedeza

ArachisArachis

Arachis

Arachis

Acacia

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

GlycineArachis

ArachisChamaecytisus

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Glycine

Glycine

Indigofera

PuerariaAcacia

Aeschynomene

Indigofera

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Phaseolus

Lespedeza

LespedezaArachis

Pueraria

Pueraria

Arachis

Pueraria

Zimbabw e

China

Zimbabw e

China

IsraelIsrael

China

China

China

China

China

China

China

China

China

Zimbabw e

China

China

China

China

China

China

China

Mexico

China

ChinaChina

China

China

China

China

China

China

China

China

China

ChinaChina

China

China

Zimbabw e

China

5

4

3

2

1

B=84


nifH-RFLP-Iiris

100

908070605040302010

100

100

81

100

100, B=82

86

83

100

100

100

100

80

90

94

88

91

90

100

100, B=870

90, B=78

99

92

100

100

100, B=990

0

0

0

0

100

90

91

96

91

100, B=100

100

91

100

99

90

91

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

sp.

sp.

sp.

yuanmingense

sp.sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

elkaniisp.

sp.canariense

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

liaoningense

japonicum

sp.

sp.sp.

elkanii

elkanii

sp.

sp.

sp.

elkanii

sp.

sp.

sp.

sp.sp.

sp.

japonicum

sp.

japonicum

HAMBI2150/LMG14300

HAMBI2228

LMG14300

HAMBI2220

283AHAMBI2153

HAMBI2134

HAMBI2142

CCBAU61178

HAMBI2137

HAMBI2138

HAMBI2136

HAMBI2151

HAMBI2149



HAMBI2126

HAMBI2125

HAMBI2145

HAMBI2146

HAMBI2147

HAMB2135

HAMBI2298

HAMBI2314/USDA6

CCBAU61307-4


CCBAU61301-1

CCBAU61307-1

CCBAU61112-3

CCBAU61113-1

CCBAU61114-2

CCBAU61116-2

CCBAU61112-1

CCBAU61221

HAMBI2217

HAMBI2227HAMBI2152

CCBAU61106

CCBAU61109-1

HAMBI2115/LMG14299

CCBAU61104

Arachis

Lespedeza

Arachis

Lespedeza

ArachisArachis

Arachis

Arachis

Acacia

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

GlycineArachis


Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Glycine

Glycine

Indigofera

PuerariaAcacia

Aeschynomene

Indigofera

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Phaseolus

Lespedeza

LespedezaArachis

Pueraria

Pueraria

Arachis

Pueraria

Zimbabw e

China

Zimbabw e

China

IsraelIsrael

China

China

China

China

China

China

China

China

China

Zimbabw e

China

China

China

China

China

China

China

Mexico

China

ChinaChina

China

China

China

China

China

China

China

China

China

ChinaChina

China

China

Zimbabw e

China


nifH-RFLP-Iiris

100

908070605040302010

100

100

81

100

100, B=82

86

83

100

100

100

100

80

90

94

88

91

90

100

100, B=870

90, B=78

99

92

100

100

100, B=990

0

0

0

0

100

90

91

96

91

100, B=100

100

91

100

99

90

91

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.


nifH-RFLP-Iiris

100

908070605040302010

100

100

81

100

100, B=82

86

83

100

100

100

100

80

90

94

88

91

90

100

100, B=870

90, B=78

99

92

100

100

100, B=990

0

0

0

0

100

90

91

96

91

100, B=100

100

91

100

99

90

91

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

sp.

sp.

sp.

yuanmingense

sp.sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

elkaniisp.

sp.canariense

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

liaoningense

japonicum

sp.

sp.sp.

elkanii

elkanii

sp.

sp.

sp.

elkanii

sp.

sp.

sp.

sp.sp.

sp.

japonicum

sp.

japonicum

HAMBI2150/LMG14300

HAMBI2228

LMG14300

HAMBI2220

283AHAMBI2153

HAMBI2134

HAMBI2142

CCBAU61178

HAMBI2137

HAMBI2138

HAMBI2136

HAMBI2151

HAMBI2149



HAMBI2126

HAMBI2125

HAMBI2145

HAMBI2146

HAMBI2147

HAMB2135

HAMBI2298

HAMBI2314/USDA6

CCBAU61307-4


CCBAU61301-1

CCBAU61307-1

CCBAU61112-3

CCBAU61113-1

CCBAU61114-2

CCBAU61116-2

CCBAU61112-1

CCBAU61221

HAMBI2217

HAMBI2227HAMBI2152

CCBAU61106

CCBAU61109-1

HAMBI2115/LMG14299

CCBAU61104

Arachis

Lespedeza

Arachis

Lespedeza

ArachisArachis

Arachis

Arachis

Acacia

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

GlycineArachis


Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Glycine

Glycine

Indigofera

PuerariaAcacia

Aeschynomene

Indigofera

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Phaseolus

Lespedeza

LespedezaArachis

Pueraria

Pueraria

Arachis

Pueraria

Zimbabw e

China

Zimbabw e

China

IsraelIsrael

China

China

China

China

China

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

sp.

sp.

sp.

yuanmingense

sp.sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

elkaniisp.

sp.canariense

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

liaoningense

japonicum

sp.

sp.sp.

elkanii

elkanii

sp.

sp.

sp.

elkanii

sp.

sp.

sp.

sp.sp.

sp.

japonicum

sp.

japonicum

HAMBI2150/LMG14300

HAMBI2228

LMG14300

HAMBI2220

283AHAMBI2153

HAMBI2134

HAMBI2142

CCBAU61178

HAMBI2137

HAMBI2138

HAMBI2136

HAMBI2151

HAMBI2149



HAMBI2126

HAMBI2125

HAMBI2145

HAMBI2146

HAMBI2147

HAMB2135

HAMBI2298

HAMBI2314/USDA6

CCBAU61307-4


CCBAU61301-1

CCBAU61307-1

CCBAU61112-3

CCBAU61113-1

CCBAU61114-2

CCBAU61116-2

CCBAU61112-1

CCBAU61221

HAMBI2217

HAMBI2227HAMBI2152

CCBAU61106

CCBAU61109-1

HAMBI2115/LMG14299

CCBAU61104

Arachis

Lespedeza

Arachis

Lespedeza

ArachisArachis

Arachis

Arachis

Acacia

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

GlycineArachis


Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Glycine

Glycine

Indigofera

PuerariaAcacia

Aeschynomene

Indigofera

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Phaseolus

Lespedeza

LespedezaArachis

Pueraria

Pueraria

Arachis

Pueraria

Zimbabw e

China

Zimbabw e

China

IsraelIsrael

China

China

China

China

China

China

China

China

China

Zimbabw e

China

China

China

China

China

China

China

Mexico

China

ChinaChina

China

China

China

China

China

China

China

China

China

ChinaChina

China

China

Zimbabw e

China

5

4

3

2

1

B=84

55

4.3.5 nodCnodC-RFLP –ryhmät muodostettiin dendrogrammissa 60% samankaltaisuudella (kuva 4.6b).

Yhteisfeneettinen korrelaatio tuki koko dendrogrammia, koska lähes kaikki arvot olivat yli 90%.

Bootstrap-analyysi sen sijaan tuki vain 100% samankaltaisten kantojen joukkoja (kuva 4.6b).

Tutkittujen Bradyrhizobium-kantojen nodC-geenit ryhmittyivät erilailla kuin muut

geenit (kuvat 4.6a ja 4.6b): nodC-ryhmät olivat laajemmat muihin geeneihin verrattuna, käsittäen

keskimäärin 4-12 kantaa, ja ryhmät olivat toisilleen kaukaisempia (kuva 4.6a). Toisaalta useiden

kantojen kohdalla nodC-geenin monistaminen epäonnistui useammin kuin muiden geenien

monistus, eli joidenkin kantojen nodC-sekvenssit olivat selkeästi erilaiset.

nodC-RFLP-analyysien mukaan maapähkinää nystyröineet kannat jakaantuivat

kahteen ryhmään, joissa oli mukana toisenkin isäntäkasvin nystyräbakteereita: ryhmä 2 koostui

maapähkinä- ja soijapapukannoista, ja ryhmä 4 koostui maapähkinä- ja Indigofera-kannoista.

Kudzua nystyröivistä kannoista B. japonicum -kannat (ryhmä 3) erottuivat B. elkanii -kannoista

(ryhmä 1).

HAMBI2228 (Lespedeza) ja CCBAU61221 (Phaseolus) -kannat erottuivat muista

kannoista selvästi. Ne olivat ainoat isäntäkasviaan edustavat bradyritsobikannat nodC-analyysissä.

Isäntäkasvien mukainen ryhmittyminen on nodC-geenin kohdalla loogista, sillä tämä geeni tuottaa

nystyröinnin onnistumisen kannalta tärkeitä nod-tekijöitä.

Kuva 4.6a. nodC-RFLP:n analyysituloksista Dice-kaavalla lasketut kantojen väliset etäisyydet MDS-analyysilla kuvattuna. Värit vastaavat

taulukossa 4.3 esitettyjä ryhmien värejä seuraavasti: punaisen sävyt ovat kudzua nystyröiviä kantoja, vihreän sävyt edistavat kiinalaista

maapähkinää nystyröiviä kantoja, ja keltainen Lespedeza-kantoja. Vasemmanpuoleisessa kuvassa on esitetty kantojen suhteet toisiinsa,

oikealla on dendrogrammi kolmiulotteisessa muodossa. Kuva osoittaa UPGMA-puuta selkeämmin, että nodC-ryhmät ovat keskenään

hyvin erilaisia.

56

Kuva 4.6b. Bradyritsobien nodC-geenin RFLP-analyysituloksista lasketun Dice-samankaltaisuusmatriisin perusteella piirretty UPGMA-

dendrogrammi. Puun haaroissa näkyvät yhteisfeneettisen korrelaation arvot sekä 70% ylittävät bootstrap-arvot. Ryhmät muodostettiin

yli 90% yhteisfeneettisen korrelaation arvoilla. Isäntäkasvin mukainen jako on vahvempi, ja ryhmien suhteet toisiinsa ovat selkeämmät

nodC-geenin perusteella kuin nifH-geenissä. Useat kannat puuttuvat kuvasta, koska niiden nodC-geenin PCR epäonnistui valituilla

alukkeilla.

nodC HaeIII+nodC MspI

nodC-RFLP-Iiris

100

90807060504030

100

1000

0

0

0

0

100

1000

100

94

89

100

78

91

100, B=99

100

100, B=99

93

90

1000

0

0

0

100

100, B=100

96

97

100, B=100

94

84

91

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

sp.

sp.elkanii

sp.

sp.

sp.

sp.

elkanii

sp.

elkanii

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.sp.

sp.japonicum

japonicum

sp.

japonicum

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.sp.

elkanii

sp.

sp.

sp.

sp.

HAMBI2228

CCBAU61221CCBAU61301-1

CCBAU61112-1

CCBAU61112-3

CCBAU61113-1

CCBAU61114-2

CCBAU61116-2

CCBAU61116-3

HAMBI2123/USDA 76

HAMBI2137

HAMBI2138

HAMBI2133

HAMBI2151

HAMBI2128/LMG14306HAMBI2136

HAMBI2149HAMBI2314/USDA6

CCBAU61104

CCBAU61106

CCBAU61109-1

HAMBI2150/LMG14300

HAMBI2150/LMG14300

HAMBI2126

HAMBI2142

HAMBI2145

HAMBI2146

HAMBI2147

HAMBI2125HAMBI2134

CCBAU61307-1

CCBAU61307-4

HAMBI2135

283A

HAMBI2153

Lespedeza

PhaseolusAeschynomene

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Glycine

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

ArachisArachis

ArachisGlycine

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

ArachisArachis

Indigofera

Indigofera

Arachis

Arachis

Arachis

China

ChinaChina

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

Zimbabw eChina

ChinaMexico

China

China

China

Zimbabw e

Zimbabw e

China

China

China

China

China

ChinaChina

China

China

China

Israel

Israel

3

4

2

1

B=100

B=95


nodC-RFLP-Iiris

100

90807060504030

100

1000

0

0

0

0

100

1000

100

94

89

100

78

91

100, B=99

100

100, B=99

93

90

1000

0

0

0

100

100, B=100

96

97

100, B=100

94

84

91

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

sp.

sp.elkanii

sp.

sp.

sp.

sp.

elkanii

sp.

elkanii

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.sp.

sp.japonicum

japonicum

sp.

japonicum

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.sp.

elkanii

sp.

sp.

sp.

sp.

HAMBI2228


CCBAU61112-1

CCBAU61112-3

CCBAU61113-1

CCBAU61114-2

CCBAU61116-2

CCBAU61116-3

HAMBI2123/USDA 76

HAMBI2137

HAMBI2138

HAMBI2133

HAMBI2151



CCBAU61104

CCBAU61106

CCBAU61109-1

HAMBI2150/LMG14300

HAMBI2150/LMG14300

HAMBI2126

HAMBI2142

HAMBI2145

HAMBI2146

HAMBI2147

HAMBI2125HAMBI2134

CCBAU61307-1

CCBAU61307-4

HAMBI2135

283A

HAMBI2153

Lespedeza


Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Glycine

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

ArachisArachis

ArachisGlycine

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

ArachisArachis

Indigofera

Indigofera

Arachis

Arachis

Arachis

China

ChinaChina

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

Zimbabw eChina

ChinaMexico

China

China

China

Zimbabw e

Zimbabw e

China

China

China

China

China

ChinaChina

China

China

China

Israel

Israel


nodC-RFLP-Iiris

100

90807060504030

100

1000

0

0

0

0

100

1000

100

94

89

100

78

91

100, B=99

100

100, B=99

93

90

1000

0

0

0

100

100, B=100

96

97

100, B=100

94

84

91

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

sp.

sp.elkanii

sp.

sp.

sp.

sp.

elkanii

sp.

elkanii

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.sp.


nodC-RFLP-Iiris

100

90807060504030

100

1000

0

0

0

0

100

1000

100

94

89

100

78

91

100, B=99

100

100, B=99

93

90

1000

0

0

0

100

100, B=100

96

97

100, B=100

94

84

91

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.

B.B.

B.

B.

B.

B.

B.

sp.

sp.elkanii

sp.

sp.

sp.

sp.

elkanii

sp.

elkanii

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.sp.

sp.japonicum

japonicum

sp.

japonicum

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.

sp.sp.

elkanii

sp.

sp.

sp.

sp.

