Upload
others
View
9
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
CARRERA DE ESPECIALIZACION EN CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIALBIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
FCEyNFCEyN--INTIINTI
Materia de Especialización CEBI_E1bMateria de Especialización CEBI_E1bTécnicas de análisis en biotecnología
Macromoléculas
Docente a cargo: SANTAGAPITA, Patricio
CEBI_E1b_3 : Western y Southern Blots
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Es una técnica que se utiliza para identificar y localizar proteínas en base a su capacidad para unirse a anticuerpos específicos.
Es utilizado en biología molecular, bioquímica e inmunogenética para la detección de proteínas en una muestra.
4 PASOS:
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
4 PASOS:
1) Utiliza electroforesis en geles de poliacrilamida. Caso más común: separar proteínas desnaturalizadas por peso molecular (SDS PAGE).
2) Las proteínas son transferidas desde el gel hacia la membrana (generalmente nitrocelulosa), donde permanecen fijas.
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
3 y 4) Luego las proteínas son detectadas utilizando anticuerposespecíficos para dicha proteína.
Esquema
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
SDS-PAGE:
- Separo los complejos de proteínas en individuales
- Separo las proteínas por tamaño
Tandem
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Western Blot Análisis:
- Transferencia de las proteínas a una membrana de nitrocelulosa
- Son más estables y permanentes
- Identifiicación de proteínas por immunodetección: uso de anticuerpos especificos contra la proteína de interés
BIORAD ©
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Las electroforesis más utilizadas son las que utiliza geles depoliacrilamida, SDS-PAGE o IEF.
La separación de las proteínas de
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
La separación de las proteínas de la muestra puede ser por su puntoisoeléctrico (pI) o por su pesomolecular (MW).
Por lo tanto el tipo de separacióndepende del tratamiento de lamuestra y de la naturaleza del gel.
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Preparación de las muestras:
Las muestras deberán ser tratadas según su tipo.
Si fuese de un cultivo o tejido sufrirán pasos de lisis celular y solubilización de proteínas, centrifugación y filtración si fuese necesario.
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
necesario.
Luego de la extracción se prepara la muestra según la electroforesis a utilizar.
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
PASOS WESTERN
a) Preparación del sistema de blotting y transferencia
b) Bloqueo de la membrana (de nitrocelulosa)
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
b) Bloqueo de la membrana (de nitrocelulosa)
c) Incubación con soluciones de anticuerpos
d) Desarrollo de color del blot
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Preparación para la
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Preparación para la transferencia de las
proteínas a la membrana (de nitrocelulosa) Corte del gel
BIORAD ©
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Transferencia:
Para hacer accesibles las proteínas a la detección de los anticuerpos, éstas deberán ser transferidas desde el gel hacia una membrana. Las más utilizadas son las de nitrocelulosa o
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
una membrana. Las más utilizadas son las de nitrocelulosa o polyvinylidene difluoride (PVDF). Estas son elegidas por su propiedad de pegado de proteínas no especifico, basado en interacciones hidrofóbicas e interacción de cargas.
2 métodos generales:- capilaridad- electrotransferencia
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Electrotransferencia.
Se usa corriente eléctrica para impulsar las proteínas del gel hacia la membrana. Corren hacia el polo positivo.
El sandwich del gel, membrana y papeles de filtro (o goma espuma) se coloca entre dos planchas metálicas, conectadas
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
se coloca entre dos planchas metálicas, conectadas respectivamente a los polos.
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Esquema de la celda de Trans-Blot
Patricio Santagapita_CEBI_E1bBIORAD ©
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Transferencia de proteínas desde el
gel hacia la membrana
Corriente eléctrica
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
30 minutes100V
Buffer para el blotting1x Tris-glicina con
20% etanolCorriente eléctrica
BIORAD ©
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Preparando la transferencia electroforetica
Tips
Se puede adicionar una unidad congelada en el tanque para paliar el aumento de temperatura (Bio-Ice cooling unit)
Patricio Santagapita_CEBI_E1bBIORAD ©
Uso de barra de agitación magnética para mantener la distribución de iones y temperatura
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Patricio Santagapita_CEBI_E1bBIORAD ©
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Transferencia x capilaridad:
La membrana se coloca sobre el gel y sobre este una pila de papeles de filtro.