HAMBI2228


CCBAU61112-1

CCBAU61112-3

CCBAU61113-1

CCBAU61114-2

CCBAU61116-2

CCBAU61116-3

HAMBI2123/USDA 76

HAMBI2137

HAMBI2138

HAMBI2133

HAMBI2151



CCBAU61104

CCBAU61106

CCBAU61109-1

HAMBI2150/LMG14300

HAMBI2150/LMG14300

HAMBI2126

HAMBI2142

HAMBI2145

HAMBI2146

HAMBI2147

HAMBI2125HAMBI2134

CCBAU61307-1

CCBAU61307-4

HAMBI2135

283A

HAMBI2153

Lespedeza


Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Glycine

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

ArachisArachis

ArachisGlycine

Pueraria

Pueraria

Pueraria

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

Arachis

ArachisArachis

Indigofera

Indigofera

Arachis

Arachis

Arachis

China

ChinaChina

China

China

China

China

China

China

China

China

China

China

Zimbabw eChina

ChinaMexico

China

China

China

Zimbabw e

Zimbabw e

China

China

China

China

China

ChinaChina

China

China

China

Israel

Israel

3

4

2

1

B=100

B=95

57

5. Tulosten tarkastelu

Tämän tutkimuksen Bradyrhizobium-kantojen sekä ydin- että symbioosigeenien diversiteetti

osoittautui suureksi. Kiinalaiset kannat muodostivat useita hyvin läheisten kantojen ryhmiä

(taulukko 4.3). ITS-alueen ja recA-geenin RFLP-ryhmät sekä AFLP korreloivat melko hyvin (kuvat

4.1a-4.3a ja 4.1b-4.3b). glnII-geeniryhmissä oli enemmän sisäistä vaihtelua kuin recA-

geeniryhmissä, mutta muilta osin (pienet ryhmät, ryhmien välisten suhteiden monimutkaisuus)

ydingeenit muistuttivat toisiaan (kuvat 4.3a/b ja 4.4a/b). ITS-ryhmät sisälsivät useanlaisia ydin- ja

symbioosigeeniryhmiä, ja symbioosigeeniryhmät sisälsivät erilaisiin ydingeeniryhmiin kuuluvia

kantoja (taulukko 4.3). Toisilleen läheisillä ITS-ryhmillä oli usein sama isäntäkasvi tai alueellinen

tausta, mutta ryhmät olivat pieniä (kuvat 4.2a ja b). Sama koski muita tutkittuja geenejä. 16S

rDNA:n perusteella määritetyt lajit saattoivat jakaantua useisiin genotyyppiryhmiin. Mm. tämän

ilmiön takia on selvää, että bradyritsobien kokonaisgenomi oli hyvin heterogeeninen, kuten AFLP

osoitti.

Yhteisen maantieteellisen alkuperän ja isäntäkasvin vaikutukset genomiin olivat

havaittavissa. Kaikissa erillisissä geeni-RFLP –tuloksissa sekä AFLP-tuloksissa voitiin erottaa

seuraavat trendit:

1) Maapähkinää nystyröivät bradyritsobit jakaantuivat useisiin pieniin ryhmiin, joiden väliset

sukulaisuussuhteet toisiiinsa vaihtelivat tutkitusta geenistä riippuen. Yleensä nämä ryhmät olivat

läheisempiä toisilleen kuin kansainvälisille Bradyrhizobium-tyyppi- ja vertailukannoille tai kudzua

nystyröiville kannoille.

2) Kudzua nystyröi kaksi hyvin erilaista bradyritsobijoukkoa, joista toinen sisälsi B. japonicum –

kantoja ja toinen B. elkanii –kantoja. B. japonicum- ja B. elkanii -joukot erosivat selvästi toisistaan.

3) Tyyppikannat eivät olleet läheistä sukua toisilleen eivätkä kiinalaisille kannoille.

Isäntäkasvi ja maantieteellinen alkuperä vaikuttivat tutkittujen Bradyrhizobium-kantojen geenien

ryhmittymiseen:

i) Etelä-Amerikasta Aasiaan tuotua maapähkinää (Arachis hypogaea) nystyröivät kannat olivat

erilaisia kuin alunperin aasialaista kudzua (Pueraria lobata) nystyröivät kannat (taulukko 4.3).

ii) Kansainväliset tyyppi- ja vertailukannat olivat toisilleen kaukaisia sukulaisia ja poikkesivat

selvästi kiinalaisista kannoista (taulukko 4.3).

iii) Maapähkinää nystyröineiden Bradyrhizobium-kantojen joukosta muodostui ryhmiä, joiden

jäsenet olivat keskenään hyvin samankaltaisia, mutta ryhmien väliset suhteet olivat vaihtelevia

(taulukko 4.3).

58

iv) Kudzua nystyröi kaksi keskenään hyvin erilaista bradyritsobiryhmää, joista toinen sisälsi B.

elkanii –kantoja ja toinen B. japonicum –kantoja. Maapähkinäkannat sijoittuivat näiden ryhmien

väliin, eivätkä selvästi kuuluneet kumpaankaan ryhmään (kuvat 4.1a-4.6a).

Tuloksista huomattiin, ettei UPGMA-puilla voitu kuvata kantojen suhteita

kokonaisuudessaan totuudenmukaisesti. Dendrogrammi kuvasi kantojen RFLP-tuloksista

laskettuja samankaltaisuusmatriiseja puutteellisesti, ja antoi siten vajavaisen kuvan kantojen

suhteista toisiinsa. Dendrogrammeista saatuja tuloksia voitiin kuitenkin tulkita, kun niiden

vajavaisuudet otettiin huomioon.

5.1 Tässä työssä käytettyjen metodien soveltuvuus taksonomia-

tutkimuksissa

5.1.1 Yksittäisten geenien suhde 16S rDNA-perusteiseen lajinmääritykseenBradyrhizobium-suvussa, sekä sormenjälkimenetelmien tulkittavuusNykyisessä taksonomiassa 16S- ja 23S- rDNA-geenien sekvensseillä on suuri rooli bakteerilajien

määrityksessä, koska niitä pidetään pitkälti muuntelemattomina genomin osina. Genomiset

tutkimukset paljastavat silti usein, että yksi geenisekvenssi kuvaa lajin sisäistä diversiteettiä varsin

vajavaisesti (Lindström ja Gyllenberg 2006, Sawada ym. 2003, Rosselló-Mora ja Amann 2001).

16S rRNAn ja rDNAn analysoinnin ongelma on, että se asettaa keinotekoiset rajat genomiselle

diversiteetille.

Tämän tutkimuksen Bradyrhizobium-kantojen genominen diversiteetti oli

huomattavasti suurempi kuin 16S rDNA:han perustuva lajitunnistus. Tutkitut geenit olivat hyvin

vaihtelevia, eivätkä ne liittyneet yksiselitteisesti 16S rDNA-perusteisiin lajimäärityksiin. Esimerkiksi

16S rDNA-geenin sekvenssin perusteella nimetyt B. elkanii –kannat olivat hyvin erilaisia muun

genominsa osalta eri puolilla maailmaa (esim. kuva 4.1b). Toisaalta esimerkiksi B. liaoningense

saattoi tietyn geenin perusteella olla B. elkanii –kannalle läheisempi kuin toinen B. elkanii –kanta,

joka oli peräisin eri isäntäkasvilajista tai maantieteelliseltä alueelta.

Yksittäisten geenien perusteella voidaan kuitenkin päätellä muita seikkoja bakteerien

ekologiasta ja elämästä. Esimerkiksi tämän tutkimuksen Bradyrhizobium-kantojen ydin- ja

symbioosigeenien samankaltaisuus ja toisaalta erilaisuus heijasti bakteerien populaatiota,

sopeutumista erilaisiin ympäristöihin, ja mahdollisesti populaatioiden välistä vuorovaikutusta

(horistontaalista geenien siirtymistä).

Kun geenejä tutkitaan sormenjälkimenetelmien avulla, tulkinnassa tulisi myös

muistaa, että tutkimus kohdentuu geenien sekvensseihin. Identtisistä sormenjälkikuvioista

huolimatta geenit eivät välttämättä ole sekvenssitasolla samanlaisia (Haukka ym. 1998). Toisaalta

59

on huomioitava, että myös nonsense-mutaatioiden aiheuttamat erot geenin sekvenssissä voivat

aiheuttaa erilaisen RFLP-sormenjäljen. Yksittäisten kantojen outo sijoittuminen, esimerkiksi

LMG14299 –kannan eroaminen AFLP-dendrogrammissa (kuva 4.1b), saattaa johtua kyseisestä

”virheestä”.

5.1.2 Tyyppikantojen käyttö tutkimuksissaTyyppikantoja käytetään tutkimuksissa yleensä edustamaan tiettyä bakteeriryhmää, -sukua tai -

lajia. Niiden avulla tunnistetaan bakteereita ja vertaillaan tutkittavien kantojen välisiä suhteita.

Tutkimukseni tulokset havainnollistivat myös tyyppikantojen käytön näkökulmasta 16S rDNA:han

perustuvan lajinmäärityksen puutteellisuutta. Tuloksista havaittiin, että samasta alkuperästä

(maantieteellinen tai isäntäkasvilaji) voi olla lähtöisin geneettisesti hyvinkin erilaisia

Bradyrhizobium-kantoja (taulukko 4.3). Tämän takia yksittäisten tyyppikantojen käyttäminen

vertailuun voi antaa yksipuolisen, jopa virheellisen, kuvan siitä, mitä ryhmää, sukua tai lajia

tutkittavat bakteerit edustavat.

Kun tyyppi- ja vertailukantoja käytetään geneettisissä identifiointi- ja fylogenia-

tutkimuksissa, tulisi analyyseihin valita mukaan riittävä määrä samankaltaisia kantoja, jotta niiden

ryhmittymistrendit suhteessa tutkimusten muihin kantoihin voitaisiin havaita. Esimerkiksi tässä

tutkimuksessa käytetty B. canariense oli lajinsa ja maantieteellisen alkuperänsä ainoa edustaja,

minkä takia lajin suhde maapähkinää nystyröiviin kantoihin jäi epäselväksi.

Valittaessa tyyppi- ja vertailukantoja Bradyrhizobium-tutkimuksiin kannattaa kiinnittää

huomiota sekä kantojen maantieteelliseen alkuperään että isäntäkasviin, jotta saataisiin

mahdollisimman yhtenäinen vertailuaineisto.

5.1.3 UPGMA-dendrogrammit samankaltaisuuden kuvaajinaKahta ”naapuria” (kantaa tai ryhmää) yhdistävää UPGMA-dendrogrammia käytetään

taksonomiassa kuvaamaan bakteerikantojen samankaltaisuutta. UPGMA-puu perustuu

analyysituloksista laskettuihin samankaltaisuusmatriiseihin. Toisinaan kahta useampi kanta on

identtinen, mutta UPGMA-menetelmällä voidaan yhdistää vain kaksi identtistä kantaa rinnakkain.

Tällöin muut identtiset kannat sijoittuvat väistämättä kauemmas kahdesta rinnastetusta, ja

aiheuttavat virhettä. Toisinaan ryhmän varhainen jako kahteen aiheuttaa sen, että myöhemmissä

haaroissa ryhmät näyttävät olevan hyvin kaukaisia toisilleen, vaikka ne todellisuudessa kuuluisivat

samaan haaraan. Tämän takia UPGMA-puu ei kuvaa samankaltaisuusmatriisia täysin totuuden-

mukaisesti.

Erilaisia matemaattisia kaavoja on kehitetty laskemaan, kuinka hyvin dendrogrammi

kuvaa samankaltaisuusmatriisia. Yhteisfeneettinen korrelaatio (cophenetic correlation) on eräs

tällainen laskukaava (Farris 1969). Tässä tutkimuksessa yhteisfeneettiset korrelaatioarvot laskettiin

dendrogrammien jokaiselle haaralle. Korrelaatioarvot kertovat kunkin ryhmän kohdalla, kuinka

60

hyvin puu kyseisessä kohdassa kuvaa samankaltaisuusmatriisia. Yhteisfeneettiset korrelaatioarvot

voidaan laskea myös kokonaisille dendrogrammeille, kuten on tehty esim. Dresler-Nurmen ym.

(2000) tutkimuksessa. Yhden arvon käyttämisessä ongelmana on kuitenkin, että yksi

”yhteisfeneettisten korrelaatioiden keskiarvo” voi peittää alleen alaryhmien heikon korrelaation. Kun

yhteisfeneettistä korrelaatiota käytetetään dendrogrammin totuudenmukaisuuden arviointiin, tulisi

siis tarkastella puun kaikkien haarojen arvoja, ja vetää johtopäätökset kokonaisuudesta. Tässä

tutkimuksessa huonot korrelaatioarvot kaukaisempien ryhmien välillä kertoivat, ettei UPGMA-puu

ole kattava tapa kuvata näin monimuotoista analyysimateriaalia. Samankaltaisuusmatriiseja

kolmiulotteisessa muodossa esittävät MDS-analyysit täydensivät kuitenkin puiden antamaa

informaatiota, koska yksi lisäulottuvuus mahdollisti esimerkiksi kolmen identtisen arvon

asettumisen yhtä kauas toisistaan.

Usein UPGMA-dendrogrammien muodostamien ryhmien paikkansapitävyyttä ja

evoluutiota arvioidaan suoraan bootstrap-arvoista, joita lasketaan poimimalla tutkittavaa ryhmää

vastaava määrä satunnaisia samankaltaisuusmatriisin arvoja toistuvasti. Bootstrap-otosten

muodostuminen kuvaa ryhmien uudelleenmuodostumisen todennäköisyyttä (Laininen 2001).

Kuitenkin se mitä bootstrap-arvot kertovat fylogeneettisen puun antamista tuloksista, riippuu paljon

analyysimenetelmistä: tutkittavien ominaisuuksien lukumäärä ja suhde toisiin tutkittaviin

ominaisuuksiin (itsenäisyys), taksonien määrä, bootstrap-otosten lukumäärä, dendrogrammin

topologia (rakenne) ja tarkasteltavan ryhmän sijoittuminen sukupuussa vaikuttavat bootstrap-

tulosten käytettävyyteen (Hillis ja Bull 1993). Useimmiten bootstrap-analyysia käytetään

sekvenoitujen geenien tutkimuksissa. Toisaalta Hampl ym. (2001) ovat tukeneet bootstrap-arvojen

käyttämistä myös DNA-sormenjälkimenetelmissä (RFLP, RAPD).

5.2 Tutkittujen bradyritsobien geneettinen diversiteetti

5.2.1 Tilastollisten testien tulokset heikensivät analyysitulosten luotettavuutta jatulkittavuuttaAnalyysituloksille tehdyt tilastolliset testit - dendrogrammien ja matriisien yhteneväisyyttä kuvaava

yhteisfeneettinen korrelaatio sekä fylogeneettisten ryhmien luotettavuutta kuvaava bootstrap-testi –

antoivat heikohkoja arvoja. Dendrogrammeissa yhteisfeneettiset korrelaatiot on merkitty jokaisessa

puun haarassa, ja 70% ylittävät bootstrap-arvot niiden viereen (kuvat 4.1b-4.6b).

Yhteisfeneettiset korrelaatioarvot osoittivat, että symbioosigeenien analyysitulokset

kuvautuivat hyvin dendrogrammeissa (kuvat 4.5b ja 4.6b). Toisilleen kaukaisemmat ydingeeni-,

ITS- ja AFLP-ryhmät sen sijaan näyttävät yhteisfeneettisen korrelaation perusteella olevan liian

61

monimutkaisissa suhteissa toisiinsa dendrogrammilla kuvattaviksi, koska suuri osa arvoista oli 80%

(kuvat 4.1b ja 4.2b). MDS-analyysien rakentamat monimutkaiset dendrogrammit osoittivat, että

ryhmien suhteiden kuvaamiseen tarvittiin kolmas ulottuvuus.

Huomioin tuloksissa vain 70% ylittävät bootstrap-arvot Hillisin ja Bullin (1993)

mukaan, koska tutkimuksessaan Hillis ja Bull esittivät, että aidosti yhtenäisissä ryhmissä bootstrap-

arvot olivat >70%. Simulaatioissaan he tosin käyttivät virusten DNA-sekvenssejä. Omissa RFLP-

tuloksissani yleensä vain 100% samankaltaisten kantojen muodostamien joukkojen bootstrap-arvot

ylittivät 70%. Jopa yhteisfeneettisen korrelaation tukemissa ryhmissä hyvät bootstrap-arvot olivat

harvinaisia (kuvat 4.1b-4.6b). Jos ryhmällä oli hyvät arvot (>70%) voitiin olettaa, että ryhmien

sisältämien kantojen läheinen sukulaisuus oli hyvin todennäköistä. Alemmat bootstrap-arvot tukivat

lähinnä oman työni aiempia AFLP- ja RFLP-analyysien tuloksia tutkittujen kantojen suuresta

genomisesta diversiteetistä. Lisäksi bootstrap-arvot jäivät yleisellä tasolla viitteitä antaviksi arvoiksi,

koska Hillisin ja Bullin (1993) mainitsemia bootstrap-arvojen luotettavuuteen vaikuttavia

ominaisuuksia ei tässä tutkimuksessa käytettyjen menetelmien osalta tunnettu.

Bootstrap-testit antoivat erittäin heikkoja arvoja suuremmille ryhmille. Yleensä 100%

samankaltaisten kantojen muodostamat ryhmät saivat hyviä bootstrap-arvoja (yli 90%), mutta

kaukaisemmat erittäin huonoja (0-60%). Erityisesti glnII-analyysin UPGMA-puun bootstrap-arvot

olivat heikot. Bootstrap-testin tulokset vahvistivat, että UPGMA-puiden ryhmien luotettavuus on

suurimmillaan hyvin samankaltaisilla kannoilla. Huonot bootstrap-arvot kertovat, että satunnais-

otannoissa kyseiset kannat eivät johdonmukaisesti asetu samaan ryhmään. Tästä voidaan

päätellä, että nämä kannat eivät ole tarpeeksi samankaltaisia.

5.2.2 AFLP maapähkinää ja kudzua nystyröivien Bradyrhizobium-kantojengenomisen diversiteetin kuvaajanaAFLP-analyysin tulokset osoittivat, että tähän tutkimukseen sisältyneet Bradyrhizobium-kannat

olivat kokonaisgenomiltaan hyvin heterogeenisiä (ks. kpl 4.2). Kiinalaista maapähkinää

nystyröivien kantojen diversiteettiä on kuvattu aiemmissa kiinalaisten tutkijoiden tekemissä

tutkimuksissa: Useat tässä tutkimuksessa käytetyt, Kiinan Sichuanin maakunnassa kerätyt

maapähkinäkannat olivat samoja, joita Zhang ym. (1999) ja Chen ym. (2003) ovat tutkineet

aiemmin (ks. taulukko 3.1). Vaikka Zhangin ym. käyttämät menetelmät rep-PCR (kokonaisgenomin

analyysi), 16S rDNA:n RFLP ja FAME-rasvahappoanalyysi eroavat AFLP-analyysistä, myös niiden

antamat tulokset osoittivat tutkimuksessa käytettyjen kantojen laajaa geneettistä diversiteettiä.

Chenin ym. (2003) AFLP-analyysit osoittivat samankaltaista ryhmittymistä kuin tämän tutkimuksen

AFLP-analyysi.

Kudzun symbionttien ryhmittyminen kolmeen eri ryhmään (ks. kpl 4.2) ja niiden

eroaminen maapähkinän symbionteista noudatti aiempia AFLP-analyysituloksia (Chen 2004).

62

Useiden ominaisuuksien erojen perusteella Chen ym. (2004) ehdottivatkin niiden edustavan uusia

Bradyrhizobium-lajeja. Maantieteellinen alue ja isäntäkasvilaji olivat määräävä ryhmittelijä sekä

kiinalaisten tutkimuksissa että omassani.

5.2.3 Genomisen diversiteetin heijastuminen ITS-alueeseen16S- ja 23S- rDNA:n välissä sijaitseva ITS-alue vaihtelee enemmän kuin taksonomiassa lajin-

määritykseen käytetyt ribosomaaliset 16S- ja 23S-geenit. ITS-alueen sekvenssivaihtelua on

käytetty esim. ”alalajien” tunnistukseen (Terefework 2002, Tan ym. 2001). Koska Bradyrhizobium-

suvun edustajilla on tiedettävästi vain yksi ribosomaalisia alayksiköitä koodaava operoni, sopii ITS-

alue hyvin kuvaamaan bradyritsobien suurta diversiteettiä (Tan ym. 2001, Kündig ym. 1995).

Willems ym. (2001) vertailivat Bradyrhizobium-kantojen ITS-sekvenssien ja AFLP-

profiilien perusteella muodostettujen ryhmien suhdetta lajien sukulaisuuden määrittelyssä

käytettyyn DNA-DNA-hybridisaatioon. Tutkimuksen tulos oli, että DNA-DNA-hybridisaatio-

samankaltaisuus ja ITS-sekvenssi antavat bradyritsobien taksonomisista suhteista samankaltaista

tietoa. AFLP sen sijaan ei heijastanut Bradyrizobium-kantojen lajiutumista yhtä tehokkaasti kuin

ITS-sekvenssi. Esimerkiksi 40-60 % DNA-DNA-homologia ei välttämättä näkynyt AFLP-

analyysituloksissa, mutta heijastui ITS-alueen sekvenssianalyyseissä (Willems ym. 2001).

Tutkimukseni tulokset tukivat Willemsin ym. (2001) johtopäätöksiä, koska ITS-RFLP- ja AFLP-

analyysit kuvasivat Bradyrhizobium-kantojen diversiteettiä pitkälti samoin. Muodostuneet ydin- ja

symbioosigeeniryhmät eivät systemaattisesti liittyneet yhteen (ks. taulukko 4.3), mutta ITS-

ryhmissä kuvautui usein geenien mosaiikkimainen järjestäytyminen. AFLP-ryhmät muistuttivat ITS-

ryhmiä, mutta pilkkoivat ryhmät vielä pienemmiksi.

Alalajien erottelu ITS-alueen perusteella on bradyritsobeilla kyseenalaista niiden

genomisen vaihtelun vuoksi. Jos tarkastellaan tässä tutkimuksessa analysoitujen kantojen ITS-

alueiden samankaltaisuutta vain 50%:n arvolla, voidaan analyysituloksissa nähdä kantojen

ryhmittyvän ”alalajeittain” isäntäkasvin mukaan (kuvat 4.2a ja 4.2b). Kuitenkin 50% saman-

kaltaisuus on hyvin alhainen samankaltaisuus, ja näin muodostuneiden ”alalaji”-ryhmien sisäinen

ITS-alueen diversiteetti on edelleen erittäin suuri. Lisäksi näin muodostetussa alalajien

ryhmittelyssä B. canariense (isäntäkasvi C. proliferus) joutuisi kiinalaista maapähkinää nystyröivien

Bradyrhizobium-kantojen ryhmään, eli isäntäkasvikaan ei olisi perusteltu alalajeja ryhmittelevä

tekijä. Kokonaisgenomin suuren vaihtelun vaikutuksesta ITS-alue muodosti erittäin runsaasti pieniä

ryhmiä, jotka kuvaavat pikemmin populaatioita kuin alalajeja (kuvat 4.2a ja 4.2b sekä taulukko 4.3).

5.2.4 Ydin- ja symbioosigeenien erilaisen ryhmittymisen taustaaKoska ydingeeneillä on ratkaiseva rooli mikrobin perusaineenvaihdunnan ylläpidossa, niiden

sekvenssissä voi tapahtua vain hyvin pieniä muutoksia hyvin pitkän ajan kuluessa (suuret ja

nopeat muutokset ovat yleensä letaaleja). Tällä lähtöoletuksella tutkin ryhmittyivätkö ydingeenit

63

ribosomaalisen 16S-geenin mukaisesti, mutta tulokset osoittivat, että ydingeenienkin diversiteetti

oli suuri. Jos siis ydingeenien oletetaan olevan muuntumattomampia kuin esim. symbioosigeenien,

voidaan olettaa että tässä työssä tutkitut Bradyrhizobium-kannat edustivat hyvin suurta määrää

erilaisia Bradyrhizobium-sukuun kuuluvia lajeja.

Tutkimuksessani recA noudatti pitkälti ITS-alueen mukaista ryhmittymistä, mutta glnII

osoitti suurempia eroja (kpl 4.3.2 ja 4.3.3). Myös Turner ja Young (2000) havaitsivat

glutamiinisyntetaasientsyymien ja ribosomaalisen 16S-alayksikön geenejä tutkiessaan, että

bakteereilla yleisemmän glutamiinisyntetaasi I -entsyymin geeni (glnI) ja 16S-rDNA noudattivat

samanlaista ryhmittymistä, mutta glnII erosi näistä selvästi. Tutkimuksessani glnII erosi usein recA-

geenin ja ITS-alueen yhteisistä ryhmistä, mutta se ei liittynyt selvästi myöskään

symbioosigeeneihin. Turner ja Young (2000) esittivätkin, että ydingeeneihin lukeutuva glnII olisi

siirtynyt horisontaalisesti ritsobisukujen välillä. Ottaen huomioon sen, että glutamiinisyntetaasi II-

entsyymi on bakteereilla huomattavasti harvinaisempi kuin glutamiinisyntetaasi I (Kumada ym.

1993), on teoria hyvinkin mahdollinen. Kuitenkin tämän tutkimuksen tulokset näyttävät, että mikäli

geeni siirtyy horisontaalisesti bakteeripopulaatioissa, se ei todennäköisesti siirry yhdessä

symbioosigeenien kanssa, koska symbioosigeeniryhmät olivat erilaisia kuin glnII-geenin

perusteella muodostuneet ryhmät.

Sekä kasvin että bakteerin on kyettävä tuottamaan oikeanlaisia kommunikaatioon

tarvittavia molekyylejä, jotta isäntäkasvin nystyröinti onnistuisi. nod-geenien rakennemuutokset

heijastuvat ritsobien tuottamien Nod-tekijöiden rakenteisiin (Debellé ym. 2001). Tutkimukseni

tuloksissa nodC-geenit ryhmittivät kantoja sen mukaan mistä kasvilajista ne oli eristetty (kpl 4.3.5),

ja yksi nodC-geeniryhmä saattoi sisältää useita erilaisia ITS-alueen ja ydingeenien muodostamia

kantaryhmiä. Tämä osoittaa, että isäntäkasvia voi nystyröidä usea erilainen Bradyrhizobium-kanta,

jos bakteeri kykenee tuottamaan oikeanlaisia Nod-tekijöitä.

Nod-tekijöiden erilaiseen substituointiin liittyviä geenejä on erittäin paljon, ja niiden

erilaiset yhdistelmät ritsobeissa mahdollistavat erittäin laajan Nod-tekijävalikoiman maaperässä.

Moulin ym. (2004) osoittivat, että nod-geenit voivat vaihdella Bradyrhizobium-suvun sisällä

runsaasti. Siksi bradyritsobit ovat isäntänsä suhteen laaja-alaisia. Myös tutkimukseni nodC-

analyysit viittasivat siihen, että kantojen nodC-geeni oli erityisen erilaistunut, eli kannat olivat

kehittäneet spesifisiä nystyröintitekijöitä erilaisille kasveille. Useiden isäntäkasvien tehokkaaseen

nystyröintiin kykenevät bakteerit lisääntyvät runsaasti, jolloin niiden geenien leviäminen on toden-

näköisempää (Stepowski ym. 2003). On jopa esitetty, että nystyröintigeenit olisivat tällaisen

luonnonvalinnan kautta kehittyneet kasvien yhteyteen (Stepowski ym. 2003, Ueda ym. 1995).

Tähän tutkimukseen valittiin useita erilaisia isäntäkasveja nystyröiviä Bradyrhizobium-

kantoja. Tuloksista huomattiin, että sama Bradyrhizobium-laji saattoi nystyröidä usean eri suvun

isäntäkasvia. Bradyritsobien laajaa isäntäkasvivalikoimaa on esitellyt myös esimerkiksi Perret ym.

(2000). Tutkimieni Bradyrhizobium-kantojen nodC-RFLP:n perusteella muodostui kaksi erilaista

64

maapähkinää nystyröivien kantojen ryhmää: toisessa ryhmässä isäntäkasveina olivat maapähkinä

(Arachis) ja Indigofera-suvun palkokasveja, toisessa ryhmässä maapähkinä ja soijapapu (Glycine).

Ryhmät erosivat toisistaan nodC-geenin rakenteen osalta, mikä viittaa siihen, että kannoilla on

todennäköisesti jossain määrin erilaiset Nod-tekijät. Voidaankin pohtia onko maapähkinä erityisen

laaja-alainen symbionttinsa suhteen, koska sitä vaikuttaa nystyröineen sekä soijapapua nystyröiviä

bradyritsobeja että Indigofera-kasvia nystyröiviä bradyritsobeja.