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
El sandwich formado se sumerge en una solución buffer, que ingresa por capilaridad, llevándose la proteína a la membrana.
Demora mucho más tiempo que la electrotransferencia (overnight).
Nota: la nitrocelulosa es mas barata que el PVDF, pero mas frágil.
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
La uniformidad y eficiencia de transferencia se puede confirmar con colorantes como el Ponceau S.
Ponceau S es el más comúnmente utilizado por su alta sensibilidad, rápido teñido (5 min) y su solubilidad en agua lo que hace mas fácil su posterior desteñido.
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Útil para nitrocelulosa, PVDF(reversible en ambos casos)
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Bloqueo
Se debe prevenir la interacción entre el anticuerpo utilizado y lamembrana.
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Para ellos, se incuba la membrana con una solución de proteínas (BSA, leche en polvo descremada -funciona muy bien y es económica-) que no serán detectadas por el anticuerpo y llenarán los espacios libres de la membrana evitando que interaccione el anticuerpo “inespecíficamente” con esta. Esto reduce el “ruido” del producto final dejando resultados más claros.
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Bloqueo
Buffer de bloqueo: BSA 0,1-1% + Tween 20 0,005% - leche en polvo 3-5% + Tween 20 0,025-0,05%, Caseína, etc. (en buffer TBS o PBS, que mantiene el correcto pH y fuerza iónica)
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
o PBS, que mantiene el correcto pH y fuerza iónica)
Luego del bloqueo se realizan lavados para eliminar el exceso de proteína de bloqueo. Se realizan con TBS o PBS + Tween 20 0,05%.
TBS: Tris/Borate/salinePBS: Phosphate/Borate/saline
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Detección:
Uso de anticuerpos como herramienta de diagnóstico
Patricio Santagapita_CEBI_E1bBIORAD ©
Hoy en día hay compañías que se especializan en proveer anticuerpos (monoclonales y policlonales – éstos últimos son los más usados-) contra una gran cantidad de proteínas.
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
1) La proteína de interés es enfrentada contra un anticuerpo especifico
3 pasos:
Proteínas en la membrana
Patricio Santagapita_CEBI_E1bBIORAD ©
contra un anticuerpo especifico
1) Unión de un 2do anticuerpo contra el primero (no hay necesidad que sea específico). Posee enzima.
1) Detección por adición de sustrato de la enzima. Reacción colorimétrica/ quimioluminiscente.
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Detección
Los anticuerpos se diluyen en la solución de bloqueo.
La incubación debe llevar una leve
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
La incubación debe llevar una leve agitación, la temperatura puede variar, cuanto mayor sea se incrementará la unión tanto especifica (señal deseada) como no especifica (ruido).
Puede dejarse 1 h a T amb, también a 37C; u overnight en heladera, de preferencia con agitación (tb fciona sin).
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Tomada de http://employees.csbsju.edu/hjakubowski/classes/ch331/Techniques/TechElectrophoresis.htm
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
1er anticuerpo: 0,5 - 5 µg/ml
2do anticuerpo: dirigido a la porción “especie específico” (Fc) delanticuerpo primario
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Otras opciones: ej. puede estar unido a biotina, o a enzimas tales como fosfatasa alcalina o peroxidasa
Los más utilizados son los unidos a peroxidasa, con los cuales se utiliza como sustrato alfa-cloronaftol (más barato y menos sensible), o reactivos quimioluminiscentes (se revela en una placa fotográfica)(ver catálogos)
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Resultado: Western Blot
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Si el Blot se hizo
desde un gel no teñido
Si el Blot se hizo
desde un gel teñido
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Recomendaciones:
Algunos anticuerpos pueden reusarse (entre 1 y 3 veces, y según como están conservados-buffer, leche-), pero hay que definir según la técnica.