Urtzin ja Elkanin (1996) tutkimus bradyritsobien symbioosigeenialueista (nifDK ja

nodABC) osoitti, että nod- ja nif-alueet ryhmittivät kantoja samoin, vaikka nod-alueen geeneissä oli

enemmän variaatiota. Tämä tutkimus kattoi kaksi yksittäistä geeniä Urtzin ja Elkanin (1996)

tutkimilta alueilta, mutta heidän tulostensa trendi oli samansuuntainen omien tulosteni kanssa:

Bradyrhizobium-kantojen nodC-geeni osoitti tutkituista geeneistä yhtenäisintä ryhmittymistä, ja

toisaalta suurimpia rakenne-eroja kantojen välillä. Molemmissa tutkimuksissa nifH ryhmitti kantoja

enemmän samansuuntaisesti nodC-geenin kanssa kuin ydingeenit. Tutkimuksessani

symbioosigeenien samankaltaisuus korreloi yleisen genomisen samankaltaisuuden kanssa, kuten

myös Urtzin ja Elkanin tutkimuksessa (1996). ”Yleinen genominen samankaltaisuus” näkyi ITS-

ryhmien ja ydingeeniryhmien yhdistyessä muutaman kannan käsittäviksi ryhmiksi. Näihin ryhmiin

kuuluvilla kannoilla oli yleensä myös samankaltaiset symbioosigeenit.

Symbioosigeenien samankaltainen ryhmittyminen perustunee siihen, että

Bradyrhizobium-suvussa symbioosigeenit liittyvät kromosomiin yhtenäisenä symbioosisaarekkeena

(Göttfert ym. 2001, Kaneko ym. 2002). B. japonicum –tyyppikanta USDA 110:n kokonaisen

genomin sekvenointi osoitti, että symbioosigeenien alue oli erilainen kuin muu genomi:

Perusgenomin G+C -sisältö poikkesi selvästi symbioosisaarekkeen vastaavasta (Kaneko ym.

2002). Lisäksi sekvennoidun B. japonicum –kannan genomi sisälsi runsaasti transposaasigeenejä,

joista suurin osa sijoittui symbioosisaarekkeeseen. Löydöt vahvistivat oletusta siitä, että symbioosi-

geenit voivat siirtyä horisontaalisesti kromosomista toiseen. Voi olla, että geenien liittyminen

kromosomiin asettaa suuremmat vaatimukset kohdegenomin rakenteelle, mikä selittäisi usein

havaittua symbioosigeenien ryhmittymistä ”yleisen genomisen samankaltaisuuden” mukaan

(Moulin ym. 2004, Wernegreen ja Riley 1999, Urtz ja Elkan 1996). On esitetty, että

Bradyrhizobium-suku olisi vaihtanut horisontaalisesti myös glnII-ydingeenejä Mesorhizobium-suvun

kanssa (Turner ja Young 2000). Sekä Bradyrhizobium- että Mesorhizobium-suvuissa kaikki geenit

sijaitsevat yhdessä kromosomissa, ja geenien siirtymisen mahdollistavien transposaasien geenejä

on löydetty molemmista suvuista (Kaneko ym. 2002, Sullivan ja Ronson 1998).

Millainen merkitys on horisontaalisella geeninsiirrolla bakteeripopulaatioissa, kun

bradyritsobien geenien diversiteetti on tässäkin tutkimuksessa havaittu erittäin laajaksi verrattuna

16S rDNA:han perustuviin lajinmäärityksiin? B. japonicum –tyyppikannan genomista löytyneet

symbioosisaarekkeen ulkopuoliset transposaasigeenit (Kaneko ym. 2002) sekä tämän tutkimuksen

kantojen glnII-geenien ryhmittyminen antavat aiheen uskoa, että ydingeenitkin voivat siirtyä

65

horisontaalisesti. Tämän tutkimuksen bradyritsobien geenien mosaiikkimainen järjestyminen

genomeissa viittaisi siihen, että Bradyrhizobium-suvussa geenit siirtyisivät joko herkemmin tai eri

tavalla kuin yleisemmin tutkituissa ritsobeissa. Bradyritsobien geenien herkästä siirtymisestä tai

omalaatuisesta järjestäytymisestä on todisteena Krausen ym. (2002) tutkimus kolmen eri ritsobi-

suvun tts-alueen rakenteesta. Krause ym. (2002) huomasivat, että isäntäspesifisyyteen vaikuttavan

III-tyypin erityssysteemin (Type III Secretory System) geenit sijoittuivat tutkitun B. japonicum –

kannan tts-alueessa hyvin eri tavalla kuin M. loti- ja R. sp. NGR234 –kantojen vastaavat. Kun R.

sp.- ja M. loti –kantojen tts-alueella geenit sijoittuivat pitkälti samassa järjestyksessä samoille

puolille aluetta, B. japonicum –kannan yksittäiset geenit olivat sijoittuneet usein päinvastaisille

puolille tts-aluetta ja lisäksi eri järjestyksessä. Tutkimieni Bradyrhizobium-kantojen geenien

mosaiikkimainen yhdistyminen genomissa vaikuttaa samalta kuin Krausen ym. (2002) havaitsema

tts-alueen poikkeuksellinen rakenne. Bradyrhizobium-suvun genomin mosaiikkimaisuutta on

havaittu myös uusimmissa tutkimuksissa (Lindström 2006, suullinen tiedonanto). Johtuuko ilmiö

siitä, että Bradyrhizobium-suvun edustajat kykenevät siirtämään geenejä suvun sisällä erityisen

aktiivisesti, vai onko mosaiikkimaisen genomin ominaisuus vain muutamien yksittäisten kantojen

erikoisuus? Asiaa voisi selvittää jatkossa esimerkiksi vertaamalla bradyritsobien

symbioosisaarekkeen rakennetta (Göttfert ym. 2001) muiden ritsobien symbioosisaarekkeiden tai

symbioosiplasmidien rakenteisiin, tai vertaamalla B. japonicum –kannan koko genomin sekvenssiä

(Kaneko ym. 2002) muiden ritsobien kokonaiseen sekvenssiin. Tietenkään yhden kannan genomi

ei kerro koko totuutta sen edustaman suvun diversiteetistä, mutta B. japonicum –kannan avulla

kyettäisiin mahdollisesti todistamaan genomin erilainen rakenne muihin ritsobeihin verrattuna. Siitä

eteenpäin Bradyrhizobium-suvun geenien siirtymismekanismit ja –spesifisyys olisivat erittäin

mielenkiintoisia tutkimuskohteita.

5.2.5 Typensidonnan tehokkuuden mahdolliset vaikutukset genomiinEräs kantojen genomin käyttäytymistä selittävä seikka voi olla niiden erilainen kyky muodostaa

symbiooseja isäntäkasvin kanssa, sekä niiden typensidontateho juurinystyrässä.

Symbioositehokkuus voi vaikuttaa isännän valintaan pidemmällä aikavälillä, koska isäntäkasvi

usein suosii tehokasta typensitojakantaa (Kiers ym. 2003). Symbioosigeenien perusteella

määritettävä symbioosigeenityyppi heijastaa usein bakteerin symbioositehokkuutta (Laguerre ym.

2003, Urtz ja Elkan 1996). Tutkimuksessani symbioosigeenityypit sisälsivät myös ydingeeneiltään

erilaisia Bradyrhizobium-kantoja. Tämä kertoo siitä, että symbioosigeenityypit mahdollistavat

useammanlaisen kasvi-bakteeri –vuorovaikutussuhteen: Joko isäntäkasville sopii usea erilainen

symbiontti, tai Bradyrhizobium-kannoille usea erilainen isäntäkasvi. Joka tapauksessa tässä

tutkimuksessa analysoidut kannat olivat hyvin sopeutuvia ja muutoskykyisiä.

Palkokasvin nystyröissä voi myös elää myös parasiittisia bakteereja, jolloin vain osa

nystyrässä elävistä bakteerilajeeista sitoo tehokkaasti typpeä (Denison ja Kiers 2004).

66

Parasiittisten nystyräbakteerien nystyröintigeenit auttavat bakteereita pääsemään juurinystyrään ja

lisääntymään siellä, mutta niiden typensidontageenit eivät sovi isäntäkasvin yhteyteen. Nystyröivät

parasiittiset bakteerit ovat voineet saada geeninsä myös horisontaalisen geeninsiirron myötä.

Parasitismi-ilmiö voi olla taustalla tutkimukseni nifH-analyysissa, jossa B. elkanii (USDA76) –

tyyppikanta päätyi ryhmänsä (kuva 4.5a) ainoaksi soijapavusta (G. max) eristetyksi kannaksi.

Rakenne-erot nifH-geenissä heijastavat todennäköisesti typensidontatehoa, koska geenillä

tuotetaan typpeä sitovan nitrogenaasientsyymin toista alayksikköä. Tutkimukseni nifH-RFLP-

tulosten mukaan USDA76 –tyyppikanta sijoittui samaan ryhmään usean kiinalaisen maapähkinä-

kannan kanssa, mutta erosi selvästi muista B. elkanii –kannoista, jotka nystyröivät kudzua.

Kuykendall ym. (1992) esittivät, että tyyppikanta USDA76 eläisi soijapavun juurinystyröissä

parasiittina, koska ko. kannalla siirrostetut soijapavut eivät sitoneet typpeä. Kanta ei soijapavun

juurinystyröissä muodostanyt aktiivista, typpeä sitovaa nitrogenaasientsyymiä. Sen sijaan Vigna

unguiculata-kasvin juuristossa kannan indusoimat nystyrät sitoivat typpeä aktiivisesti. Tämä

havainto voidaan seillää kahdella mahdollisella teorialla: i) Soijapavulle parasiittinen B. elkanii

USDA76 voi edustaa eri symbioosifenotyyppiä (biovaari) kuin 16S rDNA:n perusteella B. elkanii –

lajiksi tunnistetut kudzukannat, ja erilaisten symbioosiominaisuuksiensa takia kanta voi sitoa

maapähkinän juuristossa typpeä, tai ii) USDA76:n edustama Bradyrhizobium-ryhmä voi sisältää

maapähkinää nystyröiviä parasiitteja, mikäli nifH-geenin tuottama nitrogenaasin alayksikkö on

inaktiivinen maapähkinässä.

On mahdollista, että eri isäntäkasvit (soijapapu, kudzu ja maapähkinä) vaativat

symbiontiltaan erilaisen nitrogenaasigeenin rakenteen. Kasvikokein voitaisiin jatkossa selvittää

seuraavia asioita: 1) Voiko soijapapua nystyröivä kanta nystyröidä muita kasveja. Esimerkiksi

tässä tutkimuksesssa B. japonicum –tyyppikanta (USDA6), jonka tiedetään sitovan typpeä

aktiivisesti soijapavun nystyröissä (Jordan 1982), ryhmittyi kauas maapähkinän nystyrä-

bakteereista. Toisaalta USDA6 –tyyppikannan typensidontatehoa maapähkinässä ei ole testattu,

joten kyseisen B. japonicum –kannan isäntäspesifisyyttä ei tiedetä. 2) Onko kudzu valikoiva

symbionttinsa suhteen? Tässä tutkimuksessa havaittiin, että kudzua nystyröivällä B. japonicum –

kantaryhmällä ja B. elkanii –kantaryhmällä oli erilaiset nifH-geenit. Sopiko kudzun tehokkaaseen

nystyröintiin kaksi erirakenteista nitrogenaasientsyymiä vai oliko toinen kannoista parasiitti? 3)

Tuottiko kaksi erirakenteista nifH-geeniä identtisiä nitrogenaasin alayksikköjä? Jos kaikki

kasvikokeet osoittavat, että typensidontaa tapahtuu huolimatta erilaisesta nifH-geenistä, voi

taustalla olla nonsense-mutaatio, joka ei lopulta vaikuta geenin koodaaman proteiinin

rakenteeseen.

67

5.2.6 Palkokasvien juurinystyröiden erilaisten infektiomekanismien heijastuminenniitä nystyröivien bakteerikantojen diversiteettiinPalkokasvien juurinystyröiden tiedetään infektoituvan ainakin kahdella erilaisella mekanismilla:

infektiolangan avulla ja sivujuuren tyvihalkeaman kautta (mm. Hirsch 1992, Boogerd ja van

Rossum 1997). Eniten tutkittu nystyröintimekanismi on infektiolangan avulla tapahtuva

nystyränmuodostus (mm. Hirsch 1992), jolla esimerkiksi soijapapu infektoituu (Pueppke 1983).

Maapähkinän nystyrät puolestaan infektoituvat bradyritsobien tunkeutuessa juureen lateraalijuuren

tyvihalkeaman kautta (Boogerd ja van Rossum 1997). Juurihalkeama-infektiomekanismia ei

tunneta vielä yhtä kattavasti kuin infektiolangan avulla tapahtuvan nystyröinnin biologiaa. Useiden

kasvien juurinystyröiden on todettu infektoituvan juurihalkeaman kautta, mutta Nod-tekijöiden rooli

prosesseissa vaihtelee (Webster ym 1998, O’Callaghan ym. 1997). Nystyröiden erilaisten

infektiomekanismien taustalla voi olla hyvinkin erilainen signalointi. Esimerkisi O’Callaghanin ym.

(1997) tutkimuksessa havaittiin, että Sesbania rostrata -kasvin infektioon juurihalkeaman kautta ei

tarvita lainkaan Nod-tekijöitä. Jos Nod-tekijöillä ei ole merkitystä kommunikaatiomolekyyleinä, on

typpeä sitovan nystyrän muodostuksessa toimittava muita kasvin ja bakteerin vuoropuhelun

mahdollistavia molekyylejä. On siis mahdollista, että myös maapähkinän juurinystyröiden infektioon

liittyy muita kuin Nod-tekijöitä, eikä isäntäspesifisyys välttämättä näy nodC-analyysien tuloksissa.

Toinen havainto tutkimukseni tuloksissa, joka mahdollisesti liittyi infektiomekanismiin,

oli Bradyrhizobium-kantojen erilainen isäntäspesifisyys. Kudzua nystyröi kaksi hyvin erilaista

kantaryhmää, joista toinen sisälsi B. japonicum –kantoja ja toinen B. elkanii –kantoja. Selittäisikö

epäspesifinen infektiomekanismi sen, että kudzu ei ole spesifinen symbionttinsa suhteen? Asian

voisi selvittää yksinkertaisesti tarkastelemalla kudzun infektioprosessia. Mikäli myös kudzun

juurinystyrät infektoituvat juurihalkeaman kautta, voidaan olettaa, että maapähkinän infektio-

mekanismi on syynä sen symbionttien suureen geneettiseen diversiteettiin.

5.3 Maapähkinää (Arachis hypogaea) ja kudzua (Pueraria lobata)

nystyröivät bradyritsobit horisontaalisen geeninsiirron valossa

Fylogeneettiset tutkimukset ovat osoittaneet, että Bradyrhizobium-suvun lajit ovat hyvin kaukaisia

sukulaisia muille ritsobisuvuille (Sawada ym. 2003). Toisaalta bradyritsobien monet yhteiset

ominaisuudet muiden ritsobien kanssa (kyky muodostaa symbiooseja palkokasvien kanssa sekä

symbioosigeenien samankaltaisuus) tukevat teoriaa, jonka mukaan ritsobien symbioosigeenit

voivat siirtyä horisontaalisesti myös kaukaisempiin bakteerisukuihin (Gogarten ym. 2002).

Ritsobisukujen erilaisuuden vuoksi symbioosigeenien evoluutiosta on esitetty muun muassa, että

68

kasvi-bakteeri –vuorovaikutuksen mahdollistavat geenit olisivat alun perin kehittyneet yhtenä

”pakettina”, joka olisi levinnyt useisiin bakteerilajeihin, ja erilaistunut aikojen kuluessa kasvien

vaatimusten mukaan (esim. Moulin ym. 2004, Stepowski ym. 2003).

On esitetty, että horisontaalinen geeninsiirto tapahtuisi Bradyrhizobium-suvussa

pääasiassa suvun sisällä lajilta ja kannalta toiselle, ja että bradyritsobien vuorovaikutus muiden

ritsobisukujen kanssa olisi vähäistä (Moulin ym. 2004). Ilmiötä voi selittää se, että bradyritsobien

genomi koostuu vain yhdestä kromosomista, ja niiden geeniensiirtymismekanismi on erilainen kuin

esimerkiksi sym-plasmidia kantavilla ritsobisuvuilla (Kaneko ym. 2002, Sullivan ja Ronson 1998).

Bradyritsobien geenien on myös havaittu sijoittuvan genomiin eri tavoin kuin joissain toisissa

ritsobisuvuissa (Krause ym. 2001), mikä voi viitata aktiiviseen geenien siirtymiseen.

Tutkimuksessani Bradyrhizobium-suvun mahdollisesti aktiivista geenien vaihtoa kuvastivat i)

geenien suhteen ”mosaiikkimaisiksi” muodostuneet kantaryhmät, ii) Bradyrhizobium-kantojen suuri

geneettinen diversiteetti verrattuna harvoihin 16S rDNA-sekvenssin perusteella määritettyihin

lajeihin ja iii) laaja isäntäkasvivalikoima harvojen lajien keskuudessa.

Maantieteellinen etäisyys rajoittaa luonnollisesti populaatioiden geeninvaihtoa, mikä

näkyy bakteerikantojen i) alueellisena samankaltaisuutena ja ii) eri alueilla niiden välisenä

erilaisuutena (Zhang ym. 1999, van Rossum ym. 1995). Horisontaalinen geeninsiirto on aktiivisinta

samassa ympäristössä elävien kantojen kesken, mikä havaittiin myös tässä tutkimuksessa tiettyjen

kiinalaisten kasvilajien nystyräbakteerien samankaltaisuutena (Lespedeza, Pueraria).

Maapähkinäkantojen eroja voivat kuitenkin maantieteellisen etäisyyden lisäksi selittää myös

isätntäkasvin genomin erot (Chen ym. 2003, Wilkinson ym. 1996). Esimerkiksi Chen ym. (2003)

vertailivat erilaisten maapähkinälajikkeiden ja bradyritsobien yhteensopivuutta nystyröinti- ja

typensidontakyvyn kannalta. He huomasivat, että jotkut maapähkinälajikkeet muodostivat typpeä

sitovia nystyröitä useammanlaisten bradyritsobien kanssa, toiset vain tietyn bradyritsobikannan

kanssa. Horisontaalinen geeninsiirto ei siis ole ainoa diversiteettiin vaikuttava tekijä.

Bradyrhizobium-suvun bakteerit elävät ja nystyröivät maapähkinää ympäri maailmaa (Chen ym.

2003, Saleena ym. 2001, Zhang 1999, Urtz ja Elkan 1996). Yleisesti oletetaan, että maapähkinä on

alun perin kotoisin Etelä-Amerikasta, josta nykyisin Kiinassa viljeltävät lajikkeet on 1600-luvulla

tuotu kauppiaiden mukana Kiinaan. On myös esitetty, että Kiinassa viljeltiin erilaisia

maapähkinälajikkeita jo tätä ennen (Yao 2004). On siis mahdollista, että paikallinen

bradyritsobikanta on sopeutunut uuteen kasvilajiin, mutta on myös esitetty että maapähkinän

mukana on tullut vieraita bakteerikantoja jotka ovat sopeutuneet uusiin maaperäolosuhteisiin.

Tämän tutkimuksen taustalla oli kolme erilaista teoriaa maapähkinää nystyröivien bradyritsobien

alkuperästä. Tuloksista ei voida johtaa suoria vastauksia kysymyksiin, mutta niistä voidaan

kuitenkin päätellä jotain:

69

i) Mahdollistiko symbioosigeenien horisontaalinen kulkeutuminen paikallisten kantojen

sopeutumisen uuteen kasvilajiin, eli maapähkinään?

Tutkimuksessa analysoitujen Bradyrhizobium-kantojen mosaiikkimainen genomi tuki

vahvasti geenien siirtymisteoriaa, mutta geenien siirtymisen määrää ja suuntaa on vaikea arvioida.

Koska kudzua ja maapähkinää nystyröivät kannat olivat niin erilaisia, voidaan olettaa, että

maapähkinää nystyröivät kannat eivät olleet peräisin kudzusta. Toisaalta maapähkinää nystyröi

useita pieniä ryhmiä hieman erilaisia Bradyrhizobium-kantoja, mikä voi tarkoittaa maapähkinän

olevan laaja-alainen symbionttinsa suhteen. Kun lisäksi tiedetään, että bradyritsobit voivat

nystyröidä useampaa isäntäkasvia (Perret ym. 2000), on todennäköistä että tulokaslaji on saanut

symbiontikseen paikallisten palkokasvilajien symbiontteja.

On mahdollista, että nykyisin viljeltäviin maapähkinälajikkeisiin on sopeutunut 1300-

luvulla viljeltyä kiinalaista maapähkinää nystyröineitä bakteerikantoja. Mikäli Kiinan maaperässä on

jo valmiiksi ollut maapähkinän nystyröinnin mahdollistavia ”geenipaketteja”, on horisontaalinen

geenien siirtyminen ollut helppoa. Avoimeksi kysymykseksi jää, mistä vanhempi maapähkinälaji on

kotoisin, mistä sitä nystyröivät Bradyrhizobium-kannat ovat tulleet, ja kuinka kauan kannoilla on

ollut aikaa muuntua maapähkinän tehokkaiksi symbionteiksi

ii) Saapuivatko bakteerit Kiinaan maapähkinän siementen mukana?

Tämän tutkimuksen tuloksissa teoriaa vastustaa se, että kiinalaiset bradyritsobit olivat kaukaisia

sukulaisia kansainvälisiin maapähkinää nystyröineisiin vertailukantoihin. Jos bradyritzobit olisivat

saapuneet siementen mukana Kiinaan, niillä olisi ollut vain muutamia vuosisatoja aikaa muuntua

nykyisenkaltaisiksi kannoiksi. Kansainvälisten vertailukantojen ja kiinalaisten maapähkinäkantojen

genomien erot olivat tuloksissani niin suuria, että voidaan epäillä olisiko 500-700 vuoden

maapähkinänviljely Kiinassa riittänyt niin suureen bradyritsobien erilaistumiseen.

Lisäksi kiinalaisten maapähkinäkantojen muodostamat ryhmät olivat ITS-alueen,

ydingeenien ja AFLP:n perusteella yleensä hieman läheisempiä muita kiinalaisia kasveja

nystyröivien kantojen ryhmille, kuin kansainvälisille tyyppi- ja vertailukannoille. Nämä

perusgenomin sukulaisuudesta kertovat tulokset tukivat pikemmin sitä, että paikalliset kannat

olisivat sopeutuneet tulokaskasveihin.

iii) Ovatko kosmopoliitit bradyritsobit poikkeuksellisen aktiivisia geenien siirtäjiä tai mutaatioherkkiä,

ja sen takia sopeutuvat hyvin uusiin tulokaspalkokasvilajeihin?

Bakteerien evoluutio on alkanut jo 1,5 miljardia vuotta sitten (Woese 1987) ja palkokasvien kehitys

vasta 50-60 miljoonaa vuotta sitten (Lavin ym. 2005). Bradyritsobien genomin muuntelukyvystä

kertoo esimerkiksi se, että 16S rDNA:n perusteella määritettäviä lajeja on vähän, mutta näillä

harvoilla lajeilla on suuri geneettinen diversiteetti (esim. tämä tutkimus, Willems ym. 2001, Tan ym.

2001). Bradyritsobit vaihtavat geenejä keskenään, mahdollisesti erilaisella mekanismilla kuin muut

70

ritsobit (Krause 2001, Moulin ym. 2004), ja ovat todennäköisesti sopeutuneet ympäristötekijöihin

vuosimiljoonien aikana. Yksi mahdollinen teoria olisi, että aktiivisen geenien siirtymisen ansiosta

bradyritsobien keskuudessa on muodostunut monipuolinen geenivaranto. Tulokaskasvilajien

saapuessa uusille alueille, kuten tässä tapauksessa maapähkinän saapuessa Kiinaan, olisi brady-

ritsobeilla ollut mahdollisuus sopeutua helposti uusiin isäntäkasveihin.

Tämän tutkimuksen tulokset tukivat teoriaa siitä, että maapähkinän saapuessa

Kiinaan sille valikoitui nystyröintiin sopivia, alun perin kiinalaisia bradyritsobeja. Tutkimuksessa

havaittu kiinalaisten kantojen perusgenomin sukulaisuus (ks. kohta ii) viittaa kantojen yhteiseen

maantieteelliseen taustaan. Tutkittujen kantojen mosaiikkimainen genomi puolestaan viittaa

aktiiviseen geenien vaihtoon kiinalaisten ritsobien välillä. Useiden pienien kantaryhmien

muodostuminen maapähkinää nystyröineistä Bradyrhizobium-kannoista voi johtua siitä, että

maapähkinä ei ole symbionttinsa suhteen erityisen valikoiva. On mahdollista, että useat erilaiset,

jopa eri kasveja nystyröineet bakteerit ovat kyenneet muodostamaan sen kanssa

symbioosisuhteen. Maapähkinän tiedetään nystyröiden tiedetään infektoituvan eri mekanismilla

kuin useiden muiden palkokasvien nystyröiden (Boogerd ja van Rossum 1997). Infektiomekanismi

voi vaikuttaa kasvin spesifisyyteen sitä nystyröivien bakteerien suhteen.

Geenikeskusteorian (gene center theory, Vavilov 1926) mukaan kasvin geneettinen diversiteetti on

suurin alueella, josta kasvi on kotoisin. Palkokasvien tapauksessa myös kasvia nystyröivien

ritsobien diversiteetti on laajin kasvin alkuperäisessä ympäristössä. Kun maapähkinän tiedetään

olevan lähtöisin Etelä-Amerikasta, voisi jatkotutkimuksessa selvittää eteläamerikkalaisten ja

kiinalaisten maapähkinäkantojen geneettistä sukulaisuussuhdetta ja toisaalta isäntäkasvin

geneettistä diversiteettiä. Eteläamerikkalaista maapähkinää nystyröivien Bradyrhizobium-kantojen

diversiteetin laajuus, eri mannerten maapähkinäkantojen sukulaisuus, maapähkinäkantojen

sijoittuminen suhteessa toisen isäntäkasvin (kudzun) symbiontteihin, sekä maapähkinän

maailmanlaajuinen diversiteetti sekä suhde kasvia nystyröiviin erilaisiin bradyritsobikantoihin

voisivat valottaa kiinalaisen maapähkinäsymbiontin historiaa, sekä kertoa paljon uutta

Bradyrhizobium-suvun historiasta ja sen symbioosiominaisuuksista.

5.4 Typensitojabakteereiden käyttö - tulevaisuuden mahdollisuus?

Typensidontasymbioosin tunteminen on ensimmäinen askel sen hyödyntämiseen. Kasvin ja

bakteerin välinen vuorovaikutus on ensisijainen, mutta ei ainoa symbioosinmuodostukseen

vaikuttava tekijä. Ympäristön olosuhteet voivat myös estää teoriassa yhteensopivien lajien

symbioosin. Esimerkiksi maaperän happamuuden vaikutusta bradyritsobien toimintaan ja

71

symbioosinmuodostukseen ovat tutkineet mm. Vinuesa ym. (2004), Angelini ym. (2003) ja Saleena

ym. (2001).

Viherlannoittaminen palkokasveilla, eli kasvuston kyntäminen maahan kasvukauden

lopussa, parantaa maaperän laatua. Viljelykierrossa palkokasvin lannoittava vaikutus saadaan

hyödyksi viljelemällä vuorovuosina palkokasvia ja muita viljelykasveja (Rajala 2004). Etenkin

trooppisilla alueilla harjoitetussa seosviljelyssä (intercropping) viljelykasvien väliin istutetaan

palkokasvia jatkuvan typensidonnan takaamiseksi. Palkokasvien soveltuvuutta myös monivuotisten

energiakasvien (esim. ruokohelpi) lannoitukseen olisi syytä tutkia.

Biologisen typensidonnan suosiminen ei ole uusi käsite, mutta se on kemiallisen

lannoitetuotannon markkinoiden kasvun/kasvattamisen myötä aktiivisesti unohdettu. Teollisten

typpilannoitteiden korvaaminen biologisilla lannotteilla (palkokasvit, biokaasutuksen jäämäliete,

kotieläinten tuottama lietelanta yms.) on nykyisessä maailmassa välttämätön energiansäästötoimi.

Noin kolmannes maanviljelyn energiankulutuksesta johtuu keinotekoisten lannotteiden käytöstä

(esim. Kim ja Dale 2005). Tuntemalla typensidontasymbioosin taustalla olevat tekijät, kuten

bakteerien geneettinen diversiteetti ja toiminta erilaisissa ympäristöissä, voidaan saada aikaan

hyvin toimivia ja luonnollisia typensidontasymbiooseja, sekä mahdollistaa energiankulutuksen ja

talouden kannalta tehokas, ekologisesti kestävä, ja tuottava maanviljelys kaikkialla maailmassa.

6. Johtopäätökset

Tämän tutkimuksen tulokset osoittivat, että i) tutkittujen Bradyrhizobium-kantojen ydin- (recA ja

glnII) ja symbioosigeenien (nifH ja nodC) diversiteetti oli erittäin suuri, ii) nämä geenit eivät

noudattaneet 16S rDNA-sekvenssiin perustuvaa lajijakoa, ja iii) ydin- ja symbioosigeenit

ryhmittyivät hieman eri tavoin. Tutkitut kannat edustivat Bradyrhizobium-suvun bakteereita, joita oli

kerätty eri puolilta maailmaa ja eri isäntäkasveista, mikä selittänee osin niiden suurta diversiteettiä.