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Agitación constante en las incubaciones, excepto en frío overnight.
Respetar tiempos y lavados. Es importante sacar el exceso de bloqueo y de anticuerpo para eliminar background.
Nitrocelulosa es mas barata pero mas frágil.
Sensibilidad: 0,1 ng.
No dejar burbujas de aire.
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Recomendaciones y aplicaciones:
Identificación de la proteína (criterio de identidad).
Detección de agregados no muy degradados.
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Alta concentración de albúmina puede interferir.
No es cuantitativo.
Permite diferenciar entre moléculas de mayor PM y agregados de la proteína.
Western Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Deteccíón de proteína CKK47 por SDS-PAGE y Western Blot
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Southern Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Similar a la técnica descripta para Western
Se puede hacer tanto para geles de agarosa com poliacrilamida, pero precaución en el método de transferencia (electrotransferencia únicamente).
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
únicamente).
Paso 1: Como preparar y correr un gel de agarosa(How to Make and Run an Agarose Gel (DNA Electrophoresis))http://www.youtube.com/watch?v=2UQIoYhOowM
Paso 2: Procedimiento de Southern
Southern Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Membranas más comunes: nitrocelulosa (ojo, es frágil), nylon (positivas o negativas, permiten reuso)
Luego de la transferencia, se debe FIJAR el DNA a la membrana. Métodos más comunes: irradiación UV (para nylon) o “cocinado” (nitrocelulosa).
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
o “cocinado” (nitrocelulosa).
Brown, Encyclopedia of Life Sciences (2001) Nature Publishing Group
Southern Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Brown, Current Protocols in Molecular Biology (1999) 2.9.1-2.9.20
Ver capítulo de libro anexo (Brown, Current Protocols in Molecular Biology (1999) 2.9.1-2.9.20) donde se dan detalles de protocolos para transferencias en medio ácido o básico según polaridad de membrana.
Southern Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Procedimiento completo Southern blot
http://v.youku.com/v_show/id_XMjYwODM5MTY4.html
http://www.youtube.com/watch?v=NaDGkF16Jm8
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
http://www.youtube.com/watch?v=NaDGkF16Jm8
Southern Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Revelado más comunes
Los métodos de revelado más comunes no son los mismos que para Western
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
-Radioactivos: Probe radioactiva – autoradiografia
-No radioactivos: quimioluminiscenica, colorimétrico (streptoavidina-biotina-enzima).
Southern Blot
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Aplicaciones y selección de membrana
-Nylon retiene fragmentos hasta 50 nucleot, mientras nitrocelulosa, 500. (Ojo en análisis de fragmentos de DNA digeridos con enz. restricción)
-Para PCR: mejor nylon, pero se usa nitrocelulosa dada la alta
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
-Para PCR: mejor nylon, pero se usa nitrocelulosa dada la alta cantidad de DNA de partida.
Principales aplicaciones: a) identificación de clones y localización de fragmento más pequeño conteniendo el gen de interés.
b) Mapeo RFLP (restriction fragment length polymorphism)(ver detalles en Brown, Encyclopedia of Life Sciences (2001) Nature Publishing Group)
Otros Blots
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Existen los llamados Northern blot y “Eastern blot”.
Northern blot Se basa en la detección y separación de ARN a partir de geles de agarosa
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
(video de muestra del proceso http://www.dnatube.com/video/2999/Nouthern-Blot)
“Eastern blot”.Variante (y extensión) del Western blot. Se usa principalmente para analizar modificaciones post-traduccionales de proteínas (lipi-, glico-, fosfo-rilaciones). Polémica y no aceptaciones global del término.
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Patricio Santagapita_CEBI_E1b