Kuitenkin myös samoilta alueilta peräisin olevissa bradyritsobeissa esiintyi suurta geneettistä

vaihtelua. Etenkin useiden pienien ryhmien muodostuminen ydingeeneistä antaa olettaa, että

tutkitut kannat edustivat suurta määrää Bradyrhizobium-lajeja tai alalajeja. Kaiken kaikkiaan

vaikutti siltä, että bradyritsobien genomin rakenteessa on suurta vaihtelua.

Tulokset viittasivat siihen, että Bradyrhizobium-kantojen sukulaisuus liittyi isäntäkasvi-

lajiin ja maantieteelliseen alkuperään. Työn tavoitteisiin kirjattuihin tutkimuskysymyksiin saatiin

seuraavia vastauksia:

72

i) Maapähkinää nystyröivien kiinalaisten Bradyrhizobium-kantojen diversiteetti jalajiutuminen muiden kuin 16S rDNA:n suhteen: Maapähkinää nystyöivien

Bradyrhizobium-kantojen diversiteetti oli suuri. Kantojen genomin rakenne vaihteli sekä

maantieteellisen alkuperän että isäntäkasvilajin perusteella, ja samaa kasvia (sekä

maapähkinää että kudzua) saattoi nystyröidä usea erilainen Bradyrhizobium-kanta.

Samankaltaisten ydin- ja symbioosigeeniryhmien sekä ITS-ryhmien yhdistämät

kantaryhmät olivat kooltaan pieniä, ja heijastivat paremmin osapopulaatioiden kuin

alalajien diversiteettiä.

ii) Kiinassa kotoperäisten villien palkokasvien, kuten kudzun, ja vierasperäisenmaapähkinän symbionttien sukulaisuus: Kiinalaiset Bradyrhizobium-kannat

ryhmittyivät isäntäkasvinsa mukaan, ja niiden isäntäkasvit vaikuttivat symbionttinsa

suhteen laaja-alaisilta. Alun perin aasialaista kudzua nystyröi kaksi hyvin erilaista

kantaryhmää. Kiinalaisten maapähkinäkantojen diversiteetti oli melko suuri, mutta ne

sijoittuivat omana joukkonaan kudzua (sekä villejä kiinalaisia palkokasveja)

nystyröineiden ryhmien väliin.

iii) Kiinalaisten maapähkinää ja luonnon palkokasveja (kudzu, Lespedeza- jaIndigofera-lajit) nystyröivien Bradyrhizobium-kantojen ryhmittyminen eri Brady-rhizobium-lajien tyyppikantoihin ja soijapapua nystyröiviin bradyritsobeihinverrattuna: Kansainväliset tyyppi- ja vertailukannat olivat keskenään hyvin erilaisia,

eivätkä ne muodostaneet tilastollisesti merkittäviä ryhmiä. Kiinalaisten kantojen

muodostamat pienet ryhmät muodostivat seuraavia joukkoja: ”maapähkinää

nystyröivien kiinalaisten Bradyrhizobium-kantojen joukko”, ”kudzua nystyröivien B.

japonicum –kantojen joukko” sekä ”kudzua nystyröivien B. elkanii –kantojen joukko”.

Nämä joukot olivat kaukaisia kansainvälisille tyyppi- ja vertailukannoille. Soijapapua

nystyröivien kansainvälisten vertailukantojen sijoittumista ei voitu luotettavasti vertailla

tässä yhteydessä, koska kantoja oli hyvin vähän, ja koko tutkimuksen Bradyrhizobium-

kantojen diversiteetti oli hyvin suuri.

Tulosten tarkastelun alussa esitettyihin kysymyksiin maapähkinää nystyröivien Bradyrhizobium-

kantojen alkuperästä saatiin suuntaa antavia vastauksia. Kaikissa esitetyissä teorioissa oli

horisontaalinen geeninsiirto suuressa osassa:

i) Mikäli symbioosigeenin horisontaalinen kulkeutuminen mahdollisti paikallistenkantojen mukautumisen tuontikasviin eli maapähkinään, oli maapähkinän

nystyröinnin mahdollistavia geenejä paikallisessa maaperässä jo ennen maapähkinän

saapumista. Maapähkinää nystyröineiden kantojen diversiteetti oli suuri, joten ne

saattoivat olla peräisin useasta erilaisesta paikallisesta palkokasvista. Kannat eivät

todennäköisesti olleet peräisin kudzusta.

73

ii) Bakteerien saapuminen Kiinaan maapähkinän siementen mukana vaikutti

epätodennäköiseltä, koska kiinalaiset maapähkinäkannat erosivat selvästi kansain-

välisistä maapähkinää nystyröineistä vertailukannoista.

iii) Kosmopoliittien, erittäin vanhojen Bradyrhizobium-bakteereiden sopeutuminenuusiin isäntäkasvitulokkaisiin vallitsevien olosuhteiden myötävaikutuksellatäydentää ensimmäistä hypoteesia lisäämällä siihen historianäkökulman. Tutkittujen

Bradyrhizobium-kantojen geenien mosaiikkimainen yhdistyminen genomissa voi olla

osoitus bradyritsobien poikkeuksellisen aktiivisesta geeniensiirtämiskyvystä. Voi olla,

että sopeutumiskykyiset bradyritsobit ovat voineet mukautua useisiin erilaisiin isäntä-

kasveihin, ja maapähkinän saapuessa Kiinaan on erilaisten palkokasvien symbiontteja

siirtynyt nystyröimään maapähkinää.

Tieto ritsobien diversiteetistä ja symbioosiominaisuuksista voi olla tulevaisuudessa erittäin

hyödyllinen maatalouden harjoittajille. Typpeä sitovien symbionttisten mikrobikantojen avulla

voidaan esimerkiksi vähentää kemiallista typpilannoitusta ja parantaa maaperän rakennetta, ja

edistää siten ekologisesti, taloudellisesti ja sosiaalisesti kestävää maanviljelyä. Tehokkaiden typen-

sidontasymbioosien tunteminen on olennaista tuloksen kannalta. Koska symbioosiin kuuluu aina

kaksi osapuolta, ovat sekä kasvin ja bakteerin vaatimukset ympäristön suhteen, että niiden

keskinäinen yhteensopivuus tärkeitä tutkimuskohteita tämän päivän ympäristötutkimuksessa.

7. Kirjallisuus

Andronov E. E., Terefework Z., Roumiantseva M. L., Dzyubenko N. I., Onichtchouk O. P.,Kurchak K. N., Dresler-Nurmi A., Young J. P. W., Simarov B. V. ja Lindström K. 2003.Symbiotic and genetic diversity of Rhizobium galegae isolates collected from the Galega orientalis

gene center in the Caucasus. Applied and Environmental Microbiology 69(2), 1067-1074.

Angelini J., Castro S. ja Fabra A. 2003. Alterations in root colonization and nodC gene induction

in the peanut-rhizobia interaction under acidic conditions. Plant Physiology and Biochemistry 41,

289-294.

APHIS (Animal and Plant Health Inspection Service) 11.4. 2006. Lackey J: Soybean

[verkkojulkaisu]. USDA, APHIS, Biotechnology permits, USA [viitattu 30.9.2006] Saatavissa:

http://www.aphis.usda.gov/brs/soybean.html.

Berg D. E., Akopyants N. S. ja Kersulyte D. 1994. Fingerprinting microbial genomes using the

RAPD or AP-PCR method. Methods in Molecular and Cellular Biology 5(1), 13-24.

http://www.aphis.usda.gov/brs/soybean.html.

74

Bianco P. R. ja Kowalczykowski S. C. 2005. RecA Protein. Teoksessa: Encyclopedia of Life

Sciences. John Wiley & Sons, Ltd: Chichester http://www.els.net/ [doi:10.1038/npg.els.0003925]

Boogerd F. ja van Rossum D. 1997. Nodulation of groundnut by Bradyrhizobium: a simple

infection process by crack entry FEMS Microbiology Reviews 21 (1), 5-27.

Brewin N. J. 1991. Development of the legume root nodule. Annual Review of Cell Biology 7, 191-

226.

Brewin N. J. 2002. Root Nodules (Rhizobium, Legumes). Teoksessa: Encyclopedia of life

sciences. John Wiley&Sons Ltd: Chichester. http://www.els.net/

Burris R. H. 1999. Nitrogen Fixation. Teoksessa: Encyclopedia of Life Sciences. John Wiley &

Sons, Ltd: Chichester http://www.els.net/ [doi:10.1038/npg.els.0000626]

Chantreuil C., Giraud E., Prin Y., Lorquin J., Ba A., Gillis M., de Lajudie P. ja Dreyfus B. 2000.Photosynthetic bradyrhizobia are natural endophytes of the African wild rice Oryza brevigulata.

Applied and Environmental Microbiology 66 (12), 5437-5447.

Chen Q., Zhang X., Terefework Z., Kaijalainen S., Li D. ja Lindström K. 2003. Diversity and

compatibility of peanut (Arachis hypogaea L.) bradyrhizobia and their host plants. Plant and Soil

255, 605-617.

Chen Q. 2004. Genetic diversity and phylogeny of rhizobia isolated from six genera of legume, and

determination of the taxonomy of rhizobia from Pueraria spp. In Sichuan province, P. R. China.

[kiinankielinen väitöskirja] China Agricultural University, P.R.China.

Chen W.-M., Moulin L., Bontemps C., Vandamme P., Béna G. ja Boivin-Masson C. 2003.

Legume symbiotic nitrogen fixation by β-proteobacteria is widespread in nature. Journal of

Bacteriology 185(24), 7266-7272.

Corley R. N., Woldeghebriel A. ja Murphy M. R. 1997. Evaluation of the nutritive value of kudzu

(Pueraria lobata) as a feed for ruminants. Animal Feed Science and Technology 68, 183–188.

Cournoyer B. ja Lavire C. 1999. Analysis of Frankia evolutionary radiation using glnII sequences.

FEMS Microbiology Letters 177(1), 29-34.

Crawley M. J. 1997. The structure of plant communities. Teoksessa M.J. Crawley (toim.) Plant

Ecology 2. painos. Blackwell Science Ltd. USA. Sivut 475-531.

Debellé F., Moulin L., Mangin B., Dénarié J. ja Boivin C. 2001. nod genes and Nod signals and

the evolution of the Rhizobium-legume symbiosis. Acta Biochimica Polonica 48(2), 359-365.

Denison R. F. ja Kiers E. T. 2004. Lifestyle alternatives for rhizobia: mutualism, parasitism, and

forgoing symbiosis. FEMS Microbiology Letters 237, 187-193.

Dobert R. C., Breil B. T. ja Triplett E. W. 1994. DNA sequence of the common nodulation genes

of Bradyrhizobium elkanii and their phylogenetic relationship to those of other nodulating bacteria.

Molecular Plant-Microbe Interactions 7(5), 564-572.

Dresler-Nurmi A., Fewer D., Räsänen L. A. ja Lindström K. 2006. The diversity and evolution of

rhizobia. Käsikirjoitus (Soveltavan kemian ja mikrobiologian laitos, Helsingin yliopisto).

http://www.els.net/

http://www.els.net/

http://www.els.net/

75

Dresler-Nurmi A., Terefework Z., Kaijalainen S., Lindström K. ja Hatakka A. 2000. Silver

stained polyacrylamide gels and fluorescence-based automated capillary electrophoresis for

detection of amplified fragment length polymorphism patterns obtained from white-rot fungi in the

genus Trametes. Journal of Microbiological Methods 41, 161-172.

de Faria S. M., Hay G. T. ja Sprent J. I. 1988. Entry of rhizobia into roots of Mimosa scabrella

Bentham occurs between epidermal cells. Journal of General Microbiology 134(8), 2291-2296.

Farris J. S. 1969. On the cophenetic correlation coefficient. Systematic Zoology 18(3), 279-285.

Felsenstein J. 1985. Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap.

Evolution 39(4), 783-791.

Fisher S. 1992. Glutamine synthesis in Streptomyces - a review. Gene 115(1-2), 13-17.

Gage D. J. ja Margolin W. 2000. Hanging by a thread: invasion of legume plants by rhizobia.

Current Opinion in Microbiology 3, 613-617.

Giraud E., Hannibal L., Fardoux J., Verméglio A. ja Dreyfus B. 2000. Effect of Bradyrhizobium

photosynthesis on stem nodulation of Aeschyomene sensitiva. Proceedings of the National

Academy of Sciences of the United States of America 97(26), 14795-14800.

Gogarten J. P., Doolittle W. F. ja Lawrence J. G. 2002. Prokaryotic evolution in light of gene

transfer. Molecular Biology and Evolution 19(12), 2226-2238.

Goormachtig S., Capoen W. ja Holsters M. 2004. Rhizobium infection: lessons from the versatile

nodulation behaviour of water-tolerant legumes. Trends in Plant Science 9(11), 518-522.

Göttfert M., Röthlisberger S., Kündig C., Beck C., Marty R. ja Hennecke H. 2001. Potential

symbiosis-specific genes uncovered by sequencing a 410-kilobase DNA region of the

Bradyrhizobium japonicum chromosome. Journal of Bacteriology 183(4), 1405-1412.

Hampl V., Pavlicek A. ja Flegr J. 2001. Construction and bootstrap analysis of DNA

fingerprinting-based phylogenetic trees with the freeware program FreeTree: Application to

trichomonad parasites. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 51, 731-

735.

Haukka K., Lindström K. ja Young P. W. 1998. Three phylogenetic groups of NodA and NifH

genes in Sinorhizobium and Mesorhizobium isolates from leguminous trees Growing in Africa and

Latin America. Applied and Environmental Microbiology 64(2), 419-426.

Hennecke H. 1990. Nitrate fixation genes involved in Bradyrhizobium japonicum–soybean

symbiosis. FEBS Letters 268(2), 422-426.

Hillis D. M. ja Bull J. J. 1993. An empirical test of bootstrapping as a method for assessing

confidende in phylogenetic analysis. Systematic Biology 42(2), 182-192.

Hirsch A. M. 1992. Developmental biology of legume nodulation. New Phytologist 122, 211-237.

Hirsch A. M. 1999. Role of lectins (and rhizobial exopolysaccharides) in legume nodulation.

Current Opinion in Plant Biology 2, 320-326.

Hymowitz T. 1970. On the domestication of the soybean. Economic botany 24(4), 408-421.

76

ICRISAT 2005. Groundnut (peanut) [verkkodokumentti] International Crops Research Institute for

the Semi-Arid Tropics. [viitattu 21.9.2006] Saatavissa:

http://www.icrisat.org/GroundNut/GroundNut.htm

ILDIS (International Legume Database & Information Service) 5.7. 2006. Pueraria montana

var. lobata [verkkojulkaisu]. School of Plant Sciences, University of Reading, UK [viitattu

30.9.2006]

Saatavissa:http://www.ildis.org/LegumeWeb?version~10.01&LegumeWeb&tno~15546&genus~Pu

eraria&species~lobata

ILDIS (International Legume Database & Information Service) 5.7. 2006. Glycine max

[verkkojulkaisu]. School of Plant Sciences, University of Reading, UK [viitattu 30.9.2006]

Saatavissa:http://www.ildis.org/LegumeWeb?version~10.01&LegumeWeb&tno~13287&genus~Gly

cine&species~max

ILDIS (International Legume Database & Information Service) 5.7. 2006. Arachis hypogaea L.


Saatavissa:http://www.ildis.org/LegumeWeb?version~10.01&LegumeWeb&tno~1295&genus~Arac

his&species~hypogaea

ILDIS (International Legume Database & Information Service) 5.7. 2006. Lespedeza cuneata.


Saatavissa: http://www.ildis.org/LegumeWeb?sciname=Lespedeza+cuneata

Jordan D. C. 1982. Transfer of Rhizobium japonicum Buchanan 1980 to Bradyrhizobium gen.

nov., a genus of slow-growing root nodule bacteria from leguminous plants. International Journal of

Systematic Bacteriology 32, 136-139.

Judd W. S., Campbell C. S., Kellogg E. A. ja Stevens P. F. 1999. Plant Systematics – A

Phylogenetic Approach. Sinauer Associates Inc. USA. 464 sivua.

Kaneko T., Nakamura Y., Sato S., Minamisawa K., Uchiumi T., Sasamoto S., Watanabe A.,Idesawa K., Iriguchi M., Kawashima K., Kohara M., Matsumoto M., Shimpo S., Tsuruoka H.,Wada T., Yamada M. ja Tabata S. 2002. Complete genomic sequence of nitrogen-fixing symbiotic

bacterium Bradyrhizobium japonicum USDA110. DNA Research 9, 189-197.

Karr D. B., Liang R., Reuhs B. L. ja Emerich D. W. 2000. Altered exopolysaccharides of

Bradyrhizobium japonicum mutants correlate with impaired soybean lectin binding, but not with

effective nodule formation. Plant 211, 218-226.

Kiers E. T., Rousseau R. A., West S. A. ja Denison R. F. 2003. Host sanctions and the legume-

rhizobium mutualism. Nature 425, 78-81.

Kim S. ja Dale B. E. 2005. Environmental aspects of ethanol derived from no-tilled corn grain:

nonrenewable energy consumption and greenhouse gas emissions. Biomass and Bioenergy 28,

475-489.

http://www.icrisat.org/GroundNut/GroundNut.htm

http://www.ildis.org/LegumeWeb?sciname=Lespedeza+cuneata

77

Krause A., Doerfei A. ja Göttfert M. 2001. Mutational and transcriptional analysis of the type III

secretion system of Bradyrhizobium japonicum. Molecular Plant-Microbe Interactions 15(12), 1228-

1235.

Kumada Y., Benson D. R., Hilleman D., Hosted T. J., Rochefort D. A., Thompson C. J.,Wohlleben W. ja Tateno Y. 1993. Evolution of the glutamine synthetase gene, one of the oldest

existing and functioning genes. Proceedings of the National Academy of Science of the United

States of America 90, 3009-3013.

Kunin V., Goldovsky L., Darzentas N. ja Ouzounis C. A. 2005. The net of life: Reconstructing

the microbial phylogenetic network. Genome Research 15, 954-959.

Kurland C. G., Canback C. ja Berg O. G. 2003. Horizontal gene transfer: A critical review.

Proceedings of the National Academy of the United States of America 100(17), 9658-9662.

Kuykendall L. D., Saxena B., Devine T. E. ja Udell S. E. 1992. Genetic diversity in

Bradyrhizobium japonicum Jordan 1982 and a proposal for Bradyrhizobium elkanii sp. nov.

Canadian Journal of Microbiology 38, 501-505.

Kündig C., Beck C., Hennecke H. ja Göttfert M. 1995. A single rRNA gene region in

Bradyrhizobium japonicum. Journal of Bacteriology 177(17), 5151-5154.

Laguerre G., Louvrier P., Allard M.-R. ja Amarger N. 2003. Compatibility of rhizobial genotypes

within natural populations of Rhizobium leguminosarum biovar viciae for nodulation of host

legumes. Applied and Environmental Microbiology 69(4), 2276-2283.

Laguerre G., Nour S. M., Macheret V., Sanjuan J., Drouin P. ja Amarger N. 2001. Classification

of rhizobia based on nodC and nifH gene analysis reveals a close phylogenetic relationship among

Phaseolus vulgaris symbionts. Microbiology 147, 981-993.

Laininen P. 2001. Todennäköisyys ja sen tilastollinen soveltaminen. 5. painos. Oy Yliopisto-

kustannus/Otatieto, Hakapaino Oy, Helsinki.

Lavin M., Herendeen P. S. ja Wojciechowski M. F. 2005. Evolutionary rates analysis of

Leguminosae implicates a rapid diversification of lineages during the tertiary. Systematic Biology

54(4), 575-594.

Lie T. A., Akkermans A. D. L. ja Egeraat A. W. S. M. 1984. Natural variation in symbiotic

nitrogen-fixing Rhizobium and Frankia spp. Antonie van Leeuwenhoek 50, 489-503.

Lindström K. 2007. Suullinen tiedonanto, joka perustui E. Giraudin esitelmään ”The mosaic

genomes of two photosynthetic Bradyrhizobium strains do not contain canonical nodulation genes.”

Lindström K. ja Gyllenberg H. 2006. The species paradigm in bacteriology: Proposal for a cross-

disciplinary species concept. World Federation of Culture Collections Newsletter, July 2006, 4-13.

Lindström K., Kokko-Gonzales P., Terefework Z. ja Räsänen L. A. 2006. Differentiation of

nitrogen-fixing legume root nodule bacteria (rhizobia). Teoksessa: Cooper ja Rao (toim.) Molecular

Techniques for Soil, Rhizosphere and Plant Microorganisms. CAB International. Sivut 236-258.

78

Ludden P. W. 1999. Nitrogenase Complex. Teoksessa: Encyclopedia of Life Sciences. John Wiley

& Sons, Ltd: Chichester http://www.els.net/ [doi:10.1038/npg.els.0001386]

Madigan M. T., Martinko J. M. ja Parker J. 2003. Brock Biology of Microorganisms. 10. painos.

Pearson Education Inc. USA. 1019 sivua.

Masterson R. V., Prakash R. K. ja Atherly A. G. 1985. Conservation of symbiotic nitrogen fixation

gene sequences in Rhizobium japonicum and Bradyrhizobium japonicum. Journal of Bacteriology

163(1), 21-26.

Mathis J. N., McMillin D. E., Champion R. A. ja Hunt P. G. 1997. Genetic variation in two

cultures of Bradyrhizobium japonicum 110 differing in their ability to impact drought tolerance in

soybean. Current Microbiology 35, 363-366.

Mitich L. W. 2000. Kudzu (Pueraria lobata [Willd.] Ohwi). Weed Technology 14, 231-235.

Molouba F., Lorquin J., Willems A., Hoste B., Giraud E., Dreyfus B., Gillis M., de Lajudie P. jaMasson-Boivin C. 1999. Photosynthetic bradyrhizobia from Aeschyomene spp. are specific to

stem-nodulated species and form a separate 16S ribosomal DNA restriction fragment length

polymorphism group. Applied and Environmental Microbiology 65(7), 3084-3094.

Morgante C., Angelini J., Castro S. ja Fabra A. 2005. Role of rhizobial exopolysaccharides in

crack entry/intercellular infection of peanut. Soil Biology and Biochemistry 37(8), 1436-1444.

Moulin L., Munive A., Dreyfus B. ja Boivin-Masson C. 2001. Nodulation of legumes by members

of the β-subclass of proteobacteria. Nature 411, 948-950.

Moulin L., Béna G., Boivin-Masson C. ja Stepowski T. 2004. Phylogenetic analyses of

symbiotic nodulation genes support vertical and lateral gene co-transfer within the Bradyrhizobium

genus. Molecular Genetics and Evolution 30, 720-732.

O’Callaghan K. J., Davey M. R. ja Cocking E. C. 1997. Xylem colonization of the legume

Sesbania rostrata by Azorhizobium caulinodans. Proceedings of the Royal Society B: Biological

Sciences 264(1389), 1821-1826.

Perret X., Staehelin C. ja Broughton W. J. 2000. Molecular basis of symbiotic promiscuity.

Microbiology and Molecular Biology Reviews 64(1), 180-201.

Pueppke S. G. 1983. Rhizobium infection threads in root hairs of Glycine max (L.) Merr., Glycine

soia (L.) Sieb. and Zucc., and Vigna unguiculata (L.) Walp. Canadian Journal of Microbiology

29(1), 69-76.

Rai A. N., Söderbäck E. ja Bergman B. 2000. Cyanobacterium-plant symbioses. New Phytologist

147(3), 449-481.

Rajala J. 2004. Viljelykierrot. Teoksessa: Rajala J. (toim.) Luonnonmukainen maatalous. Helsingin

yliopiston maaseudun tutkimus- ja koulutuskeskuksen julkaisuja 80. Mikkeli 2004. Sivut 110-119.

Rivas R., Willems A., Palomo J. L., García-Benavides P., Mateos P. F., Martinez-Molina E.,Gillis M. ja Velázquez E. 2004. Bradyrhizobium betae sp. nov. isolated from roots of Beta vulgaris

http://www.els.net/

79

affected by tumor-like deformations. International Journal of Systematic Evolution Microbiology (in

press).

Robson R. L. 1979. Characterization of an oxygen-stable nitrogenase complex isolated from

Azotobacter chroococcum. Biochemical Journal 181, 569–575.

Rosselló-Mora R. ja Amann R. 2001. The species concept for prokaryotes. FEMS Microbiology

Reviews 25, 39-67.

van Rossum D., Schuurmans F. P., Gillis M., Muyotcha A., van Versefeld H. W., StouthamerA. H. ja Boogerd F. C. 1995. Genetic and phenetic analyses of Bradyrhizobium strains nodulating

peanut (Arachis hypogaea L.) roots. Applied and Environmental Microbiology 61(4), 1599-1609.

Räsänen L. A. 2002. Biotic and abiotic factors influencing the development of N2-fixing symbioses

between rhizobia and the woody legumes Acacia and Prosopis. Mikrobiologian julkaisuja 2002.

Mikrobiologian osasto, Soveltavan kemian ja mikrobiologian laitos, Helsingin yliopisto. Saatavissa:

http://ethesis.Helsinki.fi/maa/skemi/vk/rasanen

Saito A., Mitsui H., Hattori R., Minamisawa K. ja Tsutomu Hattori T. 1998. Slow-growing and

oligotrophic soil bacteria phylogenetically close to Bradyrhizobium japonicum. FEMS Microbiology

Ecology 25, 277-286.

Saleena L. M., Loganathan P., Rangarajan S. ja Nair S. 2001. Genetic diversity of

Bradyrhizobium strains isolated from Arachis hypogaea. Canadian Journal of Microbiology 47, 118-

122.

Sawada H., Kuykendall L. D. ja Young J. M. 2003. Changing concepts in the systematics of

bacterial nitrogen-fixing legume symbionts. Journal of General and Applied Microbiology 49, 155-

179.

Schultze M. ja Kondorosi A. 1998. Regulation of symbiotic root nodule development. Annual

Reviews in Genetics 32, 33-57.

Smith B. W. 1950. Arachis hypogaea. Aerial flower and subterranean fruit. American Journal of

Botany 37(10), 802-815.

Spaink H. P. 2000. Root nodulation and infection factors produced by rhizobial bacteria. Annual

Review of Microbiology 54, 257–288.

Spaink H. P. 1994. Role of rhizobial lipo-chitin oligosaccharide signal molecules in root nodule

organogenesis. Plant Molecular Biology 26(5), 1413-1422.

Sprent J. I. 2001. Nodulation in legumes. Royal Botanic Gardens, Kew, s.146.

Stacey G., Libault M., Brechenmacher L., Wan J. ja May G. D. 2006. Genetics and functional

genomics of legume nodulation. Current Opinion in Plant Biology 9, 110-121.

Stepowski T., Swiderska A., Miedzinska K., Czaplinska M., Swiderski M., Biesiadka J. jaLegocki A. B. 2003. Low sequence similarity and gene content of symbiotic clusters of

Bradyrhizobium sp. WM9 (Lupinus) indicate early divergence of “lupin” lineage in the genus

Bradyrhizobium. Antonie van Leeuwenhoek 84, 115-124.

http://ethesis.Helsinki.fi/maa/skemi/vk/rasanen

80

Stewart W. D. P. 1969. Biological and ecological aspects of nitrogen fixation by free-living micro-

organisms. Proceedings of the Royal Society of London, Series B, Biological Sciences 172, 367-

388.

Stougaard J. 2000. Regulators and regulation of legume root nodule development. Plant

Physiology 124, 531–540.

Sullivan J. T. ja Ronson C. T. 1998. Evolution of rhizobia by acquisition of a 500-kb symbiosis

island that integrates into a phe-tRNA gene. Proceedings of the National Academy of Science of

the USA 95, 5145-5149.

Suominen L., Roos C., Lortet G., Paulin L. ja Lindström K. 2001. Identification and structure of

the Rhizobium galegae common nodulation genes – evidence for horizontal gene transfer.

Molecular Biology and Evolution 18, 906-916.

Suominen L. 2000. Molecular biology of symbiotic interactions between Galega orientalis and

Rhizobium galegae. Mikrobiologian julkaisuja 29/2000. Mikrobiologian osasto, Soveltavan kemian

ja mikrobiologian laitos, Helsingin yliopisto. Sivut 1-23.

Tan Z., Hurek T., Vinuesa P., Müller P., Ladha J. K. ja Reinhold-Hurek B. 2001. Specific

detection of Bradyrhizobium and Rhizobium strains colonizing rice (Oryza sativa) roots by 16S-23S

ribosomal DNA intergenic spacer-targeted PCR. Applied and Environmental Microbiology 67(8),

3655-3664.

Terefework Z. 2002. Diversity and phylogeny of Rhizobium galegae, and reflections on molecular

evolution of rhizobium-legume symbiosis. Mikrobiologian julkaisuja 2002. Mikrobiologian osasto,

Soveltavan kemian ja mikrobiologian laitos, Helsingin yliopisto. Saatavilla:

http://ethesis.Helsinki.fi/maa/skemi/vk/terefework

Thormann C. E., Ferreira M. E., Camargo L. E. A., Tivang J. G. ja Osborn T. C. 1994.

Comparison of RFLP and RAPD markers to estimating genetic relationships within and among

cruciferous species. TAG Theoretical and Applied Genetics 88, 973-980.

Turner S. L. ja Young P. W. 2000. The glutamine synthetases of rhizobia: Phylogenetics and

evolutionary implications. Molecular Biology and Evolution 17(2), 309-319.

Ueda T., Suga Y., Yahiro N. ja Matsuguchi T. 1995. Phylogeny of Sym plasmids of rhizobia by

PCR-based sequencing of a nodC segment. Journal of Bacteriology 177(2), 468-472.

University of Georgia 2003. World Geography of the Peanut [verkkodokumentti]. Sustainable

Human Ecosystems Laboratory, Dept of Anthropology, University of Georgia, USA. [viitattu

21.9.2006]. Saatavissa: http://lanra.anthro.uga.edu/peanut/knowledgebase/countries/china.cfm

Urtz B. E. ja Elkan G. H. 1996. Genetic diversity among Bradyrhizobium isolates that effectively

nodulate peanut (Arachis hypogaea). Canadian Journal of Microbiology 42, 1121-1130.

Vavilov N. I. 1926. Studies on the origin of cultivated plants. Leningrad. 250 sivua.

Vega-Hernandez M. C., Perez-Galdona R., Dazzo F. B., Jarabo-Lorenzo A., Alfayate L. C. jaLeon-Barrioz M. 2001. Novel infection process in the indeterminate root nodule symbiosis

http://ethesis.Helsinki.fi/maa/skemi/vk/terefework

http://lanra.anthro.uga.edu/peanut/knowledgebase/countries/china.cfm

81

between Chamaecytisus proliferus (tagasaste) and Bradyrhizobium sp. New Phytologist 150 (3),

707-721.

Verma D. P. S. ja Hong Z. 1996. Biogenesis of the peribacteroid membrane in root nodules.

Trends in Microbiology 4(9), 364-368.

Versalovic J., Schneider M., de Bruijn F. J. ja Lupski J. R. 1994. Genomic fingerprinting of

bacteria using repetitive sequence-based polymerase chain reaction. Methods in Molecular and

Cellular Biology 5(1), 25-40.

Vinuesa P., León-Barrios M., Silva C., Willems A., Jarabo-Lorenzo A., Pérez-Galdona R.,Werner D. ja Martínez-Romero E. 2004. Bradyrhizobium canariense sp. nov. , an acid-tolerant

endolymbiont fron he nodules of endemic woody legume species (Papilionoideae:Genisteae)

growing in the Canary Islands along with B. japonicum bv. genistearum, Bradyrhizobium

genospecies a and Bradyrhizobium genospecies b. International Journal of Systematic Evolution

Microbiology (in press. http://dx.doi.org/10.1099/ijs.0.63292-0)

Vinuesa P., Silva C., Werner D. ja Martinez-Romero E. 2005. Population genetics and

phylogenetic inference in bacterial molecular systematics: the roles of migration and recombination

in Bradyrhizobium species cohesion and delineation. Molecular Phylogenetics and Evolution 34(1),

29-54.

Vos P., Hogers R., Bleeker M., Reijans M., van de Lee T., Hornes M., Frijters A., Peleman J.,Kuiper M. ja Zabeau M. 1995. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acid

Research 23(21), 4407-4414.

Webster G., Jain V., Davey M. R., Gough C., Vasse J., Dénarié J. ja Cocking E. C. 1998. The

flavonoid naringenin stimulates the intercellular colonization of wheat roots by Azospirillum

caulinodans. Plant, Cell and Environment 21, 373-383.

Wernegreen J. J. ja Riley M. A. 1999. Comparison of the evolutionary dynamics of symbiotic and

housekeeping loci: A case for the genetic coherence of rhizobial lineages. Molecular Biology and

Evolution 16, 98-113.

Wilkinson H. H., Spoerke J. M. ja Parker M. A. 1996. Divergence in symbiotic compatibility in a

legume-Bradyrhizobium mutualism. Evolution 50(4), 1470-1477.

Willems A. ja Collins M. D. 1993. Phylogenetic analysis of rhizobia and agrobacteria based on

16S rRNA gene sequences. International Journal of Systematic Bacteriology 43(2), 305-313.

Willems A., Coopman R. ja Gillis M. 2001. Phylogenetic and DNA-DNA hybridization analyses of

Bradyrhizobium species. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 51,

111-117.

Woese C. R. 1987. Bacterial evolution. Microbiological Reviews 51(2), 221-271.

Xu L. M., Ge C., Cui Z., Li J. ja Fan H. 1995. Bradyrhizobium liaoningense sp. nov., isolated from

the root nodules of soybeans. International Journal of Systematic Bacteriology 45, 706-711.

http://dx.doi.org/10.1099/ijs.0.63292-0

82

Yanagi M. ja Yamasato K. 1993. Phylogenetic analysis of the family Rhizobiaceae and related

bacteria by sequencing of 16S rRNA gene using PCR and DNA sequencer. FEMS Microbiology

Letters 107, 115-120.

Yang J. K., Xie F. L. ja Zhou J. C. 2002. Genetic diversity and phylogeny of rhizobia isolated from

peanut (Arachis hypogaea). Yi Chuan Xue Bao 29(12), 1118-1125.

Yao G. 2004. Peanut production and utilisation in the People's republic of China

[verkkodokumentti]. Peanut in Local and Global Food Systems Series Report No.4, Department of

Anthropology, University of Georgia, USA [viitattu 30.9.2006]. Saatavissa:

http://lanra.anthro.uga.edu/peanut/download/china.pdf

Yao Z. Y., Kan F. L., Wang E. T., Wei G. H. ja Chen W. X. 2002. Characterization of rhizobia that

nodulate legume species of the genus Lespedeza and description of Bradyrhizobium

yuanmingense sp. nov. International Journal of Systematic Evolution Microbiology 52, 2219-2230.

Young P. W. ja Haukka K. E. 1996. Diversity and phylogeny of rhizobia. New Phytologist 133, 87-

94.

Zhang X., Nick G., Kaijalainen S., Terefework Z., Paulin L., Tighe S. W., Graham P. H. jaLindström K. 1999. Phylogeny and diversity of bradyrhizobium strains isolated from the root

nodules of peanut (Arachis hypogaea) in Sichuan, China. Systematic and Applied Microbiology 22,

378-386.

Kannen kuvat:Pueraria lobata (Peggy Greb) www.ars.usda.gov/is/graphics/photos/nov01/k9675-1.htm. Arachis

hypogaea

Muut kuvat:

http://en.wikipedia.org/wiki/Indigofera

http://en.wikipedia.org/wiki/Lespedeza 21.9.

http://lanra.anthro.uga.edu/peanut/download/china.pdf

http://www.ars.usda.gov/is/graphics/photos/nov01/k9675-1.htm.

http://en.wikipedia.org/wiki/Indigofera

http://en.wikipedia.org/wiki/Lespedeza

Liite 1. Alustat 1/1

Alustat

HUM-liemimannitoli 10,0 g

CaCo3 4,0 g

K2HPO4 0,5 g

hiivauute 0,4 g

MgSO4 x 7H2O 0,2 g

NaCl 0,1 g

tisl. H2O 1,000 l

pH 6,8-7,0 + 0,2 25°C:ssa

Autoklavoidaan 15 minuuttia 121°C:ssa.

HUM-agarKuten HUM-liemi, mutta lisätään seokseen lisätään 15,0 g agaria.

TY-liemikaseiini 16.0 g

hiivauute 10,0 g

NaCl 5,0 g

tisl. H2O 1,000 l

pH 7,0 + 0,2 25°C:ssa

Autoklavoidaan 15 min 121°C:ssa

Liite 2. Geeli 1/1

Geeli

TAETris base 242,0 g

Etikkahappo (väk.) 57,1 ml

0,5 M EDTA, pH 8,0 100,0 ml

Täydennetään ionivaihdetulla vedellä 1000,0 ml:ksi

1,5 % agaroosigeeli0,5 x TAE 230 ml

agaroosi 3,45 g

EtBr (5 mg/ml) 6 µl

Liite 3. DNA:n eristys 1/1

DNA:n eristys

-ohjeen on laatinut Zewdu Terefework 12.4.1999

1. HUM- tai TY-liemessä kasvaneet solut kerättiin sentrifugoimalla 10 000 rpm 2 min

2. Solut (max 50 µl) suspendoitiin 400 µl:aan

100 mM Tris (Valmistetaan pipetoimalla 10 ml 1 M Tris:a ja 10 ml 0,5 M

50 mM EDTA EDTA:ta, joiden pH 8, ja lisätään 80 ml steriiliä vettä.)

ja sekoitettiin pipetoimalla edestakaisin.

3. 1M beta-merkaptoetanolia lisättiin 4 µl ja käänneltiin putkea ympäri pari kertaa.

4. Solujen lopulliseksi hajotukseksi lisättiin 50 µl 10% SDS (natriumdodekyylisulfaatti) ja

käänneltiin putkea ympäri parin minuutin ajan.

5. DNA stabiloitiin lisäämällä putkeen 50 µl 5 M NaCl ja sekoittamalla.

6. Putkea inkuboitiin 65°C:ssa 10 minuuttia DNAsin inaktivoimiseksi.

7. Putkeen lisättiin 175 µl 5 M KAC (kaliumasetaattia) ja sitä sekoitettiin voimakkaasti.

8. Putkea inkuboitiin jäävedessä vähintään 20 minuuttia.

9. Seokseen lisättiin 650 µl -20°C:ssa säilytettyä kloroformi-2-oktanoli (24:1) -liuosta ja putkea

ravisteltiin voimakkaasti.

10. 50 µl CTAB:a lisättiin ja sekoitettiin kääntelemällä putkea ylösalas, minkä jälkeen sitä

inkuboitiin 65°C:ssa 10 minuuttia.

11. Putkea sentrifugoitiin 12 000 rpm 2 minuuttia ja päällimmäinen faasi siirrettiin uuteen putkeen.

12. Lisättiin vastaava tilavuus fenoli-kloroformi (1:1) -liuosta ja sekoitettiin kunnolla.

13. Putkea sentrifugoitiin 12 000 rpm 2 minuuttia ja ylempi vesifaasi siirrettiin uuteen putkeen.

Lisättiin vastaava tilavuus kloroformi-2-oktanolia (24:1). Kohta toistettiin.

14. Putkea sentrifugoitiin 12 000 rpm 2 minuuttia ja ylempi faasi siirrettiin uuteen putkeen.

15. Lisättiin yhtä suuri tilavuus 2-isopropanolia, joka saostaa DNA:n. Inkuboitiin -20°C:ssa

vähintään 1 h.

16. Putkea sentrifugoitiin 10 000 rpm 5 minuuttia ja yläfaasi poistettiin.

17. DNA-pelletti pestiin 200 µl:lla 70% etanolia. 10 000 rpm 5 minuutin sentrifugoinnin jälkeen

etanoli voitiin kaataa pois. Pelletti kuivattiin Heto Vacuum Centrifuge -laitteella 10 minuutissa.

18. DNA liuotettiin 30 µl:aan steriiliä vettä.

19. RNAsi-entsyymiä (Roche Diagnostics Corp. Indianapolis, USA) pipetoitiin DNA-liuokseen 0,7 µl

ja inkuboitiin yön yli +37°C:ssa.

Liite 4. Reagenssit 1/1

Reagenssit

Laimennettu pGEMpGEM© DNA Markers (Promega, USA) 1µg/µl 10 µl

ster. H2O 150 µl

2 x Load Dye (Promega, USA) 160 µl

50 bp DNA LadderGeneRulerTM 50 bp DNA Ladder 0,5 µg/µl (Fermentas) 1 µl

6 x Load Dye (Promega, USA) 1 µl

ster. H2O 3 µl

AFLP-adapteritEcoRI-Ad1 5'- CTC GTA GAC TGC GTA CC -3'

EcoRI-Ad2 5'- AAT TGG TAC GCA GTC TAC -3'

MseI-Ad1 5'- GAC GAT GAG TCC TGA G -3'

MseI-Ad2 5'- TAC TCA GGA CTC AT -3'

AFLP-PCR -alukkeetEcoRI-AC-FAM 5'- FAM- GAC TGC GTA CCA ATT CAC -3'

MseI-GC 5'- GAT GAG TCC TGA GTA AGC -3'

Liite 5. PCR-ohjelmat 1/2

5. PCR-ohjelmat (PTC-200 Programmable Thermal Controller)

Zewdu - BACAFLP

1 = 50,0°C; 0:05 min

2 = 60,0°C; 0:05 min

3 = 70,0°C; 1:00 min

4 = 95,0°C; 1:00 min - DNA:n denaturaatio

5 = 94,0°C; 0:30 min

6 = 59,5°C; 0:30 min - alukkeen liittyminen juosteeseen

7 = 79,0°C; 1:30 min - DNA:n kopiointi

8 = kohdat 5-7, 29 kertaa

9 = 72,0°C; 1:30 - DNA:n viimeinen kopiointi

10 = 4,0°C

Aneta - APEKKA

1 = 94,0°C; 1:35 min - DNA:n denaturaatio

2 = 94,0°C; 0:35 min

3 = 52,0°C; 1:00 min - alukkeen liittyminen juosteeseen

4 = 0,2s lämpötilaan 72,0°C

5 = 72,0°C; 2:00 min - DNA:n kopiointi


7 = 72,0°C; 10:00 min - DNA:n viimeinen kopiointi

8 = 4,0°C

Aneta – APEKKA1

1 = 95°C; 5:00 min

2 = 94°C; 0:35 min

3 = 52°C; 1:00 min

4 = 0,2°C/s 72°C:seen

5 = 72°C; 2:00 min


7 = 72°C; 10 min

Liite 5. PCR-ohjelmat 2/2

Aneta – NIFH

1 = 95°C; 5:00 min

2 = 93°C; 2:00 min

3 = 62°C; 1:00 min

4 = 72°C; 2:00 min


6 = 72°C; 10:00 min

7 = 4°C

Jyrki – NODD

1 = 94°C; 1:35 min

2 = 94°C; 0:35 min

3 = 55°C; 1:00 min

4 = 72°C; 2:00 min


6 = 72°C; 10:00 min

7 = 4°C

Jyrki – CELB

1 = 95°C; 3:30 min

2 = 94°C; 1:10 min

3 = 56°C; 0:40 min

4 = 72°C; 2:10 min


6 = 72°C; 10:00 min

7 = 4°C

Documents

Maapähkinää (Arachis hypogaea) ja kudzua (Pueraria lobata · 2007-03-20 · Maapähkinää (Arachis hypogaea) ja kudzua (Pueraria lobata)nystyröivien kiinalaistenBradyrhizobium-kantojen